本发明属于心脏植入材料技术领域，具体涉及一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法。
背景技术：
心肌梗塞会导致心肌损失和非收缩性瘢痕组织的形成。虽然手术和药物治疗能提高生存的可能性，但这些干预措施不能弥补心肌细胞的损失。因此，需要继续寻求新的策略来恢复受损心脏的结构和功能特征。在这些策略中，从适合细胞接种的生物材料中产生心肌样生物替代物的方法是有希望的。
原生心脏组织是高度各向异性的，人类已经开发了许多再生心肌纤维定向特征支架的制造方法。近年来，纤维材料作为心肌组织修复的平台被广泛研究，因为它们具有独特的机械强度，柔韧性以及与增强细胞附着、生长和分化的细胞外基质蛋白相似的结构。值得注意的是，这种支架以天然或合成聚合物为原料，通过静电纺丝制得，既快速又经济。目前支架的案子制备一方面是合成聚合物：如聚乳酸(聚乳酸)，聚己内酯(pcl)和聚(d,l-丙交酯-共-乙醇酸)(plga)，因为其良好的机械性能和低的降解性而用于再生心脏组织的纤维支架。另一方面是天然聚合物：如蛋白质和多糖，可以更有效地复原和支持细胞。因此，将天然聚合物：胶原蛋白，弹性蛋白，壳聚糖和明胶用于心脏组织工程的支架。
在这些聚合物中，聚乳酸和壳聚糖引起了最大的关注。聚乳酸是具有疏水和线性结构、好的生物相容性及可生物降解的无毒聚酯，且具有优异的可纺性。另一方面，壳聚糖有优异的消炎抗菌性、生物相容性、生物可降解性以及促使伤口愈合等生物性能，它是与生长因子，细胞受体和粘附蛋白相互作用的亲水性多糖，它及其衍生物已得到了人们极大的关注并被广泛应用于生物医药领域。然而，壳聚糖具有差的机械性能，并且由于溶解度有限，分子量高，甚至在低浓度下会形成非常粘稠和抗流动的水凝胶，因此非常难以电纺丝。此外，壳聚糖纤维强度过低，严重影响了其下游产品的开发，人们采用了许多方法试图改善壳聚糖纤维的拉伸强度。因此，壳聚糖通常与其它合成聚合物混合以改善电纺丝性能和其它性能。而电纺聚乳酸/壳聚糖纳米纤维在心脏组织工程中的应用报道还很少。
传统金属支架在使用的过程中，金属支架丝永久性地存在于血管中，会发生支架内血栓、支架内再狭窄这些并发症，表现为造成内膜增生，大量平滑肌细胞增殖及细胞外基质分泌增加，可能会引起心绞痛、心肌梗死，约20％的患者可能存在急性心肌酶阳性，而一旦发生，患者一般需要再次进行介入治疗，受支架丝的影响，处理起来也更困难，常常需要支架里套支架，这本身也增加了支架内血栓的发生风险。还有少见的并发症包括：支架丝断裂等等。同时，支架丝撑在那里，血管就被禁锢了，正常血管的收缩和舒张运动受到限制，得不到自由。
因此，本领域需要开发一种机械强度更高、生物相容性更好、扩张性能可靠的复合材料支架，从而避免传统金属支架植入后引起的皮内细胞结构和功能受损、支架内血栓和内再狭及心绞痛、心肌梗死等问题的出现，并解决普通生物可吸收心脏支架材料使用过程中支撑力差的局限性。
技术实现要素：
针对现有技术中的问题，本发明提供一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，该方法制备的心脏支架可消除支架内血栓形成和再狭窄的风险，可恢复支架植入段血管的收缩功能、增加管腔直径，进一步缓解心绞痛，它还支持心肌细胞生长发育，引导细胞伸长，增加肌节α辅肌动蛋白和肌钙蛋白ⅰ的产生。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，该制备方法包括医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维膜的制备以及通过交联法制备聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架。
其中，所述医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维膜的制备步骤如下：
(1)配置聚乳酸/壳聚糖溶液：
s1，将聚乳酸和壳聚糖分别干燥处理；
s2，将聚乳酸加入到有机溶剂中，在室温中搅拌溶解；
s3，将壳聚糖加入至s2的溶液中，充分混合得到稳定均一的溶液；
(2)医用级聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜的制备：
s4，调节环境湿度为40-50％，将s3得到的溶液装入注射器中进行静电纺丝，并在铝箔覆盖的平板上收集，得到医用级聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜，所述纺丝注射器的针管外径为0.7-1.2mm，电压5-30kv，推进速度1-4ml/h，接收距离10-30cm；
s5，将医用级聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜真空室温干燥24-72h，去除残余溶剂。
其中，所述医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架通过以下方法制备得到：
s6，将医用级聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜放在质量分数为0.25％戊二醛溶液上层密封交联反应6-12h，然后浸泡至0.1mol/l甘氨酸水溶液中10-20h，取出后用蒸馏水轻轻洗涤3-6次；
s7，将洗涤后的医用级聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜浸泡在ph为7.2-7.4的磷酸盐缓冲液中16-32小时，取出后用蒸馏水再次清洗3-5次并在室温下干燥过夜，最后-20℃储存，得到聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架。
