本发明属于纳米医药
技术领域：
，涉及一种负载治疗性蛋白的纳米粒，含有所述纳米粒的微胶囊，制备所述纳米粒或微胶囊的方法，含有所述纳米粒或微胶囊的药物组合物，以及所述纳米粒或微胶囊的用途。
背景技术：
：胰岛素是一种蛋白质激素，由胰脏内的胰岛β细胞分泌，参与调节糖代谢，控制血糖平衡。外源性胰岛素主要用来治疗糖尿病。胰岛素的传统给药途径是皮下注射，然而，长期注射会使患者的依从性降低，并产生诸多副作用。相比皮下注射，胰岛素的口服给药途径具有患者依从性好、经济、方便、安全等优点。胰岛素经口服后，可经肝门静脉进入体循环，直接参与肝脏对葡萄糖的代谢，能够有效地模拟内源性胰岛素的分泌模式和生理作用。但是，胰岛素通过口服途径给药时有以下亟待解决的问题：首先，由于胃中的酸性环境，胰岛素在胃中很容易被降解；第二，胰岛素在消化道内可能被酶降解失活；最后，由于胰岛素的高分子量和低脂溶性，其在肠粘膜上皮细胞的渗透性低，造成口服生物利用度较低。现有技术中，已经出现了负载胰岛素等蛋白类药物的纳米粒，用于这些药物的口服递送。将纳米粒作为载体，有助于减少胃中的酸性环境和/或酶环境对药物的影响。但是，这些纳米粒往往存在粒径分布宽、表面形态不均匀、生物利用度不高或药效不高等问题。特别地，胃肠道系统中，在肠细胞表面覆盖有黏液层，黏液层中的粘蛋白可通过静电或疏水作用与纳米粒络合，在原位形成较大的聚集体，纳米粒锚定在黏液层中，影响了纳米粒在黏液层中的快速无规则运动，进而阻碍纳米粒在黏液层中的渗透效率。因此，黏液层的存在成为限制口服蛋白类药物递送效率的瓶颈问题。技术实现要素：本发明人通过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种负载治疗性蛋白的纳米粒。本发明人利用带负电的聚阴离子对正电的载药纳米核心进行包被，形成外层为带负电的聚阴离子、内部为载药纳米核心的、具有壳核结构的纳米粒。本发明的纳米粒可以通过静电排斥作用，减少其自身与黏液层中粘蛋白的相互作用，增加纳米粒在黏液层中的渗透效率，从而将更多的药物递送至肠上皮细胞。因此，在一个方面，本申请提供了一种纳米粒，其包含核心和包被在核心上的聚阴离子；所述核心包含治疗性蛋白，还包含细胞穿透肽(cpp)。在某些实施方案中，所述聚阴离子选自三聚磷酸钠、海藻酸、肝素、透明质酸(ha)、透明质酸盐、硫酸软骨素、聚丙烯酸类聚合物、聚苯乙烯磺酸类聚合物或其任意组合。在某些实施方案中，所述聚阴离子选自透明质酸、透明质酸盐(例如透明质酸钠)或其组合。透明质酸具有来源广泛、无毒、生物可降解、生物相容性好等特点，适于载药纳米粒的制备。透明质酸在碱性条件下可转化为透明质酸盐。在某些实施方案中，所述聚阴离子的重均分子量为4kda-200kda(例如4kda-10kda、10kda-50kda、50kda-100kda、100kda-150kda或150kda-200kda)。本发明的纳米粒中，所述核心包含的治疗性蛋白可以是激素、激素类似物、酶、酶抑制剂或抗体。在某些实施方案中，所述治疗性蛋白为胰岛素。本发明的纳米粒中，所述核心包含的cpp可以起到载体的作用。cpp被认为具有负载药物活性分子并增强其跨细胞转运的能力。在某些实施方案中，所述cpp包含精氨酸残基。在某些实施方案中，所述cpp的n端为精氨酸残基。在某些实施方案中，所述cpp为penetratin。penetratin来源于果蝇的触角足蛋白的同源异形域，由16个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如seqidno：1所示。penetratin可以介导多种疏水大分子进入活体细胞质内而不破坏细胞膜的完整性。在某些实施方案中，所述cpp被烷基修饰。使用烷基化的cpp作为载体，更容易形成稳定、分散性好的纳米粒。可以通过包含以下步骤的方法获得烷基化的cpp：使饱和脂肪酸的羧基与cpp上的氨基(例如，n端的氨基)发生缩合反应，形成酰胺键。优选地，所述缩合反应在缩合剂(例如，o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸(tbtu))、溶剂(例如，n,n-二甲基甲酰胺(dmf))和/或碱性试剂(例如，n,n-二异丙基乙胺(diea))存在的条件下进行。在某些实施方案中，所述烷基是c12-c18烷基(例如c12烷基、c14烷基、c16烷基或c18烷基)。在某些实施方案中，所述烷基是直链烷基。在某些实施方案中，所述cpp的n端被烷基修饰。在某些实施方案中，所述cpp为n端被正十八烷基修饰的penetratin。本发明的纳米粒可以被荧光化合物所标记，因此，在某些实施方案中，所述纳米粒还包含荧光化合物或荧光化合物的生色团。所述荧光化合物包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明异硫氰酸酯(ritc)、3h-吲哚菁类染料(例如cy3、cy5)或罗丹明(例如罗丹明6g、罗丹明123、罗丹明b)。所述荧光化合物可以标记在聚阴离子、治疗性蛋白和/或cpp上。本发明的纳米粒及其包含的核心可以是任何形状。在某些实施方案中，所述纳米粒为球形。在某些实施方案中，所述核心为球形。在某些实施方案中，本发明的纳米粒具有窄的粒径和/或均一的粒径分布。在某些实施方案中，所述纳米粒的粒径为100nm-900nm(例如100nm-200nm、200-300nm、300-400nm、400-500nm、500-600nm、600-700nm、700-800nm或800-900nm)。在某些实施方案中，所述纳米粒粒径的多分散指数(pdi)为0.05-0.5(例如0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4或0.4-0.5)。在某些实施方案中，本发明的纳米粒所包含的核心具有窄的粒径和/或均一的粒径分布。在某些实施方案中，所述核心的粒径为30nm-500nm(例如30nm-100nm、100-200nm、200-300nm、300-400nm或400-500nm)。在某些实施方案中，所述核心的粒径的多分散指数(pdi)为0.1-0.5(例如0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4或0.4-0.5)。在某些实施方案中，本发明的纳米粒表面呈电负性。在某些实施方案中，所述纳米粒的zeta电位为-10mv至-50mv(例如-10mv至-20mv、-20mv至-30mv、-30mv至-40mv或-40mv至-50mv)。在某些实施方案中，本发明的纳米粒具有较高的包封率和/或载药量。在某些实施方案中，所述纳米粒的包封率为90％-99％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在某些实施方案中，所述纳米粒的载药量为50％-90％(例如50％-55％、55％-60％、60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％或85％-90％)。本发明中，纳米粒的包封率(ee)和载药量(lc)可以通过包含以下步骤的方法测得：1)使用荧光标记的治疗性蛋白制得纳米粒，2)将包含所述纳米粒的混悬液置于超滤管中进行离心，得到滤液；3)测定滤液中治疗性蛋白的荧光强度，进而计算滤液中的治疗性蛋白的浓度，以确定游离治疗性蛋白的量。按下式计算包封率(ee)和载药量(lc)：在某些实施方案中，所述纳米粒中，治疗性蛋白：聚阴离子：cpp的质量比为1∶0.5-0.9∶0.1-0.5(例如1∶0.5∶0.1-0.5、1∶0.6∶0.1-0.5、1∶0.7∶0.1-0.5、1∶0.8∶0.1-0.5或1∶0.9∶0.1-0.5，例如1∶0.5-0.9∶0.1、1∶0.5-0.9∶0.2、1∶0.5-0.9∶0.3、1∶0.5-0.9∶0.4或1∶0.5-0.9∶0.5)。进一步地，在某些实施方案中，聚阴离子与cpp的质量之和：治疗性蛋白的质量比为1∶1。在某些实施方案中，聚阴离子：cpp：治疗性蛋白的质量比为0.9∶0.1∶1、0.8∶0.2∶1、0.7∶0.3∶1、0.6∶0.4∶1或0.5∶0.5∶1。本申请还提供了一种微胶囊，所述微胶囊包含壁层，以及包埋在壁层中的本发明的纳米粒，所述壁层包含肠溶材料或主要由肠溶材料组成。本发明中，将负载蛋白类药物的纳米粒制成肠溶微胶囊，可提高纳米粒在胃肠道中的稳定性、提高肠道部位药物释放的特异性、改善药动学行为，从而提高药物在体内的生物利用度、改善体内药效学结果。在某些实施方案中，所述肠溶材料选自纤维素及其衍生物，例如羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯(hpmcp)、邻苯二甲酸乙酸纤维素(cap)、1,2,4-苯三甲酸乙酸纤维素(cat)等。在某些实施方案中，所述肠溶材料为hpmcp。在某些实施方案中，所述微胶囊的粒径为1-10μm(例如1μm-2μm、2μm-3μm、3μm-4μm、4μm-5μm、5μm-6μm、6μm-7μm、7μm-8μm、8μm-9μm或9μm-10μm)。在某些实施方案中，所述微胶囊的形状为球形。