裸花紫珠提取物、其制备方法及应用与流程

本发明涉及生物化学领域，特别涉及裸花紫珠提取物、其制备方法及应用。

背景技术：

裸花紫珠(callicarpanudiflorahook.etarn.)为马鞭草科紫珠属植物，一般生长在湿度较大的，平均温度在15～25℃的环境中，所以，在国内主要分布于湿度较大的海南、广东、广西等地，在海南又主要生长于澄迈、定安、儋州等地，其中海南五指山的裸花紫珠较其他地方品质更上一筹。裸花紫珠的药用部位为地上干燥部分，在海南当地人民用之为药材，同时也被当地黎族医生作为常用药材之一。近年来，很多科研单位加强了对裸花紫珠的研究，主要为国内，国外鲜见报道，2015年版的中国药典再一次把裸花紫珠录入，同时明确了其功能与主治为“消炎，解毒，止血，祛瘀，止痛”,众多的信息使得人们对其药用功能有了更多的了解与认识。

一直以来，国外主要集中在广东紫珠、大叶紫珠等的研究，对裸花紫珠的研究报道较少，国内对裸花紫珠化学成分的研究报道中,主要分离的化合物为黄酮类、萜类、挥发油、酚酸类、缩合蹂质等,在总结分离得到的化合物的基础上，又从裸花紫珠中分离了角胡麻苷1种新的化和物及其他6种首次出现在紫株属中的化合物。

近几年关于裸花紫珠药材或制剂质控中常以此些化学成分中一个或多个为指标，这些化学成分的分离鉴定主要用乙醇回流提取，再用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇萃取得浸膏后，综合应用各种柱层析如硅胶柱层析、中压反相柱层析、sephadexlh-20柱层析方法和hplc制备分离纯化,最后借助波谱数据和文献资料鉴定化合物的结构。

目前，裸花紫珠已经占有一定的市场，但总体来说，市场经营的广度和力度还需要提升，需要充分利用其在药用价值上的作用，为更多的人服务，减轻劳动者就业困难。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供裸花紫珠提取物、其制备方法及应用。该提取物具有较好的止血和杀菌功效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种裸花紫珠提取物，包括总黄酮和/或毛蕊花糖苷。

在本发明的一些具体实施方案中，总黄酮的含量至少为0.2mg/ml，毛蕊花糖苷的含量至少为2mg/ml。

在本发明的一些具体实施方案中，裸花紫珠提取物的制备方法为：取裸花紫珠与有机溶剂混合，提取，获得提取液，离心，收集滤液；所述有机溶剂为乙醇，乙醇的体积浓度为50％～70％。

在本发明的一些具体实施方案中，裸花紫珠提取物的制备方法中所述提取的次数为1～3次；所述提取的温度为80℃～120℃；所述提取的时间为9～12min。

本发明还提供了一种裸花紫珠提取物的制备方法，取裸花紫珠与有机溶剂混合，提取，获得提取液，离心，收集滤液；所述有机溶剂为乙醇，乙醇的体积浓度为50％～70％。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提取的次数为1～3次。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提取的温度为80℃～120℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述提取的时间为9～12min。

本发明还提供了所述制备方法制得的裸花紫珠提取物；所述裸花紫珠提取物中的有效成分为毛蕊花糖苷和/或总黄酮。

在本发明的一些具体实施方案中，本发明制得的裸花紫珠提取物中总黄酮的含量至少为0.2mg/ml，毛蕊花糖苷的含量至少为2mg/ml。

在本发明的领一些具体实施方案中，本发明制得的裸花紫珠提取物中所述毛蕊花糖苷的质量百分含量为2.6％。

本发明还提供了所述的裸花紫珠提取物在制备止血剂和/或抑菌剂中的应用。

本发明还提供了一种组合物，包括所述的裸花紫珠提取物和药学上可接受的辅料。

在本发明的一些具体实施方案中，所述辅料包括乙醇、丙二醇和/或水杨酸。

在本发明的一些具体实施方案中，所述离心的速度为5000rad/min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述乙醇的体积浓度为50％～80％，所述乙醇与所述裸花紫珠提取物混合后制得浓度为0.02g/ml的制剂；所述丙二醇的加入量(以裸花紫珠提取物加乙醇后制得的消毒剂为基准)为3％(v/v)～7％(v/v)；所述组合物的ph值为4.00～6.00。

