本发明属于中药领域，涉及一种增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物及其应用。
背景技术：
随着时间的推移，所有个体都会发生功能性和器质性衰退的渐进过程，即衰老。衰老又称老化，是生命活动进程中的必经阶段。免疫是指机体接触“抗原性异物”或“异己成分”的一种特异性生理反应。免疫系统对维持机体正常生理功能具有重要意义。当人们营养素摄入不足(蛋白质、维生素、微量元素等缺乏)时会造成机体抵抗力下降，免疫力低下的身体易于被感染或患癌症；免疫力超常也会产生对身体有害的结果，如引发过敏反应、自身免疫疾病等。中青年人在工作和生活的双重压力下，过度消耗与透支体能，免疫力低下，且组织器官提前衰老也趋于年轻化。人们不断寻求可以健康长寿，提高免疫力，战胜各种疾病，提高身体机能的方法，以提高生活质量。因此需要不断开发具有抗衰功能的药食同源的保健品。
冬虫夏草[cordycepssinensis(berk.)sacc.]是我国医药宝库中与野生人参、鹿茸全称为“三大宝”中的一宝，享有极高的声誉。该药具有益精髓，补虚损、保肺、益肾、止血、化痰等功效，主要用于久咳虚喘、劳嗽咯血、阳痿遗精、腰膝酸痛等症。但由于其生长条件要求高，目前濒于灭绝，被列为国家重点保护野生植物(ii级)，2016年国家食品药品监督管理局印发通知停止冬虫夏草用于保健食品试点工作(食药监食监三【2016】21号)。冬虫夏草急需寻找合适的替代品。
拟青霉属paecilomyces是虫生真菌中的重要类群，已记录约50种，其中许多是害虫的重要自然控制因子，有些是害虫生物防治的重要材料；其中有些种是重要药用真菌资源虫草属cordyceps的无性型，有的种如蝉拟青霉p.cicadae(miquel)samson还可直接入药。粉拟青霉p.farinosus(holmexgray)brown、玫烟色拟青霉p.umosoroseus(wize)brown&smith和淡紫拟青霉p.lilacinus(thom.)samaon已在前苏联和菲律宾等国注册应用。
拟青霉属真菌的菌丝体及代谢产物具有一定的药用价值，对于这方面的研究主要集中在古尼拟青霉、细脚拟青霉以及蝉拟青霉上，已有研究显示古尼拟青霉具有镇静、镇痛、改善记忆、降低肿瘤活细胞率等药理作用；细脚拟青霉确有增强免疫力、抗癌、增强肺、肾功能、防止动脉硬化、预防贫血、增加小鼠常压耐缺氧、镇痛和镇静和有利于爱滋病恢复等作用；蝉拟青霉能改善脂质物质代谢和保护脏器组织的作用，具有镇静、镇痛、抗辐射、抗惊厥、抗衰老和解热作用，且毒性极小，但对于其他拟青霉菌株研究较少。且目前对拟青霉菌的利用上，除了蛹草拟青霉接种成蛹虫草外，大多均停留在菌丝体的开发利用上。
为了克服已有开发利用的局限性，需要开发能够从根本上治疗病因并有效地改善疾病症状的新药。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物及其应用。
本发明的另一目的是提供增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物及其制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物，主要由古尼拟青霉菌蛹基虫草20～70份，细脚拟青霉菌蛹基虫草20～40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草1～10份组成，优选为由古尼拟青霉菌蛹基虫草50～70份，细脚拟青霉菌蛹基虫草30～40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草2～5份组成。
所述的增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物在制备增强免疫力抗衰老药物中的应用。
一种增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物的制备方法，包括如下步骤：
a.将各组分干燥后粉碎，目数不少于20目；
b.将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到本发明中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：古尼拟青霉菌蛹基虫草20～70份，细脚拟青霉菌蛹基虫草20～40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草1～10份组成，优选为由古尼拟青霉菌蛹基虫草50～70份，细脚拟青霉菌蛹基虫草30～40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草2～5份组成。
