本发明属于生物医用材料，特别是涉及一种酸敏控释抗炎凝胶及其制备方法与应用。
背景技术：
类风湿关节炎是一种不明病因的临床综合征，以慢性、多关节滑膜炎症、关节外病变为主要表现，我国人群的患病率为0.32％～0.36％，低于欧美国家白人的1％，是造成丧失劳动力和致残的主要病因之一。关节软骨和骨组织的破坏是致残的根本原因，因此积极寻找导致关节软骨破坏及骨组织病理生理改变的关键环节是防治的重点。机体在正常生理环境下，pH受到十分精密的调节以达到内环境稳定，在一些生理和病理条件下如在炎症、缺血和肿瘤组织中，组织酸化导致pH值可以降低至6.0以下。如在免疫炎症发生过程中，炎症发生区域的pH值范围为5.5-7，这种下降可能介导了病理改变(Journal of Leukocyte Biology,2001.69(4):522-530.)。研究表明，关节腔内炎性代谢产物聚集导致的pH值下降是类风湿关节炎发病的主要原因之一，可引起侵蚀性外周关节滑膜炎，继而导致滑膜组织增生、软骨细胞过度凋亡，最终引起关节软骨、周围韧带及骨质破坏等典型病理学改变。目前类风湿关节炎的治疗措施主要包括抗炎、免疫调节等。
透明质酸是一种高分子量直链糖胺聚糖，广泛分布于人和动物结缔组织的细胞外基质，是关节滑液的主要成分，有较强的吸水性和高度粘滞性，与蛋白多糖连接以聚合体形式存在，可以保护蛋白多糖的核心蛋白，使其免受多种蛋白酶的降解，同时在关节内抗压载荷，在膝关节骨性关节炎的病情进展中发挥重要作用。此外，透明质酸对细胞生长、胚胎发育、组织损伤修复、炎症发生和肿瘤发展等也有一定的作用。CD44属于细胞粘附因子，为多种细胞表面广泛表达的跨膜糖蛋白分子，是透明质酸的主要受体之一。在炎症反应过程中，透明质酸和CD44结合主要介导白细胞募集，炎症细胞与细胞外基质的相互作用，参与细胞增殖、迁移、分化以及细胞外基质成分的重构。线性透明质酸大分子经过化学基团修饰，在交联剂存在的条件下可以形成具备一定特性和机械性能的水凝胶，由于机械性能的可塑性，可以使水凝胶具备理想的结构、形状、硬度和生物活性。利用包含二硫键的二酰肼化学试剂能为透明质酸引入巯基基团，经巯基修饰的透明质酸由聚乙二醇二丙烯酸酯交联形成水凝胶。利用甲基丙烯酸缩水甘油酯与透明质酸反应，引入甲基丙烯酸盐化学基团，然后通过光照或氧化还原引发剂引发聚合，可以得到透明质酸弹性水凝胶。1974年Peyron等首次提出并应用向关节腔内注射外源性的透明质酸用于治疗关节炎，取得了良好的疗效。1997年美国食品和药物管理局(FDA)批准关节内透明质酸注射液用于骨关节炎的临床治疗。
单宁酸是自然界中存在广泛的一种复杂的多元酚酸，在生物体内，单宁酸能清除烷氧自由基，通过脱氢反应产生稳定的苯氧自由基，这个过程在消耗氧的同时结合活性氧等自由基以发挥抗氧化的特性，从而对生物组织起到保护作用。单宁酸分子的邻位酚羟基则是较强的氢或中子的供给体，在氧化状态下转变为醌类，具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗癌作用。研究表明，单宁酸具有非特异性抗炎、抗氧化、抗渗出、镇痛作用，能够抑制创面过度炎症反应和机体高代谢反应(ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8(42):28511-28521.)。
透明质酸水凝胶用于关节炎的治疗，一般认为其主要作用是发挥润滑功能，缓解关节应力作用，保护关节内结构，促进了关节液的回流与更新，使堆积的炎症因子、代谢产物等得以清除，缓解和阻断关节局部病变的恶性循环，而且透明质酸水凝胶也可以作为药物载体。然而，未见研究关注到关节腔内炎性代谢产物聚集导致的pH值下降的特点设计材料结构。
本发明基于苯硼酸修饰的透明质酸，设计酸敏感(pH敏感)的透明质酸水凝胶，由于苯硼酸与邻二羟基化合物能可逆结合(已有研究表明，基于各种邻二羟基化合物与苯硼酸的结合常数不同，设计指示剂，可以依据光谱产生的变化识别单糖客体。Tetrahedron,2002,58(26):5291-5300.)，因此本发明透明质酸水凝胶在pH值下降的关节腔内释放单宁酸，发挥抗炎作用，是一种新型的控释抗炎凝胶。
技术实现要素：
本发明的目的是针对关节腔内炎性代谢产物聚集导致的pH值下降的特点，设计透明质酸水凝胶结构，提供一种酸敏控释抗炎凝胶，并提供了其制备方法。
