NUDT5蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用的制作方法

本发明涉及nudt5蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用，属于分子生物学和生物医药领域。

背景技术：

结直肠癌(colorectalcancer，crc)是由于结肠粘膜上皮在环境和遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性癌变，是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在世界范围内，发病率居于恶性肿瘤第三位，死亡率居第四位，每年约有120万新发病例，严重威胁人类健康。结直肠癌在亚洲发病率较高，尤其是中国，主要与年龄、家族史、不健康的饮食及生活习惯等危险因素有关。

无论在正常代谢活动中还是在外源性刺激下，细胞会产生大量的ros，可以损伤dna，rna和游离核苷酸。鸟嘌呤因具有最低氧化电势，其氧化产物8-oxog是细胞内含量最丰富的氧化碱基。含有8-oxog的核苷酸可以掺入dna或rna中，由于8-oxog以同等效率与a和c配对，故引起复制水平和转录水平错配。

nudt5(nudixhydrolase5)蛋白属于哺乳动物nudix水解酶超家族。nudt5蛋白具有水解8-oxo-dgdp的活性，阻止氧化的鸟嘌呤掺入dna中，减少复制错配，还拥有更广的底物特异性，它还能水解8-oxo-dadp、2-oxo-dadp、5-cho-dudp。体内外实验研究发现在mutt缺陷大肠杆菌中表达nudt5的cdna显著降低其自发突变率和显著抑制变异蛋白的产生，在293t细胞中敲减nudt5后加入外源性8-oxo-dgtp增加了a∶t到c∶g颠换突变，这些结果表明nudt5蛋白可以维持氧化应激下dna复制和转录的保真性。然而目前还没有报道研究肿瘤组织中nudt5的表达。

技术实现要素：

本发明的一个方面提供了nudt5蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用。

本发明基于以下发现：

我们首次发现nudt5蛋白在结直肠癌(crc)组织中表达量增高，并与crc进展和预后有关。nudt5蛋白表达量与结直肠癌ajcc分期和淋巴结转移有关。nudt5高表达组的crc患者进行手术治疗后总的生存率更低。我们研究发现nudt5表达与crc进展和预后有关，抑制nudt5蛋白表达导致细胞活力下降，因此nudt5蛋白是一个潜在的结直肠癌治疗的新靶点。在此基础上完成了本发明。

本发明的第二个方面，提供了nudt5蛋白的抑制剂在制备预防和/或治疗结直肠癌的药物中的用途。

所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为nudt5蛋白的抑制剂。

所述nudt5蛋白的抑制剂选自nudt5蛋白的抗体和/或nudt5蛋白的结合蛋白。

本发明的第三个方面，提供了nudt5基因的抑制剂在制备预防和/或治疗结直肠癌的药物中的用途。

所述药物包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为nudt5基因的抑制剂。

所述nudt5基因的抑制剂选在nudt5基因特异性的rnai、nudt5基因特异性的microrna、或抑制nudt5基因启动子的抑制剂中的一种或多种。

本发明的第四个方面，提供了一种预防和/或治疗结直肠癌的药物，包括药学上可接受的载体和有效量的以下活性成分：nudt5蛋白的抑制剂和/或nudt5基因的抑制剂。

所述nudt5蛋白的抑制剂选自nudt5蛋白的抗体和/或nudt5蛋白的结合蛋白；所述nudt5基因的抑制剂选在nudt5基因特异性的rnai、nudt5基因特异性的microrna、或抑制nudt5基因启动子的抑制剂中的一种或多种。

术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

所述的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐水、缓冲液、甘油、乙醇、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药途径等。

本发明的第五个方面，提供了一种体外非治疗性抑制肿瘤细胞的方法，在nudt5蛋白抑制剂或nudt5基因抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而抑制肿瘤细胞。其中所述的肿瘤细胞是结直肠癌细胞。

我们检测结直肠癌(crc)细胞株和结直肠癌(crc)组织中nudt5的表达，比较crc细胞(组织)与正常细胞(组织)表达量的差异，分析nudt5表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性，明确了敲减nudt5蛋白可使结直肠癌细胞株增殖能力显著下降。

有益效果：本发明提供了结直肠癌的新的治疗靶点，该靶点可有效用于结直肠癌发展判断、治疗方案选择和/或预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的结直肠癌诊断剂和/或治疗剂，具有临床应用前景。

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。凡依照本公开内容进行的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为结直肠癌组织(细胞)和配对癌旁组织(细胞)中nudt5蛋白的表达；图1a是结直肠癌细胞株中nudt5mrna表达的相对定量，图1b是结直肠癌细胞株中nudt5蛋白表达的代表性westernblotting条带，图1c是结直肠癌细胞株中nudt5蛋白表达的相对定量，图1d是6对结直肠癌组织和配对癌旁组织中nudt5蛋白表达的代表性westernblotting条带，图1e是20对结直肠癌组织和配对癌旁组织中nudt5蛋白表达的定量结果，统计方法为student’st-test。

图2为结直肠癌组织和配对癌旁组织中nudt5蛋白免疫组化代表图

图3为kaplan-meier生存曲线

图4为敲减nudt5蛋白抑制sw480和colo320细胞增殖；图4a为westernblotting验证sw480和colo320细胞中nudt5蛋白敲减效果，图4b为敲减nudt5蛋白后sw480和colo320细胞增殖曲线。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。

实施例1.