c.组合物进一步制成粉剂、片剂、胶囊或口服液。
其中，所述古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草、玫烟色拟青霉菌蛹基虫草三种原料粉碎的目数为20-80目。
按照上述方法制备的增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物。
所述的增强免疫力抗衰老的拟青霉菌蛹基虫草组合物采用天然原材料制备而成，具有增强免疫力、抗衰老、缓解体力疲劳、辅助改善记忆等功能。本发明活性优于各原料的单一使用，且优于冬虫夏草，为增强免疫力抗衰老药物的开发提供了新方式。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步阐述，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。本发明的实验动物，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心(生产许可证号：scxk(军)2007-004)。
实施例1不同拟青霉菌株接种效果的比较
对7种以鳞翅目为寄主的拟青霉菌株(拟青霉、蛹草拟青霉、古尼拟青霉、环链拟青霉、细脚拟青霉、蝉拟青霉、玫烟色拟青霉)为供试菌株，将所试菌株分别接种于pda培养基上，26℃恒温培养14d，用灭菌的打孔器(直径1cm)切取带菌的琼脂片，并将其置于装有玻璃珠的30ml0.1％吐温-80的无菌水中，振荡30min，待分生孢子完全被打散均匀后，用无菌脱脂纱布过滤，获得孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子浓度，并计算出每菌株的产孢量(每菌株设3个重复)，最后将孢子悬浮液浓度均稀释为1×107个/ml。
在超净工作台上采用注射法接种，用1ml注射器给每只蚕蛹注射0.1ml左右菌液，以菌液不溢出为宜，以免体表滋生杂菌、引起交叉感染。注射部位选取翼翅正后方与第3环节交叉点。接种时注射器针头插入蛹体表层1mm左右，然后让针头与蛹体平行，向前推进3mm左右，注入菌液，迅速抽出针头即可，其余接种部位仅需直接插入蛹体表层1mm左右，注入菌液即可。
接种后移至恒温培养箱中避光、25℃培养约一个月。转色后，通散射光、18-22℃、湿度保持在85％-90％培养至采收。
在接种箱无菌条件下接种，在20-25℃，相对湿度85％-90％下菌丝暗培养时间按照正交试验设计，分别培养2、3、4d。菌丝培养完毕后，进行光照培养，诱导子实体原基产生，1000lx每天光照(9.5-10)h。子实体原基有少量出现时，用0.2mm粗的针扎孔进行通气，每瓶扎5个孔。培养45d后，子实体顶端膨大，即可进行收采。
接种后硬化茧数、硬化率、出草率和虫草平均鲜重：硬化率是指蚕蛹接种3-5d后硬化的蚕蛹与接种蚕蛹总数的比值；出草率是指硬化后长出子实体的蚕蛹与硬化蚕蛹总数的比值；虫草平均鲜重是指蚕蛹虫草的总鲜重与出草蚕蛹总数的比值。
表1不同菌株接种蚕蛹接种效果比较研究
表1数据也可以看出拟青霉菌株，其硬化率较低，出草后的子实体品质低。蛹草拟青霉、玫烟色拟青霉两个菌种，其接种后的硬化率分别达到98％和99.3％；出草率分别达到96.7％和98.6％，子实体品质也较高。除了拟青霉菌株，其余六种拟青霉菌在硬化率、出草率和虫草平均鲜重三个指标方面无显著性差异。
实施例2不同蚕蛹-拟青霉菌株子实体对血虚小鼠免疫活力的影响比较研究
动物分组及处理：取icr小鼠，随机分为正常组，模型组，阳性对照(香菇多糖组)，接种后子实体(拟青霉、蛹草拟青霉、古尼拟青霉、环链拟青霉、细脚拟青霉、蝉拟青霉、玫烟色拟青霉)单剂量组，共10组，每组20只。试验组小鼠按剂量分别灌胃给药(0.4ml)，正常组与模型组小鼠同时灌服等容量生理盐水，阳性对照组灌服香菇多糖水溶液0.4ml，每日1次，连续15天。从第12天起模型组与给药组小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg·kg-1，连续3天，正常组小鼠同时注射等体积生理盐水。
指标的检测：各组于第15天末次给药1.0小时后，每组10只尾静脉注射用生理盐水稀释5倍的印度墨汁10ml/kg体质量，立即计时。于注射后2min(t1)，12min(t2)分别从内眦静脉丛取血20μl，加到2ml0.1％na2co3溶液中摇匀，以na2co3溶液作空白对照，用分光光度计在600nm波长处测吸光度值(a)。第2次采血结束后，立即处死小鼠，称体重；取胸腺、肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污后称其湿重，计算脾指数和胸腺指数。脾指数(mg/g)＝脾重量(mg)/体重(g)；胸腺指数(mg/g)＝胸腺重量(mg)/体重(g)。另10只小鼠行摘眼球取血，测外周血象。计算吞噬指数，按下列公式计算廓清指数k和校正廓清指数α。