在某些实施方案中，所述微胶囊的包封率为30％-95％(例如30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)。本发明中，微胶囊的包封率(ee)可以通过包含以下步骤的方法测得：1)使用荧光标记的治疗性蛋白制得纳米粒，2)将所述纳米粒制成微胶囊，3)将包含所述微胶囊的混悬液置于超滤管中进行离心，得到滤液；4)测定滤液中治疗性蛋白的荧光强度，进而计算滤液中的治疗性蛋白的浓度，以确定游离治疗性蛋白的量。按下式计算包封率(ee)：在一个方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本发明的纳米粒或微胶囊。在某些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗所述纳米粒或微胶囊中包含的治疗性蛋白所能够预防或治疗的疾病。在某些实施方案中，所述治疗性蛋白为胰岛素，所述药物组合物用于预防或治疗受试者中的高血糖症。在某些实施方案中，所述高血糖症包括应激诱发高血糖症、糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)和葡萄糖耐量受损。在某些实施方案中，所述药物组合物包含预防或治疗有效剂量的纳米粒或微胶囊。在某些实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种药用载体。可用于本发明的药用载体包括但不限于填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、泡腾剂、乳化剂、絮凝剂、反絮凝剂、抑菌剂、增溶剂。在某些实施方案中，所述药用载体选自:离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清蛋白)、甘油、山梨酸、山梨酸钾、水、硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜂蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、羊毛脂及其任意组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包含冻干保护剂。在某些实施方案中，所述冻干保护剂为醇类冻干保护剂，例如木糖醇、甘露醇或山梨醇。本发明的药物组合物可被制成各种合适的剂型，包括但不限于：口服剂型、注射剂型(例如适于皮下注射、肌肉注射或静脉注射的剂型)、吸入剂型、粘膜给药剂型或者局部给药剂型。在某些实施方案中，所述药物组合物被制成口服剂型，例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服溶液、口服混悬液、微丸剂或微片剂。在一个方面，本申请提供了本发明的纳米粒或微胶囊用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防或治疗所述纳米粒或微胶囊中包含的治疗性蛋白所能够预防或治疗的疾病。在某些实施方案中，所述治疗性蛋白为胰岛素，所述疾病为高血糖症。在某些实施方案中，所述高血糖症包括应激诱发高血糖症、糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)和葡萄糖耐量受损。在一个方面，本申请提供了一种预防或治疗疾病的方法，包括给有此需要的受试者施用本发明的纳米粒、微胶囊或药物组合物，所述疾病为所述纳米粒、微胶囊或药物组合物中包含的治疗性蛋白所能够预防或治疗的疾病。在某些实施方案中，所述治疗性蛋白为胰岛素，所述疾病为高血糖症。在某些实施方案中，所述高血糖症包括应激诱发高血糖症、糖尿病(包括1型糖尿病和2型糖尿病)和葡萄糖耐量受损。在本申请的实施方案中，所述受试者优选为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物；例如，所述受试者为人。在一个方面，本申请提供了制备本发明纳米粒的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：制备纳米粒a，所述纳米粒a为包含治疗性蛋白和cpp的纳米粒；步骤2：使用聚阴离子对步骤1得到的纳米粒a进行包被。在某些实施方案中，所述步骤1包括：使包含治疗性蛋白的溶液与包含cpp的溶液进行混合。在某些实施方案中，所述步骤1进一步包括以下步骤：步骤1-1：提供包含治疗性蛋白的溶液和包含cpp的溶液；步骤1-2：提供包含涡流混合区域和多个可供流体流向涡流混合区域的通道的装置；步骤1-3：使包含治疗性蛋白的溶液和包含cpp的溶液通过不同的通道到达涡流混合区域中，进行混合，得到包含纳米粒a的混悬液。在某些实施方案中，步骤1-1的包含cpp的溶液具有0.1-0.5mg/ml(例如0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml或0.5mg/ml)的质量浓度。在某些实施方案中，步骤1-1中，包含cpp的溶液：包含治疗性蛋白的溶液的质量浓度比为0.1-0.5∶1(例如0.1∶1、0.2∶1、0.3∶1、0.4∶1或0.5∶1)。在某些实施方案中，所述包含治疗性蛋白的溶液为水溶液。在某些实施方案中，所述包含cpp的溶液为水溶液。本发明中，包含治疗性蛋白的溶液的质量浓度是指所述溶液中的治疗性蛋白的质量浓度。本发明中，包含cpp的溶液的质量浓度是指所述溶液中的cpp的质量浓度。在某些实施方案中，所述步骤1-1还包括：使用酸性溶液(例如盐酸)或碱性溶液(例如氢氧化钠溶液)将所述包含治疗性蛋白的溶液的ph调整至6.5-7.0(例如6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0)。在某些实施方案中，所述步骤1-2中的装置为多入口涡流混合器(multi-inletvortexmixer(mivm))。在某些实施方案中，所述步骤1-3中，包含治疗性蛋白的溶液，以及包含cpp的溶液在通道中以相同的流速匀速流动。在某些实施方案中，所述流速为1-50ml/min(例如1-15ml/min、15-25ml/min或25-50ml/min)。在某些实施方案中，步骤1制备的纳米粒a具有窄的粒径和/或均一的粒径分布。在某些实施方案中，所述纳米粒a的粒径为30nm-500nm(例如30nm-100nm、100-200nm、200-300nm、300-400nm或400-500nm)。在某些实施方案中，所述纳米粒a的粒径的多分散指数(pdi)为0.1-0.5(例如0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4或0.4-0.5)。在某些实施方案中，步骤1制备的纳米粒a呈电正性。在某些实施方案中，所述纳米粒a的zeta电位为+10mv至+50mv(例如+10mv至+20mv、+20mv至+30mv、+30mv至+40mv或+40mv至+50mv)。在某些实施方案中，步骤1制备的纳米粒a具有较高的包封率和/或载药量。在某些实施方案中，所述纳米粒a的包封率为90％-99％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。在某些实施方案中，所述纳米粒a的载药量为60％-90％(例如60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％或85％-90％)。本发明中，纳米粒a的包封率(ee)和载药量(lc)可以通过包含以下步骤的方法测得：1)使用荧光标记的治疗性蛋白制得纳米粒a；2)将包含所述纳米粒a的混悬液置于超滤管中进行离心，得到滤液；3)测定滤液中治疗性蛋白的荧光强度，进而计算滤液中的治疗性蛋白的浓度，以确定游离治疗性蛋白的量。按下式计算包封率(ee)和载药量(lc)：在某些实施方案中，所述步骤2包括：使包含聚阴离子的溶液与包含纳米粒a的混悬液进行混合。在某些实施方案中，所述步骤2进一步包括以下步骤：步骤2-1：提供包含聚阴离子的溶液和包含纳米粒a的混悬液；步骤2-2：提供包含涡流混合区域和多个可供流体流向涡流混合区域的通道的装置；步骤2-3：使包含聚阴离子的溶液和包含纳米粒a的混悬液通过不同的通道到达涡流混合区域中，进行混合，得到包含本发明纳米粒的混悬液。在某些实施方案中，步骤2-1中的包含纳米粒a的混悬液由包含步骤1-1、步骤1-2和步骤1-3的方法得到。在某些实施方案中，步骤2-1的包含聚阴离子的溶液具有0.5-0.9mg/ml(例如0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml或0.9mg/ml)的质量浓度。在某些实施方案中，步骤2-1中，包含聚阴离子的溶液：包含纳米粒a的混悬液的质量浓度比为0.5-0.9∶1(例如0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1或0.9∶1)。在某些实施方案中，所述包含聚阴离子的溶液为水溶液。在某些实施方案中，所述包含纳米粒a的混悬液中，分散介质为水。