本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种胎盘样硫酸软骨素a免疫组合物及应用。
背景技术：
目前，还没有一种避孕疫苗应用于临床实践。避孕疫苗的靶标主要针对激素或者生殖细的某些组份，这些激素或者和生殖细胞相关组分通常在生殖过程发挥关键作用，如通过抑制生殖细胞产生(精子或者卵子)或者抑制生殖细胞的功能，以及阻碍正常妊娠进展和维持[1]。在这些组分中，精子成为第一个避孕疫苗靶标，1899年诺贝尔奖获得者landsteiner和metnikoff分别开展了抗精子抗体研究，注射抗精子抗体能够起到避孕的效果；随后外科医生morris在1937年申请了第一个抗精子避孕疫苗的美国专利，尽管这一疫苗能够在生育妇女中产生可逆的避孕效果，其不明确的副作用阻碍了其临床应用[2]。目前，有多种激素和生殖细胞组分被用来开展避孕疫苗的研究(如表1)。
表1.已有研究避孕疫苗的靶向分子
第一，靶向激素分子及其受体的避孕疫苗。合适的特异性抗激素抗体能够阻断生殖活动所需激素正常功能的行使，用激素免疫成熟个体刺激机体产生足够滴度的具有生物中和性的抗体，只要有足够的抗体滴度，接种疫苗者就能保持避孕状态[5]。目前，gnrh已经通过多种动物实验进行验证，如通过免疫去势来控制野生动物种群，在人的临床实验中，gnrh被用来延长产后妇女的无排卵期，同时被用于男性避孕和前列腺癌的治疗[3,10]。fsh避孕疫苗已经在男性上开展了i期临床实验，主要评估其免疫原性以及对精子发生的影响，但是得到的结果并不理想，发现其仅有很弱的免疫原性，能够减少精子的数量和活力，但对精液的其他参数无显著影响[4]。hcg疫苗能够阻止母体妊娠识别来终止早期妊娠，目前已经成功的在女性身上开展了i期和ii期临床实验，发现其是一种非常有前景的避孕疫苗[11,12]。几种以hcg为基础的避孕疫苗已经开展了广泛的临床前期和临床期研究，如β亚单位hcg疫苗和羧基末端肽β亚单位hcg疫苗[13-15]，这些疫苗通过中和hcg的促黄体作用来阻止或者干扰围植入期胚胎附植，这类疫苗也被用来抑制类固醇激素的过量分泌，如子宫肌瘤、多囊卵巢综合症、子宫内膜异位和性早熟等[11]。但是，靶向激素及其受体类避孕疫苗仍然存在避孕失败的风险，且会造成机体内分泌紊乱，扰乱卵巢功能，影响健康。
第二，靶向生殖细胞相关分子。细胞表面通常会存在的抗原分子，这些表面抗原通常具有组织特异性，免疫原性强，容易刺激机体产生相应的抗体。透明带抗原是其中之一，这是一种非细胞成份、特异性的细胞外基质糖蛋白，覆盖在雌性生殖细胞卵子和围植入期胚胎表面，在卵泡形成、受精、早期胚胎发育等过程中起关键作用，被认为是非常有前途的候选避孕疫苗[16]。透明带避孕疫苗可能通过阻止透明带被子宫蛋白酶水解，影响精子穿透或者胚胎植入，成为一种堕胎疫苗[8,17]。透明带避孕疫苗需要诱导机体产生很高的抗透明带抗体滴度才能阻止受精，但过高的抗透明带抗体通常很难维持，而且可能造成卵巢损伤，引起原始卵泡过早失活，因此在解决损伤卵巢这一缺陷之前很难得到推广应用。
雄性生殖细胞精子表面也存在一些特异性的蛋白，因此靶向精子的避孕疫苗可能非常有前景[18]。精子能够成为自身抗原和异体抗原，能够刺激两种性别的个体产生抗体，抗精子抗体已被在体内外阻止受精和胚胎发育[7]。用精子或者精子提取物免疫不同物种，包括人，能够刺激机体产生抗精子抗体，从而导致不孕不育[7]。因此精子能够刺激机体产生免疫反应，维持一定的抗精子抗体滴度能够促使机体保持不孕不育状态。但是靶向精子的避孕疫苗通常因不能维持高抗体滴度，不能确保阻止所有精子进入受孕状体而造成避孕失败，同时精子的来源受到了严重挑战，这些情况阻碍了精子避孕疫苗的推广应用。
