本发明属于涉及医药
技术领域：
，特别是涉及银杏内酯组合物在治疗/预防慢性阻塞性肺病中的应用。
背景技术：
：慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是一种慢性疾病，以不完全可逆的气流受限为特征，且气流受限呈进行性加重，与肺部的炎症反应有关。COPD的病理改变存在于中央气道、外周气道、肺实质和肺血管系统。在中央气道内，炎症细胞浸润表皮上皮，增大粘液分泌腺、杯状细胞数目增多，导致更多的粘液分泌。在外周气道内，慢性炎症会导致气道壁发生循环的损伤和修复过程。反复修复导致气道壁结构重塑，增加胶原含量，促进疲痕组织形成，这些病理改变导致气道腔狭窄，引起气道阻塞。COPD的发病机制目前尚未完全明了，一般认为炎症、氧化-抗氧化失衡、蛋白酶-抗蛋白酶失衡是发病的三个途径。如何在早期控制气道炎症，干预气道结构重塑，延缓/逆转气道狭窄成为治疗的关键所在。临床治疗所用的一线药主要包括受体激动剂、糖皮质激素、抗生素等，到目前为止，几乎没有哪种药物被证明可以减缓慢性阻塞性肺病患者的肺功能下降速率，药物治疗只能控制症状，缓解病人痛苦。抗生素治疗在COPD加重期具有重要地位，本实验中所用的阳性药头孢克肟，对链球菌属、肺炎球菌、淋球菌、伯雷汉氏菌属、大肠杆菌等造成的感染具有明显的治疗作用，临床上常用于治疗COPD。慢性阻塞性肺病动物模型造模方法主要有SO2吸入、烟熏和感染等。采用多因素造模是建立慢性阻塞性肺病模型常用的方法。银杏叶提取物是目前国际上使用最为广泛的中药提取物之一，其中银杏内酯是银杏叶提取物及其制剂主要的药效活性成分，目前还未见银杏叶提取物能对慢性阻塞性肺病具有治疗或预防作用的相关报道。技术实现要素：本发明以在两种动物模型上进行验证的方式对银杏内酯组合物进行研究，旨在得到一种具有治疗或预防慢性阻塞性肺病的银杏内酯组合物。由此，本发明提出了一种银杏内酯组合物在制备治疗或预防慢性阻塞性肺病药物中的应用。该慢性阻塞性肺病具有包括肺功能指标下降，呼吸急促，血清细胞因子IL-10表达降低，而IFN-γ和IL-6的表达升高，肺泡数减少等等的症状。其中，所述银杏内酯组合物包括银杏内酯A、B、K，其特征在于，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～40)：(50～75):(0.2～5)。或，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～35)：(50～70):(0.5～4)。进一步地，以重量比计，银杏内酯A：银杏内酯B：银杏内酯K比例为(20～30)：(50～65):(0.8～4)。具体地，所述慢性阻塞性肺病药物选自口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。优选地，所述口服给药剂型剂量为2.5-10mg/kg/d。本发明通过烟熏加气管滴注脂多糖法和烟熏加肺炎双球菌法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，给予银杏内酯组合物药物干预后发现银杏内酯组合物剂量依赖性改善慢性阻塞性肺病模型大鼠呼吸频率、肺功能、降低模型组大鼠IFN-γ、IL-6的表达、升高模型大鼠IL-10的表达、增加肺泡数、降低胶原含量、减轻气道重塑等。因此，由对于两种慢性阻塞性肺病动物模型的药效均证实银杏内酯组合物具有治疗慢性阻塞性肺病的作用。具体实施方式以下通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式的内容仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。需要注意的是，如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用与本发明。银杏内酯组合物对烟熏加气管滴注脂多糖法建立的慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的保护作用1、实验材料1.1药物及试剂原料银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由江苏康缘药业股份有限公司自制，具体如下；雄性SD大鼠160只，体重(200±20)g，普通级，购自北京维通利华实验动物中心；LPS购于Sigma公司；头孢克肟片购于广州白云山制药股份有限公司；生理盐水购于金健药业有限公司。