本发明中，包含聚阴离子的溶液的质量浓度是指所述溶液中的聚阴离子的质量浓度。本发明中，包含纳米粒a的混悬液的质量浓度是指所述混悬液中的纳米粒a所含有的治疗性蛋白的质量浓度。在某些实施方案中，所述步骤2-2中的装置为多入口涡流混合器。在某些实施方案中，所述步骤2-3中，包含聚阴离子的溶液，以及包含纳米粒a的混悬液在通道中以相同的流速匀速流动、。在某些实施方案中，所述流速为1-50ml/min(例如1-15ml/min、15-25ml/min或25-50ml/min)。本申请还提供了制备本发明微胶囊的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1’：制备本发明的纳米粒；步骤2’：使用肠溶材料对步骤1’得到的纳米粒进行包被。在某些实施方案中，步骤1’包括：以如上所述的制备方法制备本发明的纳米粒。在某些实施方案中，所述步骤2’进一步包括以下步骤：步骤2’-1：提供包含本发明纳米粒的混悬液和包含肠溶材料的溶液；步骤2’-2：提供包含涡流混合区域和多个可供流体流向涡流混合区域的通道的装置；步骤2’-3：使包含本发明纳米粒的混悬液、包含肠溶材料的溶液和任选的酸性溶液(例如盐酸)通过不同的通道到达涡流混合区域中，进行混合，得到包含本发明微胶囊的溶液。在某些实施方案中，步骤2’-1的包含肠溶材料的溶液具有0.25-1mg·ml-1(例如0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml、0.7mg/ml、0.75mg/ml、0.8mg/ml、0.85mg/ml、0.9mg/ml、0.95mg/ml或1mg/ml)的质量浓度。在某些实施方案中，步骤2’-1中，包含肠溶材料的溶液：包含本发明纳米粒的混悬液的质量浓度比为0.25-1∶1(例如0.25∶1、0.3∶1、0.35∶1、0.4∶1、0.45∶1、0.5∶1、0.55∶1、0.6∶1、0.65∶1、0.7∶1、0.75∶1、0.8∶1、0.85∶1、0.9∶1、0.95∶1或1∶1)。在某些实施方案中，所述包含肠溶材料的溶液为水溶液。在某些实施方案中，所述包含本发明纳米粒的混悬液中，分散介质为水。本发明中，包含肠溶材料的溶液的质量浓度是指所述溶液中的肠溶材料的质量浓度。本发明中，包含本发明纳米粒的混悬液的质量浓度是指所述混悬液中的本发明的纳米粒所含有的治疗性蛋白的质量浓度。在某些实施方案中，所述步骤2’-2中的装置为多入口涡流混合器。在某些实施方案中，所述步骤2’-3中，包含肠溶材料的溶液，以及包含本发明纳米粒的混悬液在通道中以相同的流速匀速流动。在某些实施方案中，所述流速为1-50ml/min(例如1-15ml/min、15-25ml/min或25-50ml/min)。图1示例性地显示了制备本发明纳米粒和微胶囊的过程，其中，用于制备纳米粒的治疗性蛋白为胰岛素，聚阴离子为透明质酸(ha)，用于制备微胶囊的肠溶材料为hpmcp。制备过程如下：第一步，将cpp溶液与胰岛素溶液在多入口涡流混合器中进行混合，形成表面带正电的纳米粒a(np-a)；第二步，将包含np-a的混悬液与包含ha的溶液进行混合，形成以np-a为核心，表面包被ha的纳米粒(np-b)；第三步，将包含np-b的混悬液、包含hpmcp的溶液和ph为2.5的稀盐酸混合，使hpmcp包被在纳米粒上，得到肠溶微胶囊。各步骤中，使用多入口涡流混合器对液体进行快速混合。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中使用的，术语“治疗性蛋白”是指能够用于预防或治疗疾病的蛋白，包括但不限于激素、激素类似物、酶、酶抑制剂和抗体。如本文中使用的，术语“细胞穿透肽”(cellpenetratingpeptide,cpp)是指由一般不超过30个氨基酸构建的短肽，其可以穿过细胞膜进入细胞，可以用来将外源性分子携带进入细胞。细胞穿透肽可以是天然存在的肽或人工合成的肽。常见的细胞穿透肽包括：阳离子cpp，例如：tat(48-60)、penetratin、聚精氨酸、oct4、wt1-ptj、dpv3；两亲性cpp，例如：transportan、map、vp22、pep1、kw；疏水性cpp，例如：kfgf、fgf12、integrinβ3peptide、c105y、tp2。常见的细胞穿透肽的来源和序列可参见，例如joshuad.ramsey,nicholash.flynn.cell-penetratingpeptidestransporttherapeuticsintocells,pharmacology&therapeutics154(2015)78–86。可以对细胞穿透肽进行修饰，例如，在cpp的c端或n端进行修饰(例如烷基化修饰)。如本文中使用的，术语“饱和脂肪酸”是指至少一端含有羧基的饱和碳氢链，其中，所述饱和碳氢链多为直链，碳原子数可以是小于6个、6-12个或大于12个(例如12-18个)。饱和脂肪酸的实例包括但不限于：己酸、辛酸、癸酸、月桂酸(十二烷酸)、豆蔻酸(十四烷酸)、软脂酸(十六烷酸)、硬脂酸(十八烷酸)、花生酸(二十烷酸)。如本文中使用的，术语“纳米粒”是指尺寸(即颗粒的最长维度中的直径)在纳米级的颗粒，例如尺寸为1-100nm、100-500nm、500-1000nm或1000-2000nm的颗粒。如本文中使用的，术语“粒径”即“等效粒径”，是指当被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或组合)最相近时，就把该球体的直径(或组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒度分布)。如本文中使用的，术语“平均粒径”是指，对于一个由大小和形状不相同的粒子组成的实际粒子群，与一个由均一的球形粒子组成的假想粒子群相比，如果两者的粒径全长相同，则称此球形粒子的直径为实际粒子群的平均粒径。平均粒径的测量方法是本领域技术人员已知的，例如光散射法；平均粒径的测量仪器包括但不限于马尔文粒径仪。如本文中使用的，术语“微胶囊”是指一种固体微粒，其具有壁层，以及包埋在壁层中的内容物。构成壁层的物质通常为高分子。微胶囊可以是各种形状，例如球形，其直径通常在微米级或毫米级。如本文中使用的，术语“肠溶微胶囊”是指以肠溶材料作为壁层的主要材料制得的微胶囊，其能够耐受胃酸，在进入肠道后能够崩解并释放出内容物。如本文中使用的，术语“肠溶材料”是指在胃液中不溶或几乎不溶，而在肠液中能崩解或溶解的材料。肠溶材料的溶解度随ph不同而不同。可用于本发明的肠溶材料包括但不限于纤维素及其衍生物，例如羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯(hpmcp)、邻苯二甲酸乙酸纤维素(cap)、1,2,4-苯三甲酸乙酸纤维素(cat)等。如本文中使用的，术语“混悬液”是指固体微粒分散于液体分散介质中形成的液态分散体系，所述液体分散介质包括但不限于水。如本文中使用的，术语“约”应该被本领域技术人员理解，并将随其所用之处的上下文而有一定程度的变化。如果根据术语应用的上下文，对于本领域技术人员而言，其含义不是清楚的，那么“约”的意思是偏差不超过所述特定数值或范围的正负10％。如本文中使用的，术语“预防”是指阻止或延迟疾病的发生。如本文中使用的，术语“治疗”是指治愈或至少部分阻止疾病的进展，或缓解疾病的症状。发明的有益效果本发明得到了一种负载治疗性蛋白的纳米粒，其具有核壳结构，其中，核心包含负载治疗性蛋白的cpp，壳层包含聚阴离子。本发明的纳米粒实现了较高的黏液层渗透率和肠上皮细胞转运效率，最终提高了治疗性蛋白的口服生物利用度和药效。进一步地，包含本发明纳米粒的微胶囊可在胃酸中保护纳米粒、而在肠道中快速释药，药效持续平稳。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是，本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明图1示例性地显示了制备本发明纳米粒和微胶囊的过程，其中，用于制备纳米粒的治疗性蛋白为胰岛素，聚阴离子为透明质酸(ha)，用于制备微胶囊的肠溶材料为hpmcp。制备过程如下：第一步，将cpp溶液与胰岛素溶液在多入口涡流混合器中进行混合，形成表面带正电的纳米粒a(np-a)；第二步，将包含np-a的混悬液与包含ha的溶液进行混合，形成以np-a为核心，表面包被ha的纳米粒(np-b)；第三步，将包含np-b的混悬液、包含hpmcp的溶液和ph为2.5的稀盐酸混合，使hpmcp包被在纳米粒上，得到肠溶微胶囊。各步骤中，使用多入口涡流混合器对液体进行快速混合。图2显示了实施例1的制备纳米粒的过程中，流速1以及cpp溶液的初始ph值对np-a粒径大小、分散度和/或表面电位的影响，图中数据为平均值±sd(n＝6)。图2a)显示了流速1为50ml·min-1的条件下，不同初始ph值的cpp溶液制得的np-a的粒径大小(■)、分散度(▲)及表面电位(▼)。结果表明，在ph为5.0～8.0的范围内，随着cpp溶液初始ph值的升高，np-a的粒径和表面电位均降低。