载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法、载药载氧杂交蛋白纳米粒和应用与流程

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是涉及一种载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法、载药载氧杂交蛋白纳米粒和应用。

背景技术：

实体肿瘤由于混乱和复杂的血管结构以及旺盛的细胞代谢而表现出缺氧的微环境特点，研究证明，肿瘤缺氧造成了肿瘤特殊的微环境，影响了肿瘤组织的血管生成、细胞分裂等过程，导致对化疗药物和放射治疗不敏感，甚至还会导致肿瘤基因突变和肿瘤转移。光动力疗法中，氧气作为反应物对于肿瘤光动力治疗效果具有一定影响，肿瘤缺氧限制了光动力治疗活性氧的产生，影响了治疗效果。

目前临床治疗采用吸入高压氧的方式以增加肿瘤区域的氧含量，并获得肿瘤对放射治疗、化疗和光学治疗的增敏效果。高压氧疗法通过血液中的红细胞供氧，但是红细胞无法穿透血管将氧输送到肿瘤内部，并且肿瘤血管的不规则生长限制了氧和药物到达肿瘤。同时，高浓度的氧还会使肺和中枢神经系统发生氧中毒。因此，本领域技术人员需要研制一种具有肿瘤靶向和载氧功能，能够将氧气和药物高效递送到缺氧的肿瘤内部，且无副作用的治疗方案，以满足肿瘤治疗的需要。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法，以缓解目前临床治疗采用吸入高压氧的方式通过血液中的红细胞供氧，但是红细胞无法穿透血管将氧输送到肿瘤内部，且肿瘤血管的不规则生产限制了氧和药物到达肿瘤，同时高浓度的氧还会使肺和中枢神经系统发生氧中毒的技术问题。

本发明提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(a)将还原剂与血清白蛋白混合均质，进行还原反应，得到还原型血清白蛋白；

(b)将还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物在有氧条件下混合均质，即制得载药载氧杂交蛋白纳米粒。

进一步的，所述血红蛋白来源于动物，优选地，所述血红蛋白来源于人、牛或猪；

优选地，所述血清白蛋白来源于动物或采用生物发酵方式获得，进一步优选地，所述血清白蛋白来源于人或牛，更进一步优选地，所述血清白蛋白为生物发酵方式获得的重组人血清白蛋白。

进一步的，所述还原剂选自谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸或同型半胱氨酸中的至少一种。

进一步的，所述药物为化疗药物和/或光敏剂；

优选地，所述化疗药物选自盐酸阿霉素、甲氨蝶呤或金丝桃素中的至少一种；

优选地，所述光敏剂选自吲哚菁绿、血卟啉、原卟啉或二氢卟吩-e6中的至少一种。

进一步的，血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(2-50)，优选为1：(3-15)，更优选为1：(5-10)；

优选地，所述血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.1-1)，优选为1：(0.15-0.5)，更优选为1：(0.15-0.3)。

进一步的，在步骤(b)中，还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物的混合溶液的ph值为7-9；

优选地，混合均质时间为10-180分钟；

优选地，还原型血清白蛋白的浓度为0.5-3％。

进一步的，在步骤(b)中，先将还原型血清白蛋白与血红蛋白及药物在有氧条件下混合均质，然后加入沉淀剂混合均匀，最后通过真空干燥、超滤或透析将沉淀剂和游离蛋白及药物去除，即可制得载药载氧杂交蛋白纳米粒；优选地，所述沉淀剂为无水低碳醇，更优选为无水乙醇。

进一步的，还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物的混合溶液与沉淀剂的体积比为1：(1-2.5)；

优选地，还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物混合溶液与沉淀剂的混合时间为0.5-12小时。

本发明的目的之二在于提供一种按照上述载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法制备而成的载药载氧杂交蛋白纳米粒。

本发明的目的之三在于提供上述载药载氧杂交蛋白纳米粒在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法，简便易行，便于推广应用，适用于大规模制备。

本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒，通过血红蛋白和血清白蛋白通过二硫键共价结合，包载药物，结合氧气，使其同时具备血清白蛋白的肿瘤靶向功能和血红蛋白的载氧功能，能够靶向的将氧和药物输送到肿瘤内部，提高药物在肿瘤内部的富集，并且能够根据所处的微环境下的氧浓度，进行氧分子的可逆释放，不会影响正常氧浓度的组织，无副作用，能够有效改善肿瘤缺氧，增强肿瘤的治疗效果，实现肿瘤增氧与药物递送的一体化，提高了药物的生物利用率。另外本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒结构稳定，储存时间长，便于推广和应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例7提供的载药载氧杂交纳米粒的粒径分布图；

