本发明涉及药物领域，具体涉及中药前胡中一种有效单体化合物在制备药物性肝损伤保护药物中的应用。
背景技术：
肝脏是人体内最大消化腺，主导人体新陈代谢，是人体内巨大的“化工厂”。肝损伤是多种肝脏疾病共有的一种病理状态，主要表现为肝细胞坏死或凋亡、肝细胞变性、肝细胞脂肪变性、淤胆性损害及炎性反应等。长期肝损伤是导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌发生的重要使动因素。
近年随临床用药种类迅速增加及患者自行服药或随意加大药物剂量的概率增加，药物性肝损伤发生率亦相应增加，有900种以上药物(如四氯化碳、溴苯、氟烷、抗结核药、抗生素、非甾体抗炎药等)明确可导致药物性肝损伤。肝损伤尤其是药物性肝损伤已严重威胁到了人类健康和生命，保护肝脏健康已是摆在我们面前的一个刻不容缓的任务。
现代医学并无治疗肝损伤的特异性药物，多采用休息、调节饮食、补充维生素和对症治疗(选择抗病毒药物、免疫调节药物、保肝降酶药物)，严重者需被迫终止用药，以免加重肝损伤。当前应用中草药及其制剂治疗肝脏疾病在我国已相当普遍，现代药理研究表明很多中药(包括复方、单味药材及单体成分)均能有效治疗或改善肝损伤疾病，且中药则因保肝疗效肯定，毒副作用较小，多成分、多靶点起效而日渐备受青睐。
中药(如羌活、白芷、前胡、蛇床子、秦皮、补骨脂、北沙参、佛手等)中广泛存在的香豆素是具有苯骈α-吡喃酮结构的一类化合物，可看作是邻羟基肉桂酸的内酯，广泛存在于芸香科、伞形科、菊科、豆科、瑞香科、茄科等高等植物中。根据环上取代基及其位置的不同，常将香豆素分为简单香豆素(如伞形花内酯、秦皮乙素、蛇床子素、瑞香素)、呋喃香豆素(如欧前胡素、异欧前胡素、补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素)、吡喃香豆素(如白花前胡苷、美花椒内酯、紫花前胡素)和其他香豆素(如亮菌甲素、双七叶内酯)等。研究表明，香豆素类化合物具有抗hiv、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘及抗菌等多方面生物学活性(中国中药杂志，2005，30(6)：410-414；中国新药杂志，2013，22(20)：2392-2404)。另有研究证明，一些香豆素类化合物也具有保肝活性，包括蛇床子素(中药药理与临床，2006，22(2)：21-22)、珊瑚菜素(archpharmres，1993,16(1)：13-17)、8-甲氧基补骨脂素(中国现代应用药学，2012，29(8)：682-686)；，还发现白花前胡乙素有抗高脂血症、高血糖、非酒精性脂肪肝及2型糖尿病活性(发明专利申请号：201710046028.2)，党参根皮中5种呋喃香豆素类化合物有抑制肝癌细胞增殖活性(中国实验方剂学杂志，2012，18(6)：203-205)，以及欧前胡素和异欧前胡素对肝微粒体细胞色素p450酶有抑制活性(中国中药杂志，2013，38(8)：1237-1241)。
然而，迄今为止，异欧前胡素对抗药物性肝损伤的药理作用仍未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供中药有效成分在制备药物性肝损伤保护药物中的应用。
本发明所研究的化合物涉及中药(如羌活、白芷)中分离、制备得到的1种呋喃香豆素类成分，其化学结构如下，可从天然药物中分离制备得到，也可通过化学合成制备得到。
本发明通过考察化合物对四氯化碳(ccl4)损伤的乳鼠原代肝细胞存活率、丙氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)的影响，首次发现异欧前胡素具有抗药物性肝损伤作用。
本发明通过考察化合物对ccl4损伤的小鼠血清中alt、ast含量，肝脏形态学，肝脏中肝指数、mda、sod和谷胱甘肽(gsh)的影响，以及对肝细胞线粒体中mda、atp酶活性和膜电位的影响，首次发现异欧前胡素具有抗药物性肝损伤作用。
本发明通过药理实验发现中药(如羌活、白芷)中1种单体成分的抗药物性肝损伤药理活性，能用于制备具有相应作用的药物和保健品，有利于进行新型药物性肝损伤保护药物和保健品的研发。
本发明的药物可以是任何可药用的剂型，包括片剂、胶囊剂、口服液、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴丸剂、贴剂、缓释制剂和控释制剂等。