图2b)显示了在cpp溶液初始ph值为8.0的条件下，不同流速1下制得的np-a的粒径(■)和分散度(▲)。如图所示，在流速1为1～50ml·min-1范围内，通过调控流速，可将np-a的粒径控制在约75nm至约480nm范围内，分散度控制在0.12～0.45范围内；且随着流速的增加，np-a的粒径和分散度急剧减小，并在流速增至30ml·min-1后达到一个平台期。图3显示了不同流速2下制得的np-b3的粒径(■)和分散度(▲)，所使用的np-a是在cpp溶液的初始ph为8.0，流速1为50ml·min-1的条件下制得的。如图所示，随着流速的提高，np-b的粒径从约219nm降至约105nm，分散度从0.46降至0.067。图4显示了表1中np-a、np-b1、np-b2、np-b3的形貌。图中，所有纳米粒均为近似球形，粒径均一且分散均匀。由于使用磷钨酸染色，显深色部位应为带正电的细胞穿透肽的富集区域。图a1-a3为np-a的图像，标尺分别为1μm、200nm、100nm。可以清楚地看到，绝大多数的细胞穿透肽位于np-a的表面，形成蓬松的薄层。图a4-a6分别为np-b1、np-b2、np-b3的图像，标尺均为200nm。如图所示，经ha包被后，在纳米核心表面出现可见的浅灰色层，表明纳米核心表面成功地包被上了ha，形成了壳核结构。此外，ha对纳米核心表面进行包被后，内部的纳米核心结构变得更加致密，说明对纳米核心的表面进行包被，可以压实其内部结构，使整个纳米粒的结构更加稳定。图5显示了fret实验的测试结果。单荧光标记的纳米粒(rho123-ha/(cpp/insulin)和ha/(cpp/ritc-insulin))在450nm激发光激发后，可分别在530nm、580nm处观察到各自的发射峰。然而，对于双荧光标记制备的纳米粒(rho123-ha/(cpp/ritc-insulin))，经450nm的激发光激发后，rho123-ha的发射峰(530nm)明显降低，而ritc-insulin的发射峰(580nm)显著增高，意味着能量从供体转移到受体上，表明ha成功包被在载有胰岛素的纳米核心上。图6显示了表1中的np-a和np-b3在低温(4℃)或常温(25℃)，下的粒径和粒径分布。图中数据为平均值±sd(n＝6)。np-a在25℃条件下可稳定存在9h，9h后粒径、分散度明显增加。经ha包被后，纳米粒的稳定性显著提高，粒径和分散度在48h内几乎不变。低温条件下，np-a和np-b3的纳米粒的稳定性较高，粒径、pdi值无显著变化。以上结果表明，纳米核心经亲水性的ha包被后，稳定性显著提高。图7显示了np-a、np-b1、np-b2、np-b3在模拟胃液(ph2.5)和模拟肠液(ph7.0)中的胰岛素损失百分率。如图所示，np-a在模拟胃液(1h)及模拟小肠液(2h)中，胰岛素损失量分别高达24％和21％。经ha的包被后，可显著减少胰岛素损失。上述结果表明，ha的包被可提高纳米粒的稳定性，减少胃肠道消化液对纳米粒的破坏，且ha分子量越高，保护效果越好。图8显示了np-a和np-b3在ph值为7.4的含有透明质酸酶(0.01mg/ml)的pbs中的胰岛素释放曲线，以及np-a和np-b3在ph值为7.4的不含透明质酸酶的pbs中的胰岛素释放曲线。如图所示，无论有无透明质酸酶的存在，np-a释放胰岛素的速率始终是最快，在最初2h内存在明显的突释现象(累积释放率为45％)。经ha表面包被后，释放胰岛素的速率减缓，而且释放胰岛素的速率随着表面ha分子量的增加而降低。图9显示了实施例9中，纳米粒与不同浓度的粘蛋白溶液在37℃下共同孵育1h后，形成的聚集物沉淀中的胰岛素含量。将np-a与0.5％的粘蛋白得到的聚集物沉淀的荧光强度作为对照并归一化；#表示与其他0.5％粘蛋白组相比，p＜0.01；*表示与其他1.0％粘蛋白组相比，p＜0.001。图中数据为平均值±sd(n＝6)。在无粘蛋白存在时，各纳米粒孵育后所得沉淀中的胰岛素含量极低。然而，与浓度为0.5％或1.0％的粘蛋白在37℃孵育1h后，np-a与粘蛋白发生了严重聚集，离心所得沉淀中的胰岛素含量高，表明表面带强正电的np-a易通过静电作用与带负电的粘蛋白络合成聚集体；经ha表面包被后，纳米粒与粘蛋白的相互作用明显减弱，聚集体形成的量显著减少，随着ha分子量的增加，抗粘蛋白吸附效果越显著。np-b3分别与浓度为0.5％和1.0％的粘蛋白共孵育后，沉淀中的胰岛素量仅是np-a组的16.5％和22.9％。图10显示了np-a、np-b1、np-b2、np-b3对ht29-mtx细胞的毒性，如图所示，纳米粒对ht29-mtx均没有明显的细胞毒性，安全性较好。图11为实施例11中的共聚焦显微镜照片，显示了游离胰岛素(图11a)、np-a(图11b)、np-b1(图11c)、np-b2(图11d)、np-b3(图11e)在黏液层中的渗透情况，以及在穿透黏液层的过程中核心结构的完整性。图中的标尺为10μm，绿色为fitc-cpp，红色为cy-5-胰岛素，蓝色为dipa染色的细胞核。如图所示，对于游离胰岛素，将其溶液与细胞孵育3h后，胰岛素总体荧光强度明显小于各纳米粒组，且多数滞留在黏液层中(参见15μm处的照片)，最终能够穿过黏液层到达细胞表面(参见30μm处的照片)的量很少。对于np-a组，纳米粒在黏液层中渗透的初期就形成大量的粘蛋白-纳米粒聚集体，难以向下穿行而在原位滞留(参见0μm处的照片)，但与胰岛素溶液相比，在到达细胞层面的荧光强度有所提高。对于np-b，随着ha分子量的增大，纳米粒在黏液层中的滞留量逐渐减少，到达细胞表面的信号逐渐增强。此外，从图中可以清晰地看到，np-a及np-b1～3在穿过黏液层到达上皮细胞顶端时，纳米核心中的细胞穿透肽(绿色)和胰岛素(红色)信号几乎完全共定位，说明在纳米粒自上而下的渗透过程中，黏液层的存在对纳米核心的结构完整性没有明显影响。图12显示了实施例12中，ht29-mtx细胞对游离胰岛素和各组纳米粒的相对摄取量，图中，数据为平均值±sd(n＝6)。如图所示，各纳米粒组的摄取量显著高于游离胰岛素组。纳米粒按照摄取量由低到高的排序为：np-a＜np-b1＜np-b2＜np-b3。np-b3的细胞摄取量最高，分别是游离胰岛素和np-a组的11倍、1.9倍。图13显示了实施例13中，游离胰岛素组和纳米粒在caco-2/mucin模型中的表观渗透常数(papp)。δ代表p＜0.01；*代表p＜0.001。图中数据为平均值±sd(n＝6)。与游离胰岛素溶液相比，各纳米粒组的papp值均明显更高，np-b的papp值较np-a有所增加，且随着ha分子量的增加，papp增加，说明随着ha分子量越高，转运量越高。图14为实施例14中，各组小鼠空肠组织横截面的荧光共聚焦显微照片，图中，游离胰岛素和各纳米粒呈红色(cy-5的荧光颜色)，组织中的黏液层呈绿色(wga-647的荧光颜色)，细胞核呈蓝色(dapi的颜色)。图中的标尺为50μm。如图所示，对于口服游离胰岛素溶液组，仅在小肠绒毛及上方的黏液层中观察到少量的胰岛素荧光(红色信号)，证明口服胰岛素溶液很难达到有效的药物吸收。对于口服np-a组，观察到位于黏液层中的胰岛素荧光很强，而下方的小肠绒毛内的荧光很弱，说明多数np-a在黏液层滞留，能够渗透过黏液层、进而被肠上皮细胞吸收的量较少。与之相比，np-b1、np-b2、np-b3的黏液穿透能力及被小肠上皮细胞吸收转运的效率明显提高。其中，np-b3在小肠绒毛中的信号最强，且荧光多位于绒毛毛细血管存在的部位，表明np-b3可被上皮细胞有效吸收并转运到血液循环。上述结果证明，相对于表面带正电且未经修饰的纳米核心，经ha包被后的纳米粒的抗黏液层滞留并快速向下渗透转运的能力显著增强，进而使体内胰岛素的小肠吸收效率提高。图15显示了实施例15-试验1中，各组大鼠给药后的血糖水平随时间的变化。图中，#代表相对于np-b1组，p＜0.05；*代表相对于np-b2组，p＜0.05。图中数据为平均值±sd(n＝8)。如图所示，给药八小时内，口服去离子水的大鼠的血糖水平稍有降低。皮下注射组的血糖水平在1h内急剧下降至初始水平的25％，在接下来的4h内血糖都一直保持在较低水平。相比之下，给予纳米粒的大鼠的血糖水平在给药后的8h内均显著但缓慢降低。np-a、np-b1和np-b2纳米粒在口服给药后，在给药初期(0～5h)的降血糖效果并无明显差异。在5～8h期间，np-b2的降血糖效果比np-a和np-b1更为明显，可将血糖值降低至初始值的45％。np-b3组的体内降血糖效果最为显著和持久，8h内可将血糖水平缓慢平稳地降低至初始值的40％。图16显示了实施例15-试验2中，各组大鼠给药后的血糖水平随时间的变化。图中，*代表相对于np-b1微胶囊组，p＜0.05；#代表相对于np-b2微胶囊组，p＜0.05。图中数据为平均值±sd(n＝6)。如图所示，经口服给药后，np-b1和np-b2微胶囊组的降血糖效果明显。这两组大鼠在口服给药后，血糖水平一直持续平稳地下降，大鼠的血糖值在给药8h后分别降低至初始水平的50％和40％。np-b3微胶囊组的体内降血糖效果极其显著，可以使大鼠血糖在8h内平缓持久地降低至初始值的20％，此时，糖尿病大鼠的血糖水平达到正常范围(3.5～5mm)。