图2为荷瘤裸鼠注射载药载氧杂交蛋白纳米粒后肿瘤部位含氧血红蛋白含量变化的光声成像监测图；

图3为注射载药载氧杂交蛋白纳米粒6小时后的荷瘤裸鼠和注射游离二氢卟吩-e6溶液6小时后的荷瘤裸鼠的荧光成像对比图；

图4为载药载氧杂交蛋白纳米粒和游离盐酸阿霉素溶液进行化疗后的肿瘤细胞存活率对比柱状图；

图5为载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液和游离阿霉素和二氢卟吩-e6混合溶液在增氧化疗和增氧光动力联合治疗后肿瘤细胞的存活率对比柱状图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

(a)将还原剂与血清白蛋白混合均质，进行还原反应，得到还原型血清白蛋白；

(b)将还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物在有氧条件下混合均质，即制得载药载氧杂交蛋白纳米粒。

本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备方法，简便易行，便于推广应用，适用于大规模制备。

在步骤(a)中，通过还原剂与血清白蛋白进行还原反应，将血清白蛋白分子内部的二硫键断开，得到无规状态的还原型血清白蛋白分子。在步骤(b)中，还原型血清白蛋白分子与血红蛋白的游离巯基发生交联，重构成分子间二硫键，形成杂交蛋白纳米载体，并且在二硫键重构阶段，杂交纳米载体能够包载药物并结合氧气，形成载药载氧杂交蛋白纳米粒。

在本发明中，混合均质指的是混合后再进行均质。

在本发明的一种优选实施方式中，血红蛋白来源于动物，优选地，所述血红蛋白来源于人、牛或猪；优选地，血清白蛋白来源于动物或采用生物发酵方式获得，优选地，所述血清白蛋白来源于人和牛，更优选地，所述血清白蛋白为生物发酵方式获得的重组人血清白蛋白。

血红蛋白来源于动物，能够从动物血液中提取得到，当血红蛋白从人、牛和猪等动物血液中进行提取时，所制成的载药载氧杂交蛋白纳米粒在体内的稳定性更佳。血红蛋白包括血红蛋白及其类似物分子，血红蛋白原料包括hba、hba2、hbf等亚型。

血清白蛋白从动物血液中提取得到或通过生物发酵方式获得。当血清白蛋白为从人、牛等动物血液中提取得到的血清白蛋白时，所制成的载药载氧杂交蛋白纳米粒的体内稳定性更好，当血清白蛋白为采用生物发酵方式获得的重组人血清白蛋白时，所制成的载药载氧杂交蛋白纳米粒的体内稳定性更佳。

在本发明的一种典型但非限制性的实施方式中，还原剂选自谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸或同型半胱氨酸中的至少一种。

在发明的典型但非限制性的实施方式中，还原剂可以为谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸和同型半胱氨酸中的一种，也可以为谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸和同型半胱氨酸中任意两种的混合物，如谷胱甘肽和二硫苏糖醇的混合物、二硫苏糖醇和半胱氨酸的混合物或半胱氨酸和同型半胱氨酸的混合物等，还可以为谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸和同型半胱氨酸中任意三种的混合物，如古胱甘肽、二硫苏糖醇和半胱氨酸的混合物或谷胱甘肽、二流苏糖醇和同型半胱氨酸的混合物等，也可以为谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸和同型半胱氨酸四种物质的混合物。

在本发明的一种优选实施方式中，药物为化疗药物和/或光敏剂；

优选地，化疗药物选自盐酸阿霉素、甲氨蝶呤或金丝桃素中的至少一种；

优选地，光敏剂选自吲哚菁绿、血卟啉、原卟啉或二氢卟吩-e6中的至少一种。

本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒通过携带有化疗药物和/或光敏剂及氧气，以在缺氧肿瘤内部释放氧气、化疗药物和/或光敏剂，改善肿瘤缺氧和提高化疗药物和/或光敏剂在肿瘤内部的富集，从而增强肿瘤的治疗效果。

