矮紫堇在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒BVDV药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药工程技术领域，具体涉及矮紫堇在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv药物中的应用。

背景技术：

牛病毒性腹泻(bvd)又叫做牛病毒性腹泻-黏膜病，该病是由于牛病毒性腹泻病毒(bvdv)引起的急性传染病，在我国将其列为二类传染病。临床症状包括发热、食欲不振、腹泻及典型的黏膜损伤。各个年龄段的牛均易感。但主要侵害6-24个月的青年牛。依据病毒rna的核苷酸序列比对，目前bvdv至少有2种基因型，bvdv-1和bvdv-2，每一种基因型又可分为细胞病变型和非细胞病变型。血清学调查显示，bvdv呈现全球性分布。

在受精阶段感染bvdv时，可导致母牛妊娠率降低；在胚胎发育的前4个月感染bvdv时，可导致胚胎自溶、流产、发育迟缓或持续性感染，这样的病牛一出生即为pi牛，可终身带毒。但胚胎发育到4-6个月感染时，可造成眼睛的先天性畸形，有时会出现木乃伊胎、死胎、早产或弱犊。

而且值得注意的是持续感染非致细胞病变型bvdv的牛是该病毒的自然宿主，而持续感染牛是bvdv的主要传染源，可通过分泌物和排泄物排出大量bvdv,进而感染易感牛群。而且感染bvdv后，造成免疫抑制，加重继发感染。

灭活疫苗和弱毒疫苗对bvd是有效的。但存在使用限制或不足：1)因为bvdv对胎儿易感并可出现免疫抑制现象，因此对妊娠母牛和表现临床症状的牛，不推荐使用弱毒疫苗。2)灭活疫苗可用于妊娠母牛，但保护期较短，需要多次免疫接种。3)目前不同的基因型和亚基因型之间的抗原变异程度尚不清楚，这种抗原差异会影响疫苗接种的免疫保护效果。4)但持续感染牛再次感染致细胞病变型bvdv时，就会引起粘膜病。致细胞病变型bvdv通常是内源性的，但外源性包括其他牛以及弱毒疫苗。对于持续感染的牛，用疫苗免疫有风险，所以一般采用淘汰检测pi牛的方式净化牛场。目前bvdv的治疗尚无有效的治疗药物。

所以基于bvdv防控的难点和免疫的限制，研发能抑制和杀灭病毒的药物成为众多研究者的热点之一。藏药是我国传统中药学的重要组成部分,具有独特的理论体系和浓厚的民族特色，有着悠久的历史和临床应用基础，但药物的一些新用途和新的药理药效作用仍有待于进一步挖掘研究。《度母本草》上记载,矮紫堇清热症，治瘟疫等诸热证；牛病毒性腹泻病是1946年首先发生于美国，后传入我国的一种传染病，传播速度较快，目前在牛场已广泛流行。矮紫堇对防治bvdv是否有效尚未可知。

技术实现要素：

本发明的目的就是针对上述bvdv疫苗的使用限制和防治药物的缺乏，提供了矮紫堇在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv药物中的应用，可作为防治bvdv和/或清除bvdv感染的候选藏药。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：矮紫堇在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv药物中的应用。

进一步的，上述的应用，所述抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv药物为矮紫堇的水提物。

进一步的，上述的应用，矮紫堇水提物的制备方法为：按照料液重量比1:10取矮紫堇加入水中，采用水提法进行提取30min，然后将提取液浓缩成200ml，经冻干机冻干成粉后密封，4℃避光保存备用。

进一步的，上述的应用，矮紫堇水提物对牛肾细胞mdbk的最大安全浓度为1mg/ml，抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv的药物浓度为1mg/ml。

本发明建立了以牛肾细胞(mdbk)为载体，bvdv细胞致病模型的药物体外筛选技术。

确定了矮紫堇对mdbk细胞的最大安全浓度1mg/ml，并且为抗病毒效果最佳时药物的浓度；相应的半数中毒浓度cc50分别为7.116mg/ml。

本发明还提供了根据病毒的致病机制，分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。

矮紫堇的新型抗病毒作用，对bvdv有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。矮紫堇直接杀伤bvdv病毒的有效率为72.86％，高于利巴韦林(51.06％)；矮紫堇对bvdv的治疗指数为19.39,高于利巴韦林(10.00)。

