用于巯基检测的氟‑19磁共振造影探针的制备方法与应用与流程

本发明涉及一种用于巯基检测的氟-19磁共振造影探针的制备方法与应用，具体为适用于高灵敏和高选择性巯基检测的聚合物纳米探针，利用氟-19磁共振造影(¹⁹fmri)进行细胞或活体水平巯基检测，属于生物分析技术领域的纳米探针。

背景技术：

近年来随着生命科学和医学科学的快速发展，细胞中活性物质的检测逐渐引起人们的广泛关注。半胱氨酸(cys)，高半胱氨酸(hcy)及谷胱甘肽(gsh)等生物体内的活性巯基小分子，在人体生理和病理过程中发挥着重要作用。尽管它们结构极为相似，但生物功能却完全不同。cys是唯一含巯基(-sh)的天然必需氨基酸，是合成蛋白质的重要组分。hcy通常源于蛋氨酸在体内代谢，维持着生物体内含硫氨基酸的水平变化。gsh是细胞内含量最高的(1-10mmol/l)非蛋白巯基化合物，参与机体众多生理功能，如维持机体氧化还原动态平衡、清除外源性毒素、参与信号转导、完成基因调控等。机体内这些巯基化合物水平的异常，往往诱发多种疾病。研究显示，生物体内cys水平异常会引起多种疾病，如生长缓慢、水肿、肝脏损伤、肌肤损害等。hcy水平过高，同样会诱发人体多种疾病，如心血管疾病、老年痴呆症、维生素b族缺失等。现代医学表明，gsh的异常与许多疾病和癌症直接相关。认识这些巯基化合物的产生、分布及水平波动对细胞活性、机体生理和病理等研究有着重要的科学意义。因此，定量检测生物体内巯基小分子含量的变化成为当前化学、医学和生命科学等领域研究的热点。

目前，已见报道的检测巯基化合物方法很多，如毛细管电泳法、高效液相色谱法、液相-质谱联用法、微流控芯片法、放射酶测定法、荧光法等。其中，基于化学识别功能的荧光探针，对巯基化合物选择性高，且检测信号易于分析处理。同时，荧光法具备灵敏度高、操作简便、组织伤害小、不需昂贵复杂仪器等特点，已广泛用于生物样品分析，为生物体巯基化合物的实时、原位可视化监测提供了重要手段。但是，目前生物荧光分析在活体水平上的应用依然存在一些问题，分辨率低是限制其检测应用的最为关键的问题。

mri是利用核磁共振的原理，在没有放射性损害的条件下得到机体生理和病理的详细三维图像。这种成像技术可以通过非侵入性的手段来观察人体内部结构，在医学诊断学领域具有革命性的意义。现在，mri不仅是一种常见的临床疾病诊断工具，已经越来越多地被应用到了基础生命科学研究领域中，用来阐明疾病发生发展机制、辅助药物开发和疾病治疗的可视化研究。目前，临床上应用的主要是基于氢核的磁共振成像(¹hmri)，理论上¹hmri可以检查人体全身的各个部位，并提供一个三维立体的空间影像。但是临床实践发现，由于体内水分子的广泛分布，导致其存在强烈的背景干扰，这种情况下所得到的成像效果非常差，从而影响了对诊断结果的判断。为了得到更好的成像效果，人们开始研究各种各样的显影剂，希望能够通过显影剂在靶标部位的聚集存在，增强不同组织部位检测信号的对比度和提高不同软组织成像的分辨率。幸运的是，¹⁹fmri非常好地克服了¹hmri的缺陷：首先，相对于¹hmri受限于机体内存在的水分子造成的强烈背景干扰，机体内没有可以检测到的¹⁹fmri信号(骨骼中的固态氟化合物检测不到¹⁹fmri信号)，因此¹⁹fmri完全没有背景干扰；其次，¹⁹fnmr灵敏度高，是仅次于¹hnmr的高灵敏的自旋核；再次，¹⁹f是一种稳定同位素，其天然丰度为100%，因此¹⁹fmri在使用前无需同位素富集和使用过程中也无需放射性防护；最后，¹⁹fmri信号有近400ppm的化学位移范围，而¹hmri信号仅20ppm左右，而且对化学键和微环境的变化非常灵敏，因而¹⁹fmri特别适合提供体内药物存在形态及病灶区域微环境(如ph值、氧气浓度、粘度等)。这些生理病理信息对于疾病的诊断和治疗至关重要。总之，¹⁹fmri具有无创伤性、无内源性背景干扰及空间分辨率髙等优点，在生物成像和疾病诊断等领域受到越来越多的关注。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于巯基检测的氟-19磁共振造影探针的制备方法与应用。以聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(mpegma)和2-((2,4二硝基-n-（3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺）甲基丙烯酸乙酯（ama-dnbsf）为单体，通过可逆加成链转移自由基聚合得到无规共聚物，可通过调整两种单体的投料比控制聚合物的亲疏水链段比例，进而调控纳米探针的组装。本发明是一种氧化还原响应激活胺基质子化的新型¹⁹f磁共振造影的聚合物纳米探针，可用于生物体内的巯基检测。此纳米探针对巯基化合物选择性高，且检测信号易于分析处理。同时，此纳米探针具备灵敏度高、操作简便、组织伤害小和分辨率高等特点，为生物体巯基化合物的实时、原位可视化监测提供了重要手段。

