【技术领域】
本发明涉及人体保健品技术领域，尤其涉及一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品的制备方法。
背景技术：
随着年龄的增长，人体的骨密度会越来越低，尤其对于老年人来说，常常会出现骨质疏松等由骨密度流失导致的骨科疾病，针对这类人群，需要食用营养价值高的壮骨补品以提高人体自身骨密度，增强体质，提高生活质量。
牛骨中主含胶原蛋白，味甘、性温，归心、肾、大肠经，具有蠲痹，截疟，敛疮之功效，故常用于关节炎，泻痢，疟疾，疳疮。因此，作为营养价值高的壮骨补品之一往往被人们青睐。牛骨通常以食用或者煎服的方式进入人体，其胶原蛋白一般要被消化液酶解为低聚肽或氨基酸而被机体吸收和利用，而老龄人群常见脾胃虚弱或有胃肠道反应，因此消化道酶的活性低，消化能力差，因此上述服用不仅会造成患者消化系统的负担，而且也达不到应有的药效。
而将牛骨胶原蛋白经过处理得到小分子阿胶肽可以有效克服上述问题，为人类健康带来福音。因此，发明一种适合工业化生产、产品质量高的牛骨胶原蛋白低聚肽制品的制备方法是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明实施例提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品的制备方法。
一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品的制备方法，包括如下步骤：
1)选取新鲜洗净后的牛骨用锡箔纸完全包裹后，然后放入液氮中冷却1min，取出后用破碎机将牛骨粉碎至100目，加入提取溶液进行提取后得到固液混合物；其中，所述提取溶液是溶剂为水的混合溶液，各溶质的浓度分别为：氢氧化钠100mm、氯化钠50mm、蔗糖10mm，提取过程在400w的微波环境中进行；
2)向固液混合物中加入混合酶，加入乳酸调节ph值为6，在38℃的恒温环境中酶解60min，得到第一酶解液，其中混合酶为重量份数比为4:1:5:2的胶原蛋白酶、脂肪酶、糖元酶和核酸酶混合酶体系；保持温度与ph值不变，向第一酶解液中加入和混合酶等重量份的蛋白内切酶，酶解90min后得到第二酶解液；
3)向第二酶解液中加入和牛骨重量份数比为1:150的中药提取物，不断搅拌升温至沸腾，并保持20min，然后降至室温，离心过滤后得到混合提取液；其中，中药提取物是通过如下步骤制备而成：
a、取干燥中药组合物进行粉碎，其中所述中药组合物为重量份数之比为5:2:10:4:3:1的龙骨、豨签草、枳椇子、凤凰衣、胡芦巴和代代花，然后加入体积分数为90％的乙醇水溶液回流提取5次，每次加入乙醇水溶液为干燥中药组合物2倍重量，回流时间为4h；收集并合并提取液，减压浓缩至无醇，得稠浸膏；
b、将步骤a所得的稠浸膏混悬于干燥中药组合物2倍体积的水中，然后用石油醚萃取3次，每次加入石油醚的量为稠浸膏0.3倍体积量，萃取完毕后合并有机相，干燥，减压浓缩，得中药粗提取物；
c.将步骤b所得的中药粗提取物以1.0g/ml的浓度溶于丁酸甲酯中，上硅胶层析柱；
d.梯度洗脱：洗脱流量为6ml/min，先用石油醚洗脱5个柱体积，除去流分；再用体积比为3:1的石油醚和二氯甲烷混合液洗脱6个柱体积，收集流分；再用体积比为5:3:1的石油醚、二氯甲烷和丁酸甲酯的混合液洗脱8个柱体积，除去流分；再用体积比为4:3:2的石油醚、二氯甲烷和丁酸甲酯的混合液洗脱20个柱体积，收集流分，将收集的流分合并，减压浓缩，即得中药提取物；
4)将混合提取液进行分离、浓缩和干燥后，得到牛骨胶原蛋白低聚肽制品。
本发明还提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，还包括辅料，所述牛骨胶原蛋白低聚肽制品与辅料的重量份数比为1:6，所述辅料包括如下重量份数的成分：亲水性凝胶20份、填充剂30份、助溶剂2份、起泡剂4份、润滑剂2份和稳泡剂2份。
作为优选地，所述亲水性凝胶包括重量份数比为1:3:2.5的豆胶、瓜尔胶以及罗望子胶。
作为优选地，所述填充剂包括重量份数比为1:3:4的交联聚维酮、香兰素以及木糖醇。
作为优选地，所述助溶剂包括重量份数比为1:2:3聚乙烯吡咯烷酮、肝素钠和亮氨酸。