本发明剂型选自片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、眼用制剂、鼻用制剂、栓剂、软膏剂乳膏剂、喷雾剂、凝胶剂、胶剂或涂剂。优选喷雾剂。

本发明还提供了所述的组合物在制备止血剂和/或抑菌剂中的应用。

本发明提供了裸花紫珠提取工艺，得到较好的抑菌和止血活性成分，研制同时具有较好的抑菌和止血效果的生物消毒剂。基于以上裸花紫珠的功能特色和优势，开发裸花紫珠生物止血消毒剂具有重要的科学意义和产业价值，既可克服化学消毒剂补充化学消毒剂的缺点，又可推动黎药裸花紫珠的产品多样化及其产业的发展，拓展了裸花紫珠的应用方向和产业价值。

与传统的化学消毒剂相比，它们具有杀菌特异性强、作用条件温和、作用速度较快、不易产生耐药菌株、易溶于水、对物品无刺激性、无臭、无味、毒副作用低、对皮肤粘膜无刺激、不残留有害物质、不易燃烧、使用安全等优点。生物消毒剂是一种新型消毒剂，其应用研究尚处于起步阶段。生物消毒剂在消毒方面有着极大的优势，虽然目前还不能普及应用，但是随着生物学技术的发展，研究不断深入及完善，其性能将得到进一步提高。相信不久就会应用于生产实践，特别是在无公害畜禽产品生产方面的生物消毒剂问世，将会拥有广阔的市场前景。

为了制备出同时具有较好的杀菌和止血功效的消毒剂，以毛蕊花糖苷为指标，通过提取药材，对提取的药材进行配方前离心速度、活性炭的加量和最小抑菌浓度的试验，之后，选择加入辅料进行毛蕊花糖苷含量的测定试验。结果，提取温度为120℃，提取次数为1次，提取的乙醇浓度为50％，提取时间为12min时，毛蕊花糖苷的提取率最大为2.34％，此时，总黄酮的提取率为0.403％，最小抑菌浓度为0.02g/ml。辅料丙二醇的加量为7％(v/v)，水杨酸为2％(g/ml)。工艺优化时，原药材离心速度为5000rad/min，不使用活性炭，先加入7％丙二醇，再加入水杨酸调节ph至4～6。

结果表明，样品的感官性状在一个月内变化不大，都为清香草药气味和易摇匀的棕色液体。重金属pb、as、hg、cr、nd、cd、sb、ni、te、ti含量为低于国际《化妆品卫生规范》(2007年版)要求，限量分别为:0.004％、0.001％和0.0001％。稳定性试验表明，快速抑菌试验表明在短时间内，常见阳性菌金黄色葡萄球菌和阴性大肠埃氏菌和铜绿假单胞菌的杀灭对数值达到要求大于5，且其中最难杀死的白色念珠菌也达到要求，大于4。皮肤刺激和眼刺激试验表明样品对家兔的皮肤和眼睛没有刺激。样品与市场止血剂云南白药对菌的抑菌性和对体外的止血性表明，样品的的杀菌作用强于市场止血剂，且实施例5制得的消毒剂比实施例1～3制得的提取液的抑菌性持久，对于凝血试验，实施例5制得的消毒剂与实施例1～3制得的提取液凝血时间差别不大，比云南白药快且有显著差异。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示致病菌刃天青显色结果；

图2示硼砂和水杨酸的加入顺序对调节ph值的影响；

图3示硼砂和水杨酸的加入量对调节ph值的影响；

图4(a)～图4(b)示离心与不离心最小抑菌浓度的对比结果；

图5(a)～图5(c)示白色念珠菌总数和快速杀灭试验结果；

图6(a)～图6(d)示家兔局部皮肤刺激试验结果；

图7(a)～图7(d)示家兔眼刺激试验结果；

图8(a)示实施例9中两种喷头；

图8(b)示实施例9中两种喷头的凝血结果。

具体实施方式

本发明公开了一种裸花紫珠提取物、其制备方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

药材提取物质量标准：《中国药典》、《药品生产质量管理规范》(gmp)、《中药生产质量》(gap)