作为改进，所述聚乳酸的重均分子量为5-50万。
作为改进，所述聚乳酸与有机溶剂的重量比为0.1-0.5。
作为改进，所述壳聚糖的重均分子量为0.5-2万，其中，脱乙酰基为85％。
作为改进，所述有机溶剂采用三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂、二甲基甲酰胺和四氢呋喃的混合溶剂、丙酮和氯仿的混合溶剂中的一种。
作为改进，所述聚乳酸与壳聚糖的重量比例为1-10。
作为改进，所述交联剂采用乙二醛、戊二醛或两者的混合物。
从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
1.本发明制备的复合纳米纤维支架消除支架内血栓形成和再狭窄的风险，恢复支架植入段血管的收缩功能、增加管腔直径，进一步缓解心绞痛。
2.本发明制备的复合纳米纤维支架支持心肌细胞生长发育，引导细胞伸长，增加肌节α辅肌动蛋白和肌钙蛋白ⅰ的产生。
3.本发明制备的复合纳米纤维支架具有机械强度更高、生物相容性更好、扩张性能可靠的特点
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但并非是对本发明的进一步限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均购于常规生化试剂厂商。其中溶剂均为分析纯，未经纯化使用。
实施例1
一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，该制备方法包括医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维膜的制备以及通过交联法制备聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架：
(1)聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜的制备：
配制聚乳酸/壳聚糖溶液：将聚乳酸(mw＝15万)在真空干燥箱中60℃干燥过夜，壳聚糖在110℃下干燥24h；将三氟乙酸和二氯甲烷以80:20(v:v)的比例混合；将2.5g聚乳酸溶解在10g上述混合液中并在室温下搅拌12小时，再加入壳聚糖(mw＝1万)1g并充分混合。
静电纺丝法制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜：将聚合物溶液装入5ml注射器中，注射器的针管外径为0.70mm，在环境湿度43％，电压20kv，推进速度1ml/h，接收距离15cm的条件下进行静电纺丝，采用铝箔覆盖的平板收集，得到聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜。将收集的纤维膜在室温下真空干燥2天。
(2)聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备：
将聚乳酸/壳聚糖膜片置于戊二醛蒸气环境中8小时。然后将膜片浸于0.1mol/l甘氨酸水溶液中12h，取出后用蒸馏水轻轻洗涤3次，再将膜片在磷酸盐缓冲液中浸泡24小时，取出后用蒸馏水再次清洗3次并在室温下干燥过夜，最后-20℃储存。
以目前采用的聚乳酸纳米纤维作为对比例，实施例1与对比例进行机械强度比对：
经比对，复合纳米纤维具有更佳的机械强度，应变性更好，张力更佳，完全可以取代聚乳酸纳米纤维。
实施例2
一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，该制备方法包括医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维膜的制备以及通过交联法制备聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架：
(1)聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜的制备：
配制聚乳酸/壳聚糖溶液：将聚乳酸(mw＝30万)在真空干燥箱中60℃干燥过夜，壳聚糖在110℃下干燥24h。将二甲基甲酰胺和四氢呋喃以70:30(v:v)的比例混合，将4.0g聚乳酸溶解在10g上述混合液中并在室温下搅拌16小时，再加入壳聚糖(mw＝1万)1g并充分混合。
静电纺丝法制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜：将聚合物溶液装入5ml注射器中，注射器的针管外径为0.70mm，在环境湿度45％，电压25kv，推进速度2ml/h，接收距离20cm的条件下进行静电纺丝，采用铝箔覆盖的平板收集，得到聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜。将收集的纤维膜在室温下真空干燥2天。
(2)聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备：
将聚乳酸/壳聚糖膜片置于戊二醛蒸气环境中10小时。然后将膜片浸于0.1mol/l甘氨酸水溶液中16h，取出后用蒸馏水轻轻洗涤5次，再将膜片在磷酸盐缓冲液中浸泡24小时，取出后用蒸馏水再次清洗4次并在室温下干燥过夜，最后-20℃储存。
实施例3
一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，该制备方法包括医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维膜的制备以及通过交联法制备聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架：