作为优选地，所述起泡剂包括重量份数比为1:4:2:3的枸橼酸脂肪酸甘油酯、烷基甜菜碱、聚乙二醇单月桂酸酯和脂肪酰二乙醇胺。
作为优选地，所述润滑剂包括重量份数比为2:3:5的聚α烯烃、月桂醇硫酸镁和山嵛酸三甘油酯。
作为优选地，所述稳泡剂包括重量份数比为1:3:2的聚乙二醇、皂甙以及羟甲基纤维素。
上述技术方案中的一个技术方案具有如下有益效果：
本发明提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品的制备方法，工艺先进、工序合理、可操作性强，易于工业化生产，该方法制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品具有壮骨、增加骨密度、促进骨骼生长愈合、治疗关节炎等效果，添加的中药组份可以与牛骨胶原蛋白低聚肽进行协同，更容易吸收，进一步增强了壮骨健骨、治疗和预防骨病的功效，另外，酶解中酶的组合和用量的选择，使得酶解效率和酶解程度高，且酶解物中氨基化学物的种类和数量多，口感好。
【具体实施方式】
为了更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明实施例进行详细描述。
应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
应当理解，本文中使用的术语“和/或”仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
实施例1
一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品的制备方法，包括如下步骤：
1)选取新鲜洗净后的牛骨用锡箔纸完全包裹后，然后放入液氮中冷却1min，取出后用破碎机将牛骨粉碎至100目，加入提取溶液进行提取后得到固液混合物；其中，所述提取溶液是溶剂为水的混合溶液，各溶质的浓度分别为：氢氧化钠100mm、氯化钠50mm、蔗糖10mm，提取过程在400w的微波环境中进行；
2)向固液混合物中加入混合酶，加入乳酸调节ph值为6，在38℃的恒温环境中酶解60min，得到第一酶解液，其中混合酶为重量份数比为4:1:5:2的胶原蛋白酶、脂肪酶、糖元酶和核酸酶混合酶体系；保持温度与ph值不变，向第一酶解液中加入和混合酶等重量份的蛋白内切酶，酶解90min后得到第二酶解液；
3)向第二酶解液中加入和牛骨重量份数比为1:150的中药提取物，不断搅拌升温至沸腾，并保持20min，然后降至室温，离心过滤后得到混合提取液；其中，中药提取物是通过如下步骤制备而成：
a、取干燥中药组合物进行粉碎，其中所述中药组合物为重量份数之比为5:2:10:4:3:1的龙骨、豨签草、枳椇子、凤凰衣、胡芦巴和代代花，然后加入体积分数为90％的乙醇水溶液回流提取5次，每次加入乙醇水溶液为干燥中药组合物2倍重量，回流时间为4h；收集并合并提取液，减压浓缩至无醇，得稠浸膏；
b、将步骤a所得的稠浸膏混悬于干燥中药组合物2倍体积的水中，然后用石油醚萃取3次，每次加入石油醚的量为稠浸膏0.3倍体积量，萃取完毕后合并有机相，干燥，减压浓缩，得中药粗提取物；
c.将步骤b所得的中药粗提取物以1.0g/ml的浓度溶于丁酸甲酯中，上硅胶层析柱；
d.梯度洗脱：洗脱流量为6ml/min，先用石油醚洗脱5个柱体积，除去流分；再用体积比为3:1的石油醚和二氯甲烷混合液洗脱6个柱体积，收集流分；再用体积比为5:3:1的石油醚、二氯甲烷和丁酸甲酯的混合液洗脱8个柱体积，除去流分；再用体积比为4:3:2的石油醚、二氯甲烷和丁酸甲酯的混合液洗脱20个柱体积，收集流分，将收集的流分合并，减压浓缩，即得中药提取物；
4)将混合提取液进行分离、浓缩和干燥后，得到牛骨胶原蛋白低聚肽制品。
实施例2
本实施例还提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片还包括辅料，其中胃漂浮片中牛骨胶原蛋白低聚肽制品为10g，辅料为60g，辅料包括如下成分：亲水性凝胶20g、填充剂30g、助溶剂2g、起泡剂4g、润滑剂2g和稳泡剂2g。
实施例3