k＝(lga1－lga2)/(t2－t1)；α＝k1/3×体重/(肝脏重量+脾脏重量)。
其中a为血样吸收度值，t1，t2为注射墨汁后采血时间。
从表2可看出，模型组小鼠白细胞(wbc)、血小板(plt)和血红蛋白(hb)与较正常组相比均有显著下降(p<0.01)，红细胞(rbc)明显下降，提示环磷酰胺造血虚模型成功。与模型组比较，蛹草拟青霉蛹基虫草、古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草组小鼠的白细胞、血小板和血红蛋白的量均有显著升高(p<0.01)，红细胞数明显回升，趋于正常，说明蛹草拟青霉蛹基虫草、古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草均能有效改善血虚小鼠的外周血象，且对外周血象的作用相当。其余蚕蛹-拟青霉菌株子实体组小鼠的白细胞、血小板和血红蛋白的量与模型组无显著性差异(p>0.05)。
表2不同蚕蛹-拟青霉菌株子实体对血虚小鼠外周血象的影响比较(
注：与模型组比较，*：p<0.05，**：p<0.01
从表3看出：模型组小鼠的免疫脏器指数与正常组相比均有显著下降(p<0.01)，与模型组比较，蛹草拟青霉蛹基虫草、古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草组小鼠的免疫脏器指数均显著升高(p<0.01)；模型组小鼠的k值和α值与正常组相比均显著降低(p<0.01)，与模型组比较，蛹草拟青霉蛹基虫草、古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草组小鼠的k值和α值均显著增加(p<0.01，p<0.05)。总体来说，蛹草拟青霉蛹基虫草、古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草对血虚小鼠免疫脏器指数和单核巨噬细胞吞噬功能的影响相当。其余蚕蛹-拟青霉菌株子实体组小鼠的k值和α值与模型组无显著性差异(p>0.05)。
表3不同蚕蛹-拟青霉菌株子实体对血虚小鼠免疫脏器指数和单核巨噬细胞吞噬功能的影响(
注：与模型组比较，*：p<0.05，**：p<0.01
结果显示蛹草拟青霉蛹基虫草、古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草能够治疗血虚小鼠的免疫功能障碍，其作用无显著性差异，说明蛹草拟青霉、古尼拟青霉、细脚拟青霉菌和玫烟色拟青霉菌感染蚕蛹后可以产生具有免疫抑制活力的子实体，为开发新型药用拟青霉菌株研究提供参考。
实施例3免疫抑制活性蛹拟青霉组合物的制备
将蛹草拟青霉蛹基虫草、古尼拟青霉菌蛹基虫草、细脚拟青霉菌蛹基虫草和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草干燥后粉碎，目数不少于20目；
样品1：将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：古尼拟青霉菌蛹基虫草50份，细脚拟青霉菌蛹基虫草40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草10份组成；
样品2：将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：古尼拟青霉菌蛹基虫草70份，细脚拟青霉菌蛹基虫草20份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草10份组成；
样品3：将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：古尼拟青霉菌蛹基虫草58份，细脚拟青霉菌蛹基虫草40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草2份组成；
样品4：将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：蛹草拟青霉蛹基虫草100份；
样品5：将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：古尼拟青霉菌蛹基虫草100份；