1.2主要耗材与仪器M2e酶标仪购于MD公司；小动物肺功能检测系统购于BUXCO公司。2、实验方法2.1动物模型的建立采用宋一平等(慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及药物干预的影响[J].解放军医学院学报,2001,22)的方法并加以改良建立大鼠慢性阻塞性肺疾病模型如下：在室温环境中，第1、14d大鼠麻醉后气管内滴脂多糖，将大鼠逐一称质量，按50mg/kg体质量腹腔注射质量浓度为4g/L戊巴比妥钠溶液，待大鼠麻醉后，将其固定于解剖台上，头低位暴露声门，将静脉套管针沿气管走行快速插入气管，拔出针芯，接1mL注射器，1s内注入溶于注射用生理盐水的质量浓度为1g/L的脂多糖0.2mL(200μg)，将大鼠直立，左右旋转，使脂多糖在肺内均匀分布。第2～28d(天)给予大鼠2次/d香烟烟熏，每次点燃烟丝的质量为9.03g(每支烟烟丝质量为0.645g)，持续时间大约1h，间隔4h(滴脂多糖当天不烟熏)。被动吸烟方法：将大鼠放入自制的有机玻璃染毒箱(100cm×80cm×50cm)内，香烟点燃后，用60mL注射器吸满烟雾，然后通过三通管将香烟烟雾快速注入染毒箱内(此操作频率为20次/min)，进行大鼠被动吸烟染毒。为减少香烟燃烧所产的水蒸气对大鼠的影响，在箱底放置适量硅胶干燥剂。2.2实验分组随机抽取大鼠10只，作为空白对照组，其余造模。造模成功的大鼠随机分为模型组、阳性药组(18mg/kg)、YXNZ-1-低(2.5mg/kg)、YXNZ-1-中(5mg/kg)、YXNZ-1-高(10mg/kg)、YXNZ-2-低(2.5mg/kg)、YXNZ-2-中(5mg/kg)、YXNZ-2-高(10mg/kg)、YXNZ-3-低(2.5mg/kg)、YXNZ-3-中(5mg/kg)、YXNZ-3-高(10mg/kg)、YXNZ-4-低(2.5mg/kg)、YXNZ-4-中(5mg/kg)、YXNZ-4-高(10mg/kg)，每组10只。空白对照组给予新鲜空气，模型组按照2.1方法造模，给药组(阳性药和YXNZ组)在按照2.1方法造模后给予相应药物，灌胃给药7d。2.3检测2.3.1一般情况、体重记录大鼠体质量、活动、反应时间、毛发、粪便死亡率、呼吸速率、咳嗽、呼吸道分泌物、痰和其他慢性阻塞性肺疾病的症状和体征。2.3.2肺功能评价利用小动物肺功能检测装置进行检测，用力肺活量、平均呼气流量和呼气峰流速纳入记录。2.3.3酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附实验检测血清干扰素-γ、IL-6和白细胞介素-10(IL-10)。操作严格按照试剂盒说明进行。2.4数据处理实验结果以Mean±SD表示，所有数据用SPSS17.0软件进行分析。采用方差分析统计，P﹤0.05有统计学差异。3实验结果3.1生物学观测对照组中，食物的摄入量和体质量逐渐增加。大鼠呼吸频率稳定，无呼吸道分泌物，无痰。模型组大鼠食欲减退，毛发脱落，体质量低于对照组(P＜0.001)。模型组大鼠呼吸急促，呼吸频率显著高于对照组(P＜0.001)。此外，实验组鼻腔和口中有分泌物，有咳嗽，呼吸道有痰液，表明该组肺功能减低。YXNZ各组症状明显好于模型对照组，体质量和呼吸频率优于模型对照组(P＜0.05)，见表1。表1大鼠体重和呼吸频率的比较(g，n＝10)组别给药剂量(mg/kg)体质量(g)呼吸频率(Hz)对照组0229.24±18.421.31±0.30模型组0181.77±15.84###2.39±0.43###阳性药组18218.55±16.16***1.50±0.48***YXNZ-1-低2.5204.05±14.97**1.76±0.22***YXNZ-1-中5211.86±15.44***1.68±0.43**YXNZ-1-高10219.42±18.10***1.44±0.34***YXNZ-2-低2.5208.61±14.30***1.64±0.39***YXNZ-2-中5217.86±16.81***1.52±0.33***YXNZ-2-高10225.34±17.52***1.35±0.28***YXNZ-3-低2.5198.28±16.79*1.82±0.23**YXNZ-3-中5208.13±15.68**1.77±0.35**YXNZ-3-高10211.50±14.41***1.61±0.36***YXNZ-4-低2.5191.05±15.522.01±0.45YXNZ-4-中5201.54±17.01*1.89±0.36*YXNZ-4-高10208.48±15.88**1.74±0.41**#p＜0.05vs对照组；##p＜0.01vs对照组；###p＜0.001vs对照组；*p＜0.05vs模型组；**p＜0.01vs模型组；***p＜0.001vs模型组。