图17显示了实施例16中，各组大鼠体内血清胰岛素浓度随时间的变化曲线。图中数据为平均值±sd(n＝6)。如图所示，皮下注射给予胰岛素溶液(5iu·kg-1)后，大鼠血清中胰岛素浓度急剧增加，并于1h达到峰值(～120miu·l-1)。np-b2微胶囊和np-b3微胶囊经口服给药后，大鼠血清胰岛素水平缓慢上升，达峰时间为4h。经计算，np-b1微胶囊、np-b2微胶囊和np-b3微胶囊的相对生物利用度分别为5.3％、7.4％和11％。图18显示了实施例17中，各组大鼠血清中的alp、ast、alt、γ-gt含量。图中数据为平均值±sd(n＝6)。与阴性对照组(口服pbs的正常大鼠)和阳性对照组(口服pbs的模型大鼠)相比，口服胰岛素纳米粒或胰岛素纳米粒肠溶微胶囊后，模型动物体内的四种肝药酶(alp、ast、alt、γ-gt)的活性没有明显升高，表明口服递送本发明的纳米粒及其肠溶微胶囊在动物体内没有明显毒性。图19显示了实施例17中，各组大鼠肝脏组织he染色切片的显微照片，a1：口服pbs的正常大鼠；a2：口服pbs的模型大鼠；a3：口服np-b3的模型大鼠；a4：口服hpmcp包被的np-b3的模型大鼠。与对照组大鼠的情况相似，实验组大鼠的肝脏结构完整，肝细胞排列较整齐，说明本发明的纳米粒及其肠溶微胶囊在多剂量重复口服给药后，未引起明显的肝损伤。序列信息本发明涉及的序列的信息提供于下表中：序列号(seqidno:)描述1penetratin的氨基酸序列序列信息序列1(seqidno:1):16aarqikiwfqnrrmkwkk具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。材料异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明异硫氰酸酯(ritc)、罗丹明123(rho123)购自上海阿拉丁生化科技有限公司；cy5购自武汉little-pasciences有限公司；(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)购自上海阿拉丁试剂有限公司；cpp(ste-rqikiwfqnrrmkwkk，n端修饰正十八烷基的penetratin)购自南京肽业生物科技有限公司，货号：njp12879；粘蛋白、透明质酸酶(haase)购自上海原叶生物有限公司；透明质酸钠(mw分别为4.7kda、35kda、190kda)购自山东华熙福瑞达生物医药有限公司；猪胰岛素(27.4iu/mg)购自江苏徐州万邦生物制药有限责任公司；dapi、mtt以及alexa647小麦胚芽凝集素配合物(af-647)购自英国abcam公司；猪胰岛素elisa试剂盒购自瑞典mercodia公司；碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)试剂盒、天冬氨酸转氨酶(aspartatetransaminase,ast)试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,alt)试剂盒、γ-谷氨酰转肽酶(glutamyltranspeptidase,γ-gt)试剂盒购自江苏南京建成生物科技有限公司；hpmcp(密度＝42.0cp·s)购自浙江绍兴市康可胶囊有限公司；其余所有试剂均为商购的分析纯试剂。仪器马尔文激光粒度测定仪(malvernzetasizernanozs，英国malvern公司)；冷冻干燥机(alpha1-2ldplus，德国christ公司)；ph计(sevencompactphmeter，瑞士mettler公司)；自动双重纯水蒸馏器(美国millipore公司)；高速离心机(5810r，德国eppendorf公司)；紫外可见分光光度计(evolution，美国thermo公司)；荧光分光光谱仪(fs-980,英国edinburgh公司)；激光共聚焦显微镜(sp8，德国leica公司)；tem(jeol-1400，日本jeol公司)；多功能酶标仪(synergy2，美国biotek公司)；细胞培养箱(formatmsteri-cycletm，美国thermo公司)；血糖仪(ultravue,美国johnson公司)。统计分析所有数值均表示为平均数±标准差。采用graphpadprismversion5.0(graphpadsoftware，usa)进行单因素anova或t检验评价，p＜0.05表示统计学显著差异。实施例1ha包被的cpp-胰岛素纳米粒及肠溶微胶囊的制备1、配制溶液：将细胞穿透肽粉末溶于双蒸水中，配制成浓度为0.3mg·ml-1的溶液，并用3m的氢氧化钠溶液调至所需ph值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0)。胰岛素粉末用0.01m的稀盐酸溶液溶解，配制成浓度为1mg·ml-1的溶液，并用3m的氢氧化钠溶液将ph值调过其pi，并缓慢调至6.8，使其再次形成透明澄清的均一溶液。三种不同分子量的透明质酸钠(mw＝4.7kda、35kda或190kda)粉末用双蒸水制备成浓度分别为0.28、0.30、0.70mg·ml-1的溶液。2、制备cpp-胰岛素纳米核心(纳米粒a)：将细胞穿透肽溶液从多入口涡流混合器的入口2、3注入，胰岛素溶液从入口1、4注入，保持各溶液的流速一致(流速1)，得到包含纳米粒a(np-a)的混悬液。制备ha包被的cpp-胰岛素纳米粒：将得到的含np-a的混悬液从入口1、2、3注入，ha溶液从入口4注入，保持各溶液的流速一致(流速2)，得到混悬液，其中含有表面包被ha的cpp-胰岛素纳米粒(np-b)。使用三种不同分子量的ha(mw＝4.7kda、35kda、190kda)，制得的纳米粒分别命名为np-b1、np-b2、np-b3。3、制备肠溶微胶囊：从多入口涡流混合器的入口1注入包含np-b的混悬液，入口2注入hpmcp的乙醇溶液(浓度为0.75mg·ml-1)，入口3、4注入稀盐酸(ph2.5)，得到包含肠溶微胶囊的混悬液。图1示例性地显示了上述制备过程。实施例2荧光标记的纳米粒的制备1、荧光标记组分的合成(1)异硫氰酸荧光素标记的细胞穿透肽(fitc-cpp)的制备将400mg细胞穿透肽溶于40ml0.05m碳酸盐缓冲液(配制：1.59gna2co3、2.93gnahco3加至1l双蒸水中，ph9.6)中，10mgfitc溶于1.5ml的甲醇，将fitc的甲醇溶液与细胞穿透肽溶液混合后，于4℃、温和搅拌下避光反应24h。反应完毕后，用截留分子量为1.0kda的透析袋在去离子水中对样品进行透析，全程避光，吸取透析袋外侧的透析介质，监测其荧光值，直至游离染料透析完毕。冻干后避光保存备用。(2)罗丹明异硫氰酸酯标记的胰岛素(ritc-胰岛素)及cy5标记的胰岛素(cy5-胰岛素)的制备称取400mg胰岛素，以0.05m碳酸盐缓冲液(1.59gna2co3、2.93gnahco3加至1l双蒸水中，ph9.6)中配制5mg·ml-1的胰岛素溶液，加入5ml浓度为2mg·ml-1的ritc甲醇溶液，于4℃、避光反应24h。反应液于4℃透析(透析袋的截留分子量为3.5kda，透析介质为ph3.0的盐酸溶液)。监测到透析介质中无ritc荧光信号，即可认为透析彻底，冻干即得ritc-胰岛素粉末。cy5-胰岛素的标记方法同上，除了将ritc的甲醇溶液换成cy5的水溶液。(3)罗丹明123标记的透明质酸(rho123-ha)的制备称取200mg190kda的透明质酸钠，溶于20ml甲醇与水(1∶1，v/v)的混合溶剂中，充分溶解后，加入95.6mgedc·hcl，57.4mgnhs，调ph至5.0，反应2h后，加入40mg罗丹明123，调ph至6.0，过夜反应24h，用截留分子量为14kda的透析袋在去离子水中进行透析，定时吸取透析袋外侧的透析介质，监测荧光值，判断游离染料是否透析完毕。透析结束后，冻干成粉末，避光保存，备用。(4)罗丹明异硫氰酸酯标记的透明质酸(ritc-ha)的制备称取200mg190kda的透明质酸钠，溶于20ml甲醇与水(1∶1，v/v)混合溶剂中，充分溶解后，加入40mgritc的甲醇溶液，过夜反应24h，用截留分子量为14kda的透析袋在去离子水中进行透析，定时吸取透析袋外侧的透析介质，监测荧光值，判断游离染料是否透析完毕。透析结束后，冻干成粉末，避光保存，备用。2、按照实施例1描述的过程，使用荧光标记的原料制备纳米粒，制备条件：细胞穿透肽溶液初始ph值为8.0，流速1和流速2均为50ml·min-1。实施例3粒径、粒子分散性和表面电位的测定采用马尔文激光粒度测定仪测定纳米粒的粒径、分散度和表面电位。测定方法如下：1)直接对制备好的包含纳米粒的混悬液进行测定；2)将混悬液用截留分子量为100kda的超滤管于300×g的转速下进行超滤，浓缩液用0.01m的磷酸盐缓冲液(pbs，ph6.6)重悬，再进行后续测定。将样品放入样品池中，于25℃平衡120s后，进行测定。每一样品平行测定三次。图2a)显示了流速1为50ml·min-1的条件下，不同初始ph值的cpp溶液制得的np-a的粒径大小(■)、分散度(▲)及表面电位(▼)。