核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体及其制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体及其制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤是当今世界严重威胁人类生命健康的常见疾病之一。目前主要的治疗方法包括手术、化疗和放疗，化学药物治疗是目前肿瘤的常用治疗方法。由于大多数抗肿瘤药物缺少对肿瘤细胞的特异性，在化疗杀死肿瘤细胞的同时也会杀伤正常细胞，毒副作用较大。化疗药物通过注射途径进入全身血液循环后要经过同蛋白结合、代谢、排泄等步骤，药物到达肿瘤部位的药物较少。化疗与免疫治疗相结合，使药物更高效的到达肿瘤部位，又能抑制肿瘤细胞的生长。

巨噬细胞分类表型可变和功能多样是巨噬细胞的重要特征。因此，巨噬细胞能根据接收到的微环境信号执行多种多样的功能，如促炎、抗菌、免疫调节、组织重塑和促癌作用。巨噬细胞主要有两种功能表型：经典活化的巨噬细胞(m1型巨噬细胞)和替代性活化的巨噬细胞(m2型巨噬细胞)。m1型巨噬细胞具有高递呈抗原的能力，并能大量分泌促炎性细胞因子il-12和il-23，杀伤病原体(细菌和病毒)和肿瘤细胞。m2型巨噬细胞又称为肿瘤相关巨噬细胞(tam)，肿瘤的生长是由肿瘤中浸润白细胞的主要成分tam所诱导。而且，在许多但不是所有的人类肿瘤中，大量tam的浸润与预后不良相关。

由于巨噬细胞具有多样性和可塑性，生物体内的巨噬细胞可能经常以不同比例的两种表型同时存在。而且，在免疫应答或病理过程中，巨噬细胞可从一个表型转换成另一表型。

单壁碳纳米角(swcnhs)是一种新型碳纳米材料，具有圆锥形尖端的角状结构，直径为2～3nm，长度为20～50nm，锥角约为20°。通常情况下以聚集体的状态存在，直径为80～100nm，这种聚集尺寸能增强通透保留效应(epr效应)，减少被网状内皮系统(res)的摄取，被动靶向于肿瘤组织并蓄积。swcnhs是一种新型导电单壁碳纳米角材料，在不使用金属催化剂的条件下通过激光消融石墨或者电弧放电法合成，达到较高产率和较高纯度，无毒副作用，且避免了复杂的纯化步骤，以及在纯化过程中对石墨烯结构的破坏。通过氧化能在swcnhs壁上开口，氧化后的swcnhs表面积增大，可以负载更多的药物或基团。

在人体正常生理环境下，ph值在7.0～7.4，为中性，肿瘤组织在局部缺血时，肿瘤间质液出现异常酸化现象，ph值通常在5.0～6.5之间，低于正常组织。ph敏感型脂质体在中性时可以保持稳定结构，但是处于ph值较低的酸性条件下，则会引起脂肪酸羧基发生质子化现象，这种现象会导致形成六方晶相结构，促使脂质体膜和细胞膜互相融合，膜流动性变大，能快速将药物从脂质体中释放出来，而在正常组织部位的膜破裂较慢，使药物以缓慢速度释放，此举使得药物大量地聚集在肿瘤部位，在提高药物治疗效果的前提下还可降低对人体的副作用。

技术实现要素：

为解决上述提到的技术问题，本发明的目的是提供一种核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体及其制备方法，其载药量高，制备方法简单，采用化疗和免疫治疗相结合的方式，可增加其抗肿瘤效果，降低毒副作用，抑制肿瘤的转移。

本发明提供了一种核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体，包括ph敏感型脂质体以及包裹在ph敏感型脂质体中的氧化碳纳米角(o-swcnhs)，ph敏感型脂质体表面负载有肿瘤相关巨噬细胞的极化因子或极化药物，氧化碳纳米角上负载有抗肿瘤药物，核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体的直径为100-200nm。

