一种肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法与流程

本发明涉及医疗领域，具体为一种肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法。

背景技术：

世界卫生组织(who)globocan2012统计结果显示，与2008年统计所得的1270万新发病例和760万癌症相关死亡病例相比，2012年新增1410万例癌症病人，与癌症相关死亡820万例，截止到2012年，在过去5年里全球约有3260万病人被诊断为癌症。根据现有数据预计，随着全球人口增长和老龄化，到2025年，全球每年新增癌症病例数将高达1930万。中国有307万新增癌症患者及220万癌症死亡病例，分别占全球总量的21.9%和26.8%。由于我国目前环境污染，吸烟等问题仍较严重，在2025年前癌症发病率下降的可能性不大。肿瘤已成为严重威胁我国居民健康和社会发展的重大疾病，必须采取有效措施加强预防和管理。随着现代医学发展和分子生物学技术的提高，人们已经充分认识到化学药物结合生物治疗在恶性肿瘤多学科综合治疗中的重要性，发现能够指导放疗、化疗的生物标志物将有助于提高放疗、化疗的效果并减少其毒副作用，高效的生物分子靶向治疗在肿瘤的治疗中也占有越来越重要的地位。

技术实现要素：

本发明提供一种肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法，肿瘤的靶向治疗是指利用能够与肿瘤生长、进展和扩散相关的特异性分子相互作用的药物或其他物质，通过特异性地干预这些靶点而阻止肿瘤生长和扩散。目前靶向治疗主要集中在抗肿瘤药物的研制方面，它是个体化医学的基础，其特点是利用病人的基因组、核酸和蛋白的相关信息来预防、诊断和治疗肿瘤类疾病，可以有效解决上述背景技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法，包括如下种类：mirna与肿瘤靶向治疗、sirna与肿瘤靶向治疗、lncrna与肿瘤靶向治疗和核酸适配体(aptamer)与肿瘤靶向治疗，利用基因工程技术将上述核酸导入人体患病部位。

1）mirna与肿瘤靶向治疗

许多mirnas参与调控细胞的生命活动，与肿瘤发生相关的mirnas又被称为“oncomirs”，依据其主要的靶标是抑癌基因或癌基因，被分为促癌和抑癌的mirnas，与编码蛋白基因的转录本类似，pri-mirnas包括有5’帽子结构以及poly(a)尾，有时候会有内含子序列，每个pri-mirna会由部分互补序列形成一个茎环结构，在核内核糖核酸酶的作用下，drosha和它的分子伴侣dgcr8一起识别茎环结构并进一步介导pri-mirna形成pre-mirna中间体，在exportin-5/ran-gtp作用下pre-mirna进入胞浆后，在另一个核糖核酸酶dicer1作用下形成双链mirna分子，两条链均可产生成熟mirnas，但也可能仅有一条链变成有功能的mirna，而另一条链将很快降解，成熟mirna可以与argonaute蛋白联合形成一个rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex，risc)，从而由mirna引导该复合体到靶mrna的3’utr区阻断其翻译和(或)诱导其降解，肿瘤中mirna表达的改变可以导致基因表达的显著改变，并对肿瘤的发生和发展具有重要作用。

2）sirna与肿瘤靶向治疗

rnai治疗是指应用rna分子在转录后水平调节基因表达，从而调控基因的表达，rnai的序列选择的特异性以及有效抑制基因表达的能力，在真核生物体内、体外实验中均得到了证实；在肿瘤治疗方面，rnai已被用来抑制k-ras等基因突变诱导的肿瘤。rnai单独治疗或者联合其他药物可以增加肿瘤对一线治疗药物的敏感性，从而有效克服化疗药物耐受这一难题。mdr1编码的p-糖蛋白在多种药物耐药中起着重要的作用，在胰腺癌和胃癌中靶向mdr1的rnai可敲降90%mdr1的表达，在体外可降低89%的胰腺癌细胞及58%的胃癌细胞对道诺霉素(daunorubicin)的耐药。rnai具有可以沉默任何已知序列基因的特性，并且rnai只靶向沉默与其100%互补配对的靶基因，已成为基因功能研究的有力手段，同时也为肿瘤的靶向治疗提供了契机。