本发明提供的用于巯基检测的氟-19磁共振造影探针为聚乙二醇(peg)-聚2-((2,4二硝基-n-(3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺)甲基丙烯酸乙酯(ama-dnbsf)(pedf)两亲性聚合物，其结构和组成如下：

其中x为5~50的整数，y为5~50的整数。

所述的探针在水溶液中自组装得到核壳结构，外层为聚乙二醇(peg)亲水层，内核为聚2-((2,4二硝基-n-(3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺)甲基丙烯酸乙酯。

本发明提供的用于巯基检测的氟-19磁共振造影探针的制备方法是经过下述步骤：

1）以二甲基甲酰胺为溶剂，在引发剂偶氮二异丁腈存在下，苯基-（2-羟乙基）硫代碳酸酯、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯和2-((2,4二硝基-n-（3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺）甲基丙烯酸乙酯于68~72℃下反应20-24h；反应结束后，加入dmf溶解，装入透析袋中，用去离子水透析72h，每12h更换一次透析液，产物冷冻干燥得到pedf两亲性聚合物，利用核磁氢谱和氟谱对所述的聚合物进行表征；所述的苯基-（2-羟乙基）硫代碳酸酯、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯和2-((2,4二硝基-n-（3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺）甲基丙烯酸乙酯的摩尔比为：1:5:5~1:50:50。

2）上述得到的两亲性聚合物在超声作用下直接分散于ph=7.4的0.01m的磷酸盐缓冲溶液中，即得到聚合物纳米探针，利用激光粒度仪和透射电子显微镜检测纳米粒的粒径和形态。

所述的纳米粒粒径为20-200nm。

所述的纳米探针的分散液中的氟原子浓度可以通过调控聚合物比例调控，浓度为0.05-0.5mol/l。

本发明提供的用于巯基检测的氟-19磁共振造影探针以聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(mpegma)和2-((2,4二硝基-n-（3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺）甲基丙烯酸乙酯（ama-dnbsf）为单体，通过可逆加成链转移自由基聚合得到无规共聚物，可通过调整两种单体的投料比控制聚合物的亲疏水链段比例，进而调控纳米探针的组装。具体讲纳米探针通过巯基与纳米探针疏水段2,4-二硝基-苯磺酰胺之间的快速亲核取代反应，从而导致含氟链段产生仲氨基团，仲氨基团在ph7.4条件下完全质子化，使得含氟链段自旋-自旋弛豫发生剧烈扰动，使¹⁹fmri信号从“关闭”转为“开启”。¹⁹f链段被冻结于纳米探针内核中，因而在没有巯基存在条件下¹⁹f磁共振(¹⁹fnmr)信号被完全屏蔽。

所述的纳米探针聚2-((2,4二硝基-n-(3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺)甲基丙烯酸乙酯链段中存在强拉电子基团2,4-二硝基-苯磺酰胺结构，能够与巯基快速发生亲核取代反应产生仲胺基团，仲胺基团在ph7.4条件下完全发生质子化从而导致纳米探针组装解体，从而检测到¹⁹fnmr信号。

本发明提供的聚乙二醇(peg)-聚2-((2,4二硝基-n-(3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺)甲基丙烯酸乙酯(ama-dnbsf)(pedf)两亲性聚合物，用于巯基检测，具有快速响应性，在半胱氨酸存在条件下，¹⁹fmri信号快速增强。

本发明提供了用于巯基检测的氟-19磁共振造影探针，是一种氧化还原响应激活胺基质子化的新型¹⁹f磁共振造影的聚合物纳米探针，可用于生物体内的巯基检测。对于巯基的响应性具有高度选择性，且检测信号易于分析处理。仅对生物环境中存在的巯基产生响应，而对于赖氨酸等不含巯基的氨基酸、活性氧化物(过氧化叔丁醇，过氧化氢，次氯酸钠)和还原剂(抗坏血酸)等呈现化学惰性。该纳米探针可在活体水平上检测肿瘤组织中的谷胱甘肽，从而实现肿瘤的¹⁹fmri检测。本发明具备灵敏度高、操作简便、组织伤害小和分辨率高等特点，为生物体巯基化合物的实时、原位可视化监测提供了重要手段。