在本发明的典型但非限制性的实施方式中，化疗药物为盐酸阿霉素、甲氨蝶呤或金丝桃素，也可以为盐酸阿霉素、甲氨蝶呤和金丝桃素中任意两种的混合物，还可以为盐酸阿霉素、甲氨蝶呤和金丝桃素的混合物。

在本发明的典型但非限制性的实施方式中，光敏剂为吲哚菁绿、血卟啉、原卟啉或二氢卟吩-e6，也可以为吲哚菁绿、血卟啉、原卟啉和二氢卟吩-e6中任意两种的混合物，还可以为吲哚菁绿、血卟啉、原卟啉和二氢卟吩-e6的混合物。

在本发明的一种优选实施方式中，血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(2-50)，优选为1：(3-15)，更优选为1：(5-10)；

优选地，血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.1-1)，优选为1：(0.15-0.5)，更优选为1：(0.15-0.3)。

通过控制血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(2-50)，血清白蛋白为血红蛋白提供充分的保护，从而提高载药载氧杂交蛋白纳米粒在体内的稳定性，延长载药载氧杂交蛋白纳米粒在体内的循环时间，当血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(3-15)时，所制成的载药载氧杂交蛋白纳米粒不仅在体内的稳定性好，循环时间长，而且载氧量和载药量均较大，尤其当是血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(0.15-0.3)之间时，其体内稳定性更佳，循环时间更长，载氧量和载药量更大。

通过控制血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.1-1)，以使得还原剂与血清白蛋白发生还原反应时，血清白蛋白分子还原反应进行的充分，血清白蛋白分子内部的二硫键能够断开，生成的还原型血清白；尤其是血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.15-0.5)时，血清白蛋白还原反应进行的更加充分，血清白蛋白分子内部的二硫键断开的更多，当血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.15-3)时，其血清白蛋白还原反应进行的更充分，生成的还原型血清白蛋白分子所含的游离巯基更多。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(b)中，还原型血清白蛋白与血红蛋白的混合溶液的ph值为7-9；

优选地，混合均质时间为10-180分钟；

优选地，还原型血清白蛋白的浓度为0.5-3％。

在步骤(b)中，通过控制还原型血清白蛋白和血红蛋白的混合溶液的ph值为7-9，以促进载药载氧杂交蛋白纳米粒的生成，在进行混合匀质的过程中，可以通过碳酸氢钠调节ph值，使其ph值保持在7-9。

通过控制混合均质的时间为10-180分钟，以使得还原型血清白蛋白和血红蛋白反应更加充分，提高载药载氧杂交蛋白纳米粒的产率。

上述还原型血清白蛋白的浓度指的是还原型血清白蛋白在还原血清白蛋和血红蛋白的混合溶液中的浓度。通过控制还原型血清白蛋白的浓度为0.5-3％，以提高载药载氧杂交蛋白纳米粒的制备效率。

在本发明的一种优选实施方式中，在步骤(b)中，先将还原型血清白蛋白与血红蛋白及药物在有氧条件下混合均质，然后加入沉淀剂混合均匀，最后通过真空干燥、超滤或透析将沉淀剂和游离蛋白及药物去除，即可制得载药载氧杂交蛋白纳米粒。

在步骤(b)中，采用沉淀剂以降低血红蛋白与还原型血清白蛋白的溶解度，使血红蛋白与还原型血清白蛋白交联反应进行的更充分，提高载药载氧杂交蛋白纳米粒的产率。

最后通过真空干燥、超滤或透析将沉淀剂和游离蛋白及药物去除，以对载药载氧杂交蛋白纳米粒进行提纯，上述游离蛋白包括未进行交联反应的游离血清白蛋白和游离血红蛋白。

在本发明的典型但非限制性的优选实施方式中，沉淀剂为无水低碳醇，所述无水低碳醇指的是c1-c4的低碳醇，优选地，所述沉淀剂为无水乙醇。

在本发明的进一步优选实施方式中，采用超滤或透析将沉淀剂和游离蛋白及药物去除时，超滤或透析截留的分子量为100-300kda。

在本发明的一种优选实施方式中，还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物的混合溶液与沉淀剂的体积比为1：(1-2.5)；

优选地，还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物混合溶液与沉淀剂的混合时间为0.5-12小时。

通过控制还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物的混合溶液与沉淀剂的体积比为1：(1-2.5)，以使得沉淀剂与血清白蛋白、血红蛋白和药物的混合溶液充分混合，降低还原型血清白蛋与血红蛋白的溶解度，使两种蛋白交联反应进行的更充分。