3）lncrna与肿瘤靶向治疗

长链非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)的概念是指其长度大于200nt且缺乏开放阅读框的rna，lncrna可以在转录、翻译和转录后水平对基因的表达进行调控。malat1(metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1)系一种lncrna，其最先在转移相关基因分析中被发现并定义。malat1在大部分人类正常组织中广泛表达，包括胰腺和肺，但是在皮肤、胃、骨髓以及子宫等组织中表达缺乏，提示malat1可能具有组织特异性功能，malat1在子宫内膜间质肉瘤、宫颈癌以及肝癌中高表达，而在相对应的正常组织中表达低甚至检测不到。又如，hoxtranscriptantisenserna(hotair)是从hoxc基因位点转录生成，通过反式调控方式抑制跨越40kd的hoxd基因位点的染色质的活性从而导致hoxd基因的转录抑制。hotair与乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤的增殖和转移相关，hotair通过与prc2复合体相互作用促进h3k27三甲基化，从而导致多个基因的转录抑制，特别是与转移相关的基因。

4）核酸适配体(aptamer)与肿瘤靶向治疗

aptamer是碱基数为20-80的单链核酸，既可以是dna也可以是rna，因为aptamer可以与靶标特异性结合，其结合强度与结合特异性与传统抗体相当，故又称为化学抗体，目前核酸适配体己经成功应用到肿瘤标记物发现、肿瘤诊断、肿瘤成像以及肿瘤治疗中，系非常有应用前景的核酸类化合物。

根据上述技术方案，所述rna根据长度可以分为三类：1、短链非编码rna：这类rna长度在17-30nt之间，如microrna；2、中等长度非编码rna：长度介于20-200nt；3、长链非编码rna，如lncrna。

根据上述技术方案，对于促癌性的mirna主要治疗手段有：抗-mirna的寡聚核苷酸、mirna海绵(mirnasponges)、mirna罩等；而对于抑癌的mirnas，通过恢复这些mirnas的表达将是有效的治疗手段。

（一）抗-mirna的寡聚核苷酸，mirna的显著抑制分子即抗-mirna寡聚核苷酸(anti-mirnaoligonucleotides，amos)，可以竞争性地抑制mirna与其靶mrnas的结合；

（二）mirna海绵(mirnasponges)，被定义为包含有多个内源性mirna结合位点的合成mrna，从而阻止mirna与其内源性靶标的相互作用；

（三）mirna罩，即可以与内源性mirna完全互补的一段序列，mirna罩与靶mrna具有较高的亲和性并可形成二聚体，从而阻断mirna与其结合位点的结合，并避免了amos介导mrna降解时的潜在副作用；

（四）恢复具有抑癌作用mirnas的表达。人们设想恢复具有抑癌作用mirnas的表达可能像恢复蛋白编码抑癌基因的表达一样具有抑癌作用，比如抑制lin28而恢复let-7的表达来抑制肿瘤的生长。

根据上述技术方案，针对lncrna的靶向治疗策略主要有：小干扰rna(sirna)、反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，aso)、核糖酶(ribozyme)、适配体(aptamer)、小分子化合物、转录后加工通路以及靶向lncrnas的mirnas等。

（一）sirna，所述sirna是长约21-25nt的双链rna序列，在胞浆中sirna与rna-诱导沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex，risc)相互作用诱导mrna的降解，从而介导目标rna的转录后沉默；

（二）反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，aso)，是针对目标rna设计的、长度在8-50nt之间的、短的单链dnas或者rnas；

（三）核糖酶(ribozyme)，其在细胞内rna的合成过程中起催化作用，它的分子功能之一是降解rna分子。核糖酶具有抑癌作用，核糖酶的应用可能弥补sirnas设计中的不足；

