红景天提取物的制备方法与流程

本发明属于药物
技术领域：
，涉及红景天提取物的制备方法。
背景技术：
：红景天(学名：rhodiolaroseal.)，别名：蔷薇红景天，扫罗玛布尔(藏名)等；为多年生草本植物，高10-20厘米。根粗壮，圆锥形，肉质，褐黄色，根颈部具多数须根，根茎短，粗状，圆柱形，被多数覆瓦状排列的鳞片状的叶。生长在海拔1800—2500米高寒无污染地带，其生长环境恶劣，因而具有很强的生命力和特殊的适应性。可作药用，能够补气清肺，益智养心，是一味作用广泛的中药。亦有很大的美容效果，可作护肤品，也可食用。分布于黑龙江、吉林、西藏及云南西北部、宁夏、甘肃、青海、四川、西藏等地；在欧洲北部至苏联、蒙古、朝鲜、日本亦有分布。埃博拉病毒(ebov)和马尔堡病毒(marv)是具有丝状形态的包裹的单链负链rna病毒。它们是丝状病毒科的两个高致死性成员，它们在人和非人灵长类动物中引起严重的出血性发热，死亡率高达90％(kuhn等，2010)。最近2014-2016年埃博拉疫情在西非地区停滞了两年左右，导致11,325人死亡(截至2016年4月13日世界卫生组织更新)。尽管已经在抗病毒药物研发方面付出了巨大努力，但到目前为止，还没有fda批准的疫苗或治疗方法可用于抵抗这些病毒(schafer等，2017)。因此迫切需要新的方法来促进抗病毒药物的开发。技术实现要素：本发明的目的在于提供红景天提取物的制备方法。本发明所采用的技术方案是红景天加水煎煮，浓缩后70％乙醇沉淀、红景天加水超声提取、红景天加水煎煮、红景天加70％乙醇超声提取、红景天加70％乙醇回流提取、红景天加水煎煮，浓缩后加60％乙醇沉淀，50℃下真空干燥并溶于dmso中。进一步，红景天和水重量比为1:10。进一步，红景天和乙醇重量比为1:10。本发明的有益效果是能够高效提取红景天提取物，用来抑制丝状病毒。附图说明图1是红景天提取物针对四种病毒进入的特异性抗病毒活性示意图；图2是红景天的6种提取物的抗病毒活性；图3是70％乙醇超声提取显示出最好的抗病毒活性；图4是70％乙醇超声提取的细胞毒性；图5是鞣花酸和没食子酸抑制～90％和～80％的ebov进入；图6是鞣花酸对假型ebov和marv感染都显示出典型的s形剂量反应抑制作用。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。1细胞培养在补充有10％胎牛血清(sigma)的dmem(cellgro)中培养人胚胎肾细胞(239t，atcc#crl-1573)，人肺上皮细胞(a549，atcc#ccl185)和hela细胞fbs，gibco)，100μg/ml链霉素和100单位青霉素(invitrogen)。2假病毒的制备假病毒由以下质粒产生：分离自a/goose/青海/59/05(h5n1)或a/netherlands/219/03(h7n7)的马尔堡病毒糖蛋白的血凝素(ha)和神经氨酸酶埃博拉病毒扎伊尔包膜糖蛋白和hiv-1前病毒载体pnl4-3.luc.re-(通过nihaids研究和参考试剂程序获得)。使用基于聚乙烯亚胺(pei)的转染方案通过瞬时共转染人类293t细胞产生所有类型的假病毒颗粒，hiv/marv，hiv/ebov，hiv/h5n1和hiv/h7n1。将编码ebovgp，marvgp，血凝素(ha)/神经氨酸酶(na)和复制缺陷型hiv载体(pnl4-3.luc.r-e-)的质粒用于瞬时共转染到293t生产细胞中。转染6小时后，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞，并将20ml新鲜培养基加入到每个平板(150mm)中。转染24小时后，收集上清液并通过0.45μm孔径的过滤器(nalgene)过滤。使用前将假病毒储存在4℃。3提取物的制备如表1所示。表1no提取方法1水煎煮，浓缩后70％乙醇沉淀2水超声370％乙醇超声提取4水煎煮570％乙醇回流提取6水煎煮，浓缩后60％乙醇沉淀红景天粉末，加十倍量溶剂，提取2次，分别处理后，50℃下真空干燥并溶于dmso中。红景天采用6种不同的提取方法共获得6种提取物，将提取物以20mg/ml储备溶剂浓度储存。4抗病毒效果筛选将提取物在0.0625％dmso(v/v)中的终浓度为12.5μg/ml的384孔板中筛选。低传代a549细胞在感染前24小时以密度1000/孔接种在384孔板中。在中药提取物存在下，a549细胞被含有荧光素酶报道基因的hiv/ebov，hiv/h5n1或hiv/h7n1假型病毒粒子感染。将平板再温育48小时，并使用neolitereportergeneassaysystem(perkinelmer)通过感染的a549细胞的荧光素酶活性定量感染。用dmso单独用病毒作为阴性对照；用5μmazt(一种hiv逆转录酶抑制剂)作为阳性对照。将数据通过阴性对照标准化，并将平行>90％抑制平均值的标准用于挑选命中。然后将选择的活性提取物重新格式化到新的96孔板中，并在0.0625％dmso(v/v)中测试12.5μg/ml的hiv/ebov，hiv/marv，hiv/h5n1或hiv/h7n1，结果。