结果表明，在ph为5.0～8.0的范围内，随着cpp溶液初始ph值的升高，np-a的粒径和表面电位均降低。上述结果表明，本发明的方法可以通过调节cpp溶液的初始ph值得到不同粒径和表面电位的np-a。图2b)显示了在cpp溶液初始ph值为8.0的条件下，不同流速1下制得的np-a的粒径(■)和分散度(▲)。如图所示，在流速1为1～50ml·min-1范围内，通过调控流速，可将np-a的粒径控制在约75nm至约480nm范围内，分散度控制在0.12～0.45范围内；且随着流速的增加，np-a的粒径和分散度急剧减小，并在流速增至30ml·min-1后达到一个平台期。上述结果表明，本发明的方法可以通过调节流速得到不同粒径和分散度的np-a。图3显示了不同流速2下制得的np-b3的粒径(■)和分散度(▲)，所使用的np-a是在cpp溶液的初始ph为8.0，流速1为50ml·min-1的条件下制得的。如图所示，随着流速的提高，np-b的粒径从约219nm降至约105nm，分散度从0.46降至0.067。上述结果表明，本发明的方法可以通过调节流速得到不同粒径和分散度的np-b。在cpp溶液的初始ph为8.0，流速1和2均为50ml·min-1的条件下，制备np-a和np-b，其粒径、粒子分散性和表面电位如表1所示。表1如表1所示，在cpp溶液的初始ph为8.0，流速1和2均为50ml·min-1的条件下，制得的np-a的粒径小(～75nm)，分布窄(pdi:～0.12)，表面带正电(～+22mv)。经不同分子量的ha包被后，粒径增大(～100nm)，表面呈现负电性(～-20mv)。电荷的反转表明，ha成功包被于np-a表面。经ha包被后，纳米粒的粒径分布仍较为均匀(pdi:～0.1)。实施例4包封率和载药量的测定按照实施例2的方法，使用ritc-胰岛素制得np-a，并进一步得到包含np-b的混悬液。将包含np-b的混悬液置于超滤管(截留分子量为100kda)中，于4℃、300×g离心20min。用多功能酶标仪测定滤液中胰岛素的荧光强度，进而计算滤液中的胰岛素浓度，以确定游离胰岛素量。按下式计算纳米粒的包封率(encapsulationefficiency，ee)和载药量(loadingcontent，lc)：测定结果如表2所示。表2样品ha(mw)ee(％)lc(％)np-a—93.9±1.675.8±0.3np-b14.7kda95.6±2.455.5±0.6np-b235kda97.3±1.866.1±0.4np-b3190kda96.6±1.766.7±0.5如图所示，各纳米粒的包封率均在90％以上，载药量在55％以上。此外，np-b3纳米粒的总产量可达到6.6g·h-1，相当于约4.5g·h-1的胰岛素产量(由纳米粒的总产量乘以载药量算得)，表明本发明的方法可应用于胰岛素纳米粒的连续和规模化的生产。实施例5纳米粒微观形态的观察采用透射电镜观察纳米粒的形貌。取含有纳米粒的混悬液，滴在覆有碳支持膜的200目铜网上，停留20min，用滤纸吸去多余的液体，滴加2％的磷钨酸溶液染色2min，再用滤纸吸去多余的磷钨酸溶液，自然晾干，用透射电镜观察并拍照。图4显示了表1中np-a、np-b1、np-b2、np-b3的形貌。图中，所有纳米粒均为近似球形，粒径均一且分散均匀。由于使用磷钨酸染色，显深色部位应为带正电的细胞穿透肽的富集区域。图a1-a3为np-a的图像，标尺分别为1μm、200nm、100nm。可以清楚地看到，绝大多数的细胞穿透肽位于np-a的表面，形成蓬松的薄层。图a4-a6分别为np-b1、np-b2、np-b3的图像，标尺均为200nm。如图所示，经ha包被后，在纳米核心表面出现可见的浅灰色层，表明纳米核心表面成功地包被上了ha，形成了壳核结构。此外，ha对纳米核心表面进行包被后，内部的纳米核心结构变得更加致密，说明对纳米核心的表面进行包被，可以压实其内部结构，使整个纳米粒的结构更加稳定。实施例6fret实验考察胰岛素纳米粒的结构本实施例采用荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,fret)技术，确认透明质酸与胰岛素的相互作用。根据实施例2的方法，使用rho123(ex：490nm，em：530nm)标记的ha，和ritc(ex：540nm，em：580nm)标记的胰岛素，制备双荧光标记的纳米粒np-b3，形成荧光共振能量对。以单独标记rho123的透明质酸或单独标记ritc的胰岛素制备而成的纳米粒作为对照，在450nm的激发波长下测定各样品荧光光谱的变化。测试结果如图5所示。单荧光标记的纳米粒(rho123-ha/(cpp/insulin)和ha/(cpp/ritc-insulin))在450nm激发光激发后，可分别在530nm、580nm处观察到各自的发射峰。然而，对于双荧光标记制备的纳米粒(rho123-ha/(cpp/ritc-insulin))，经450nm的激发光激发后，rho123-ha的发射峰(530nm)明显降低，而ritc-insulin的发射峰(580nm)显著增高，意味着能量从供体转移到受体上，表明ha成功包被在载有胰岛素的纳米核心上。实施例7纳米粒的贮存稳定性及在模拟胃肠液中的稳定性将表1中的np-a和np-b3放置于低温(4℃)或常温(25℃)，在特定的时间点(1、3、6、9、12、18、24、48h)监测纳米粒的粒径和粒径分布，初步评价纳米粒在短期贮存过程中的稳定性。如图6所示，np-a在25℃条件下可稳定存在9h，9h后粒径、分散度明显增加。经ha包被后，纳米粒的稳定性显著提高，粒径和分散度在48h内几乎不变。低温条件下，np-a和np-b3的纳米粒的稳定性较高，粒径、pdi值无显著变化。以上结果表明，纳米核心经亲水性的ha包被后，稳定性显著提高。按照实施例2的方法，使用ritc-胰岛素制备np-a、np-b1、np-b2和np-b3，分散于模拟胃液(稀盐酸溶液，ph2.5)和模拟肠液(0.01mpbs，ph7.0，含有透明质酸酶0.01mg·ml-1)中，分别于1h、2h后用超滤管(截留分子量为100kda)超滤，用多功能酶标仪测定滤液中的荧光强度(ex：540nm，em：580nm)，从而计算胰岛素含量，得出胰岛素损失百分率，考察纳米粒在模拟胃液及肠液中的药物损失情况。图7显示了np-a、np-b1、np-b2、np-b3在模拟胃液(ph2.5)和模拟肠液(ph7.0)中的胰岛素损失百分率。如图所示，np-a在模拟胃液(1h)及模拟小肠液(2h)中，胰岛素损失量分别高达24％和21％。经ha的包被后，可显著减少胰岛素损失。上述结果表明，ha的包被可提高纳米粒的稳定性，减少胃肠道消化液对纳米粒的破坏，且ha分子量越高，保护效果越好。实施例8体外释放实验按照实施例2的方法，使用ritc-胰岛素制备np-a和np-b3。将纳米粒分散于含有透明质酸酶(0.01mg·ml-1)的ph7.4的pbs中，37℃，100rpm恒温振荡。定时取样，超滤(截留分子量为100kda)，采用多功能酶标仪测定滤液的荧光强度(ex：540nm，em：580nm)，进而计算出胰岛素含量，得出累积药物释放百分率。同时，将纳米粒分散于不含有透明质酸酶的分散介质中进行体外释放研究，用作对照实验。图8显示了np-a和np-b3在ph值为7.4的含有透明质酸酶(0.01mg/ml)的pbs中的胰岛素释放曲线，以及np-a和np-b3在ph值为7.4的不含透明质酸酶的pbs中的胰岛素释放曲线。如图所示，无论有无透明质酸酶的存在，np-a释放胰岛素的速率始终是最快，在最初2h内存在明显的突释现象(累积释放率为45％)。经ha表面包被后，释放胰岛素的速率减缓，而且释放胰岛素的速率随着表面ha分子量的增加而降低。实施例9体外模拟粘蛋白-纳米粒吸附本实施例在体外考察纳米粒与粘蛋白的相互作用。按照实施例2的方法，使用ritc-胰岛素制备荧光标记的纳米粒。将不同浓度的粘蛋白溶液和纳米粒共孵育一定时间，通过监测最终形成的粘蛋白-纳米粒聚集物沉淀中的胰岛素含量，来考察纳米粒与粘蛋白的相互作用情况。实验过程：将荧光标记的纳米粒分别分散于0.5％或1.0％(m/v)的粘蛋白水溶液中，用不含粘蛋白的空白溶液作对比，在37℃震荡孵育1h。混合物于3000rpm离心10min，所得沉淀用pbs洗涤2次，并用200μl的氢氧化钠溶液(3m)充分破坏，涡旋振荡，形成均一溶液后，用多功能酶标仪测定溶液的荧光强度(ex：540nm，em：580nm)。实验结果如图9所示。在无粘蛋白存在时，各纳米粒孵育后所得沉淀中的胰岛素含量极低。然而，与浓度为0.5％或1.0％的粘蛋白在37℃孵育1h后，np-a与粘蛋白发生了严重聚集，离心所得沉淀中的胰岛素含量高，表明表面带强正电的np-a易通过静电作用与带负电的粘蛋白络合成聚集体；经ha表面包被后，纳米粒与粘蛋白的相互作用明显减弱，聚集体形成的量显著减少，随着ha分子量的增加，抗粘蛋白吸附效果越显著。np-b3分别与浓度为0.5％和1.0％的粘蛋白共孵育后，沉淀中的胰岛素量仅是np-a组的16.5％和22.9％。