（四）适配体(aptamer)，系短的dna或者rna寡核苷酸链或者多肽，在体内具有稳定的三维结构，并且可以依据lncrna的三维结构特异性地结合到相应的靶标；

（五）小分子化合物，可特异性地结合到目标lncrna的rna结合带，与蛋白因子或者细胞内小的配体竞争性地与lncrna结合，特异性阻断lncrna的功能途径。另外，小分子与lncrna的结合可导致lncrna分子构象改变，或者阻碍重要的lncrna三维结构的形成，从而阻抑lncrna功能的发挥。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法包括：核酸适配体(aptamer)与肿瘤靶向治疗相关的方法三种：

（一）以肿瘤细胞作为靶标分离肿瘤标记物。目前以肿瘤细胞作为靶标的selex(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术分离肿瘤标记物的研究很多，该方法发现的肿瘤标记物在未来肿瘤的靶向治疗上具有重要意义。aptamer是碱基数为20~80的单链核酸，既可以是dna也可以是rna。因为aptamer可以与靶标特异性结合，其结合强度与结合特异性与传统抗体相当，故又称为化学抗体；

（二）以肿瘤蛋白质组为靶标，应用selex筛选核酸aptamers的方法分离和鉴定肿瘤标志物。考虑到肿瘤的发生、发展是一个多基因共同参与的过程，单蛋白、单靶标的研究方法不能很好地满足实际需要，以肿瘤病人的血清或者肿瘤细胞的蛋白质组作为selex的筛选靶标对发现诊断标记物具有重要意义；

（三）aptamer直接应用于肿瘤治疗。aptamer的许多特性与抗体相似，如亲和性及特异性。同时，aptamer与蛋白质的结合多在其活性区域，因此与抗体一样，aptamer也可以直接用于肿瘤的靶向治疗。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法包括：在前列腺癌中通过应用sirna下调lncrnamalat的表达，进而抑制了前列腺癌细胞的生长、侵袭和迁移；同时诱导去势抵抗性前列腺癌细胞周期阻滞在g0/g1期。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法还包括：所述aptamer序列较小，免疫原性低，不会引起人体的免疫反应，而单克隆抗体多源于小鼠，容易产生机体的免疫反应；且aptamer可以反复冻融易于保存，而抗体蛋白要求一定的保存条件。

与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明的治疗过程无副作用，患者治疗过程较为轻松。肿瘤的靶向治疗是指利用能够与肿瘤生长、进展和扩散相关的特异性分子相互作用的药物或其他物质，通过特异性地干预这些靶点而阻止肿瘤生长和扩散。目前靶向治疗主要集中在抗肿瘤药物的研制方面，它是个体化医学的基础，其特点是利用病人的基因组、核酸和蛋白的相关信息来预防、诊断和治疗肿瘤类疾病，与药物治疗和放射治疗相比，副作用极低，系从基因层次进行治疗，病人无需忍受化疗和放疗的痛苦过程，实用性更强。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

在附图中

图1为本发明的流程框图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：如图1所示，本发明提供一种肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法，包括如下种类：mirna与肿瘤靶向治疗、sirna与肿瘤靶向治疗、lncrna与肿瘤靶向治疗和核酸适配体(aptamer)与肿瘤靶向治疗，利用基因工程技术将上述核酸导入人体患病部位；

1）mirna与肿瘤靶向治疗

许多mirnas参与调控细胞的生命活动，与肿瘤发生相关的mirnas又被称为“oncomirs”，依据其主要的靶标是抑癌基因或癌基因，被分为促癌和抑癌的mirnas，与编码蛋白基因的转录本类似，pri-mirnas包括有5’帽子结构以及poly(a)尾，有时候会有内含子序列，每个pri-mirna会由部分互补序列形成一个茎环结构，在核内核糖核酸酶的作用下，drosha和它的分子伴侣dgcr8一起识别茎环结构并进一步介导pri-mirna形成pre-mirna中间体，在exportin-5/ran-gtp作用下pre-mirna进入胞浆后，在另一个核糖核酸酶dicer1作用下形成双链mirna分子，两条链均可产生成熟mirnas，但也可能仅有一条链变成有功能的mirna，而另一条链将很快降解，成熟mirna可以与argonaute蛋白联合形成一个rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex，risc)，从而由mirna引导该复合体到靶mrna的3’utr区阻断其翻译和(或)诱导其降解，肿瘤中mirna表达的改变可以导致基因表达的显著改变，并对肿瘤的发生和发展具有重要作用。