原辅料要求：符合《中华人民共和国药典》、国家及行业标准等有关规定

生产用水：符合《中华人民共和国药典》中纯水的要求。

本发明提供的裸花紫珠提取物、其制备方法及应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

取裸花紫珠粉末药材与浓度为50％的乙醇混合，提取温度为120℃，提取次数为1次，提取时间为12min，制得提取液。毛蕊花糖苷含量提取率(mg/g药材)为2.4％；总黄酮提取率(mg/g药材)为0.41％，毛蕊花糖苷含量平均值(mg/g浸膏)为107.20,总黄酮含量平均值(mg/g浸膏)为11.53。最小抑菌浓度(g/ml)为0.02，所以药液浓度(浸膏/溶剂)最小为0.02g/ml，此时，药液中毛蕊花糖苷和总黄酮浓度分别为2.1mg/ml和0.2mg/ml。

实施例2

取裸花紫珠粉末药材与浓度为70％的乙醇混合，提取温度为80℃，提取次数为3次，提取时间为6min，制得提取液。毛蕊花糖苷含量提取率(mg/g药材)为2.3％；总黄酮提取率(mg/g药材)为0.40％，毛蕊花糖苷含量平均值(mg/g浸膏)为105.3总黄酮含量平均值(mg/g浸膏)为10.42。最小抑菌浓度(g/ml)为0.02，所以药液浓度(浸膏/溶剂)最小为0.02g/ml，此时，药液中毛蕊花糖苷和总黄酮浓度分别为2mg/ml和0.2mg/ml。

实施例3

取裸花紫珠粉末药材与浓度为60％的乙醇混合，提取温度为100℃，提取次数为2次，提取时间为9min，制得提取液。毛蕊花糖苷含量提取率(mg/g药材)为2.3％；总黄酮提取率(mg/g药材)为0.40％，毛蕊花糖苷含量平均值(mg/g浸膏)为106.20,总黄酮含量平均值(mg/g浸膏)为10.63。最小抑菌浓度(g/ml)为0.02，所以药液浓度(浸膏/溶剂)最小为0.02g/ml，此时，药液中毛蕊花糖苷和总黄酮浓度分别为2mg/ml和0.2mg/ml。

实施例4

取实施例1制得的裸花紫珠提取物，辅料丙二醇的加量为3％(v/v)。5000rad/min离心后旋蒸、挥发至浸膏。制备时，不使用活性炭，先加入3％丙二醇，再加入水杨酸调节ph至4。

实施例5

取实施例2制得的裸花紫珠提取物，辅料丙二醇的加量为5％(v/v)。5000rad/min离心后旋蒸、挥发至浸膏。制备时，不使用活性炭，先加入5％丙二醇，再加入水杨酸调节ph至6。

实施例6

取实施例3制得的裸花紫珠提取物，辅料丙二醇的加量为7％(v/v)，水杨酸为2％(g/ml)。5000rad/min离心后旋蒸、挥发至浸膏。制备时，不使用活性炭，先加入7％丙二醇，再加入水杨酸调节ph至5。

对比例1～37

实施例7

毛蕊花糖苷线性方程

精密称取毛蕊花糖苷对照品5.1mg，置5ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25ml，置于5ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，进样20μl，得出线性关系：y＝24260x+303.15(r2＝0.9909)。

在相同条件下测定峰面积，实验结果如表1所示：

表1

最优提取条件下的微生物最小抑菌浓度的：

称取一份浸膏，配成约为0.02g/ml的药液，对半稀释8个浓度，分别从冰箱取出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌，进行最小抑菌浓度的选择。

微生物最小抑菌浓度结果：

表2微生物最小抑菌浓度的结果

由表2可以看出，白色念珠菌最难杀死，最小抑菌浓度最大为0.02g/ml，此时mic值的计算：对半稀释浓度选为0.02g/ml(浸膏/溶剂)，得出在与菌液混合进行杀菌条件下消毒剂的浓度为：20*对半稀释浓度/260μl＝0.0015g/ml，为了杀菌误差降低，所以，选择药液浓度为0.02g/ml(浸膏/溶剂)。

辅料种类及量：

丙二醇用量:将浸膏配成0.02g/ml的原药材，按照体积比5％、7％、9％、11％加入丙二醇，检测其沉淀度、展涂性、ph和毛蕊花糖苷峰面积。

丙二醇用量：

表3丙二醇的用量选择结果

*注：沉淀度、展涂性<4表示久置后几乎无沉淀、展涂性较低，4＜沉淀度、展涂性<8表示久置后有轻度沉淀，保湿展涂性适中，沉淀度、展涂性>8表示有久置后有重度沉淀，展涂性较大。