口服液体制剂的形式可以是水性或油性溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂或酏剂，其可含有常规的添加剂，包括溶剂例如水、乙醇等，悬浮剂例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素等，乳化剂例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯、阿拉伯胶等，防腐剂例如对羟基苯甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸等。
口服固体制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括硬脂酸镁。适宜的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
附图说明
图1受试单体化合物对ccl4损伤小鼠肝组织病理变化的影响
正常组(a)、模型组(b)、水飞蓟宾组(c)、异欧前胡素8mg/kg组(d)、异欧前胡素16mg/kg组(e)、异欧前胡素32mg/kg组(f)的小鼠肝脏病理变化(×200)
正常组肝组织结构清晰可见，肝细胞排列有序，大小一致，肝细胞索呈明显的放射状，汇管区无变性、坏死及炎症细胞浸润等病变；模型组小鼠肝细胞明显水肿、气球样变，肝索排列紊乱，肝细胞点状坏死，肝实质有较多炎细胞浸润；水飞蓟宾组肝组织可见炎细胞浸润较模型组明显减轻，肝细胞无明显变化；异欧前胡素各剂量组均有不同程度的炎细胞浸润，但较模型组明显减轻。
具体实施方式
为了更好地解释本发明可用于制备药物性肝损伤保护药物和保健品的实质内容，以下通过具体实验实施例来作进一步的阐释。以下实施例均为说明性的，并不对本发明做任何限定。
实施例1：受试单体化合物对四氯化碳损伤的乳鼠原代肝细胞的影响
1材料、试剂及仪器
1.1主要材料与试剂
受试化合物对照品(异欧前胡素、水飞蓟宾)购自成都普菲德生物技术有限公司；l-02细胞(陕西脉元生物科技有限公司)；dmem/f12培养基(美国gibco公司)；胎牛血清(美国gibco公司)；cck-8细胞增殖检测试剂盒(索莱宝生物科技有限公司)；四氯化碳(ccl4)(sigma)；青链霉素双抗(美国gibco公司)；pbs(索莱宝生物科技有限公司)；96孔细胞培养板(thermo公司)；0.22um滤膜(corning)；血球计数板(镇江市丹徒科达医疗用品厂)；alt、ast、sod、mda检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.2主要仪器
5％co2培养箱(thermo公司)；台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；生物安全柜(苏州净化设备有限公司)；酶标仪(tecan)；-80℃冰箱(thermo公司)。
2方法
2.1受试样品溶液配制
取各受试化合物对照品适量溶于dmso，取dmso溶解的受试样品用生理盐水稀释到所需要浓度。
2.2建模及给药
细胞铺板：重悬细胞使其浓度为1×105个/ml，每孔铺10000个细胞(100μl)，细胞置3重复，37℃5％co2培养12h后，各实验药物处理24h。随后每孔加入终浓度为10mmol/lccl4，置37℃5％co2培养6h。
实验分组包括：空白组(只含培养基)；正常组；溶剂对照组(1‰dmso)；溶剂对照组+ccl4(模型组)；水飞蓟宾组(浓度60μmol/ml)+ccl4(阳性对照组)；异欧前胡素(浓度80μmol/ml、160μmol/ml、320μmol/ml)+ccl4。
2.3细胞存活率测定(cck-8法)
更换100μl/孔无血清培养基，加10μl/孔cck-8原液，5％co2培养箱中共孵育2h，450nm处测定吸光度。
2.4alt、ast、mda、sod含量测定
按试剂盒说明书的具体步骤进行测定。
2.5计算与统计
细胞存活率(活细胞相对数量％)＝a(加药)-a(空白)/a(0加药)-a(空白)×100；
spss17.0软件计算并统计，anova单因素方差分析显著性差异(p<0.05)。
3实验结果