进一步地，ph敏感型脂质体为二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、半琥珀酸胆固醇(chems)、油酸(oa)和磷脂酰乙醇胺(pe)中的两种或几种。

进一步地，肿瘤相关巨噬细胞的极化因子为il-21。白细胞介素21(il-21)是γ链(γc)家族中的一种调节性细胞因子，主要由活化的cd4+t细胞、nkt细胞分泌，能够激活t细胞并促进其分泌细胞因子，从而参与调节机体免疫应答。

进一步地，极化药物为唑来膦酸或阿仑膦酸钠。

进一步地，抗肿瘤药物为多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素和柔红霉素中的一种或几种。

进一步地，氧化碳纳米角的粒径为50-100nm。

氧化碳纳米角的制备方法包括以下步骤：

将碳纳米角(swcnhs)加入酸的水溶液，在80℃条件下搅拌得到混合物，过滤、干燥后制得氧化碳纳米角(o-swcnhs)。

进一步地，碳纳米角为单壁碳纳米角，其粒径为50-100nm，形状为球形。

进一步地，酸的水溶液为双氧水，其质量浓度为30％。

本发明还提供了一种上述核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将氧化碳纳米角(o-swcnhs)与抗肿瘤药物在有机溶剂中混匀，加入ph为7.0-7.5的缓冲溶液，混匀后得到载药的碳纳米角；

(2)将ph敏感型脂质体(psl)溶于有机溶剂，再加入水进行水化，加入肿瘤相关巨噬细胞的极化因子或极化药物混匀，过膜挤出，得到负载极化因子或极化药物的ph敏感型脂质体；

(3)将载药的碳纳米角与负载极化因子或极化药物的ph敏感型脂质体混匀，过膜挤出，得到所述核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体。

进一步地，在步骤(1)中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液。

进一步地，在步骤(1)中，抗肿瘤药物与氧化碳纳米角的质量比为1:2-4。

进一步地，在步骤(1)中和步骤(2)中，有机溶剂为氯仿、甲醇、乙醚和乙醇中的一种或几种。

进一步地，在步骤(3)中，载药的碳纳米角与所述负载极化因子或极化药物的ph敏感型脂质体的体积比为1:2-4。

进一步地，在步骤(2)和步骤(3)中，过膜挤出时，使用孔径为0.22-0.45μm的膜。

本发明提供了一种化药与肿瘤相关巨噬细胞极化因子/极化药物联合递送的碳纳米角/脂质体核壳状纳米载体，以氧化碳纳米角作为内核，其上通过物理吸附及π-π作用负载有芳环类结构的抗肿瘤药物，将ph敏感型脂质体包裹在swcnhs的表面作为壳，使swcnhs的分散性和生物相容性增加，ph敏感型脂质体中负载有瘤相关巨噬细胞极化因子/极化药物。

在使用时，本发明的纳米载体在肿瘤微酸性环境中，ph敏感型脂质体发生破裂，释放出细胞因子和其内部的载药碳纳米角，载药碳纳米角进而在肿瘤部位释放出抗肿瘤药物杀死肿瘤细胞细胞，同时细胞极化因子/极化药物引起肿瘤相关巨噬细胞的极化，使m2型巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞，从而干扰肿瘤转移与生长进程，显著遏制肿瘤。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明的碳纳米角/脂质体核壳状纳米载体在水中分散性较好，生物相容性好，药物负载能力高，具有明显的ph响应性释放，体内外抗肿瘤效果好，具有明显的肿瘤细胞靶向能力和控制药物释放的能力，为swcnhs靶向递药体系的研究提供理论依据。

本发明的制备方法操作简单、制备条件温和，原料易得、可靠，后处理简单，适合工业化生产。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为实施例1中不同物质的的透射电镜图；