3.2肺功能的改变与对照组相比，肺功能指标如用力呼气流量(FEV)用力肺活量(FVC)模型组明显降低(P＜0.01)。YXNZ各组FEV、FVC明显优于模型对照组(P＜0.05)，见表2。表2各组间大鼠肺功能参数的比较(n＝10)#p＜0.05vs对照组；##p＜0.01vs对照组；###p＜0.001vs对照组；*p＜0.05vs模型组；**p＜0.01vs模型组；***p＜0.001vs模型组。3.3血清细胞因子的变化IL-10可影响炎症因子的合成，抑制促炎介质的表达，IL-10的降低可能参与气道炎症以及肺组织受损等病理过程。IL-6直接参与炎症和损伤，COPD患者血清IL-6含量高于健康人群。IFN-γ是一种调节细胞功能的小分子多肽，能够促进炎症细胞渗出、激活中性粒细胞，参与炎症过程。本实验对这三个细胞因子进行检测。与正常对照组相比，模型对照组IL-10表达降低，而IFN-γ和IL-6的表达明显升高(P<0.001)。与模型组相比，YXNZ各组IL-10的表达明显升高，而IFN-γ和IL-6的表达降低(P<0.01)，见表3。表3大鼠血清IFN-γ、IL-6和IL-10(mmol/L，n＝10)#p＜0.05vs对照组；##p＜0.01vs对照组；###p＜0.001vs对照组；*p＜0.05vs模型组；**p＜0.01vs模型组；***p＜0.001vs模型组。银杏内酯组合物对烟熏加肺炎双球菌法建立的慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的保护作用1、实验材料1.1药物及试剂原料银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯K(GK)以及银杏内酯组合物1-4由江苏康缘药业股份有限公司自制，具体如下；清洁级Wistar雄性大鼠160只，购自上海斯莱克公司，体质量(200±20)g；肺炎双球菌菌液由湖南省检验中心提供；头孢克肟片购于广州白云山制药股份有限公司；生理盐水购于金健药业有限公司。1.2主要耗材与仪器动物肺功能检测分析系统购于Buxco公司，JY3002型电子天平购于上海精密科学仪器有限公司、HHS-s电子恒温不锈钢水浴锅购于上海南阳仪器有限公司、LEICADMLB2型双目显微镜购于德国LEICA公司。2、实验方法2.1造模慢性阻塞性肺疾病痰热郁肺证大鼠模型：常规饲养动物3d后，将选定为造模用的150只大鼠置于约1m3的熏房内加锯末、烟叶各50g，加硫磺10g，点燃烟熏，每日2次，每次30min，每次间隔4h以上，适当通风，每间隔2d或3d予大鼠经鼻腔滴入肺炎双球菌菌液0.1ml(每周2次)，如此循环8次(细菌浓度为6×108CFU/ml，最后2次造模菌液浓度为18×108CFU/ml)，(经鼻腔滴入的具体方法为：一次性1ml注射器吸取细菌菌液0.1ml，带塑料套管外套的5.5号针针尖进入大鼠鼻腔内，趁大鼠吸气时滴入液体)。造模28d结束。空白对照组，另室常规喂养，空白对照组予鼻腔滴入细菌常规培养液0.1ml，不做其他处理。2.2分组及给药造模成功后，150只模型大鼠不同笼喂养，称重、标记、随机分为模型组、阳性药组(18mg/kg)、YXNZ-1-低(2.5mg/kg)、YXNZ-1-中(5mg/kg)、YXNZ-1-高(10g/kg)、YXNZ-2-低(2.5mg/kg)、YXNZ-2-中(5mg/kg)、YXNZ-2-高(10mg/kg)、YXNZ-3-低(2.5mg/kg)、YXNZ-3-中(5mg/kg)、YXNZ-3-高(10mg/kg)、YXNZ-4-低(2.5mg/kg)、YXNZ-4-中(5mg/kg)、YXNZ-4-高(10mg/kg)，每组10只。10只正常大鼠为空白对照组。连续灌胃给药7d。2.3大鼠一般状况观察观察各组大鼠活动状态、对外界反映的灵敏度、皮毛性状、饮食情况、体重变化、死亡情况等及大鼠咳嗽、气喘、鼻及呼吸道分泌物等症状并详细记录。2.4肺功能测定给药7d结束次日，测定前称体重，用10％水合氯醛0.4mL/100g对大鼠行腹腔注射麻醉，麻醉后将其仰卧位固定在鼠板上，依次切开皮肤、钝性分离皮下组织、肌肉至暴露气管，行气管V形切口、气管套管气管插管后，连接Buxco系统，用Buxco动物肺功能仪分析系统测定大鼠气道气流和压力变化，测量呼气峰值流速(PEF)、吸气阻力(Ri)、及动态肺顺应性(Cdyn)等。