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尽管避孕的疫苗的研究在不同的方面取得了长足的进步，目前还没有一种避孕疫苗应用于临床实践，开发避孕疫苗一直处在研究阶段。上述非常有前景的靶标抗原疫苗存在的问题包括：第一靶向激素及其受体可能造成机体内分泌失调，影响机体正常功能；第二，靶向生殖细胞可能造成组织损伤，发生不可逆性不孕不育；第三靶标疫苗分子不能产生足够的抗体滴度，影响避孕效果，造成避孕失败。因此避孕疫苗的研究、开发和临床应用具有广阔的前景，迫切需要一种高效、价格合适、使用舒适、能够推广应用、物种选择性低的避孕疫苗来满足人类避孕、外来动物入侵和野生动物种群失衡防控的需求。
技术实现要素：
本发明首次提出避孕疫苗针对胚胎附植期这样一个胎盘形成和胚胎发育的关键、敏感的时期，靶向附植执行关键细胞滋养层细胞的观点，可以提高避孕的敏感性和有效性。将胎盘滋养层特异性分泌的pl-csa单独或者与其核心蛋白cspg4的b细胞优势抗原表位组合制备避孕疫苗，利用其核心蛋白cspg4的b细胞优势抗原表位来诱导b细胞的抗原反应，增强免疫作用，进一步增加避孕效果，从而制备一种安全、有效的避孕疫苗。
本发明一个方面提供了一种避孕用免疫组合物，其中包含至少一种胎盘滋养层细胞特异表达多糖和/或蛋白抗原。
在本发明的技术方案中，所述的胚胎或胎盘滋养层细胞特异表达多糖选自胎盘样硫酸软骨素a。
在本发明的技术方案中，免疫组合物中还包含免疫组合物中还包含诱导b细胞的抗原反应的免疫增强剂，所述免疫增强剂选自胎盘样硫酸软骨素a核心蛋白cspg4的b细胞优势抗原表位，优选地，所述胎盘样硫酸软骨素a核心蛋白cspg4的b细胞优势抗原表位如序列seqidno.2或其同源物。
ivavdeptrpiyrftqseqidno.2
在本发明的技术方案中，胚胎或胎盘滋养层细胞特异表达多糖和/或蛋白抗原与cspg4的b细胞优势抗原表位的质量比为1-100：1，优选为1-10：1。
在本发明的技术方案中，避孕用免疫组合物中还包含佐剂。
在本发明的技术方案中，佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝(磷酸铝或氢氧化铝)、皂苷、quila、ribbi佐剂、二甲基双十八烷基溴化铵(dda)、单磷酰脂质a(mpl)、海藻糖二霉菌酸酯(tdm)、海藻糖二山嵛酸酯(dibehenate)和胞壁酰二肽(mdp)、聚i:c等。
本发明另一个方面提供一种药物组合物，其中包含了本发明的所述的免疫组合物。
在本发明的技术方案中，所述的药物组合物中还包含其它避孕和/或中止妊娠的活性成分。所述的避孕和/或中止妊娠的活性成分示例性的可以为去氧孕烯炔雌醇、壬苯醇醚栓、壬苯醇醚、米非司酮、左炔诺孕酮、左炔诺孕酮炔雌醚。
本发明另一个方面提供了本发明所述的免疫组合物在制备阻止胚胎附植于子宫内膜的药物中的用途。
本发明另一个方面提供了本发明所述的免疫组合物用于阻止胚胎附植于子宫内膜中的用途。
本发明另一个方面提供了本发明所述的免疫组合物在制备中止妊娠的药物中的用途。
本发明另一个方面提供了本发明所述的免疫组合物在用于中止妊娠中的用途。
本发明另一个方面提供了本发明所述的免疫组合物在制备避孕药物中的用途。
本发明另一个方面提供了本发明所述的免疫组合物在用于避孕中的用途。
本发明再一个方面提供了本发明所述的免疫组合物在免疫人类及非人类动物抑制人类或非人类怀孕的方法，所述方法包含向动物给药治疗有效量的包含一种或多种本发明所述的免疫组合物。
在本发明的技术方案中，所述的胚胎附植于子宫内膜、避孕或中止妊娠的对象或受试者为人类或者非人类的动物，其中包括驯养动物和非驯养动物。
在本发明的技术方案中，所述的非人类动物是驯养动物。例如，但不限于，狗、猫、大鼠、小鼠、牛、马、羊、猪、兔等。
在本发明的技术方案中，所述的非人类动物是野生动物。例如，但不限于，野生动物是狗、猫、大鼠、小鼠、蝙蝠、狐狸、浣熊、松鼠、负鼠、狼、兔等。