(1)聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜的制备：
配制聚乳酸/壳聚糖溶液：将聚乳酸(mw＝5万)在真空干燥箱中60℃干燥过夜，壳聚糖在110℃下干燥24h；将丙酮和氯仿的混合溶剂以90:10(v:v)的比例混合；将1g聚乳酸溶解在10g上述混合液中并在室温下搅拌12小时，再加入壳聚糖(mw＝0.5万)1g并充分混合。
静电纺丝法制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜：将聚合物溶液装入5ml注射器中，注射器的针管外径为0.70mm，在环境湿度40％，电压5kv，推进速度1ml/h，接收距离10cm的条件下进行静电纺丝，采用铝箔覆盖的平板收集，得到聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜。将收集的纤维膜在室温下真空干燥2天。
(2)聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备：
将聚乳酸/壳聚糖膜片置于戊二醛蒸气环境中8小时。然后将膜片浸于0.1mol/l甘氨酸水溶液中12h，取出后用蒸馏水轻轻洗涤3次，再将膜片在磷酸盐缓冲液中浸泡24小时，取出后用蒸馏水再次清洗3次并在室温下干燥过夜，最后-20℃储存。
实施例4
一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，该制备方法包括医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维膜的制备以及通过交联法制备聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架：
(1)聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜的制备：
配制聚乳酸/壳聚糖溶液：将聚乳酸(mw＝50万)在真空干燥箱中60℃干燥过夜，壳聚糖在110℃下干燥24h；将三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂以50:50(v:v)的比例混合；将5g聚乳酸溶解在10g上述混合液中并在室温下搅拌12小时，再加入壳聚糖(mw＝2万)1g并充分混合。
静电纺丝法制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜：将聚合物溶液装入5ml注射器中，注射器的针管外径为1.20mm，在环境湿度50％，电压30kv，推进速度4ml/h，接收距离30cm的条件下进行静电纺丝，采用铝箔覆盖的平板收集，得到聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜。将收集的纤维膜在室温下真空干燥2天。
(2)聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备：
将聚乳酸/壳聚糖膜片置于戊二醛蒸气环境中8小时。然后将膜片浸于0.1mol/l甘氨酸水溶液中12h，取出后用蒸馏水轻轻洗涤3次，再将膜片在磷酸盐缓冲液中浸泡24小时，取出后用蒸馏水再次清洗3次并在室温下干燥过夜，最后-20℃储存。
实施例5
一种用于心脏组织工程的聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备方法，该制备方法包括医用级聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维膜的制备以及通过交联法制备聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架：
(1)聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜的制备：
配制聚乳酸/壳聚糖溶液：将聚乳酸(mw＝25万)在真空干燥箱中60℃干燥过夜，壳聚糖在110℃下干燥24h；将三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶剂以50:50(v:v)的比例混合；将5g聚乳酸溶解在10g上述混合液中并在室温下搅拌12小时，再加入壳聚糖(mw＝1万)0.5g并充分混合。
静电纺丝法制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜：将聚合物溶液装入5ml注射器中，注射器的针管外径为1.1mm，在环境湿度45％，电压30kv，推进速度4ml/h，接收距离30cm的条件下进行静电纺丝，采用铝箔覆盖的平板收集，得到聚乳酸/壳聚糖纳米纤维膜。将收集的纤维膜在室温下真空干燥2天。
(2)聚乳酸/壳聚糖复合纳米纤维支架的制备：
将聚乳酸/壳聚糖膜片置于戊二醛蒸气环境中8小时。然后将膜片浸于0.1mol/l甘氨酸水溶液中12h，取出后用蒸馏水轻轻洗涤3次，再将膜片在磷酸盐缓冲液中浸泡24小时，取出后用蒸馏水再次清洗3次并在室温下干燥过夜，最后-20℃储存。
综上所述，本发明具有以下优点：
1.本发明制备的复合纳米纤维支架消除支架内血栓形成和再狭窄的风险，恢复支架植入段血管的收缩功能、增加管腔直径，进一步缓解心绞痛。
2.本发明制备的复合纳米纤维支架支持心肌细胞生长发育，引导细胞伸长，增加肌节α辅肌动蛋白和肌钙蛋白ⅰ的产生。
3.本发明制备的复合纳米纤维支架具有机械强度更高、生物相容性更好、扩张性能可靠的特点
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。