由于丙三醇的加入会导致毛蕊花糖苷的峰变形严重，没办法测出峰面积，所以只测得丙二醇的对应值，由表3可以看出，丙二醇的加量会影响药液的澄清度，原药液放置超过一个星期后，沉淀不易摇匀，加了丙二醇后，沉淀度明显下降，且久置后沉淀易摇匀，可能是丙二醇具有表面活性剂的功效，使得药物分子处于分散状态而不易集结沉淀或结晶，以充分发挥药物的功效，以提高药物的吸收率。但随着加量的增加，其对药液ph和总黄酮的含量影响不是很大，同时展涂性分值越来越高，保湿性也越来越强，5-8％兼有甘油的优点，且其还具有防腐防霉，抗氧化剂、赋形剂、加工助剂、防霉助剂等作用。但考虑到实际情况，首先需要起到一定的润肤保湿作用，但考虑到制剂类型可能需要用于涂抹皮肤后，使用医用针，所以展涂性不能太强，即不能太滑，又因为辅料是除了具有提高药品的辅助功能外，也可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分，所以，我们选择辅料的原则是不影响或不显著影响有效成分的含量，所以，结合丙二醇的加量对毛蕊花糖苷峰值的影响和对皮肤的保湿功能和对产品具有稳定性和防腐性等功能，综合得出，选择丙二醇的量为3-7％。

硼砂和水杨酸调节ph值的顺序和量:将浸膏配成0.02g/ml的原药液即原料。将硼砂调成2g/50ml的溶液，此时ph＝9.24，由于水杨酸微溶于水，易溶于乙醇，所以，将水杨酸溶于20ml的乙醇，使得溶剂浓度和药液提取浓度一样，此时水杨酸的浓度为1g/20ml,ph为2.2。首先在药液里加入单一成分硼砂，调成不同ph，再在最大的ph基础上，加入水杨酸，调成不同的ph。第二个先入水杨酸至一定ph,再在此基础上加入硼砂，调成不同的ph值，分别取100μl加入1ml流动相稀释，连续进20μl3针，分别记录其毛蕊花糖苷峰面积。

硼砂和水杨酸调节ph值的顺序和量：

表4硼砂调节ph对毛蕊花糖苷峰面积的影响(n＝3)

表5先加硼砂后再加水杨酸调节ph对毛蕊花糖苷峰面积的影响(n＝3)

表6水杨酸调节ph对毛蕊花糖苷峰面积的影响(n＝3)

表7先加水杨酸后加再硼砂调节ph对毛蕊花糖苷峰面积的影响(n＝3)

从以上结果可以看出，不论是单独加了硼砂还是同时加入硼砂和水杨酸的的偏碱性条件下，即在ph到7时下降就已经非常明显，此时毛蕊花糖苷的峰面积都大大减少，然后，在试验辅料加入顺序时，首先，先加入硼砂后加入水杨酸时，峰面积呈现先下降后上升的趋势，且最大为2277.32，说明毛蕊花糖苷不宜在碱性条件下存在，然后，先加入水杨酸后加入硼砂的时，结果呈现在加入水杨酸时，结果峰面积没有较大差距，约为3774.83，在加入硼砂后，急剧下降，直到5.5时又上升，但此时最大为2277.32，所以，酸性环境更适于药液有效活性物质毛蕊花糖苷的存在，碱性环境可能会与其发生反应，所以，得出样品添加辅料的种类和顺序为只加水杨酸调节ph至4，此时水杨酸用量为55滴，即2.75ml溶液，0.137g水杨酸辅料，又实施例1～3制得的提取液为30ml，所以水杨酸在药液里浓度为0.45％(g/ml)。

凝血实验：在以上ph选择基础上，选择峰面积高的调节方式进行凝血实验，从市场取新鲜鸡血、鸭血、鸽子血，装入5ml肝素钠管，分别取1ml实施例1～3制得的提取液记做为a，实施例1～3制得的提取液加7％丙二醇记做为b，实施例1～3制得的提取液加7％丙二醇加硼砂再加水杨酸到ph＝5记作为c，实施例1～3制得的提取液加7％丙二醇再加水杨酸到ph＝4记做为d，实施例1～3制得的提取液加7％丙二醇加水杨酸到ph＝4再加硼砂到ph＝5.5记做为e，再加入0.5ml血液，空白记做f，云南白药(0.06g/ml)记做g。