样品6：将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：细脚拟青霉菌蛹基虫草100份；
样品7：将粉碎后的粉状原料按重量百分比称重后均匀得到中药组合物；其中所述的原料的重量百分比组成为：玫烟色拟青霉菌蛹基虫草100份；
实施例4免疫抑制活性蛹拟青霉组合物活性确立
参照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的方法对实施例3制备的样品1-7进行小鼠免疫功能的测定。
cona诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验(mtt法)
各组灌胃给样品，每天1次，连续30d。在试验第30天，每鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌hank's液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤，计数，最后用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为3×106个·ml-1。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，1孔加75μlcona液(相当于7.5μg·ml-1)，另1孔作为对照，置37℃、5％co2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同时加入mtt(5mg·ml-1)50μl·孔-1，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。在570nm波长处测定光密度值(od)。最后用加cona孔的光密度值减去不加cona孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。
表4不同样品对cona诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力及绵羊红细胞诱导小鼠迟发型变态反应(dth)的影响(x±s，n＝10)
由表4中脾淋巴细胞cona刺激后的净增值(以od570值表示)数据可见，与阴性对照组比较，样品1-7组均能提高cona诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力。样品1-3活性优于样品4-7，与阴性对照组有显著性差异(p＜0.05)，可见组合物(样品1-3)活性优于单一子实体，具有刺激脾淋巴细胞增值作用。
绵羊红细胞(srbc)诱导小鼠迟发型变态反应(dth)试验(足跖增厚法)
各组灌胃给样品，每天1次，连续30d。在试验第25天，每只鼠腹腔注射0.2ml2％(v·v-1)压积绵羊红细胞(srbc)悬液，进行免疫。免疫后4d，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20％(v·v-1)srbc，每只鼠20μl(约1×108个srbc)，注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量3次，取平均值。
由表4可知，绵羊红细胞(srbc)诱导小鼠dth(足跖增厚法)试验表明，样品1-7组能提高小鼠左后足跖部厚度差24h与0h厚度差值，差异有显著性(p＜0.05)，表明样品1-7能提高绵羊红细胞(srbc)诱导小鼠足跖部肿胀程度，具有促进迟发型变态反应的作用。由此可见，样品1-7可增强小鼠细胞免疫功能。
小鼠血清溶血素测定(血凝法)
各组灌胃给样品，每天1次，连续30d。在试验第25天，每只鼠腹腔注射0.2ml2％(v·v-1)压积绵羊红细胞(srbc)悬液，进行免疫。5d后，取血离心，收集血清，用生理盐水将血清倍比稀释，37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度，计算抗体积数。
抗体生成细胞检测(jerne改良玻片法)