本发明再一个方面提供了胎盘滋养层细胞特异表达多糖和/或蛋白抗原作为避孕或阻止胚胎附植于子宫内膜或中止妊娠的作用靶点的用途，或者作为筛选避孕或阻止胚胎附植于子宫内膜或中止妊娠的药物靶点的用途。
在本发明中，免疫组合物或药物组合物中可以包含可药用载体，包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。载体和免疫组合物可以是无菌的，并且与给药方式相适合。免疫组合物或药物组合物也可以药物制剂中常用的其它辅料，例如含有少量润湿剂、乳化剂或ph缓冲剂。
本发明的免疫组合物或药物组合物可以是液体溶液、悬液、乳液、持续释放剂型或粉剂。可以使用任何常用药物载体例如无菌盐水溶液或芝麻油。介质也可以包含常规的药用辅助物质例如调整渗透压的可药用盐、缓冲剂、防腐剂等。
本发明的免疫组合物或药物组合物的给药方式可以通过任何途径，包括但不局限于，通过口腔、经皮、粘膜(例如，阴道、直肠、口腔或鼻粘膜)、注射(例如，肌肉、皮下的、静脉内、肠胃外的、腹膜内的、鞘内的)或通过吸入(例如，口腔的或鼻的)。根据给药方式的不同，可以调整本发明免疫组合物或疫苗或药物中的辅料以及制备方法。
在本发明中，所述“附植”与“着床”含义相同，是指胚胎滋养层与子宫内膜逐渐发生组织学和生理学的联系，使胚泡固着于子宫内膜，这一生理过程成为附植。
在本发明中，所述“药物组合物”和“免疫组合物”均按其最宽含义理解，例如，免疫组合物为能够引发免疫反应的组合物，药物组合物为能够起到引发受试者机体向预期的健康方向发展的组合物。
有益效果
1、本发明首次提出避孕疫苗针对附植早期这样一个胎盘形成和胚胎发育的关键、敏感的时期，靶向附植执行关键细胞滋养层细胞的观点，提高避孕的敏感性和有效性。
2、pl-csa疫苗靶向的是滋养层细胞，这些细胞存在于囊胚滋养外胚层和胎盘中，与机体其他的正常细胞(如下丘脑-垂体-卵巢等组织细胞)仅有较低的交叉反应性，不容易损害机体组织器官正常功能的行使。
3、pl-csa是大分子多糖，结构较为稳定，免疫原性强，免疫动物能够产生较高的抗体滴度；同时将pl-csa与其核心蛋白cspg4的b细胞优势抗原表位组合，可以诱导b细胞的抗原反应，增强免疫作用，从而增加避孕效果；
4、pl-csa比较容易获得，且不同物种来源pl-csa相似性较高。滋养层细胞中pl-csa含量比较丰富，废弃的猪胎盘中pl-csa含量也非常丰富，从猪胎盘中分离纯化pl-csa可以变废为宝。
附图说明
图1为避孕疫苗工作原理图。
图2为本发明的技术路线图。
图3为pl-csa在人、小鼠和猪胎盘滋养层细胞的表达及与cspg4的共定位图。pl-csa是以rvar2和dylight650标记的抗6×his单克隆抗体进行荧光染色，cspg4是以兔抗cspg4单克隆抗体和fitc标记的山羊抗兔二抗进行荧光染色，dapi标记细胞核，merge是图片组合，人胎盘滋养层来自分娩胎盘，小鼠胎盘滋养层来自妊娠15d胎盘，猪胎盘和子宫肌层来自妊娠70d胎盘和子宫肌。由共聚焦结果图可知，在人类、小鼠和猪的胎盘滋养层中均包含了pl-csa和cspg4，而猪子宫肌内无pl-csa和cspg4表达。
图4为pl-csa免疫babl/c小鼠结果图。其中，a.pl-csa样品和标准品波普扫面，吸收波长一致；b.实验鼠解剖情况；c.实验鼠体重变化情况；d.实验鼠抗体水平；e.实验鼠受孕率。
图5为pl-csa与其核心蛋白b细胞优势抗原表位cbz-1组装疫苗免疫babl/c小鼠结果图。a.实验鼠体重变化情况；b.实验鼠受孕率；c.实验鼠抗体水平。
图6为为急性毒性实验鼠体重变化结果图。
图7为免疫鼠内脏(包括肝、脾和肾)组织切片、he染色结果图。
具体实施方式
以下列实施例说明某些具体的特点和/或实施方案。这些实施例不应该被解释为将本公开限制于所描述的具体特征或实施方案。
实施例1pl-csa及其核心蛋白cspg4的表达和定位