通过控制还原型血清白蛋白、血红蛋白和药物混合溶液与沉淀剂的混合时间为0.5-12小时，以使得沉淀剂能够与还原型血清白蛋白和血红蛋白混合溶液混合均匀，降低还原型血清白蛋白和血红蛋白的溶解度，使两种蛋白交联反应进行的更充分。

根据本发明的第二个方面，本发明提供了根据上述载药载氧杂交蛋白纳米粒制备而成的载药载氧杂交蛋白纳米粒。

本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒，通过血红蛋白和血清白蛋白通过二硫键共价结合，包载药物，结合氧气，使其同时具备血清白蛋白的肿瘤靶向功能和血红蛋白的载氧功能，能够靶向的将氧和药物输送到肿瘤内部，提高药物在肿瘤内部的富集，并且能够根据所处的微环境下的氧浓度，进行氧分子的可逆释放，不会影响正常氧浓度的组织，无副作用，能够有效改善肿瘤缺氧，增强肿瘤的治疗效果，实现肿瘤增氧与药物递送的一体化，提高了药物的生物利用率。另外本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒结构稳定，储存时间长，便于推广和应用。

根据本发明的第三方面，本发明提供了上述载药载氧杂交蛋白纳米粒的应用，其用于制备肿瘤治疗药物。

本发明提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒同时具备血清白蛋白的肿瘤靶向功能和血红蛋白的载氧功能，并包载有药物，结合有氧气，能够靶向的将氧和药物输送到肿瘤内部，在缺氧肿瘤内部释放氧气和药物，在改善肿瘤缺氧的同时提高药物富集，增强肿瘤的治疗效果。

下面结合实施例和对比例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。

实施例1

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg牛血清白蛋白、30mg二硫苏糖醇共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、10mg血红蛋白和0.8mg盐酸阿霉素在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质10分钟，用碳酸氢钠调ph值为7，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇2ml，搅拌0.5小时后，将混合溶液装入截留分子量为100kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液。

实施例2

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg人血清白蛋白、300mg同型半胱氨酸共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、0.4mg血红蛋白和0.8mg盐酸阿霉素在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质180分钟，用碳酸氢钠调ph值为9，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇5ml，搅拌12小时后，将溶液装入截留分子量为300kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液。

实施例3

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg重组人血清白蛋白、45mg谷胱甘肽共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、6.7mg血红蛋白和0.8mg盐酸阿霉素在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质20分钟，用碳酸氢钠调ph值为7.5，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇4ml，搅拌1小时后，将溶液装入截留分子量为300kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液。

实施例4

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg重组人血清白蛋白、150mg谷胱甘肽共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、1.3mg血红蛋白和0.8mg盐酸阿霉素在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质120分钟，用碳酸氢钠调ph值为8.5，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇3ml，搅拌6小时后，将溶液装入截留分子量为300kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液。

实施例5

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg重组人血清白蛋白、45mg半胱氨酸共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、4mg血红蛋白和0.8mg盐酸阿霉素在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质60分钟，用碳酸氢钠调ph值为8，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇3ml，搅拌6小时后，将溶液装入截留分子量为300kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液。

实施例6

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg重组人血清白蛋白、90mg谷胱甘肽共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、3mg血红蛋白和0.8mg盐酸阿霉素在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质45分钟，用碳酸氢钠调ph值为8，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇3ml，搅拌6小时后，将溶液装入截留分子量为300kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液。

实施例7

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg重组人血清白蛋白、75mg谷胱甘肽共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、3.2mg血红蛋白和0.8mg盐酸阿霉素在有氧条件下，共溶于2ml纯净水中均质30分钟，用碳酸氢钠调ph值为8，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇3ml，搅拌5小时后，将混合溶液装入截留分子量为100kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒。

实施例8

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，本实施例与实施例7的不同之处在于，在步骤(a)中，谷胱甘肽的用量为10mg。

实施例9

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，本实施例与实施例7的不同之处在于，在步骤(b)中，血红蛋白的用量为0.2mg。

实施例10

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg重组人血清白蛋白、75mg谷胱甘肽共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、3.2mg血红蛋白和0.8mg二氢卟吩-e6在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质30分钟，用碳酸氢钠调ph值为8，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇3ml，搅拌3小时，溶液装入截留分子量为100kd的透析袋，透析12小时，得到包载有二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒。