一.材料与方法

1.实验材料

(1)人胚胎肠粘膜细胞ccc-hie-2(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)和6种结直肠癌细胞株sw480、sw620、colo320、t84(ajcc，usa)，lovo、hct116(中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)。

(2)44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织(佳木斯大学附属第一医院提供)

(3)结肠癌组织芯片——87例癌组织和对应的癌旁正常组织(上海芯超生物科技有限公司，病人在结直肠癌根治术前未经过放疗和化疗

(4)抗-nudt5抗体(abcam)

2.实验方法

(1)通过qrt-pcr和westernblotting分别检测6种人结直肠癌细胞株hct116，sw480，sw620，lovo，colo320，t84和人正常肠粘膜上皮细胞ccc-hie-2中nudt5mrna和蛋白的表达。qrt-pcr具体步骤如下：

①使用trizol(thermofisher，usa)提取细胞株中总rna。

②使用transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix(北京全式金生物科技有限公司)将2ugrna反转录成cdna。

③使用kapafastuniversalqpcrkits(kapa，usa)进行定量pcr，nudt5引物：forward5’-gttctccagcggtctgtatg-3’(seqidno：1)和reverse5’-cttcggccttgcgttttcg-3’(seqidno：2)，gapdh引物：forward5’-cctctccagaacatcatcc-3’(seqidno：3)和reverse5’-gtgtcgctgttgaagtcag-3’(seqidno：4)。

westernblotting具体步骤如下：

①细胞加入ripa裂解液(北京索莱宝科技有限公司)，其中ripa裂解液中含有1xpmsf(索莱宝)和1x蛋白酶和磷酸酶抑制剂(cst，usa)，冰上放置30min，4℃12000g离心20min，取上清转移到新的1.5mlep管中。

②bca法(thermofisher，usa)测定总蛋白浓度。

③12％sds-page电泳，检测gapdh表达的上样量为10ug，检测mth2表达的上样量为40ug。

④转膜，将page中的蛋白电转移到pvdf膜上(millipore，usa)。

⑤免疫封闭，使用5％脱脂牛奶封闭2h。

⑥一抗孵育，抗-nudt5抗体的稀释比例为1∶1000，抗-gapdh抗体稀释比例为1∶2000，4℃过夜，tbst洗5次，每次5min。

⑦二抗孵育，山羊抗兔igg-hrp(碧云天生物技术有限公司，1∶2000)，室温孵育2h，tbst洗5次，每次5min。

⑧曝光，将显示液(millipore，usa)1∶1混合后均匀滴加到条带上，进行曝光显色。

(2)通过westernblotting检测44对结直肠癌组织与对应的癌旁正常组织中nudt5的表达量，分析nudt5蛋白表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性。具体实验步骤参照(1)。

(3)通过免疫组化检测87例癌组织和对应的癌旁正常组织(组织芯片)中nudt5的表达量，根据染色的程度和染色面积，将癌组织分为高表达组和低表达组，分析nudt5表达量与临床病理资料(如性别、年龄、位置、肿瘤大小、临床分期、分化程度等)之间的相关性。具体步骤如下：

①组织芯片使用二甲苯脱蜡2d，100％、95％、85％、75％乙醇梯度水化各2min，pbs水化10min。

②抗原修复(ph6.0柠檬酸修复液)微波修复30min，冷却至室温。

③山羊血清(北京中衫金桥生物科技有限公司)封闭30min。

④一抗孵育，抗-nudt5抗体的稀释比例为1∶1000，4℃过夜，pbs洗5minx3次。

⑤二抗孵育，使用pv-6001山羊抗兔igg/hrp聚合物，室温孵育20分钟，pbs洗5minx3次。

⑥dab(中衫金桥)显色

⑦苏木素复染、梯度脱水、透明封片。

(4)首先使用实验室已筛选出的sinudt5(靶序列为5’-catggatcctactggtaaa-3’(seqidno：5))分别敲减sw480和colo320细胞株中mrna表达水平，然后进行westernblotting验证敲减效果，最后通过cck-8实验检测在sw480和colo320细胞株中分别瞬时敲减nudt5对细胞活力的影响。具体步骤如下：