表8凝血的对比试验结果(n＝3)

注：—表示血液没有凝固

凝血实验表明，原料与原料加入7％丙二醇与原料加入7％丙二醇后再加入水杨酸调节ph至4没有明显差别(p>0.05),然而在加入了硼砂时，虽然c和e此时的毛蕊花糖苷都是相对最高的，但是凝血时间明显比a、b、d高(p<0.05),云南白药在20min内没有完全凝固，空白组在24小时内没有凝固，可能是因为肝素钠管含有抗凝剂使得血液难以凝固，但是本实验室药液还是有很快凝固，又因为d含有防腐防冻、止痒止痛、消炎消肿等功能的丙二醇和水杨酸，所以，选择d样，此时毛蕊花糖苷含量也相对较高，据文献报道其可能是发挥内源止血功效的主要活性物质，那么d将是内源与外源结合同时发挥最好止血效果的条件，实验也表明鸡血、鸭血和鸽子血凝血时间也没有显著差别，都为4.0±1min(p>0.05)。

制备工艺：

离心速度:分别在500、2500、5000(rad/min)不同离心速度下离心，取上清液，稀释一定的倍数，在优化的色谱条件下进样，记录峰面积。

离心速度：

离心与不离心最小抑菌浓度的对比：

在本发明提供的提取方法下，称取8g毛蕊花糖苷粉末进行6组萃取，将其中3组进行离心后旋蒸、挥发至浸膏，其他三组自然挥发至浸膏状态，然后精密称取一定重量的浸膏，将其用50％乙醇进行溶解，溶解完再稀释成8个梯度浓度的溶液，进行刃天青实验(选择金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)。

离心与不离心最小抑菌浓度的对比结果见图2。

由图2可知，不离心的药液最小抑菌浓度误差大于离心药液，而且不离心的药液沉淀度较大，很难沉淀后摇匀，又由于两者mic值差别不是很大，所以，结果选择对药液进行离心处理。

表9不同离心速度的结果

由表可以看出，实验三批药材，分别经不同的离心转速后进样，得到最后的峰面积，虽然结果差别不大，但还是可以看出5000的转速峰面积最大，可能是有效物质分子占据了沉淀物分子的体积，使得溶剂中的有效物质增加了。

活性炭用量：称取一份浸膏，配成约为0.02g/ml的药液，添加活性炭，按照活性炭占药液体积为0.5％、1％、2％、3％、4％、5％(g/ml)的比例加入，另取两份作未吸附溶液，室温下搅拌20min，用0.45μm孔径的滤膜进行过滤，稀释，取滤液和未吸附溶液的滤液进行分析检测，考察药液经不同浓度的药用活性炭在相同吸附时间内溶液的沉淀度、ph值、抑菌性即mic值(选择白色念珠菌)和峰面积并计算平均峰面积。

活性炭用量结果：

表10活性炭的用量(g/ml)

虽然实施例1～3制得的组合物有薄层沉淀，但还是易于摇匀，符合质量标准，而且含量最高，又由于活性炭吸附性极强，会导致有效物损失严重，所以，选择实施例4～6制得的组合物及其制备方法。

实施例8

实验材料、试剂及仪器

实验方法(皮肤消毒剂卫生要求、消毒剂技术规范)

不同时间目测感官性状试验

将消毒剂样品至于室温放置24小时，一个星期，一个月后分别观察其感官性状。重金属的含量测定试验：

取实施例1～3制得的药材浸膏2g于消解罐，分别加入4ml硝酸和1ml3％的双氧水和5ml的去离子水、4ml硝酸和2ml3％的双氧水和4ml的去离子水、4ml硝酸和3ml3％的双氧水和3ml的去离子水，按照以下程序进行微波消解，得到的液体经微孔滤膜过滤，定容于25ml容量瓶，与此同时，准备好空白对照溶液。采用电感耦合等离子发射光谱-质谱(icp–ms)方法，通过电感耦合等离子体质谱定量分析。

表11微波消解程序

稳定性试验

将实施例4～6制得的止血消毒剂及实施例1～3制得的裸花紫珠提取物，吸取适量用于测试完ph、总黄酮的吸光度、毛蕊花糖苷峰面积和抑菌浓度(选择最难杀死的白色念珠菌)后，密封，至于2-4℃(低温)的冰箱、25℃(常温)、54℃的烘箱各两支。14天后再次测定。