实施例11

本实施例提供了一种载药载氧杂交蛋白纳米粒，按如下步骤进行制备：

(a)将300mg重组人血清白蛋白、75mg谷胱甘肽共溶于5ml去离子水中，室温下震荡1小时，溶液倒入透析袋(3kd)，于无氧去离子水中透析12小时，得到还原型血清白蛋白溶液，将还原型血清白蛋白溶液用去离子水定容至6ml，得到浓度为50mg/ml的还原型血清白蛋白溶液；

(b)将20mg还原型血清白蛋白溶液、3.2mg血红蛋白、0.4mg盐酸阿霉素和0.4mg二氢卟吩-e6在有氧条件下共溶于2ml纯净水中均质30分钟，用碳酸氢钠调ph值为8，在强烈搅拌下，以1ml/min的速度向混合溶液滴加无水乙醇3ml，搅拌4小时后，将混合溶液装入截留分子量为100kd的透析袋，透析12小时，得到包载有盐酸阿霉素和二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒。

试验例1

将实施例1-12提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒均通过动态光散射分析法测定粒径分布，结果显示实施例1-12提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒的粒径均在20-200纳米。图1为实施例7提供的包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交纳米粒的粒径分布图，从图1可以看出，实施例7提供的包载有盐酸阿霉素载药载氧杂交蛋白纳米粒的粒径为20-50纳米。

试验例2

将实施例10提供的载药载氧杂交蛋白纳米粒注射至荷瘤的裸鼠体内，通过光声成像设备(激发光850纳米)监测肿瘤部位含氧血红蛋白(hbo2)的光声信号以判断肿瘤增氧情况。图2为荷瘤裸鼠注射载药载氧杂交蛋白纳米粒后肿瘤部位含氧血红蛋白含量变化的光声成像监测图；从图2可以看出，荷瘤裸鼠注射载药载氧杂交蛋白纳米粒2小时后，肿瘤部位的含氧血红蛋白含量显著增高，一直可以维持6小时的高氧环境，24小时后增恢复到缺氧状态，这说明本发明实施例10提供的包载有二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒具有靶向性，能够穿透血管，在肿瘤部位富集，并在缺氧肿瘤内部释放氧气，增强肿瘤治疗效果。

试验例3

取荷瘤裸鼠两只，其中一只注射实施例10提供的包载有二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒，另外一只同时注射同剂量游离二氢卟吩-e6溶液。通过荧光成像设备对两只裸鼠进行荧光监测，图3为注射载药载氧杂交蛋白纳米粒6小时后的荷瘤裸鼠和注射游离二氢卟吩-e6溶液6小时后的荷瘤裸鼠的荧光成像对比图，其中，杂交蛋白纳米药物指的是实施例10提供的包载有二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒；从图3可以看出，注射6小时后，注射实施例10提供的载药载氧纳米粒的荷瘤裸鼠肿瘤部分富集的二氢卟吩-e6显著高于注射游离二氢卟吩-e6溶液的荷瘤裸鼠，这说明本发明实施例10供的载药载氧杂交蛋白纳米粒具有靶向性，能够穿透血管，在肿瘤部位富集，其靶向性能显著高于游离药物，能够增强肿瘤的治疗效果。

试验例4

将实施例7提供的包载有盐酸阿霉素载药载氧杂交蛋白纳米粒和游离盐酸阿霉素分别配制成盐酸阿霉素浓度为0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml和1μg/ml溶液，然后将上述溶液分别与缺氧条件下培养的人乳腺癌细胞(mcf-7)共孵育2小时，孵育结束后，再继续培养上述肿瘤细胞24小时，测定细胞存活率。图4为载药载氧杂交蛋白纳米粒和游离盐酸阿霉素溶液进行化疗后的肿瘤细胞存活率对比柱状图，其中，杂交蛋白纳米药物指的是实施例7提供的包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒；从图4可以看出，实施例7提供的包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒能够有效杀伤肿瘤细胞，降低肿瘤细胞的存活率，且随着所包载的盐酸阿霉素浓度的提高，其对肿瘤细胞的杀伤效果更为明显，当载药载氧杂交蛋白纳米粒所包载的盐酸阿霉素的浓度为1μg/ml时，肿瘤细胞的存活率不足5％，而游离盐酸阿霉素溶液对肿瘤细胞没有明显的杀伤效果，即使游离盐酸阿霉素溶液的浓度为1μg/ml时，其肿瘤细胞存活率仍为95％以上。这说明本发明实施例7提供的包载有盐酸阿霉素的载氧载药杂交蛋白纳米粒通过对肿瘤细胞的靶向治疗和增氧化疗，能够有效杀伤肿瘤细胞，降低肿瘤细胞的存活率，增强了肿瘤的治疗效果。