技术方案：本发明所述的一种酸敏控释抗炎凝胶，由苯硼酸修饰的透明质酸，与单宁酸在中性至弱碱性条件下形成，可在弱酸性条件下释放单宁酸。
所述透明质酸的分子量为50～1000kDa。
所述酸敏控释抗炎凝胶内添加有药物，所加药物为氨氯吡咪及其类似物或非甾体抗炎药。
所述非甾体抗炎药选自阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布、塞来昔布中的一种或几种。
上述酸敏控释抗炎凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)苯硼酸修饰透明质酸的制备：配制透明质酸水溶液和3-氨基苯硼酸盐酸盐溶液，混合并充分搅拌，再加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，室温下搅拌反应12～24小时，产物经乙醇析出，离心收集并真空干燥，将所得固体配制成水溶液，透析48～96小时后冷冻干燥得到苯硼酸修饰透明质酸；
(2)酸敏控释抗炎凝胶的制备：取步骤(1)所得苯硼酸修饰透明质酸配制水溶液，与单宁酸溶液混合，所得混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌，然后加入磷酸盐缓冲液缓慢提高pH值，制得不同形态的酸敏控释抗炎凝胶。
当所述酸敏控释抗炎凝胶内添加有药物时，将步骤(2)替换为：酸敏控释抗炎凝胶的制备：取步骤(1)所得苯硼酸修饰透明质酸配制水溶液，与单宁酸和所加药物的混合溶液混合，所得混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌，然后加入磷酸盐缓冲液缓慢提高pH值，制得不同形态的酸敏控释抗炎凝胶。
步骤(1)中，所述透明质酸所含羧基与3-氨基苯硼酸盐酸盐、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的物质的量之比为1:(0.1～0.2):(0.5～1)。
步骤(2)中，所述透明质酸理论羧基与单宁酸的物质的量之比为1:(0.2～10)。
上述酸敏控释抗炎凝胶在制备治疗炎性代谢产物聚集导致pH值下降所引起的生理和病理改变的疾病的药物中的应用也在本发明的保护范围内。
所述疾病包括类风湿关节炎、风湿性关节炎、骨关节炎和感染性关节炎。
有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优点：(1)本发明基于苯硼酸修饰的透明质酸，设计酸敏感(pH敏感)的透明质酸水凝胶，在酸性条件下，释放单宁酸，特别适用于炎性代谢产物聚集导致pH值下降所引起的生理和病理改变，如在pH值下降的关节腔内释放单宁酸，发挥其抗炎作用。(2)本发明通过改变透明质酸分子量、各组分物质的量之比、溶液浓度，可以调节所得凝胶的形态结构，以适应不同的应用要求。(3)本发明凝胶既具有透明质酸的润滑功能，可缓解关节应力作用，促进代谢回流更新，还具有单宁酸的非特异性抗炎、抗氧化、抗渗出、镇痛作用，能够抑制过度炎症反应和机体高代谢反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。
实施例1
配制20mg/mL透明质酸(HA，分子量375kDa)水溶液，配制2.24mg/mL 3-氨基苯硼酸盐酸盐(APBA)溶液，取10mL APBA溶液与25mL HA溶液混合，室温搅拌10min后加入10mL新鲜配制的17.9mg/mL的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)溶液，室温下搅拌反应24小时。产物在800mL冷乙醇中析出后，离心收集并真空干燥，将所得固体溶于50mL水溶液中，经透析袋(截留分子量8kDa)透析96小时后冷冻干燥，得到约400mg苯硼酸修饰透明质酸固体。
将制得的苯硼酸修饰透明质酸(HA-APBA)配成2mg/mL的水溶液，配制一系列浓度为1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、50mM单宁酸(TA)溶液。将0.5mL HA-APBA溶液与0.5mL TA溶液混合，混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌10min。缓慢滴加pH7.4的磷酸盐缓冲液以提高溶液pH值，制得不同强度的透明质酸/单宁酸凝胶。