此部分采用免疫荧光的方式进行。首先，收集人的分娩胎盘、小鼠妊娠15d胎盘和猪妊娠70d子宫胎盘，4％的多聚甲醛固定充分；按着实施例5的方式制片；3％h2o2(10min)灭活内源性过氧化物酶；ph6.0的柠檬酸盐缓冲液95℃水浴保持10min进行抗原修复；兔抗cspg4抗体(1:200)和自制的rvar2-his-tag(1:100)试剂4℃孵育过夜；pbst(含0.1％tritonx-100)浸洗3次，每次5min；fitc标记的羊抗兔二抗(1:1000)和dylight650标记的抗6×his单克隆抗体(1:1000)，室温孵育40min；pbst浸洗3次，每次5min；dapi复染核；pbst(含0.1％tritonx-100)浸洗3次，每次5min→防荧光猝灭封片剂封片，荧光共聚焦显微镜观察拍照。实验结果参见图3。从图3结果可以看出在人类、小鼠和猪的胎盘滋养层中均包含了pl-csa和cspg4，而猪子宫肌内无pl-csa和cspg4表达。
实施例2免疫剂的制备
制备并纯化胎盘样硫酸软骨素a：
(1)猪胎盘破碎或者连续培养的滋养层细胞系半机械分离，得到组织细胞浆液；
(2)将步骤(1)获得的组织细胞浆液与裂解液混合(v细胞浆液:v裂解液＝1:10)，裂解液中含rnase、dnasei、胰酶和proteasek，得到裂解的组织细胞浆液；
(3)将步骤(2)获得的裂解的组织细胞浆液灭活裂解液中的酶；加入1/4体积的sevag液除蛋白，得到pl-csa粗品；
(4)对疟原虫感染红细胞表面抗原var2csa基因序列seqidno.1的5’端加入bamhi酶切位点，3’端加入sali酶切位点；将基因片段seqidno.1与pet28a(+)原核表达载体相连，转化大肠杆菌bl21感受态细胞，进行原核表达，利用rvar2末端6×his标签进行ni2+亲和层析，获得高纯度的rvar2(684.1μg/ml)。
seqidno.1如下所示
ggatccctggaaaactacatcaagggcgacccctatttcgctgagtacgctacaaaactgagcttcatcctgaaccccagcgacgccaacaaccccagcggcgagacagccaaccacaacgacgaggcctgcaactgcaacgagagcggcatcagcagcgtgggccaggctcagacatccggccctagcagcaacaagacctgtatcacccacagctccatcaagaccaacaagaaaaaagaatgcaaggacgtgaagctgggcgtgcgggagaacgacaaggatctgaagatctgcgtgatcgaggacaccagcctgagcggcgtggacaactgctgctgccaggatctgctgggcatcctgcaggaaaactgcagcgacaacaagcggggcagcagctccaacgacagctgcgacaataagaaccaggacgagtgccagaaaaagctggaaaaggtgttcgccagcctgaccaacggctacaagtgcgataagtgcaagagcggcacctcccggtccaagaagaagtggatctggaagaagtccagcggcaacgaggaaggcctgcaggaagagtacgccaacaccatcggcctgccccccaggacccagagcctgtacctgggcaatctgcccaaactggaaaacgtgtgcgaggatgtgaaggacatcaacttcgacaccaaagagaagtttctggccggctgcctgatcgtgtccttccacgagggcaagaatctgaagaagcgctacccccagaataagaacagcggcaacaaagaaaacctgtgcaaggctctggaatacagcttcgccgactacggcgacctgatcaagggcacctccatctgggacaacgagtacacaaaggacctggaactgaatctgcagaacaacttcggcaagctgttcggcaagtacatcaagaagaacaataccgccgagcaggacacctcctacagctccctggacgagctgcgcgagtcttggtggaataccaataagaagtacatctggaccgccatgaagcacggcgccgagatgaacatcaccacctgtaacgccgacggctccgtgaccggcagcggctccagctgcgacgacatccccaccatcgacctgatcccccagtacctgagatttctgcaggaatgggtcgagaacttctgcgagcagcggcaggccaaagtgaaggacgtgatcaccaactgcaagagctgcaaagaatccggcaacaaatgcaagaccgagtgcaaaaccaagtgcaaggatgagtgcgagaagtacaagaagttcatcgaggcctgcggcacagccggcggaggcatcggaacagccggcagcccctggtccaagagatgggaccagatctacaagcggtacagcaagcacatcgaggacgccaagcggaaccggaaggccggcaccaagaactgcggcaccagctccaccaccaacgccgctgccagcaccgacgagaataagtgcgtgcagagcgacatcgacagctttttcaagcacctgatcgatatcggcctgaccacccccagcagctacctgagcaacgtgctggacgacaacatctgtggcgccgacaaggccccctggacaacctatacaacatacactacaaccgagaagtgcaacaaagagcgggacaagagcaagagccagagcagcgacaccctggtggtggtgaacgtgcccagccccctgggcaacacaccctaccggtacaagtacgcctgccagtgcaagatccccaccaacgaggaaacatgcgacgaccggaaagaatacatgaaccagtggtcctgcgggagcgctcggaccatgaagagagggtataagaacgataactacgaactgtgcaagtacaacggcgtggatgtgaagcccaccaccgtgcggagcaactccagcaagctggacggcaacgacgtgaccttcttcaacctgttcgagcagtggaacaaagaaatccagtaccagatcgagcagtacatgaccaacgccaacatcagctgcatcgatgagaaagaagtgctggacagcgtctccgacgagggcacccccaaagtgcggggaggctacgaggacggccggaacaacaacacagatcagggcacaaattgcaaagaaaagtgcaagtgctacaagctgtggatcgagaagatcaacgatcagtggggcaagcagaaggacaactacaacaagttccggtccaagcagatctacgacgccaataagggcagccagaacaaaaaggtggtgtccctgagcaacttcctgttcttcagctgctgggaggaatacatccagaagtacttcaacggcgattggagcaagatcaagaacatcggctccgacaccttcgagtttctgatcaagaagtgcggcaacaacagcgcccacggcgaggaaatcttcagcgagaagctgaagaacgccgagaagaagtgcaaagagaacgagagcaccgacaccaatatcaacaagagcgagacatcctgcgacctgaacgccaccaactacatccggggctgccagagcaagacctacgacggcaagatcttccccggcaagggcggcgagaagcagtggatttgcaaggacaccatcatccacggcgacaccaacggcgcctgcatcccccctcgcacccagaacctgtgcgtgggcgagctgtgggacaagtcctacggcggcagatccaacatcaagaacgataccaaagaactgctgaaagagaaggtcgac。