图2为实施例2中纯药物与载体在不同ph条件的释放曲线图；

图3为实施例3中碳纳米角载体对a549和293t细胞毒性测试结果；

图4为实施例4中a549细胞对载体中阿霉素的摄取情况测试结果；

图5为实施例5中构建巨噬细胞两种表型的细胞因子水平；

图6为实施例5中il-21的极化后细胞因子的水平。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1核壳状纳米载体的制备方法

(1)将长度为50-100nm的swcnhs加入弱酸水溶液中(30％h2o2)，超声分散30min，80℃油浴中机械搅拌下冷凝回流4h，反应结束后冷却静置一段时间，去除上层酸液并用蒸馏水稀释，经0.22μm混合纤维素滤膜真空抽滤，滤饼用大量去离子水洗涤至滤液ph值为中性，50℃真空干燥，得到o-swcnhs；

(2)将o-swcnhs分散于阿霉素(dox)的甲醇溶液中，阿霉素和o-swcnhs的质量比例为1:4；混合物溶液超声30min，随后逐滴加入ph7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)，然后采用细胞粉碎机超声功率400w，超声2min，继续磁力搅拌过夜后，将混合物经10000rpm离心10min，移除上层清液，加入pbs或者甲醇洗涤，再此以相同条件离心。用pbs(ph7.4)和甲醇各洗涤2次，以除去游离的dox，产物置于真空干燥箱40℃烘干，得到载药的碳纳米角(dox-o-swcnhs)；

(3)将ph敏感型脂质体材料dope与chems溶于氯仿与甲醇混合溶液中，两者摩尔比例为2:1，加入5倍体积的蒸馏水水化，采用细胞粉碎机超声400w超声2min，50℃旋转蒸发20min，过0.45μm膜挤出，制得ph敏感型脂质体(psl)，加入一定量的il-21，室温孵育24h，制备得负载极化因子的ph敏感型脂质体(psl-il-21)；

(4)将步骤2中制得的dox-o-swcnhs(10mg)分散于20ml的psl-il-21中，过0.45μm膜挤出，制得ph敏感型脂质体包裹栽药碳纳米角载体(psl-dox-o-swcnhs)。

附图1为上述swcnhs(a)，o-swcnh(b)，psl-o-swcnhs(c)的透射电镜图，tem图表明psl成功的包裹了swcnhs，也可以看出psl-o-swcnhs的直径在100-200nm。

实施例2纳米载体的体外释放度测定

将实施例1步骤(2)制备的dox-o-swcnhs和纯药物dox分别分散于ph7.4和ph5.0的pbs溶液中，使上述四种样品中dox浓度均保持在70μg/ml。分别取2ml的样品溶液置于截留分子量为8kda的透析袋中，将透析袋用透析夹夹紧后放入相应的40mlpbs缓冲溶液中，置于37℃的水平恒温振荡器内进行动态透析(频率为100r/min)，并开始计时，每隔一定时间后取0.5ml透析液，同时补充0.5ml新鲜pbs溶液，样品平行3份并计算累积释放度。将取出的样品离心后，采用uv测定dox的含量。

附图2为功能化swcnhs(dox-o-swcnhs)载药体系中药物的释放曲线，载体中dox的释放具有ph敏感性和缓释性，且二者的释放行为存在显著性差异。dox，dox-o-swcnhs的释放度区别较大，在ph7.4条件下，48h时的药物释放量仅为10％左右，在ph5.5条件下，药物的释放量明显增加到35％左右。因人体血液正常的ph范围在7.35-7.45，可以推测dox在人体血液环境中的释放量很低，这种较低的释放量可以大大减少药物对正常组织的毒副作用。而在弱酸环境下的肿瘤组织中，疏水性的dox发生解离，很大程度地提高了溶解度，促进dox进一步的释放，这时功能化swcnhs载药载体能大量地释放药物从而杀死癌细胞。

实施例3纳米载体的细胞毒性试验

(1)细胞培养：选用非小细胞肺癌a549和正常细胞297t细胞，用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养液培养，置于37℃，5％co2的培养箱中培养。