本发明的有益效果为：本发明提供的矮紫堇在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv药物中的应用，以藏药矮紫堇为研究对象，筛选出矮紫堇水提物在mdbk细胞模型上对bvdv有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。为bvd病的防治和药物研发奠定了基础，其优点在于发现和矮紫堇的新型药理作用，可作为防治bvdv和/或清除bvdv感染的候选药物，可单独使用，也可以组方使用。

附图说明

图1显示为bvdv对mdck细胞造成的细胞病变。

图2显示为矮紫堇抗bvdv对mdck细胞的损伤效果。

具体实施方式

实施例1：

药物实施例

用于抑制或杀灭bvdv的藏药，由以下方法制备完成：

藏药矮紫堇购自兰州市黄河中药材市场，取100g矮紫堇加入1l水，采用水提法进行提取30min，然后将提取液浓缩成200ml左右，经冻干机冻干成粉后密封，4℃避光保存备用。

实施例2：

应用实施例：

(1)毒株和细胞的准备：

bvdv病毒株是nadl美国标准毒株，购自中国兽医药品监察所，经增殖后备用。牛肾细胞(mdbk)细胞株购自上海和园生物技术股份有限公司，复苏培养后备用。

(2)药物工作液的配制：

按照实施例1准备药物，在上细胞试验前，采用二倍稀释法将相应保存的藏药冻干粉用3％细胞维持液配制成以下10个浓度：256mg/ml、128mg/ml、64mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml；阳性对照药物选用利巴韦林，购自索莱宝生物有限公司。在细胞试验前，将利巴韦林干粉则稀释256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，用0.22μm微滤膜过滤除菌，4℃避光保存备用。

(3)病毒tcid50的测定：

将mdbk消化后以每孔1×10⁵个/ml的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃、5％co2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液；将bvdv连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10^-1-10^-10)接种于长满单层mdbk细胞的96孔板，每孔100μl，置于细胞培养箱中吸附2h，并每间隔20min缓慢摇动一次使毒液吸附均匀，弃去病毒液后每孔加细胞维持液100μl，放入37℃、5％co2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞cpe的情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待cpe不再继续时判定结果。细胞病变孔是50％以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按以下公式(reed-muench氏法)计算病毒tcid50。

距离比例＝(大于50％病变率的百分数-0.5)/(大于50％病变率的百分数-小于50％病变率的百分数)

lgtcid50＝距离比例×稀释度对数之间的差+大于50％病变率的稀释度的对数。

结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变(cpe)，如图1所示，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，5天后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的cpe孔数，并计算出不同浓度的cpe比率，bvdv的tcid50测定结果如表1所示。按reed-muench氏法计算出bvdvtcid50为10^-4.67/0.1ml，表示将原bvdv病毒液稀释10^4.67倍后接种100ml于mdbk细胞可使50％的细胞发生明显的细胞病变。

表1

(4)药物对mdbk细胞最大安全浓度的测定：

消化mdbk，加入细胞生长液，按每孔1×10⁵个/ml的密度接种于96孔板中，培养箱中培养成单层细胞后，弃去生长液；将二倍稀释成不同浓度的药物稀释液加入到培养的单层细胞中，每个药液梯度100μl/孔，每个浓度设8个重复，置于培养箱中继续培养培养72h，并逐日观察细胞病变程度和病变孔数。本试验同时还设置正常细胞对照组和空白对照组。待cpe不再继续时，用pbs洗涤液洗涤细胞板3次，再每孔加入10ml的cck8试剂，于37℃、5％co2条件下继续培养4h，在450nm波长处用酶标仪测定各组细胞的吸光度(od值)。计算细胞病变率的公式为：细胞病变率(％)＝[(细胞对照组平均od值-试验加药组平均od值)/细胞对照组平均od值]×100％。然后利用graphpadprism^tm软件计算药物的半数中毒浓度(cc50)和最大安全浓度(mntc)。

结果：利巴韦林在256μg/ml浓度下的细胞生长速度比正常细胞对照组减慢了3倍，但未出现细胞病变；矮紫堇出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定矮紫堇和利巴韦林的最大安全浓度分别为1mg/ml、2μg/ml,并且在此浓度下，受试细胞形态学正常，与对照组无明显差异(p＞0.05)。经分析软件分析，矮紫堇半数中毒浓度为7.116mg/ml，而利巴韦林的半数中毒浓度20μg/ml。