本实施例还提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片还包括辅料，其中胃漂浮片中牛骨胶原蛋白低聚肽制品为10g，辅料为60g，辅料包括如下成分：重量份数比为1:3:2.5的豆胶、瓜尔胶以及罗望子胶的混合亲水性凝胶20g，重量份数比为1:3:4的交联聚维酮、香兰素以及木糖的混合填充剂30g，重量份数比为1:2:3聚乙烯吡咯烷酮、肝素钠和亮氨酸的混合助溶剂2g，重量份数比为1:4:2:3的枸橼酸脂肪酸甘油酯、烷基甜菜碱、聚乙二醇单月桂酸酯和脂肪酰二乙醇胺的混合起泡剂4g，重量份数比为2:3:5的聚α烯烃、月桂醇硫酸镁和山嵛酸三甘油酯的混合润滑剂2g，重量份数比为1:3:2的聚乙二醇、皂甙以及羟甲基纤维素的混合稳泡剂2g。
对照例1
对照例1提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的亲水性凝胶为重量份数比为1:1:1的豆胶、瓜尔胶以及罗望子胶的混合物，其他均与实施例3保持一致。
对照例2
对照例2提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的亲水性凝胶为桃胶，其他均与实施例3保持一致。
对照例3
对照例3提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的亲水性凝胶为重量份数比为1:1的豆胶和瓜尔胶的混合物，其他均与实施例3保持一致。
对照例4
对照例4提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的亲水性凝胶为重量份数比为1:1的瓜尔胶和罗望子胶的混合物，其他均与实施例3保持一致。
对照例5
对照例5提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的亲水性凝胶为重量份数比为1:1的豆胶和罗望子胶的混合物，其他均与实施例3保持一致。
对照例6
对照例6提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的起泡剂为重量份数比为1:1:1:1的枸橼酸脂肪酸甘油酯、烷基甜菜碱、聚乙二醇单月桂酸酯和脂肪酰二乙醇胺混合物，其他均与实施例3保持一致。
对照例7
对照例7提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的起泡剂为重量份数比为1:1:1的枸橼酸脂肪酸甘油酯、烷基甜菜碱和聚乙二醇单月桂酸酯的混合物，其他均与实施例3保持一致。
对照例8
对照例8提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的起泡剂为重量份数比为1:1:1:1的烷基甜菜碱、聚乙二醇单月桂酸酯和脂肪酰二乙醇胺混合物，其他均与实施例3保持一致。
对照例9
对照例9提供了一种牛骨胶原蛋白低聚肽制品与药学上可接受的辅料制成的胃漂浮片，该胃漂浮片辅料中的去除稳泡剂，其他均与实施例3保持一致。
对照例10
将实施例1中的中药组合物为重量份数之比调整为4:1:6:1:5:1的龙骨、豨签草、枳椇子、凤凰衣、胡芦巴和代代花，其他和实施例1保持一致，制得牛骨胶原蛋白低聚肽制品。
对照例11
将实施例1中的加入中药组合物这一步骤去除添加并制备中药组合物这一步骤，其他和实施例1保持一致，制得不含中药提取物的牛骨胶原蛋白低聚肽制品。
对照例12
将实施例1中向第二酶解液中加入和牛骨重量份数比为1:150的中药提取物的比例调整为1:200，其他和实施例1保持一致，制得牛骨胶原蛋白低聚肽制品。
对照例13
将实施例1中向第二酶解液中加入和牛骨重量份数比为1:150的中药提取物的比例调整为1:100，其他和实施例1保持一致，制得牛骨胶原蛋白低聚肽制品。
实验例1
溶出度比较实验
以实施例1作为实验组，以对照例1-9中提供的胃悬浮片作为对照组，根据《中华人民共和国药典》2010版记载的片剂溶出度测定法之一的“转篮法”对各组胃漂浮片的溶出度进行测定，具体测定方法如下：
以模拟胃液作为溶出介质，加热至约41℃，并在真空条件下不断搅拌5min以上，得到脱气溶出介质；分别量取经脱气处理的模拟胃液，置于8个溶出杯中，每杯500ml，待溶出介质温度恒定在37℃±0.5℃后，每组样品各取6片，分别投入6个干燥的转篮内，将转篮降入溶出杯中，注意供试样品表面上不要有气泡，启动溶出度仪并调至100r/min，记录每片样品完全溶出的时间，并比较各组样品的溶出速度。实验结果见表1。