上述结果表明，ha的表面包被使纳米核心的表面由强正电反转至呈现负电，且使其亲水性增加，进而减少了纳米粒与粘蛋白之间的静电和疏水相互作用，有望增加纳米粒在黏液层中自上而下的渗透效率，提高载药纳米粒到达上皮细胞表面并进一步跨膜转运的几率。实施例10细胞毒性实验本实施例采用mtt检测方法评价各纳米粒对ht29-mtx细胞的安全性。取对数生长期的ht29-mtx细胞，以1.0×104个/孔的密度接种于96孔板，加入200μl培养基培养24h后吸去培养液，加入200μl含游离胰岛素、np-a、np-b1、np-b2或np-b3的培养基，于37℃孵育24h。随后加入20μlmtt溶液(5mg·ml-1，ph7.4pbs)继续孵育4h。移除上清液后加入100μldmso，震荡混匀，接着用酶标仪于570nm测定吸光度。以空白培养液孵育细胞，相同处理后作为对照；以无细胞的培养基相同操作处理后作为本底。每个样品设置三个复孔，根据所测得吸光度按照下述公式计算细胞存活率：其中，od样本是实验组吸光度，od对照是含细胞的空白培养液的吸光度，od0是本底的吸光度。如图10所示，各纳米粒对ht29-mtx细胞的生长均没有表现出明显的毒性，安全性较好。实施例11纳米粒在黏液层中的渗透能力实验本实施例考察纳米粒在黏液层中的渗透能力，以及在穿透黏液层的过程中纳米核心结构的完整性。按照实施例2的方法，使用fitc-cpp和cy5-胰岛素制备双荧光标记的纳米粒，并与可分泌黏液的ht29-mtx细胞共孵育，用共聚焦显微镜进行观察。实验过程：将ht29-mtx细胞以2×104个/孔的密度接种于专用的共聚焦小皿(1×1cm)，培养2～3天。加入双荧光标记的纳米粒，孵育3h后，移除培养基，并用pbs温和洗涤2次，去除黏液层表面吸附的样品，用4％多聚甲醛固定细胞10min，用pbs洗涤2次。随后在共聚焦显微镜下逐层扫描。以cy-5标记的游离胰岛素作为对照组。实验结果:图11显示了游离胰岛素(图11a)、np-a(图11b)、np-b1(图11c)、np-b2(图11d)、np-b3(图11e)在黏液层的渗透情况和核心结构的完整性。图中的标尺为10μm，绿色为fitc-cpp，红色为cy-5-胰岛素，蓝色为dipa染色的细胞核。如图所示，对于游离胰岛素，将其溶液与细胞孵育3h后，胰岛素总体荧光强度明显小于各纳米粒组，且多数滞留在黏液层中(参见15μm处的照片)，最终能够穿过黏液层到达细胞表面(参见30μm处的照片)的量很少。原因可能在于，胰岛素分子直接暴露于黏液环境，易被黏液中的酶降解破坏，因而表现出的总体荧光强度较低。此外，胰岛素为亲水性大分子，难以渗透通过黏液层并被肠上皮细胞摄取。对于np-a组，纳米粒在黏液层中渗透的初期就形成大量的粘蛋白-纳米粒聚集体，难以向下穿行而在原位滞留(参见0μm处的照片)，可能的原因在于np-a表面带正电荷，易与黏液层中的多种粘蛋白发生静电作用。但与胰岛素溶液相比，在到达细胞层面的荧光强度有所提高，原因可能在于np-a对其内部的胰岛素还是具有一定的保护效果，且易与带负电的细胞膜作用而入胞。对于np-b，随着ha分子量的增大，纳米粒在黏液层中的滞留量逐渐减少，到达细胞表面的信号逐渐增强，说明亲水性强、带负电的ha的包被的确提高了纳米粒的稳定性，降低了与黏液层中粘蛋白的亲和性，并且保护效果与ha的分子量有关。此外，从图中可以清晰地看到，np-a及np-b1～3在穿过黏液层到达上皮细胞顶端时，纳米核心中的细胞穿透肽(绿色)和胰岛素(红色)信号几乎完全共定位，说明在纳米粒自上而下的渗透过程中，黏液层的存在对纳米核心的结构完整性没有明显影响。实施例12ht29-mtx细胞对纳米粒的摄取实验实验过程：ht29-mtx细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板，加入使用ritc-胰岛素制得荧光标记的纳米粒。孵育3h后，移除培养基，并用pbs温和洗涤3次，去除残留黏液及细胞表面吸附的样品。采用sceptertm2.0手持自动细胞计数器测定细胞数目。随后用细胞裂解液对细胞进行充分裂解破坏后，采用多功能酶标仪测定细胞裂解液的荧光强度。细胞摄取的相对定量统一为每5.0×103个细胞所对应的荧光强度值。以ritc标记的游离胰岛素作为对照组。实验结果：图12显示了ht29-mtx细胞对游离胰岛素和各组纳米粒的相对摄取量，图中数据为平均值±sd(n＝6)。如图所示，各纳米粒组的摄取量显著高于游离胰岛素组。纳米粒按照摄取量由低到高的排序为：np-a＜np-b1＜np-b2＜np-b3。np-b3的细胞摄取量最高，分别是游离胰岛素和np-a组的11倍、1.9倍。在含有黏液层的细胞模型(ht29-mtx)中，纳米核心np-a的摄取量较低，可能是由于带正电的纳米核心np-a易与负电性粘蛋白聚集成较大颗粒，在黏液层中的渗透受到阻碍，到达细胞表面的量显著减少，进而细胞摄取效率降低；而ha包被的纳米粒可以高效地透过粘液层，容易被细胞摄取。实施例13纳米粒的跨上皮细胞转运按照实施例2的方法，用ritc-胰岛素制备荧光标记的纳米粒。采用表面人为添加粘蛋白的caco-2细胞模型，以胰岛素的papp值为指标，考察纳米粒的跨细胞转运能力以及黏液层对纳米粒转运效率的影响。实验过程：细胞培养：将caco-2置于37℃、5％co2的培养箱中，分别用含10％胎牛血清、1％l-谷氨酰胺、1％青-链霉素(100iu·ml-1)、1％非必需氨基酸、10mg·ml-1黏蛋白的dmem高糖培养基培养。caco-2细胞单层模型的构建：将caco-2细胞接种在costartranswell12孔板的聚酯膜上(聚酯膜孔径0.4μm，直径12mm，细胞生长区域1.1cm2)，每隔2天采用millicellers-2型电阻仪监测其跨膜电阻(trans-epithellalelectricresistance，teer)值；并且每两天更换一次培养液。培养2～3周后，当teer值高于700ω·cm2，即可用于后续实验。实验前，将transwell上、下室的培养液换成hanks平衡盐溶液(hbss)，于37℃平衡30min。上室换成200μl含荧光标记的纳米粒样品(其中胰岛素被标记，浓度为0.1mg·ml-1)的hbss。孵育4h后，取适量下室溶液，用多功能酶标仪检测溶液中的荧光强度，从而测定胰岛素浓度，计算表观渗透常数(papp)。以荧光标记的游离胰岛素作为对照组。q为渗透的药物总量(ng)；c是上室药物的初始浓度(ng·cm-3)；a是膜面积(cm2)；t是试验时间(s)。实验结果：图13显示了游离胰岛素组和纳米粒在caco-2/mucin模型中的表观渗透常数(papp)。δ代表p＜0.01；*代表p＜0.001。图中数据为平均值±sd(n＝6)。与游离胰岛素溶液相比，各纳米粒组的papp值均明显更高，np-b的papp值较np-a有所增加，且随着ha分子量的增加，papp增加，说明随着ha分子量越高，转运量越高。实施例14大鼠体内的吸收研究按照实施例2的方法，用cy5-胰岛素制备荧光标记的纳米粒，进而示踪胰岛素在大鼠小肠绒毛中的吸收行为。实验过程：取若干只正常雄性sd大鼠(230～250g)，分为5组：胰岛素溶液组、np-a组、np-b1组、np-b2组、np-b3组(胰岛素剂量：1.5mg·kg-1)。对胰岛素溶液组的大鼠，给予游离胰岛素溶液；对各纳米粒组，将实施例1制得的包含纳米粒的混悬液离心(4000rpm)冻干，将得到的固体用双蒸水重悬，将得到的混悬液给予大鼠。给药前，动物禁食过夜，可自由饮水。经口服给药2h后，大鼠用戊巴比妥钠(0.04mg·kg-1)进行麻醉，沿腹中线打开大鼠腹腔，轻柔地取出肠组织，并截取靠近十二指肠端的空肠段(～10cm)，沿着肠管腔方向纵向切割，用pbs轻柔冲洗表面粘附的纳米粒及肉眼可见的杂质，然后轻轻地将其卷曲，快速放入液氮冷却的o.c.t.(optimumcuttingtemperature)化合物中固定。用冷冻切片机进行组织切片(8μm)，用alexafluor647标记的小麦胚芽凝集素(wga)和dapi染料分别对组织横截面的黏液层中的粘蛋白和细胞核进行染色，并用共聚焦显微镜观察。染色步骤：1)配制黏液层染色液：将1.0mg·ml-1的wga储备液用hbss稀释，wga溶液的推荐浓度为5.0μg·ml-1；2)组织切片用染色液室温染色10min后移除染色液，用hbss冲洗细胞2次；3)组织切片用细胞核dapi染液避光染色5min后，冲洗细胞2次。实验结果：图14为各组小鼠空肠组织横截面的荧光共聚焦显微照片，图中，游离胰岛素和各纳米粒呈红色(cy-5的荧光颜色)，组织中的黏液层呈绿色(wga-647的荧光颜色)，细胞核呈蓝色(dapi的颜色)。图中的标尺为50μm。如图所示，对于口服游离胰岛素溶液组，仅在小肠绒毛及上方的黏液层中观察到少量的胰岛素荧光(红色信号)，证明口服胰岛素溶液很难达到有效的药物吸收。对于口服np-a组，观察到位于黏液层中的胰岛素荧光很强，而下方的小肠绒毛内的荧光很弱，说明多数np-a在黏液层滞留，能够渗透过黏液层、进而被肠上皮细胞吸收的量较少。这一现象与体外模拟粘蛋白-纳米粒吸附实验(实施例9)、纳米粒在黏液层中的渗透能力实验(实施例11)、及纳米粒在含有黏液层的细胞模型(ht29-mtx)中的摄取实验(实施例12)的结果相吻合。