命中提取物的细胞毒性使用celltiter-gloluminescentcellviabilityassay(promega)在a549细胞中以与抗病毒筛选相同的方式处理。将阴性对照孔(dmso)中的信号平均并用于数据标准化。命中提取物连续稀释ic50和cc50评估。在graphpad中通过用四参数逻辑回归拟合剂量-反应曲线来确定ic50和cc50值。5传染性病毒分析使用重组传染性扎伊尔埃博拉病毒的实验在德克萨斯生物医学研究所的生物安全4级(bsl-4)设施中进行。根据先前描述的方法产生感染性ebov。该试验中的zaireebovmayinga菌株是heinzfeldmann(nih，rockymountainlaboratory，hamilton，mt)的一种礼物，并且在核蛋白(np)和vp35(ebihara等)之间插入绿色荧光蛋白(gfp)2007)。病毒在vero细胞中生长，在澄清的上清液中的病毒通过在4℃下以141,118×g离心2小时的20％蔗糖缓冲液沉淀。将病毒沉淀物悬浮于pbs中并在-80℃等分储存直至使用。对于感染测定，将每孔4000个hela细胞在补充有10％fbs的dmem培养基中的384孔组织培养板中生长过夜；在不同浓度的tcm提取物或有效化合物存在下，ebov-gfp病毒(moi为0.05-0.15)感染细胞。将最终浓度为10nm的巴福洛霉素用作阳性对照药物。所有的治疗都是重复的。培养24小时后，将感染后的细胞在4℃下在福尔马林中浸泡24小时进行固定。固定板被去除污染并从bsl-4中取出。将来自固定板的福尔马林倒出，并用pbs洗涤平板两次。使用hoechst以1：50,000稀释度对ebov感染的细胞进行细胞核染色，并对平板进行成像。使用cellprofiler软件(broadinstitute)-版本2.1.1对核(蓝色)和感染的细胞(绿色)进行计数。将细胞核总数(蓝色)用作细胞数量的代表，并且假定细胞数目的损失反映细胞毒性。实验结果：1筛选针对流感或埃博拉病毒的进入抑制剂的中药提取物文库；从蒙古红景天提取的这种提取物进一步评估了对12.5μg/ml的hiv/ebov，hiv/marv，hiv/h5n1和hiv/h7n1假病毒颗粒的细胞毒性和抗病毒活性。如图1所示，该提取物再次表现出针对假型ebov和marv进入的特异性抗病毒活性，但是对于两种假型流感病毒亚型的进入却几乎没有活性。2六种提取方法的红景天提取物的抗ebola病毒活性；由于提取方法决定了提取物中有效生物活性分子的组成和浓度，我们通过不同的提取方法比较了来自红景天的6种提取物的抗病毒活性(表1)。6种提取物在12.5μg/ml的a549细胞中针对假型ebov和marv感染进行测试，并且所有这些提取物对两种丝状病毒都显示出强的抗病毒活性，如图2。从70％乙醇超声提取显示出最好的抗病毒活性，98％抑制hiv/ebov进入和99％抑制hiv/marv进入。进一步用剂量反应滴定法评估70％乙醇超声提取对抗假型丝状病毒。对ebov假病毒感染显示0.25μg/ml的50％抑制浓度(ic50值)，对marv假病毒感染的ic50值为4.0μg/ml，如图3。还检测了70％乙醇超声提取的细胞毒性，并显示出50％的细胞毒性浓度(cc50值)为136μg/ml，如图4。ebov提取物3的选择性指数超过500，marv假病毒提取物的选择性指数达到34以上，是进一步抗病毒药物开发的合适人选。3鞣花酸是红景天中最活跃的成分；在12.5μm的a549细胞中测试了20种已知的红景天中有效组分对抗a549细胞中的hiv/ebov感染。鞣花酸和没食子酸作为抵抗假型病毒粒子进入的最有活性的化学物质出现，分别抑制～90％和～80％的ebov进入，如图5。活性较低的成分包括槲皮素，熊果酸和迷迭香酸，其对病毒进入显示约50％的抑制。通过剂量反应滴定进一步表征鞣花酸的特征。这种化合物对假型ebov和marv感染都显示出典型的s形剂量反应抑制作用。鞣花酸对ebov假病毒感染的ic50值为1.4μm，针对marv假病毒感染的ic50值为6.4μm，如图6。鞣花酸的cc50分别为122μm。4红景天提取物及鞣花酸抑制传染性丝状病毒感染；为了进一步证实红景天提取物及其活性成分的抗病毒活性。在hela细胞中测试红景天提取物、鞣花酸对重组感染性ebov感染。红景天提取物以及鞣花酸在hela细胞中显示出良好的抑制传染性ebov感染的作用，尽管不如我们在假病毒感染测定中观察到的那样强。红景天提取物显示3.9μg/ml的ic50值，鞣花酸和没食子酸分别显示10.5μm的ic50值。在hela细胞中也评估了红景天提取物，鞣花酸的细胞毒性，cc50分别为64μg/ml，141μm，选择性指数分别为16.4,13.4。本发明进行了373种tcm提取物对假型埃博拉病毒(ebov)，h7n1和h5n1流感病毒的比较筛选。蒙古红景天提取物表现出针对丝状病毒进入的有效特异性抑制，且细胞毒性很小。此外，鞣花酸被确定为红景天提取物中最有效的成分。提取物和单体的抗病毒活性用重组传染性ebov证实。进一步的加时实验研究表明，红景天提取物及有效成分在病毒/细胞膜融合过程中在病毒进入过程中起作用。以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。当前第1页12