试验例5

将实施例11提供的包载有盐酸阿霉素和二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒配置成阿霉素/二氢卟吩-e6浓度为0.2/0.21μg/ml、0.4/0.42μg/ml、0.6/0.64μg/ml、0.8/0.85μg/ml和1/1.05μg/ml的载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液，并将上述载药载杂交蛋白纳米粒溶液与在缺氧条件培养的人乳腺癌细胞(mcf-7)共孵育2小时，同时采用660纳米激光(功率为100mw/cm²)照射肿瘤细胞，然后继续培养上述肿瘤细胞24小时，测定肿瘤细胞存活率，测试结果如图5所示。

将盐酸阿霉素和二氢卟吩-e6混合配置成盐酸阿霉素/二氢卟吩-e6浓度为0.2/0.21μg/ml、0.4/0.42μg/ml、0.6/0.64μg/ml、0.8/0.85μg/ml和1/1.05μg/ml游离阿霉素和二氢卟吩-e6混合溶液，将上述游离阿霉素和二氢卟吩-e6混合溶液与在缺氧条件培养的人乳腺癌细胞(mcf-7)共孵育2小时，同时采用660纳米激光(功率为100mw/cm²)照射肿瘤细胞，然后继续培养上述肿瘤细胞24小时，测定肿瘤细胞存活率。测试结果如图5所示。

图5为载药载氧杂交蛋白纳米粒溶液和游离阿霉素和二氢卟吩-e6混合溶液在增氧化疗和增氧光动力联合治疗后肿瘤细胞的存活率对比柱状图，其中，杂交蛋白纳米药物指的是实施例11提供的包载有盐酸阿霉素和二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒；从图5可以，本发明实施例11提供的包载有盐酸阿霉素和二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒随着盐酸阿霉素/二氢卟吩-e6浓度的提高，其对肿瘤细胞的杀伤效果显著提高，在载药载氧杂交蛋白纳米粒包载的盐酸阿霉素/二氢卟吩-e6的浓度为0.2/0.21μg/ml时，肿瘤细胞的存活率已经不足5％，而游离盐酸阿霉素和二氢卟吩-e6混合溶液中，盐酸阿霉素/二氢卟吩-e6的浓度为1/1.06μg/ml时，其肿瘤细胞的存活率仍高于50％，这说明本发明实施例11提供的包载有盐酸阿霉素和二氢卟吩-e6的载药载氧杂交蛋白纳米粒通过对肿瘤细胞的增氧治疗和增氧光动力治疗，不仅能够显著提高对肿瘤细胞的杀伤力，降低肿瘤细胞的存活率，而且能够在药物浓度较低时，达到对肿瘤细胞很强的杀伤效果，增强肿瘤的治疗效果。

试验例6

将实施例1-9提供的包载有盐酸阿霉素的载药载氧杂交蛋白纳米粒进行药物包封率和氧亲和力p50值测定，测定结果如下表1所示：

表1载药载氧杂交蛋白纳米粒性能数据表

从表1可以看出，通过实施例1-7与实施例8-9的对比可以看出，在进行载药载氧杂交蛋白纳米粒制备时，血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.1-1)，血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(2-50)时，所制成的载药载氧杂交蛋白纳米粒的氧亲和力p50值显著提高，载药量显著增加，氧亲和力p50值均高于13mmhg，载药量均高于2.5％

通过实施例1-7的对比可以看出，实施例5-7的氧亲和力p50值最高，实施例3-4的载氧量和载药量均低于实施例5-7但高于实施例1-2。这说明，当血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(3-15)，且血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.15-0.5)时，制成的载药载氧杂交蛋白纳米粒的氧亲和力p50值较强，载药量较高，当血红蛋白与血清白蛋白的质量比为1：(5-7)，且血清白蛋白与还原剂的质量比为1：(0.15-0.3)，制成的载药载氧杂交蛋白纳米粒的氧亲和力p50值更高，载药量更高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。