(5)将步骤(4)中获得的高纯度的rvar2与nhs活化琼脂糖(浓度4％)偶联：成功偶联的琼脂糖凝胶既为pl-csa的rvar2亲和层析柱；连接储液瓶、管道、电极三通、恒流泵、层析柱、管道、恒流泵、电极二通、样品或废液收集瓶，完成亲和层析纯化系统的组建。
(6)将步骤(3)中获得的pl-csa粗品步骤5)所得的层析柱进行分离，收集高纯度pl-csa，以苯酚硫酸法检测pl-csa浓度。
制备pl-csa疫苗和pl-csa+cbz-1疫苗
根据生物信息学分析(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)cspg4蛋白(id：np_001888.2)b细胞优势抗原表位，选择参数较高b细胞优势抗原表位的cbz-1，序列如seqidno.2所示(ivavdeptrpiyrftqseqidno.2)，化学合成多肽seqidno.2；将多肽与纯化的pl-csa按质量比1:1-1:10混合，超声条件完成自组装，获得pl-csa+cbz-1免疫原颗粒。
将纯化的pl-csa配置成溶液pl-csa免疫原颗粒。将得到的pl-csa免疫原颗粒和pl-csa+cbz-1免疫原颗粒与弗氏完全佐剂和不完全佐剂分别混合、乳化，制备pl-csa疫苗和pl-csa+cbz-1疫苗。
实施例3pl-csa的免疫原性和避孕效果评价
表2.pl-csa疫苗免疫分组
①免疫分组：6周龄雌性balb/c小鼠，随机分成4组，以pbs为阴性对照，每组20只(表2)，另外饲养40只10周龄balb/c雄鼠。
②免疫程序：各组雌性小鼠自由采食和饮水，每笼2只，接种pl-csa以及pl-csa+cbz-1疫苗的时间分别为0、1、2周(购入时设置为0周)，共免疫3次，第一次使用弗氏完全佐剂与免疫原混合，第二、三次使用弗氏不完全佐剂与免疫原混合。第4周开始将各组雌鼠与雄鼠合笼，查到阴栓后第9天采用b超监测是否怀孕。如果怀孕，即胚胎已经附植成功，则在妊娠第15天后将小鼠处死，解剖观察胚胎发育，收集血清，用于间接elisa检测抗体水平；如果不怀孕，连续6个发情周期与雄鼠合笼，所有雌鼠均以检测到阴栓，证明所有雌鼠均已完成交配。处死6个发情周期未怀孕小鼠，收集血清，用于间接elisa检测抗体的产生水平。
以pl-csa单独使用的避孕疫苗ig1组将小鼠受孕率降低至43％，空白组ncig1受孕率为75％；以pl-csa与其核心蛋白b细胞优势抗原表位cbz-1(ivavdeptrpiyrftq)多肽组装制备的避孕疫苗ig2组将小鼠受孕率降低至35％，空白组ncig2受孕率为85％。实验结果显示，pl-csa免疫剂和pl-csa+cbz-1免疫剂相比空白对照组能显著降低受孕率，而pl-csa+cbz-1组相比于pl-csa的避孕效果更佳。
实施例4pl-csa避孕疫苗的安全性评价
急性毒性实验：将6周雌性balb/c小鼠随机分成8组，每组10只，采取肌肉注射给药；其中pl-csa免疫剂4组，包括pl-csa-tg1组(100μg/只)、pl-csa-tg2组(200μg/只)、pl-csa-tg3组(400μg/只)、pl-csa-tg4组(800μg/只)；pl-csa+cbz-1免疫剂4组，包括cbz-1-tg1组(100μg/只)、cbz-1-tg2组(200μg/只)、cbz-1-tg3组(400μg/只)、cbz-1-tg4组(800μg/只)，单次给药200μl/只，连续观察2w，分析体征变化和死亡情况。