实施例2
配制50mg/mL HA(分子量50kDa)水溶液，配制11.2mg/mL APBA溶液，取20mL APBA溶液与50mL HA溶液混合，室温搅拌10min后加入100mL新鲜配制的17.9mg/mL DMTMM溶液，室温下搅拌反应12小时。产物在1L冷乙醇中析出后，离心收集并真空干燥，将所得固体溶于50mL水溶液中，经透析袋(截留分子量8kDa)透析48小时后冷冻干燥，得到约2g固体。
将制得的HA-APBA配成5mg/mL的水溶液，配制125mM TA溶液。将0.5mLHA-APBA溶液与0.5mL TA溶液混合，混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌10min。缓慢滴加pH7.4的磷酸盐缓冲液以提高溶液pH值，制得透明质酸/单宁酸凝胶纳米球，直径分布范围为400-800nm。
将制得的HA-APBA配成30mg/mL的水溶液，配制15mM TA溶液。将0.5mLHA-APBA溶液与0.5mL TA溶液混合，混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌10min。缓慢滴加pH7.4的磷酸盐缓冲液以提高溶液pH值，制得透明质酸/单宁酸凝胶。
实施例3
配制10mg/mL HA(分子量1000kDa)水溶液，配制6.72mg/mL APBA溶液，取10mL APBA溶液与20mL HA溶液混合，室温搅拌10min后加入15mL新鲜配制的17.9mg/mL DMTMM溶液，室温下搅拌反应24小时。产物在500mL冷乙醇中析出后，离心收集并真空干燥，将所得固体溶于60mL水溶液中，经透析袋(截留分子量100kDa)透析96小时后冷冻干燥，得到白色固体。
将制得的HA-APBA配成2mg/mL的水溶液，充分搅拌溶解，配制2mM TA溶液。将0.5mL HA-APBA溶液与0.5mL TA溶液混合，混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌10min。缓慢滴加pH7.4的磷酸盐缓冲液以提高溶液pH值，制得透明质酸/单宁酸凝胶。
实施例4
配制10mg/mL HA(分子量100kDa)水溶液，配制2.24mg/mL APBA溶液，取10mL APBA溶液与50mL HA溶液混合，室温搅拌10min后加入15mL新鲜配制的17.9mg/mL DMTMM溶液，室温下搅拌反应24小时。产物在500mL冷乙醇中析出后，离心收集并真空干燥，将所得固体溶于50mL水溶液中，经透析袋(截留分子量8kDa)透析96小时后冷冻干燥，得到白色固体。
将制得的HA-APBA配成5mg/mL的水溶液，充分搅拌溶解，配制10mM TA和100μg/mL氨氯吡咪混合溶液。将0.5mL HA-APBA溶液与0.5mL TA和氨氯吡咪混合溶液混合，混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌10min。缓慢滴加pH 7.4的磷酸盐缓冲液以提高溶液pH值，制得载药透明质酸/单宁酸凝胶。载药凝胶在pH 5.0条件下进行释放实验，12小时氨氯吡咪的释放量达到93％。
实施例5
配制5mg/mL HA(分子量800kDa)水溶液，配制2.24mg/mL APBA溶液，取1mL APBA溶液与10mL HA溶液混合，室温搅拌10min后加入1mL新鲜配制的17.9mg/mL DMTMM溶液，室温下搅拌反应24小时。产物在500mL冷乙醇中析出后，离心收集并真空干燥，将所得固体溶于80mL水溶液中，经透析袋(截留分子量100kDa)透析96小时后冷冻干燥，得到白色固体。
将制得的HA-APBA配成3mg/mL的水溶液，充分搅拌溶解，配制30mM TA和50μg/mL布洛芬混合溶液。将0.5mL HA-APBA溶液与0.5mL TA/布洛芬溶液混合，混合液起始pH值以100mM盐酸溶液调节至5，磁力搅拌10min。缓慢滴加pH7.4的磷酸盐缓冲液以提高溶液pH值，制得载药透明质酸/单宁酸凝胶。载药凝胶在pH 5.0条件下进行释放实验，10小时布洛芬的释放量达到86％。