(2)肿瘤细胞存活率的检测：取对数生长期的a549和293t细胞，按每孔8×10⁴个/ml的细胞密度接种于96孔培养板，将原料swcnhs以及实施例1制备得到的碳纳米角递药复合物o-swcnhs加入对数生长期的a549和293t细胞中，在37℃，5％co2条件下培养24h,48h。培养中止时用pbs洗2次，每孔加入10μl的wst-1,于微型振荡器上震荡10min，用酶联免疫检测仪分别于450nm和630nm处测定其吸光度值，计算得到肿瘤细胞的存活率。实验重复3次。作为对照的未加入样品的细胞存活率定位100％，加入wst-1试剂(无细胞)的孔被用来校准分光光度计，定义为零吸光度。

计算各组吸光度值平均值，根据下列公式计算细胞存活率。

od＝od450nm-od630nm

图3为a549和293t细胞经swcnhs(图3中的白色柱)和o-swcnhs(图3中的灰色柱)处理24h和48h后的细胞存活率图，其中，人肾上皮细胞系293t细胞模拟正常细胞，人肺腺癌细胞a549模拟肿瘤细胞分别进行了细胞毒性实验。图3a代表采用a549细胞处理24h后的结果，图3b代表a549细胞处理48h后的结果，图3c代表293t细胞处理24h后的结果，图3d代表293t细胞处理48h后的结果。图3表明，当载体浓度为100μg/ml以内时，细胞存活率在80％以上，且两种细胞株之间无显著性差异，具有良好的生物安全性。

以上实验结果证明o-swcnhs具有良好的生物相容性，对细胞无毒性，当其外包裹具有生物相容性的psl时，所形成的碳纳米角/脂质体核壳状纳米载体也具有良好的生物相容性，对细胞也无毒性。

实施例4纳米载体在肿瘤细胞内的摄取

(1)细胞培养：人肺腺癌细胞株a549培养于含10％胎牛血清的dmem高糖培养基中，常规添加1％青霉素-链霉素，培养条件37℃，5％co2。每日倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，对增殖状况良好的细胞用胰酶消化并传代，待稳定后开始实验。

(2)实施例1制备的dox-o-swcnhs与psl-dox-o-swcnhs在a549细胞中的摄取：将a549细胞按1×10⁵个/ml浓度铺于6孔板，培养24h(37℃，5％co2)。给药前弃去旧培养基，每孔加入2ml含有各组药物的新鲜培养基，轻轻摇匀，继续培养2h(37℃，5％co2)，弃培养基。转染后的细胞经胰酶消化收集，pbs洗3次，用流式细胞仪检测细胞对dox的摄取率。为了比较是否包裹ph敏感型脂质体的swcnhs在a549细胞中的摄取情况。流式细胞定量分析的结果如附图4，图4a为a549细胞对psl-dox-o-swcnhs和dox-o-swcnhs载体阿霉素摄取的柱状图，图4b为流式线状图，图中的control代表不含药物的培养基。从图中可看出，a549细胞对dox-o-swcnhs和psl-dox-o-swcnhs的摄取高达100％，因此可见psl对swcnhs的摄取无影响。

实施例5极化因子il-21对巨噬细胞的极化作用

(1)细胞模型的建立：

a)因子的刺激，将a549细胞按1×10⁵个/ml浓度铺于6孔板，培养24h(37℃，5％co2)。给药前弃去旧培养基，每孔加入2ml含有一定浓度的lps或者il-4的新鲜培养基，轻轻摇匀，继续培养24h(37℃，5％co2)，弃培养基。刺激后的巨噬细胞，用pbs洗一遍，弃去pbs。

b)提取mrna

1、均质化：加入0.5ml的trizol试剂，吹散均匀，室温孵育5min；

2、相分离：加入0.1ml氯仿，用力摇15s，室温孵育3min。12000×g，4℃，15min，mrna存在与上层水相，取出0.2ml水相于新的1.5ml离心管中；