实验结果显示，除cbz-1-tg4组1只小鼠注射给药后10min内死亡外，其余小鼠体质量无显著性差异(图6)，给药后连续观2w，均未见明显异常，第14d脱颈处死动物剖检，心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、脑部大体解剖无明显病理变化(图7)。
实施例5间接elisa评价抗体水平
针对实施例3中的pbs组、pl-csa组和pl-csa+cbz-1组小鼠，分别检测怀孕小鼠与未孕小鼠的血清中抗体水平。
分别以纯化后pl-csa多糖2μg作为抗原，稀释于0.05m碳酸盐中包被于96孔板，200μl/well，4℃过夜；弃掉包被液，200μlpbst缓冲液清洗3次，每次5分钟；加入200μl封闭液(5％脱脂奶粉溶于pbst,ph＝7.2)，37℃，孵育2.5h；pbst清洗3次，每次5min；1％bsa(溶于pbst)按1:1000稀释小鼠待检血清，100μl/well，37℃孵育45min；pbst清洗3次，每次10min1％bsa按1:10000稀释hrp标记羊抗鼠igg,100μl/well，37℃孵育45min；弃掉二抗，pbst彻底清洗5次，每次5min；加入tmb显色液50μl/well，室温，暗室中显色10min；加入2mh2so450μl/well终止反应。15min内于酶标仪中读取od450数值。
实验结果参见图4d和图5c。实验结果说明给予pl-csa+cbz疫苗和pl-csa疫苗后抗体水平相比于空白组均有显著上升，而无论是给予疫苗组还是在空白组中未孕小鼠的抗体水平均高于怀孕小鼠的抗体水平，且均存在显著性差异。实验结果也证实了，高抗体的水平影响了胚胎附植进而使小鼠能够成功避孕。
实施例6组织he和免疫组化染色
对实施例3获得的小鼠取肝脏、脾脏和肾脏分别制片并通过he染色观察各器官是否有毒性反应，无明显病理变化。
制片：组织样品经4％的中性多聚甲醛(bouin's液)固定不少于48h，自来水中流水浸洗过夜后制作切片：(1)乙醇梯度脱水：70％乙醇(2h)→80％乙醇(2h)→90％乙醇(30min)→95％乙醇(30min)→100％乙醇(30min)→100％乙醇(30min)。(2)二甲苯透明：50％乙醇二甲苯(12min)→100％二甲苯(10min)→100％二甲苯(10min)。(3)浸蜡：50％二甲苯石蜡(2h)→100％石蜡(1h)→100％石蜡(1h)。(4)切片：5μm连选切片。(5)展片和捞片：45℃蒸馏水展片，洁净载玻片捞片。(6)烤片：60℃烤箱放置20min。(7)脱蜡：100％二甲苯(1min)→100％二甲苯(1min)。(8)水化：100％乙醇(2min)→95％乙醇(1min)→85％乙醇(1min)→75％乙醇(1min)→自然凉干(可-20℃保存备用)。
he染色：上述制定的石蜡切片→苏木精染色液(5min)→蒸馏水流水轻洗(5sec)→1％盐酸乙醇(3sec)→蒸馏水流水轻洗(15sec)→0.5％伊红液染色(45sec)→蒸馏水流水轻洗(30sec)→80％乙醇(2sec)→90％乙醇(2sec)→95％乙醇(5sec)→石碳酸二甲苯(5min)→二甲苯(1min)→二甲苯(1min)→中性树胶封固(树胶干后才移动观察，避免产生气泡)。显微镜下观察观察胎盘组织结构在各妊娠时期的动态变化，拍照。
实验结果参见附图7，he染色结果显示免疫鼠内脏(包括肝、脾和肾)组织切片未见明显改变与pbs组结果基本一致，证明包含pl-csa的避孕疫苗使用基本安全。
sequencelisting
<110>中国科学院深圳先进技术研究院
<120>一种胎盘样硫酸软骨素a免疫组合物及应用
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