2）sirna与肿瘤靶向治疗

rnai治疗是指应用rna分子在转录后水平调节基因表达，从而调控基因的表达，rnai的序列选择的特异性以及有效抑制基因表达的能力，在真核生物体内、体外实验中均得到了证实；在肿瘤治疗方面，rnai已被用来抑制k-ras等基因突变诱导的肿瘤。rnai单独治疗或者联合其他药物可以增加肿瘤对一线治疗药物的敏感性，从而有效克服化疗药物耐受这一难题。mdr1编码的p-糖蛋白在多种药物耐药中起着重要的作用，在胰腺癌和胃癌中靶向mdr1的rnai可敲降90%mdr1的表达，在体外可降低89%的胰腺癌细胞及58%的胃癌细胞对道诺霉素(daunorubicin)的耐药。rnai具有可以沉默任何已知序列基因的特性，并且rnai只靶向沉默与其100%互补配对的靶基因，已成为基因功能研究的有力手段，同时也为肿瘤的靶向治疗提供了契机。

3）lncrna与肿瘤靶向治疗

长链非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)的概念是指其长度大于200nt且缺乏开放阅读框的rna，lncrna可以在转录、翻译和转录后水平对基因的表达进行调控。malat1(metastasis-associatedlungadenocarcinomatranscript1)系一种lncrna，其最先在转移相关基因分析中被发现并定义。malat1在大部分人类正常组织中广泛表达，包括胰腺和肺，但是在皮肤、胃、骨髓以及子宫等组织中表达缺乏，提示malat1可能具有组织特异性功能，malat1在子宫内膜间质肉瘤、宫颈癌以及肝癌中高表达，而在相对应的正常组织中表达低甚至检测不到。又如，hoxtranscriptantisenserna(hotair)是从hoxc基因位点转录生成，通过反式调控方式抑制跨越40kd的hoxd基因位点的染色质的活性从而导致hoxd基因的转录抑制。hotair与乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤的增殖和转移相关，hotair通过与prc2复合体相互作用促进h3k27三甲基化，从而导致多个基因的转录抑制，特别是与转移相关的基因。

4）核酸适配体(aptamer)与肿瘤靶向治疗

aptamer是碱基数为20~80的单链核酸，既可以是dna也可以是rna，因为aptamer可以与靶标特异性结合，其结合强度与结合特异性与传统抗体相当，故又称为化学抗体，目前核酸适配体己经成功应用到肿瘤标记物发现、肿瘤诊断、肿瘤成像以及肿瘤治疗中，系非常有应用前景的核酸类化合物。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法包括：微小rna(microrna)是一类由内源基因编码的、长度约为18-25nt的非编码单链rna分子，可以导致mrna的降解。所述rna根据长度可以分为三类：1、短链非编码rna：这些rna长度在17-30nt之间，如microrna；2、中等长度非编码rnas：长度介于20-200nt；3、长链非编码rna，如lncrna。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法包括：对于促癌性的mirna主要治疗手段有：抗-mirna的寡聚核苷酸、mirna海绵(mirnasponges)、mirna罩等；而对于抑癌的mirnas，通过恢复这些mirnas的表达将是有效的治疗手段。

（一）抗-mirna的寡聚核苷酸，mirna的显著抑制分子即抗-mirna寡聚核苷酸(anti-mirnaoligonucleotides，amos)，可以竞争性地抑制mirna与其靶mrnas的结合；

（二）mirna海绵(mirnasponges)，被定义为包含有多个内源性mirna结合位点的合成mrna，从而阻止mirna与其内源性靶标的相互作用；

（三）mirna罩，即可以与内源性mirna完全互补的一段序列，mirna罩与靶mrna具有较高的亲和性并可形成二聚体，从而阻断mirna与其结合位点的结合，并避免了amos介导mrna降解时的潜在副作用；