附图说明

图1聚合物p4核磁氢谱和核磁氟谱表征。(a)核磁氢谱，(b)核磁氟谱表征。

图2纳米探针n4粒径分布和微观形貌。

图3纳米探针n4的¹⁹fnmr信号随反应时间变化。

图4纳米探针n4的巯基选择性表征。

图5纳米探针n4检测肿瘤组织中的谷胱甘肽。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1聚合物p4的合成

在shlenk反应管中依次加入可逆加成-断裂链转移聚合(raft)链转移剂苯基-（2-羟乙基）硫代碳酸酯(12.2mg,0.1mm)、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯（mpegma）（500mg,1mm）和2-((2,4二硝基-n-（3,3,3-三氟丙基)苯基磺酰胺）甲基丙烯酸乙酯（ama-dnbsf）（455mg,1mm）、引发剂（aibn）（1.64mg,0.01mm）和3ml溶剂二甲基甲酰胺（dmf），抽真空/通氩气三个循环后，密闭反应管,在68~72℃的油浴中反应24h。反应结束后，加入dmf溶解，装入透析袋（截留分子量3500da）中，用去离子水透析72h，每12h更换一次透析液。之后，冷冻干燥得到pedf聚合物。利用核磁氢谱和氟谱对p4聚合物进行表征，结果如附图1所示。

依照实施例1中的方法，可以得到其他组成比例的聚合物。

表1.聚合物的组成与相应纳米探针的粒径及分布

实施例2纳米探针n4的制备方法

称取pedf聚合物20mg，在超声（25℃，50hz,5min）作用下直接分散于10ml的ph=7.4的0.01m的磷酸盐缓冲溶液中，即得到n4纳米粒，纳米粒浓度为2mg/ml。利用激光粒度仪和透射电子显微镜检测纳米粒的粒径和形态，检测结果如附图2所示，本实施例中制备的纳米粒的粒径为45nm，粒径分布0.12，且呈现明显的核-壳结构。

依照实施例2中的制备方法，可以制备其他聚合物组成的纳米粒。

实施例3纳米探针n4的¹⁹fnmr信号随反应时间变化

取5ml2mg/ml的n4纳米探针溶液，在氩气保护条件下加入半胱氨酸（cys）母液，使cys的最终浓度为5mg/ml，在设定的时间点，取300µl，加入100µl重水用于锁场，利用核磁共振对纳米粒溶液的¹⁹fnmr信号进行检测。如附图3所示，纳米探针能够对巯基产生快速响应，在半胱氨酸存在条件下，30min内¹⁹fnmr信号能够显著增强。

实施例4纳米探针n4的巯基选择性表征

将5ml2mg/ml的n4纳米探针溶液依次编号，在氩气保护条件下分别加入半胱氨酸（cys），高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、赖氨酸、过氧化叔丁醇、过氧化氢、次氯酸钠、和还原剂抗坏血酸等的母液，使待检测物质的最终浓度为5mg/ml，30min后，取300µl，加入100µl重水用于锁场，利用核磁共振对纳米粒溶液的¹⁹fnmr信号进行检测。如附图4所示，纳米探针仅能够对巯基产生快速响应，而对于赖氨酸等不含巯基的氨基酸、活性氧化物（过氧化叔丁醇，过氧化氢，次氯酸钠）和还原剂（抗坏血酸）等呈现化学惰性。

实施例5纳米探针n4检测肿瘤组织中的谷胱甘肽

取健康bab/c小鼠，雌性，体重19±2g，将培养的hepg2细胞在无菌条件下进行快速接种，于小鼠右后腿皮下注射细胞瘤液0.2ml/只，细胞浓度为5.0×10⁶/只。接种2周以后，挑选肿瘤体积达到250mm³(v=1/2(a×b2))的小鼠。在进行成像实验之前，向小鼠的肿瘤内注入100µl浓度为100mg/ml的n4纳米探针。随后在对活鼠进行mri测试时，向小鼠腹腔内注射100µl、7%的水合氯醛作为麻醉剂，保证测试的正常进行。用7.0t布鲁克生物核磁共振成像系统(brukerbiospec70/20usr)进行测试。¹hmri测试所用的为rare-t2脉冲序列，具体参数如下：扫描视野(fov)50mm*50mm，切片厚度1mm，激励次数2，重复时间(tr)300ms，回波时间(te)50ms，矩阵大小256*256。¹⁹fmri测试所用的为flash法，具体参数如下：扫描视野(fov)50mm*50mm，切片厚度10mm，激励次数64，重复时间(tr)300ms，回波时间(te)4.2ms，矩阵大小90*90。测试结果如图5所示，肿瘤位置清晰可见，成像具有很高的信噪比。