2.5造模后肺组织形态学观察(1)肉眼观察肺组织整体外观形态：观察肺组织的体积、形态、质地、弹性等情况。(2)染色光镜下观察肺组织结构：石蜡切片经二甲苯脱:2次及下行梯度酒精至水，苏木素染液染色10min，水洗5min，1％盐酸酒精分色(显微镜下控制分色时间)，水洗5min，0.5％伊红染液染色5min，水洗5min，上行梯度酒精脱水，二甲苯2次透明，中性树胶封固。光镜下观察(3)HE染色切片平均肺泡数比较：用图像分析系统分析HE染色切片，在400倍光镜下计数每个视野内的肺泡数，除以此视野的面积，即为平均肺泡数(MAN)，每只测5个视野，取平均值。(4)Masson法染色观察肺组织胶原纤维情况。Masson染色步骤：切片经二甲苯两次脱蜡10min，100％乙醇两次各1min，95％乙醇两次各1min；流水冲洗5min，蒸馏水洗3次；苦味酸乙醇液中分色10min，流水冲洗5min，蒸馏水洗1次；丽春红等混合液染15min；1％醋酸快速洗2次；2.5％磷钨酸20min，2.5％磷钨酸20min；流水冲洗1次，蒸馏水洗1次；2％橙黄G染15sec；1％醋酸快速洗2次；胺尼林兰染液染2min；1％醋酸快速洗2次；95％乙醇洗1次；异丙醇3个(加分子筛)各洗1次；二甲苯依次1min、2min、2min、1min封片。光镜观察：染色后光镜下观察可见，细胞核呈兰黑色，细胞浆呈朱红色，胶原呈天蓝色。观察各组胶原纤维的分布情况，并以图像分析软件分析胶原纤维含量的变化，测量各组大鼠单位面积内胶原纤维的面积。2.6数据处理实验结果以Mean±SD.表示，所有数据用SPSS17.0软件进行分析。采用方差分析统计，p﹤0.05有统计学差异。3实验结果3.1银杏内酯提取物对慢性阻塞性肺病模型一般状况的影响大鼠在造模约两周后相继出现咳嗽、喘息、鼻部潮湿、呼吸道分泌物增多，造模结束后，模型组大鼠毛色枯搞并有脱毛，蜷缩少动，行动迟缓，生长缓慢，仍有咳嗽、喘息、呼吸急促，并见面部、眼结膜水肿、舌质紫黯，甚至口唇发绀死亡。各治疗组症状较模型组有明显好转。空白对照组大鼠饮食正常，灵敏好动，皮毛光泽，体形强壮。药物治疗组大鼠整体情况较空白对照组略差，出现食欲下降、行动迟缓、舌质暗红等症状，给药后一般状况较有好转。实验观察到模型组大鼠一般体质及营养状况差，到后期甚至出现缺氧、右心衰的表现。3.2银杏内酯提取物对慢性阻塞性肺病模型大鼠肺功能的影响实验结果表明，模型组气道阻力较空白对照组显著升高，表明慢性阻塞性肺疾病疾热郁肺证大鼠模型有阻塞性通气功能障碍，YXNZ各治疗组均较模型组肺功能明显改善(P<0.01)，说明YXNZ能延缓慢性阻塞性肺疾病疚热郁肺证大鼠模型肺功能的下降。见表4。表4各组大鼠肺功能比较(n＝10)#p＜0.05vs对照组；##p＜0.01vs对照组；###p＜0.001vs对照组；*p＜0.05vs模型组；**p＜0.01vs模型组；***p＜0.001vs模型组。3.3银杏内酯提取物对慢性阻塞性肺病模型肺组织平均肺泡数的影响实验结果表明，空白对照组与模型组比较，模型组肺泡数明显减少，差异有显著性(P<0.001)。YXNZ各治疗组与模型组比较，治疗组均亦好于模型组差异有显著性(P<0.001)。提示YXNZ能减轻慢性阻塞性肺疾病疾热郁肺证大鼠模型的病变程度，对有一定的治疗作用。见表5。表5各组大鼠肺组织平均肺泡数比较(s，n＝10)#p＜0.05vs对照组；##p＜0.01vs对照组；###p＜0.001vs对照组；*p＜0.05vs模型组；**p＜0.01vs模型组；***p＜0.001vs模型组。3.4银杏内酯提取物对慢性阻塞性肺病模型大鼠肺组织Masson染色胶原面积的影响实验结果表明，YXNZ各治疗组较模型组胶原显著减少(P<0.001)，提示YXNZ起到降低胶原含量，从而减轻气道重塑(P<0.001)。见表6。表6各组大鼠肺组织Masson染色胶原面积比较(n＝10)#p＜0.05vs对照组；##p＜0.01vs对照组；###p＜0.001vs对照组；*p＜0.05vs模型组；**p＜0.01vs模型组；***p＜0.001vs模型组。本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页1 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