（四）恢复具有抑癌作用mirnas的表达。人们设想恢复具有抑癌作用mirnas的表达可能像恢复蛋白编码抑癌基因的表达一样具有抑癌作用，比如抑制lin28而恢复let-7的表达来抑制肿瘤的生长。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法包括：针对lncrna的靶向治疗策略主要有：小干扰rna(sirna)、反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，aso)、核糖酶(ribozyme)、适配体(aptamer)、小分子化合物、转录后加工通路以及靶向lncrnas的mirnas等。

（一）sirna，所述sirna是长约21-25nt的双链rna序列，在胞浆中sirna与rna-诱导沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex，risc)相互作用而诱导mrna的降解，从而介导目标rna的转录后沉默；

（二）反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，aso)，是针对目标rna设计的、长度在8-50nt之间的、短的单链dnas或者rnas；

（三）核糖酶(ribozyme)，其在细胞内rna的合成过程中起催化作用，它的分子功能之一是降解rna分子。核糖酶具有抑癌作用，核糖酶的应用可能弥补sirnas设计中的不足；

（四）适配体(aptamer)，系短的dna或者rna寡核苷酸链或者多肽，在体内具有稳定的三维结构，并且可以依据lncrna的三维结构特异性地结合到相应的靶标；

（五）小分子化合物，可特异性地结合到目标lncrna的rna结合带，与蛋白因子或者细胞内小的配体竞争性地与lncrna结合，特异性阻断lncrna的功能途径。另外，小分子与lncrna的结合可导致lncrnas分子构象改变，或者阻碍重要的lncrna三维结构的形成，从而阻抑lncrnas功能的发挥。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法包括：核酸适配体(aptamer)与肿瘤靶向治疗相关的方法有：

（一）以肿瘤细胞作为靶标分离肿瘤标记物。目前以肿瘤细胞作为靶标的selex(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)技术分离肿瘤标记物的研究很多，该方法发现的肿瘤标记物在未来肿瘤的靶向治疗上具有重要意义。aptamer是碱基数为20~80的单链核酸，既可以是dna也可以是rna。因为aptamer可以与靶标特异性结合，其结合强度与结合特异性与传统抗体相当，故又称为化学抗体；

（二）以肿瘤蛋白质组为靶标，应用selex筛选核酸aptamers的方法分离和鉴定肿瘤标志物。考虑到肿瘤的发生、发展是一个多基因共同参与的过程，单蛋白、单靶标的研究方法不能很好地满足实际需要，以肿瘤病人的血清或者肿瘤细胞的蛋白质组作为selex的筛选靶标对发现诊断标记物具有重要意义；

（三）aptamer直接应用于肿瘤治疗。aptamer的许多特性与抗体相似，如亲和性及特异性。同时，aptamer与蛋白质的结合多在其活性区域，因此与抗体一样，aptamer也可以直接用于肿瘤的靶向治疗。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法包括：在前列腺癌中通过应用sirna下调lncrnamalat的表达，进而抑制了前列腺癌细胞的生长、侵袭和迁移；同时诱导去势抵抗性前列腺癌细胞周期阻滞在g0/g1期。

根据上述技术方案，所述肿瘤的基于核酸的靶向治疗方法还包括：所述aptamer序列较小，免疫原性低，不会引起人体的免疫反应，而单克隆抗体多源于小鼠，容易产生机体的免疫反应；且aptamer可以反复冻融易于保存，而抗体蛋白要求一定的保存条件。

基于上述，本发明的优点在于，治疗过程无副作用，患者治疗过程较为轻松，肿瘤的靶向治疗是指利用能够与肿瘤生长、进展和扩散相关的特异性分子相互作用的药物或其他物质，通过特异性地干预这些靶点而阻止肿瘤生长和扩散。目前靶向治疗主要集中在抗肿瘤药物的研制方面，它是个体化医学的基础，其特点是利用病人的基因组、核酸和蛋白的相关信息来预防、诊断和治疗肿瘤类疾病，与药物治疗和放射治疗相比，副作用极低，系从基因层次进行治疗，病人无需忍受化疗和放疗的痛苦过程，实用性更强。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。