化合物对ccl4致损伤的乳鼠原代肝细胞存活率、alt、ast、mda、sod的影响
水飞蓟宾(阳性对照)可发挥肝细胞保护作用，本研究发现其可显著提高ccl4损伤的肝细胞存活率，同时显著降低alt、ast、mda含量，并显著增加sod含量，说明细胞病理模型可靠。同水飞蓟宾一样，异欧前胡素各剂量组均可显著提高ccl4损伤的肝细胞存活率，且均可显著降低alt、mda含量；异欧前胡素160μg/ml、320μg/ml剂量组可显著降低ast含量，并显著增加sod含量。结果表明该化合物有抗药物性肝损伤活性(表1)。
表1受试化合物对ccl4致损伤的乳鼠原代肝细胞存活率、alt、ast、mda、sod的影响(n＝3，
与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。
实施例2：受试单体化合物对四氯化碳损伤小鼠肝脏及血清各项指标的影响
1材料、试剂及仪器
1.1动物
5～6周龄雄性清洁级昆明种小鼠，体重18～22g，购自辽宁长生生物技术有限公司，质量合格证号：scxk(辽)2015-0001。实验前，所用动物均适应性饲养3天。在适应性饲养期间，动物自由取食，自由饮水。饲养室内保持安静，室内温度维持在23–25℃，湿度55％～75％，日光灯照明，每天24h中保持12h照明12h黑暗。
1.2主要材料与试剂
受试化合物对照品(异欧前胡素、水飞蓟宾)均购自成都普菲德生物技术有限公司；alt、ast、mda、sod、gsh、na+-k+-atp酶、ca2+-mg2+-atp酶测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；bca蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所；ccl4分析纯。
1.3主要仪器
milli-q超纯水系统(美国millipore公司)；电子分析天平、pb-10ph计(德国sartorius)；玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；uv-1800pc型紫外可见分光光度计(上海翱艺仪器有限公司)；infinitem200pro多功能酶标仪(东胜创新生物科技有限公司)；
2实验方法
昆明种雄性小鼠，随机分成6组，每组10只，即正常组(生理盐水)、模型组(0.1％ccl4花生油)、水飞蓟宾(阳性对照组，16mg/kg)、异欧前胡素低中高剂量组(8mg/kg、16mg/kg、32mg/kg)；各组小鼠均以10ml/kg的剂量灌胃给药，连续7d，每天1次，于末次给药1h后开始造模。将ccl4溶于花生油中，配成0.1％的ccl4花生油溶液，按10ml/kg的剂量进行腹腔注射，建立小鼠急性肝损伤模型。正常组腹腔注射等量花生油。
中毒后禁食不禁水，16h后摘眼球取血，全血室温放2h后分离血清，-80℃保存备用；取血后立即脱颈椎处死小鼠，迅速剖取肝脏，用4℃预冷的生理盐水漂洗除尽表面浮血，滤纸拭干后称重，计算肝脏指数。从每组挑3只小鼠取相同部位肝脏，切取组织块置于10％福尔马林中固定24h，用于病理切片检查；其余肝脏置于-80℃冰箱保存，待检测时取出，称取其0.2g放于玻璃匀浆器中剪碎，加2ml预冷的生理盐水于冰水浴中制成10％组织匀浆液，3000rpm离心10min，上清液置4℃保存备用。
3指标检测
3.1肝脏指数
分别剖取肝脏，称重，按肝脏指数＝[肝脏重量g/体重g]×100％计算肝脏指数。
3.2血清生化指标测定
血清中alt、ast的测定采用改良赖氏法，按试剂盒说明书的具体步骤进行测定。
3.3肝组织生化指标测定
取肝组织匀浆液100μl，按照试剂盒说明书操作，测定肝组织中的mda、sod和gsh含量。
3.4组织病理学观察
肝组织于10％福尔马林固定液中固定24h用水冲洗后梯度乙醇洗脱，二甲苯透明，进行石蜡包埋处理后切成4μm厚的薄片，he染色观察。
3.5肝细胞线粒体相关指标
3.5.1肝细胞线粒体分离
取出保存于-80℃冰箱的小鼠肝脏，分别剪取各组肝脏组织，用预冷的生理盐水充分洗净残血，修剪去结缔组织，用滤纸吸干水分，称重(约0.1g)；将肝组织转移至预冷的玻璃匀浆器管口，用预冷的剪刀将肝组织剪碎至无明显组织块，加入1ml预冷的线粒体分离液(0.21m甘露醇、0.07m蔗糖、10mmtrisbase、1mmedta、0.5mmegta，ph至7.4)，于冰水浴中匀浆10次；将组织匀浆液分别转移至1.5ml离心管中，于4℃，1000×g离心10min，弃去沉淀，上清液转移至另一离心管中，4℃，10000×g离心10min，所得沉淀即为肝细胞线粒体。