①sw480细胞和colo320细胞铺96孔板，每孔1x104个细胞。

②12h后，使用rnaimax(thermofisher，usa)转染50nmsinudt5和sicontrol，每组6个复孔。

③分别在转染后24h、48h和72h，使用cck-8试剂盒(全式金)检测450nm处吸光度。

3.组织芯片中nudt5蛋白表达高低评分标准：

(1)染色强度：0(无)；1(弱)；2(中)；3(强)

(2)染色面积：0(0％)；1(1-25％)；2(26-50％)；3(51-75％)；4(76-100％)；

(3)最终得分是染色强度x染色面积：低表达(0-6)；高表达(7-12)。

4.统计方法

软件spssstatisticsversion19.

(1)student’st-test比较两组均值；

(2)pearson’x2或者fisher’sexacttest比较nudt5蛋白与crc临床病理资料相关性；

(3)kaplan-meieranalysis计算总的生存率(os)，thelog-ranktest比较两组os。

二.实验结果

1.结直肠癌细胞株nudt5表达量增加

(1)qrt-pcr结果表明结直肠癌细胞株hct116，sw480，sw620，lovo，colo320，t84中nudt5mrna表达水平显著高于ccc-hie-2(student’st-test，p＜0.05，图1a)。

(2)westernblotting结果表明结直肠癌细胞株中nudt5蛋白表达水平同样显著高于ccc-hie-2(student’st-test，p＜0.05，图1b-图1c)。

2.结直肠癌组织中nudt5表达量增加

(1)我们首先进行westernblotting检测20对人结直肠癌组织和配对癌旁正常组织中nudt5蛋白表达，结果表明癌组织中nudt5表达显著高于正常组织(student’st-test，p＜0.001，图1d-e)。

(2)我们然后进行免疫组化检测组织芯片(87对人结直肠癌组织和配对癌旁组织)中nudt5蛋白表达，再次证明癌组织中该蛋白表达上调(图2)。癌旁正常组织nudt5蛋白免疫染色很弱，癌组织染色程度不同，有弱，中，强。根据癌组织免疫染色的强度和范围，87个癌组织中nudt5蛋白高表达有42个。

3.nudt5蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性

(1)根据nudt5蛋白免疫组化染色结果，分别将组织芯片中87个人结直肠癌组织分为高表达组和低表达组，应用pearson’x2orfisher’sexacttest分析蛋白表达与年龄，性别，位置，肿瘤大小，ajcc分期，t分期，n分期，m分期，分化程度，脉管转移的相关性，结果表明mth2表达量与ajcc分期和n分期(淋巴结转移)显著相关(p＜0.05，表1)。

表1.nudt5蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(免疫组化，n＝87)

^achi-squaretest

^bfisher’sexacttest

^*p＜0.05

(2)westernblotting检测44例人结直肠组织中nudt5蛋白的相对表达，应用student’st-test分析这些蛋白表达与crc临床病理相关性，结果表明nudt5表达量与ajcc分期，t分期(肿瘤浸润程度)和n分期(淋巴结转移)显著相关(p＜0.05，表2)。

表2.nudt5蛋白表达与结直肠癌临床病理参数的相关性(westernblotting，n＝44)

4.nudt5蛋白表达对结直肠癌患者预后影响

根据nudt5蛋白免疫组化染色结果，分别将组织芯片中87个人结直肠癌组织分为高表达组和低表达组，应用kaplan-meieranalysis计算crc患者进行手术治疗后总的生存率(os)，同时使用log-ranktest比较高表达组和低表达组的os，结果表明nudt5高表达组生存率更低(p＝0.003，图3)。

5.敲减nudt5蛋白抑制结直肠癌细胞株增殖能力

cck-8实验结果表明在sw480和colo320细胞株中敲减nudt5蛋白72h后，sw480和colo320细胞活力显著下降，细胞增殖能力下降(图4)。

三.结论

本研究，我们首次发现nudt5蛋白在crc组织中表达量增高，并与crc进展和预后有关。

nudt5蛋白表达量与结直肠癌ajcc分期和淋巴结转移有关。nudt5高表达组的crc患者进行手术治疗后总的生存率更低。

我们研究发现nudt5表达与crc进展和预后有关，抑制nudt5蛋白表达导致细胞活力下降，因此nudt5蛋白是结直肠癌治疗的潜在新靶点。

序列表

<110>蔡,剑平

<120>nudt5蛋白作为结直肠癌治疗靶点的应用

<130>xdrc17i034

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gttctccagcggtctgtatg20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cttcggccttgcgttttcg19

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cctctccagaacatcatcc19

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtgtcgctgttgaagtcag19

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

catggatcctactggtaaa19