(5)不同浓度药物稀释液的配制：

根据药物对mdbk细胞最大安全浓度的测定结果，采用二倍倍比稀释法用3％的细胞维持液将矮紫堇和利巴韦林以相应的最大药物安全浓度为基准(矮紫堇1mg/ml；利巴韦林2μg/ml)相应的配制成5个药物浓度，并用0.22μm微滤膜进行过滤除菌，4℃下避光保存备用。

(6)药物对bvdv的直接杀伤作用：

将等量的100·tcid50bvdv病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％co2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μl/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加100μl细胞维持液继续培养72h，逐日观察并详细记录每个细胞孔cpe结果。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设8个重复，待病毒对照组cpe不再继续时，然后进行cck8细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗bvdv的有效率。计算药物的抗病毒有效率的公式为：药物的抗病毒有效率(％)＝[(试验加药组平均od值-病毒对照组平均od值)/(细胞对照组平均od值-病毒对照组平均od值)]×100％。然后利用spss22.0软件对组间病毒抑制率及其病毒滴度的差异性进行相关性分析；采用graphpadprism^tm软件计算药物半数有效浓度(ec50)。然后按公式ti＝cc50/ec50，计算相应的治疗指数(ti)。

结果:矮紫堇与bvdv预先作用的给药方式下，各浓度的试验加药组细胞病变较病毒对照组轻微，细胞的变圆、脱落、空泡化等病理现象有所减轻，如图2所示。采用cck8试剂盒进行细胞活力检测，结果显示，矮紫堇对bvdv均表现出有一定的抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。相比同种药物的其他浓度组，矮紫堇和利巴韦林均在最大药物安全浓度时有相对较高的有效抑制率，分别是72.86％、51.06％，药物对bvdv直接杀伤作用的细胞活力检测结果如表2所示。通过分析软件，计算出矮紫堇和利巴韦林的半数有效浓度ec50分别为0.367mg/ml、2μg/ml，并按照公式计算出相应的治疗指数ti分别为19.31和10.00，如表3所示，表明矮紫堇对bvdv均具有一定的直接灭活的作用。

表2

*：p＜0.05，与病毒对照组相比；**：p＜0.01，与病毒对照组相比.

(7)药物对bvdv的吸附阻断作用：

按每孔1×10⁵个/ml的细胞密度将消化好的细胞接种到96孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，并加入以最大安全浓度内2倍倍比稀释的药液，37℃培养4h后，弃去培养液，pbs洗涤3遍，加入100·tcid50病毒液，100μl/孔，吸附2h后，每15min摇晃一次，弃去病毒液，pbs清洗3遍，之后加入细胞维持液继续培养，逐日观察cpe并记录病变孔数。本试验同时还设置病毒对照组、正常细胞对照组、空白对照组，每个浓度设8个重复。待病毒对照组不再继续出现cpe时，采用cck8检测细胞活力，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。

结果：cpe观察结果显示：药物预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。cck8检测结果显示，矮紫堇和利巴韦林对bvdv的有效抑制率均低于20％，表明矮紫堇和利巴韦林均不能阻止bvdv对mdbk细胞的吸附作用。

(8)药物对bvdv复制阻断作用：

将mdbk细胞消化好后按每孔1×10⁵个/ml的细胞密度接种到96孔板中，待长成单层细胞后加入100·tcid50病毒液，每孔100μl，37℃吸附2h后，间隔15min摇晃一次，弃上清液，pbs洗涤3遍，每孔加入100μl含药最大安全浓度内2倍倍比稀释的维持液继续培养，逐日在倒置显微镜下观察并记录cpe结果。本试验同时还设置病毒对照组、正常细胞对照组、空白对照组，每个浓度设8个重复。待病毒对照组cpe不再继续时，采用cck8试剂盒检测细胞活力，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗bvdv有效率。

结果：cpe观察结果显示：病毒预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均没有明显的变化。cck8检测结果显示，矮紫堇对bvdv的有效抑制率低于15％，表明矮紫堇不能阻断bvdv在mdbk细胞中的复制作用。而利巴韦林在2μg/ml和1μg/ml浓度时测的细胞病变率与病毒对照组相比差异显著(p＜0.05)，但细胞病变率均小于30％，表明该作用方式下的利巴韦林对bvdv则有微弱的复制阻断作用。

本发明应用实施例以牛肾细胞(mdbk)为载体，在bvdv细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现矮紫堇的新型抗病毒作用，对bvdv有一定的抑制作用，且对病毒的直接杀灭作用均好于吸附阻断作用和复制阻断作用。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。