与之相比，np-b1、np-b2、np-b3的黏液穿透能力及被小肠上皮细胞吸收转运的效率明显提高。其中，np-b3在小肠绒毛中的信号最强，且荧光多位于绒毛毛细血管存在的部位，表明np-b3可被上皮细胞有效吸收并转运到血液循环。上述结果证明，相对于表面带正电且未经修饰的纳米核心，经ha包被后的纳米粒的抗黏液层滞留并快速向下渗透转运的能力显著增强，进而使体内胰岛素的小肠吸收效率提高。实施例15i型糖尿病大鼠模型的建立及体内降血糖试验i型糖尿病大鼠模型的建立取若干只雄性sd大鼠，腹腔注射链脲霉素(stz,70mg·kg-1)，注射部位靠近大鼠仰卧位的腹部左上方。造模前需禁食6h以上，造模后4h后再重新恢复给予进食。一周后用血糖仪测定血糖水平，若空腹血糖水平值高于16.0mm，则视为i型糖尿病模型造模成功。试验1口服纳米粒的降血糖实验取56只i型糖尿病模型大鼠，分为7组：阴性对照组(口服去离子水)，胰岛素水溶液(胰岛素浓度1mg·ml-1)皮下(s.c.)注射组(5iu·kg-1)，以及胰岛素水溶液、np-a、np-b1、np-b2、np-b3混悬液(胰岛素浓度1mg·ml-1)口服给药组(80iu·kg-1)。各纳米粒混悬液通过以下方法得到：将实施例1制得的包含纳米粒的混悬液离心(4000rpm)冻干，将得到的固体用双蒸水重悬。给药前，动物禁食过夜，可自由饮水。分别于给药前及给药后1、2、3、4、5、6、7和8h尾静脉收集血液样品，用血糖仪测定其血糖水平。图15显示了各组大鼠给药后的血糖水平随时间的变化。图中，#代表相对于np-b1组，p＜0.05；*代表相对于np-b2组，p＜0.05。图中数据为平均值±sd(n＝8)。如图所示，给药八小时内，口服去离子水的大鼠的血糖水平稍有降低，可能是由于糖尿病大鼠在给药期间处于禁食状态，存在一个基础降低值。口服胰岛素溶液的大鼠的血糖水平与阴性对照组相差不明显。皮下注射组的血糖水平在1h内急剧下降至初始水平的25％，在接下来的4h内血糖都一直保持在较低水平。但是，血糖水平在较短时间内从较高水平到达较低水平的骤降效应，对于糖尿病患者来说具有高风险性，严重的会引起低血糖、昏迷、休克，甚至死亡。相比之下，给予纳米粒的大鼠的血糖水平在给药后的8h内均显著但缓慢降低。np-a、np-b1和np-b2纳米粒在口服给药后，在给药初期(0～5h)的降血糖效果并无明显差异。在5～8h期间，np-b2的降血糖效果比np-a和np-b1更为明显，可将血糖值降低至初始值的45％。np-b3组的体内降血糖效果最为显著和持久，8h内可将血糖水平缓慢平稳地降低至初始值的40％。上述结果说明，本发明的纳米粒可以平稳地起到降低血糖的作用，药效明显，安全性高。试验2口服肠溶微胶囊的降血糖实验取18只i型糖尿病模型大鼠，分为3组：hpmcp包被的np-b1微胶囊组、np-b2微胶囊组、np-b3微胶囊组，(胰岛素浓度1mg·ml-1)微胶囊用双蒸水重悬，均口服给药(80iu·kg-1)。微胶囊的制备是通过将制备得到的np-b1、np-b2、np-b3纳米粒子注入fnc入口1，制备好的hpmcp的乙醇溶液注入入口2，入口3、4注入稀盐酸溶液(ph＝2.5)，最终得到相应纳米粒子的微胶囊。给药前，动物禁食过夜，可自由饮水。分别于给药前及给药后1、2、3、4、5、6、7和8h尾静脉收集血液样品，用血糖仪测定血糖水平。图16显示了各组大鼠口服微胶囊后的血糖水平随时间的变化。图中，*代表相对于np-b1微胶囊组，p＜0.05；#代表相对于np-b2微胶囊组，p＜0.05。图中数据为平均值±sd(n＝6)。如图所示，经口服给药后，np-b1和np-b2微胶囊组的降血糖效果明显。这两组大鼠在口服给药后，血糖水平一直持续平稳地下降，大鼠的血糖值在给药8h后分别降低至初始水平的50％和40％。np-b3微胶囊组的体内降血糖效果极其显著，可以使大鼠血糖在8h内平缓持久地降低至初始值的20％，此时，糖尿病大鼠的血糖水平达到正常范围(3.5～5mm)。相对于直接皮下注射胰岛素，本发明的微胶囊经过口服，可以缓慢、平稳、持久地起到降血糖作用，安全性高，避免了产生血糖骤降等风险，更能为广大糖尿病患者所接受。实施例16体内生物利用度研究取24只i型糖尿病大鼠，分为4组：胰岛素水溶液注射组(s.c.5iu·kg-1)，np-b1微胶囊组、np-b2微胶囊组、np-b3微胶囊组(胰岛素浓度1mg·ml-1)。微胶囊用双蒸水重悬，口服给药(80iu·kg-1)。微胶囊的制备是通过将制备得到的np-b1、np-b2、np-b3纳米粒子注入fnc入口1，制备好的hpmcp的乙醇溶液注入入口2，入口3、4注入稀盐酸溶液(ph＝2.5)，最终得到相应纳米粒子的微胶囊。分别于给药后0.3、0.6、1、2、3、4、5、6、7和8h尾静脉收集血液样品，置于1.5ml采集管中，凝血后于3000rpm离心15min，小心收集上层血清，-80℃保存备用，避免反复冻融。使用猪胰岛素elisa试剂盒，采用双固相酶免疫测定法，测定血清中的胰岛素浓度。具体操作如下：测试前，先将所有试剂和样品恢复至室温。1)配制酶结合物溶液1×和清洗液1×：将酶结合物溶液(enzymeconjugate11×)按1∶10用酶结合物缓冲液(enzymeconjugatebuffer)稀释混匀；清洗液(washbuffer21×)按1∶20用去离子水稀释混匀；2)取一块96孔的酶标板，精密吸取25μl的标定液和血清样品置于96孔板中，一式三份；3)每孔加入100μl的酶结合物溶液1×；4)室温(18～25℃)下振荡(700～900rpm)孵育2h；5)洗板：翻转酶标板弃去反应液，每孔加入350μl清洗液，轻摇数秒后弃去清洗液，在吸附纸上用力拍打脱干清洗液，重复洗板5次；6)每孔加入酶结合底物(substratetmb)200μl，室温(18～25℃)下孵育15min；7)每孔加入50μl反应终止液，轻摇5s，充分混匀。用酶标仪于450nm波长下测定吸光度值，读取在30min内完成。按照下式计算口服胰岛素肠溶微胶囊的相对生物利用度(ba)：其中，auc口服灌胃和auc皮下注射分别代表口服灌胃和皮下注射后血清胰岛素浓度对时间曲线下的总面积。图17显示了各组大鼠体内血清胰岛素浓度随时间的变化曲线。图中数据为平均值±sd(n＝6)。皮下注射给予胰岛素溶液(5iu·kg-1)后，大鼠血清中胰岛素浓度急剧增加，并于1h达到峰值(～120miu·l-1)，这与实施例15中，在糖尿病大鼠模型中皮下注射等剂量的胰岛素后，血糖水平在1h内迅速降低至初始值的25％的结果互相吻合(参见图15)。np-b2微胶囊和np-b3微胶囊经口服给药后，大鼠血清胰岛素水平缓慢上升，达峰时间为4h。经计算，np-b1微胶囊、np-b2微胶囊和np-b3微胶囊的相对生物利用度分别为5.3％、7.4％和11％。实施例17大鼠体内安全性研究实验过程：取6只正常大鼠用作阴性对照组，18只i型糖尿病模型大鼠，分为3组：口服pbs组、口服np-b3组、口服hpmcp包被的np-b3组(胰岛素浓度1mg·ml-1)，纳米粒和微胶囊均用双蒸水重悬(80iu·kg-1)。连续口服给药1周后，尾静脉收集血液样品，置于1.5ml采集管中，凝血后于3000rpm离心15min，小心收集上层血清，置于-80℃冻存，避免反复冻融。按照试剂盒说明书中的方法，测定血清中的碱性磷酸酶(alp)、天冬氨酸转氨酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-gt)的含量。动物用戊巴比妥钠(0.04mg·kg-1)进行麻醉，沿腹中线打开腹腔，用pbs进行心脏灌流冲洗体内残余血液后，轻柔地取出肝脏组织，用4％多聚甲醛固定后，经石蜡包埋，用冷冻切片机进行组织切片(8μm)，进行he染色。实验结果：图18显示了各组大鼠血清中的alp、ast、alt、γ-gt含量。图中数据为平均值±sd(n＝6)。与阴性对照组(口服pbs的正常大鼠)和阳性对照组(口服pbs的模型大鼠)相比，口服胰岛素纳米粒或胰岛素纳米粒肠溶微胶囊后，模型动物体内的四种肝药酶(alp、ast、alt、γ-gt)的活性没有明显升高，表明口服递送本发明的纳米粒及其肠溶微胶囊在动物体内没有明显毒性。图19显示了各组大鼠肝脏组织he染色切片的显微照片，a1：口服pbs的正常大鼠；a2：口服pbs的模型大鼠；a3：口服np-b3的模型大鼠；a4：口服hpmcp包被的np-b3的模型大鼠。与对照组大鼠的情况相似，实验组大鼠的肝脏结构完整，肝细胞排列较整齐，说明本发明的纳米粒及其肠溶微胶囊在多剂量重复口服给药后，未引起明显的肝损伤。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表<110>中山大学<120>负载治疗性蛋白的纳米粒及其微胶囊<130>idc170050<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>16<212>prt<213>drosophilamelanogaster<400>1argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys151015当前第1页12