各组灌胃给样品，每天1次，连续30d。在试验第25天，每只鼠腹腔注射0.2ml2％(v·v-1)压积绵羊红细胞(srbc)悬液，进行免疫。5d后，每鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌hank's液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤，计数，最后用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为5×106个·ml-1。将表层培养基(1g琼脂糖加双蒸水至100ml)加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量ph7的hank's液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl10％srbc(v·v-1，用sa液配制)，20μl脾细胞悬液(5×106个·ml-1)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1-1.5h，然后用sa缓冲液稀释的补体(1∶8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1-1.5h后，计数溶血空斑数。
表5不同样品对小鼠抗体生成细胞及血清溶血素的影响(
由表5可知，样品1-7组小鼠的血清溶血素抗体积数值和阴性对照组相比较，差异均无显著性(p＞0.05)。与阴性对照组比较，样品1-7组均能提高小鼠溶血空斑数，差异均有显著性(p＜0.05)，其中样品1-3组有极显著性(p＜0.01)。表明样品1-7具有促进抗体生成细胞增值的作用，从而有助于增强小鼠体液免疫功能。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验(半体内法)
各组灌胃给样品，每天1次，连续30d。动物处死前30min，每鼠腹腔内注射20％(v·v-1)鸡红细胞悬液1ml，处死后再注入2ml生理盐水，取腹腔液滴片，38℃温箱孵育30min，固定，染色，镜检，计数100个巨噬细胞，计算吞噬率及吞噬指数。
表6不同样品对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞及碳廓清试验吞噬指数的影响(
由表6可知，样品1-7组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率、吞噬指数和阴性对照组比较，差异无显著性(p＞0.05)。样品1-7组小鼠碳廓清能力和阴性对照组比较，差异无显著性(p＞0.05)。
小鼠碳廓清试验法
各组灌胃给样品，每天1次，连续30d。在试验第30天，每鼠尾静脉注入印度墨汁，按每10g体重0.1ml计算，待墨汁注入，立即计时。注入墨汁后2min、10min分别从内眦静脉丛取血20μl，并将其加到2ml0.1％na2co3溶液中，用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(od)，以na2co3溶液作空白对照。第2次采血结束后，立即处死小鼠，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。计算吞噬指数。
nk细胞活性测定(ldh测定法)
各组灌胃给样品，每天1次，连续30d。在试验第30天，每鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌hank's液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤，计数，最后用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个·ml-1。试验前24h将yac-1细胞(靶细胞)传代培养，应用前用hank's液洗3次，用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个·ml-1。取靶细胞和脾细胞悬液(效应细胞)各100μl(效靶比50∶1)，加入u型96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％np40各100μl；上述各项均设3个复孔，于37℃、5％co2，培养箱中培养4h，离心，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入ldh基质液100μl，反应5min，每孔加入1mol·l-1的hcl30μl在490nm波长处测光密度(od)值，计算nk细胞活性。
表7不同样品对小鼠nk细胞活性的影响
由表7数据可知，与阴性对照组比较，样品1-7组均能提高nk细胞活性，有显著性差异(p＜0.05)，其中组合物(样品1-3)有极显著性差异(p＜0.01)，活性优于单一子实体。
综合表4-7实验结果可知，在提高cona诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖能力和增强nk细胞活性方面，组合物(样品1-3)优于单一子实体(蛹草拟青霉蛹基虫草，古尼拟青霉菌蛹基虫草，细脚拟青霉菌蛹基虫草，玫烟色拟青霉菌蛹基虫草)。