3、mrna沉淀：加入0.25ml异丙醇，室温孵育10min，12000×g，4℃，10min，离心后在管壁侧面形成凝胶状沉淀，弃上清；

4、mrna洗涤：加入75％的乙醇0.5ml，涡旋混合，7500×g，4℃，5min；

5、重新溶解：干燥mrna沉淀，避免其完全干燥(白色沉淀至无色)加入50μldepc水，溶解，60℃孵育10min；

6、测浓度，保存于-80℃。

c)将引物，cdna，荧光染料按一定比例混合后，用pcr仪测细胞因子水平。

本实施例中，所使用的inos序列的正向引物、反向引物的核苷酸序列表分别如seqidno.1-2所示。所使用的tgf-β序列的正向引物、反向引物的核苷酸序列表分别如seqidno.3-4所示。所使用的β-actin序列的正向引物、反向引物的核苷酸序列表分别如seqidno.5-6所示。

巨噬细胞经过il-4诱导为m2型巨噬细胞，lps刺激诱导为m1型巨噬细胞。m2型巨噬细胞低表达inos，高表达tgf-β；m1型巨噬细胞高表达inos，低表达tgf-β。图5中经过lps刺激后的细胞inos的表达增高(图5a)，经过il-4刺激后的细胞tgf-β的表达显著增高(图5b)，图中的control代表只给培养基。说明经过lps刺激后的细胞为m1型巨噬细胞，il-4刺激后的细胞为m2型巨噬细胞。

(2)将a549细胞按1×10⁵个/ml浓度铺于6孔板，培养24h(37℃，5％co2)。给药前弃去旧培养基，每孔加入2ml含有一定浓度il-4的新鲜培养基，轻轻摇匀，继续培养24h(37℃，5％co2)，弃培养基。刺激后的巨噬细胞，加入不同浓度的il-21再培养24h(37℃，5％co2)。弃培养基，用pbs洗一遍，弃去pbs。测其相关细胞因子的含量如图6。经过il-4刺激的巨噬细胞为m2型巨噬细胞，用il-21把m2型巨噬细胞极化为m1型巨噬细胞。结果如图，il-4刺激后inos的表达量降低，il-4刺激后经过il-21极化inos的水平增高，说明il-21在细胞水平上有极化作用。

实施例6

一种核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体，包括ph敏感型脂质体以及包裹在其中的氧化碳纳米角(o-swcnhs)，ph敏感型脂质体表面负载有肿瘤相关巨噬细胞的极化药物，氧化碳纳米角上负载有抗肿瘤药物，核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体的直径为100nm。其中，极化药物为唑来膦酸；ph敏感型脂质体为油酸(oa)和磷脂酰乙醇胺(pe)；抗肿瘤药物为紫杉醇。抗肿瘤药物与氧化碳纳米角的质量比为1:2，氧化碳纳米角与抗肿瘤药物的质量之和：ph敏感型脂质体与极化药物的质量之和＝1:4。

实施例7

一种核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体，包括ph敏感型脂质体以及包裹在其中的氧化碳纳米角(o-swcnhs)，ph敏感型脂质体表面负载有肿瘤相关巨噬细胞的极化药物，氧化碳纳米角上负载有抗肿瘤药物，核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体的直径为200nm。其中，极化药物为阿仑膦酸钠；ph敏感型脂质体为油酸(oa)和磷脂酰乙醇胺(pe)；抗肿瘤药物为多西紫杉醇和柔红霉素。抗肿瘤药物与氧化碳纳米角的质量比为1:4，氧化碳纳米角与抗肿瘤药物的质量之和：ph敏感型脂质体与极化药物的质量之和＝1:2。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>苏州大学

<120>核壳状碳纳米角/脂质体纳米载体及其制备方法

<141>2017-10-26

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>1

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>2

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>3

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>4

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>5

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>（人工序列）

<400>6