快速5.0min杀灭微生物实验

测定菌落总数

将2-4℃冰箱的细菌用接种环划下接于液体培养基，在适宜条件下于摇床培养，形成菌悬液，以上操作均严格按无菌要求进行。准备9根试管，梅根试管加入4.5ml培养基，并贴上标签，依次放入试管架。将菌悬液调成0.2吸光度，随后吸取0.5ml加至1号试管内。将1号试管震摇混匀，再吸取出0.5ml加入2号试管内。如此类推，直至最后一管(必要时)。将冷至40℃～45℃融化的营养琼脂培养基倾注于平皿中，每平皿15ml～20ml。选择7、8、9试管，吸取其中混合均匀的悬液100μl加于无菌平皿内，用涂布棒进行均匀涂布，每一个稀度接种3个平板。将平皿盖好，用封口膜封好平皿，翻转平皿，使底向上，置于37℃人工培养箱培养(细菌繁殖体为48h，白色念珠菌与细菌芽孢为72h)。每日观察细菌生长情况，计数最终结果的菌落总数。

杀灭计数：

将实施例4～6制得的止血消毒剂和调制0.08吸光度的细菌悬液(用生理盐水稀释)以1:10的体积混匀，反应5min，用灭过菌的移液枪头吸出，并用灭完菌的滤膜，过滤，用生理盐水多次冲洗直到消毒剂几乎被冲洗完全，将滤膜取出，放入10ml的烧杯里用生理盐水将滤膜冲洗，直到滤膜上的菌被几乎冲尽，大约需5ml，将烧杯里的细菌吸取100μl，常规操作。

一次皮肤刺激试验

将购买来的健康家兔在脊椎两侧用剪刀和剃毛刀一起剃去约4cm*4cm的区域，将纱布剪成5cm*5cm的方块状，滴入25滴实施例5制得的止血消毒剂，另一块滴入25滴的生理盐水，用保鲜膜从肚子下裹住，再用细绳系住，为了防止兔子扭头舔舐，:又剪了一个矿泉水瓶身，套在腰上。12个小时后，取下，用生理盐水清洗干净，分别于1、12、24、48(h)按照表12规定观察受试皮肤表面反应情况。然后将各时间的动物皮肤红斑与水肿形成情况的评分相加，除以动物数，得各时间的皮肤刺激反应值，取其中最高皮肤刺激指数，最后对受试动物皮肤刺激进行强度的分级。

表12皮肤刺激评分标准

*刺激强度级别：无：＜0.5、轻度：0.5＜2.0、中等：2.0＜6.0、强≥6.0

眼刺激试验：

将买来的健康家兔，右侧眼结膜囊(眼球与眼皮之间的间隙)内，一般容积为0.01ml，用胶头滴管滴入5滴实施例4～6制得的止血消毒剂，约为0.1ml，左侧作为空白对照，滴入生理盐水。于1、12、24、48(h)观察家兔结膜、虹膜和角膜的反应情况，按照表13对家兔眼刺激进行评分，最后计算各时间段评分的平均值。如果眼睛刺激反应评分降至0，即可结束试验。

表13眼刺激评分

表14眼刺激性强度标准

样品与市场云南白药功效的对比

长期抑菌实验：将实施例4～6制得的止血消毒剂配置三份，稀释至0.02g/ml的浓度；

将市场上买来的具有止血活性的云南白药和实施例1～3制得的裸花紫珠提取物，稀释成相同的浓度，即得云南白药溶液和原材料药液即实施例1～3制得的提取液；

对最难杀死的白色念珠菌进行96孔板显色即最小抑菌试验，进行时间放置大于24小时长期抑菌试验。

体外凝血实验：秤取云南白药粉末和裸花紫珠粉末各0.3g，加入5mlpbs盐缓冲液，吸取实施例4～6制得的止血消毒剂、实施例1～3制得的提取物、云南白药溶液和裸花紫珠粉末溶液各1ml于2ml的离心小试管，然后分别依次加入抗凝管中新鲜兔血0.5ml，立即摇匀计时，直到血液倾斜不再流动为止，每个药重复3次。