表1.各组胃漂浮片的完全溶出时间
由表1可知，实施例1的溶出时间均显著多于对照例1-9，从对照例1-5可以看出，本发明特定的亲水性凝胶组合溶出速率最低，无论是改变特定比例、特定组分和减少组份，对于溶出时间的影响均很大。缓控释片应在释放介质中缓慢地释放有效成分、使体内有效成分的含量一定时间内均保持在一定水平。由此可见，使用本发明提供的亲水性凝胶组合的胃漂浮片能在胃液中滞留较长时间，从而提高药物利用率，从对照例6-8可以看出，使用了本发明提供的特定起泡剂组合可与协同亲水性凝胶组合产生协同作用延，长上述滞留时间，胃漂浮片在胃液中的滞留时间更长，从对照例9可以看出，本发明稳泡剂不仅有稳泡的作用，还可以协同亲水性凝胶组合,进一步延长上述滞留时间。
实验例2
体外漂浮性能实验
以实施例1作为实验组，以对照例1-9中提供的胃悬浮片作为对照组，，以900ml浓度为0.1mol/l的盐酸溶液为释放介质，温度(37.0±0.5)℃，转速100r/min，用秒表记时。以胃漂浮片放入溶出杯至片剂漂浮至液面的时间设为起漂时间t1，从起漂开始至实验结束时的时间设为持续漂浮时间t2。实验结果见表2。
表2.各组胃漂浮片的漂浮时间
由表2可知，各组样品的漂浮时间均超过12h、达到较好的效果；实施例1的起漂时间均显著短于对照例1-9。由此可见，使用本发明提供的亲水性凝胶组合的胃漂浮片能在胃液中滞留较长时间，从而提高药物利用率，并且使用了本发明提供的起泡剂组合的胃漂浮片在胃液中的滞留时间更长，而使用稳泡剂还可以进一步延长上述滞留时间。
实验例3、对骨质疏松的效果
(一)骨质疏松的症状
骨密度和骨质量下降，骨微结0构被破坏，骨脆性增加，容易发生骨折。
(二)试验人群
250例符合骨质疏松的症状的受试者，年龄均在25-60岁之间。
(三)分组
将250例骨质疏松受试者随机分成试验组50人、对照组a50人、对照组b50人、对照组c50人、对照组d50人；试验组使用本发明实施例1制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品；对照组a服用对照例10制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品；对照组b服用对照例11制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品；对照组c服用对照例12制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品；对照组d服用对照例13制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品；均使用6个月。
(四)功能评价
显效：临床症状、体证积分减少≥70％；牛骨胶原蛋白低聚肽制品
有效：临床症状、体证积分减少50-70％；
无效：临床症状、体证积分减少≤50％
(五)结果
表3.调节骨质疏松的效果比较
(六)结论
试验组制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品，牛骨胶原蛋白低聚肽和中药提取物通过特定的配比，可显著改善患者骨质疏松的各项体证。对照组a可以看出，当调节中药提取物中的中药配比，有效率会随之下降，对照组b为单一的牛骨胶原蛋白低聚肽，效果降低更为明显，对照组c和对照组d改变了牛骨胶原蛋白低聚肽和中药提取物配比，对于有效率的影响也是很明显的。本发明实施例1中特定的中药组份，特定的牛骨胶原蛋白低聚肽和中药提取物，使得二者之间具有协同吸收，释放更多有效成分的功效。
本发明提供的牛骨胶原蛋白低聚肽制品的制备方法，工艺先进、工序合理、可操作性强，易于工业化生产，该方法制备的牛骨胶原蛋白低聚肽制品具有壮骨、增加骨密度、促进骨骼生长愈合、治疗关节炎等效果，添加的中药组份可以与牛骨胶原蛋白低聚肽进行协同，更容易吸收，进一步增强了壮骨健骨、治疗和预防骨病的功效，另外，酶解中酶的组合和用量的选择，使得酶解效率和酶解程度高，且酶解物中氨基化学物的种类和数量多，口感好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。