3.5.2肝细胞线粒体膜电位测定
提取肝细胞线粒体，加线粒体膜电位测定介质(0.25m蔗糖、5mmmgcl2、10mmkcl、5mmkh2p04、10mmhepes、10mm琥珀酸盐，ph7.4)混匀成混悬液，用bca蛋白浓度测定试剂盒测定线粒体蛋白浓度；取100μl线粒体混悬液，加入2.9ml测定介质，再加入5μl罗丹明123混匀，37℃保温30min后，在激发光波长484nm，发射波长534nm下测荧光强度。
3.5.3肝细胞线粒体mda含量、atp酶活性测定
提取肝细胞线粒体，加生理盐水混匀成混悬液，用bca蛋白浓度测定试剂盒测定线粒体蛋白浓度；分别取100μl线粒体混悬液，按照试剂盒说明书操作，测定肝细胞线粒体中的mda、na+-k+-atp酶和ca2+-mg2+-atp酶的活性。
4.统计学处理各组数据采用均数±标准差(x±s)表示，采用spss11.0统计软件分析处理数据，采用单因素方差分析进行组间比较，p<0.05认为有统计学差异。
5实验结果
5.1受试单体化合物对ccl4损伤小鼠肝脏指数的影响
与正常组相比，模型组小鼠的肝重和肝指数显著升高，提示肝脏受损；与模型组相比，水飞蓟宾组(阳性对照)小鼠的肝重和肝脏指数显著降低，说明水飞蓟宾能有效缓解ccl4所致肝损伤；同水飞蓟宾一样，异欧前胡素各剂量组的肝脏指数均显著降低(与模型组相比)，表明异欧前胡素具有抗药物性肝损伤活性(表1)。
表1受试单体化合物对ccl4损伤小鼠肝脏指数的影响(
与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。
5.2受试单体化合物对ccl4损伤小鼠血清alt、ast的影响
与正常组相比，模型组小鼠血清中的alt、ast显著升高，造模成功；与模型组相比，水飞蓟宾组小鼠血清中的alt、ast显著降低，表明水飞蓟宾能有效缓解ccl4所致肝损伤；与模型组相比，异欧前胡素8mg/kg剂量组小鼠血清中alt、ast含量均显著降低，表明异欧前胡素有抗药物性肝损伤活性(表2)。
表2受试单体化合物对ccl4损伤小鼠血清alt、ast的影响(
与模型组比较，#p<0.05。
5.3受试单体化合物对ccl4损伤小鼠肝脏mda、sod和gsh的影响
与正常组相比，模型组小鼠肝脏中的mda含量显著升高，sod和gsh的含量显著降低，造模成功；与模型组相比，水飞蓟宾组小鼠肝脏中的mda含量显著降低，sod和gsh的含量显著升高，表明水飞蓟宾能有效缓解ccl4所致肝损伤；与模型组相比，异欧前胡素8mg/kg剂量组能显著降低mda含量，并升高sod含量；且其16mg/kg剂量组能显著升高gsh含量，也说明异欧前胡素具有抗药物性肝损伤活性(表3)。
表3受试单体化合物对ccl4损伤小鼠肝脏mda、sod和gsh含量的影响(
与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
5.4受试单体化合物对ccl4损伤小鼠肝脏线粒体mda、atp酶及膜电位的影响
与正常组相比，模型组小鼠肝脏线粒体中的mda含量显著升高，na+-k+-atp酶和ca2+-mg2+-atp酶的活性显著降低，肝细胞线粒体荧光强度显著增大，引起线粒体膜电位崩溃，表明造模成功；与模型组相比，水飞蓟宾组小鼠肝脏中的mda含量显著降低，na+-k+-atp酶和ca2+-mg2+-atp酶的活性显著升高，线粒体荧光强度显著下降，从而缓解膜电位崩溃的程度，表明水飞蓟宾能有效缓解ccl4所致肝损伤。与模型组相比，异欧前胡素8mg/kg剂量组能显著降低mda含量，并显著升高na+-k+-atp酶和ca2+-mg2+-atp酶的活性；同时其16mg/kg剂量组能显著降低荧光强度，缓解线粒体膜电位的崩溃程度，结果说明异欧前胡素可保护线粒体功能而发挥抗药物性肝损伤活性(表4)。
表4受试单体化合物对ccl4损伤小鼠肝线粒体mda、atp酶及膜电位的影响(
与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。