实施例5免疫抑制活性蛹拟青霉组合物胶囊制备
将粉碎后的古尼拟青霉菌蛹基虫草58份，细脚拟青霉菌蛹基虫草40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草2份(20目)按重量百分比称重后，均匀混合后得到中药组合物，按照常规方法制备成胶囊。
实施例6免疫抑制活性蛹拟青霉组合物粉剂制备
将粉碎后的古尼拟青霉菌蛹基虫草70份，细脚拟青霉菌蛹基虫草20份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草10份(20目)按重量百分比称重后，均匀混合后得到中药组合物，按照常规方法制备成粉剂。
实施例7免疫抑制活性蛹拟青霉组合物片剂制备
将粉碎后的古尼拟青霉菌蛹基虫草70份，细脚拟青霉菌蛹基虫草20份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草10份(80目)按重量百分比称重后，均匀混合后得到中药组合物，按照常规方法制备成片剂。
实施例8免疫抑制活性蛹拟青霉组合物口服液制备
将粉碎后的古尼拟青霉菌蛹基虫草50份，细脚拟青霉菌蛹基虫草40份和玫烟色拟青霉菌蛹基虫草10份(80目)按重量百分比称重后，均匀混合后得到中药组合物，按照常规方法制备成口服液。
实施例9免疫抑制活性蛹拟青霉组合物粉剂抗衰老活性确立
将实施例6中制备的粉剂进行抗衰老活性
实验动物及分组：雄性wistar大鼠40只,体重180～220g。按随机数字表法分为正常组、模型组、热量限制组、蛹拟青霉组合物粉剂样品组(实施例6中制备的粉剂)四个组，每组10只。造模及给药：wistar大鼠适应环境1w后，开始造模。模型组、热量限制组、粉剂样品组以1％d-半乳糖生理盐水溶液，腹腔注射，1次/d，1ml/100g体重/次，连续6w造成衰老模型，造模同时粉剂样品组给予蛹拟青霉组合物粉剂样品8g/kg/d(相当于生药材量)进行灌胃，正常组、模型组、热量限制组同时以等量的生理盐水灌胃。造模期间每4天称量并记录一次大鼠体重，并根据新的体重进行给药剂量的换算。造模给药期间注意观察并记录各组大鼠的一般状态。
动物组织的获取与保存：末次给药后禁食12h。取材时，采用20％的乌拉坦溶液麻醉实验大鼠，将麻醉后的实验大鼠固定在固定板上，腹主动脉取血，然后进行解剖，用镊子小心取出大鼠的肝脏、脑组织，用生理盐水洗净表面的血液，将脑组织分切为左右两半，肝组织亦切取部分，将一半脑组织和部分肝组织放于10％甲醛溶液中固定，别一半脑组织和部分肝组织置-80℃冰箱保存，备用。大鼠血液以3500r/min4℃离心10min，取上清，血清分装后于-80℃冰箱保存。
elisa法检测蛹拟青霉组合物粉剂对衰老大鼠肝组织及脑组织中脂质过氧化物含量的影响：称取大鼠肝组织及脑组织适量，加生理盐水用手动匀浆器制成10％组织匀浆，以3500r/min4℃离心10min，取上清液，分装，并置-80℃冰箱备用。实验时取肝组织匀浆、脑组织匀浆分别测定其中的sod、t-aoc、mda的含量，检测方法严格按试剂盒说明书操作。
表8大鼠肝组织中sod、mda和t-aoc含量(
由表8可知，与正常组比较，d-半乳糖诱导的衰老模型组大鼠肝脏组织中sod活力显著下降(p<0.05)，t-aoc活力也显著降低(p<0.05)，mda含量显著增加(p<0.05)；热量限制组肝组织中sod和t-aoc活力较模型组也明显下降，mda含量较之则明显增加。将蛹拟青霉组合物粉剂组与模型组相比，蛹拟青霉组合物粉剂组大鼠肝脏中的sod活性和t-aoc活性显著增加(p<0.05)，mda含量显著减少(p<0.05)，变化要优于热量限制组。
表9大鼠脑组织中sod、mda和t-aoc含量(
由表9可知，与正常对照组比较，d-半乳糖诱导的衰老模型组大鼠脑组织中sod活力显著下降(p<0.01)，t-aoc活力也显著降低(p<0.01)，mda含量显著增加(p<0.01)；与模型组比较，热量限制组和蛹拟青霉组合物粉剂组sod活性显著增加，t-aoc活力也显著增加，mda含量显著减少(p<0.05)，变化要优于热量限制组。
elisa法检测蛹拟青霉组合物粉剂对衰老大鼠脑组织中端粒酶活性的影响：称取大鼠脑组织适量，加生理盐水用手动匀浆器制成10％组织匀浆，后以3500r/min离心10min，取上清液，分装，并置-80℃冰箱备用。实验时取大鼠脑组织匀浆液测定脑端粒酶(te)活性，检测方法严格按试剂盒说明书操作。
表10大鼠脑组织中te含量(
如表10所示，与模型组比较，正常对照组端粒酶活性明显增加(p＜0.01)；热量限制组的te活性也显著增加；蛹拟青霉组合物粉剂组端粒酶活性较模型组显著增加(p＜0.01)。