结果：

感官性状随时间的试验结果

表15感官性状随时间的试验结果

药液中重金属含量测定试验结果：

实施例4～6制得的止血消毒剂(表格中标记为样品)和实施例1～3制得的提取物(表格中标记为原药液)的稳定性试验：

表16样品的稳定性试验结果

由结果可以看出，54℃稳定性实验后，原药液和样品的ph变化不大，都稳定在开始测量的ph范围内，总黄酮的吸光度都变大,原药液的毛蕊花糖苷峰面积相比样品的峰面积明显下降，可能是样品具有添加了稳定性辅料的原因，4℃和25℃对样品和原药液都没有显著影响，然而光照对原药液的毛蕊花糖苷和黄酮有显著影响，所以建议低温避光保存样品。

表17快速5.0min杀菌实验结果

经多次试验发现，0.2的吸光度菌数总数大于10⁹,，根据gb4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验落总数测定》中的有关规定，与消毒剂相互作用时须确保菌液浓度在1×10⁷～5×10⁸cfu/ml之间，又经预实验可知将细菌的od调到0.09时，细胞浓度近似为5*10⁸cfu/ml，且从结果可以看出，白色念珠菌相比其他菌更难杀死，结果如图3，但也达到了要求：金黄色葡萄球菌杀灭试验≤5.0min、杀灭对数值≥5.0，铜绿假单胞菌杀灭对数值≥5.0，白色念珠茵杀灭对数值≥4.0。表17为所有菌的总数和杀灭后的对数值。

家兔局部皮肤刺激试验结果：

在试验过程中经肉眼观察结果，由图4显示，短时间及长时间都可以看出，兔子皮肤都没有水肿情况、红斑的情况，说明此样品对家兔的皮肤无刺激性及腐蚀性。

家兔眼刺激试验结果：

由图5结果可以看出，家兔的眼几乎没有任何变化，经试验过程中观察，短时间内家兔试验组眼睛只是闭眼时间相对对照组时间久一些，但没有异物和眼球损伤的痕迹，表明此样品对家兔的眼没有刺激性。

抑菌和凝血对比试验结果：

原药液1～3：实施例1～3制得的提取液；

样品1～3：实施例4～6制得的相应的止血消毒剂。

表1824小时长期抑菌试验的对比试验结果

表19凝血的对比试验结果

注：*表中每列具有相同的字母者表示二者无显著性差异(p＞0.05)，反则有显著性差异(p＜0.05)。

由表18可以看出，相比本发明实施例4～6制得的消毒剂，云南白药没有抑菌性，而且本实验的原药液(实施例1～3制得的提取液)与样品(实施例4～6制得的消毒剂)抑菌性差别不大，由表19可以看出，原药液的抑菌性与实施例4～6制得的消毒剂的体外凝血时间没有显著差异(p＞0.05)，且时间最短，与云南白药凝血时间有显著差异，但云南白药凝血时间短于裸花紫珠粉末，且有显著差异，说明裸花紫珠凝血有效活性物质没有很好溶于pbs溶液，所以，有效的提取方式对于有效活性物质的提取是必要的。

实施例9

选择较为适合的两种喷头进行实验，模拟涂剂和喷雾剂。喷头1，每喷一次为0.1ml，喷头2根据计量不固定，需要根据实际情况进行力度的选择，6孔板中，每个板子滴入0.1ml的血液，喷头1的加量依次为0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml，喷头2根据不同的力度也加入相同的量，加药完，均匀摇动孔板使药液尽可能的均匀。

从图8(a)、图8(b)结果可以看出，在相同药液量不同喷头的反应结果差别明显，没有喷洒药物的血液一直没有凝固，随着药液量的增加，凝固时间越来越短，凝固面积越来越大，可以得出喷头1喷洒均匀，消耗量少，在喷洒0.2ml时已经可以与0.1ml的药液反应完全，且只要接触血液的地方就会快速凝固，平均时间约为2s，其与用混合均匀的离心小试管模式实验，结果显著相同。但喷头2在使用量为0.4ml时，结果还没有反应完全，可能是与血液混合均匀度还不够的缘故，而且喷雾剂在使用时可以不接触皮肤，会减少物理摩擦对伤口的损害，而且其也可以起到涂剂的效果，即直接获取使用，又根据“湿润愈合”的原理，如果伤口在早期表面保持湿润，有利于愈合伤口，加速其表皮角质化且不易结痂。所以，此剂型选择喷雾剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。