一种延长脑梗死溶栓时间窗的药物和方法与流程

本申请涉及用于脑梗死治疗的药物和方法。更具体地，涉及用免疫调节剂延长人重组组织纤溶酶原激活物(rtpa)的溶栓时间窗，优选地，将该溶栓时间窗从4.5小时延长至6小时。
背景技术：
：“脑卒中”(cerebralstroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，cva)，是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起的脑组织损伤，包括出血性卒中和缺血性卒中。缺血性卒中又称脑梗死，其发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60％～70％。目前已被各国公认的脑梗死急性期临床静脉药物治疗方法仅限于人rtpa溶栓。关于这种溶栓在本世纪初就已有不少文献，其中有提到发病后6小时、甚至12小时的溶栓可能对治疗脑梗死有效。但随后很多证据表明，超过一定时间给予溶栓处理，虽然可能获得了溶栓效果，但伴有诸多危及生命的严重副作用，例如再灌注损伤和出血(参见例如，hackew等，nengljmed，359(13):1317-1329，2008；leeskr等，lancet375(9727):1695-1703，2010)。为此，各国一方面批准了tpa的临床应用，另一方面也设立了严格的用药时间窗，即不超过发病后4.5小时(参见中国急性期缺血性脑卒中诊治指南2014，中华神经科杂志，2015年第4期)，美国甚至提出溶栓不能超过发病后3.0小时，对于发病后3.0～4.5小时期间溶栓的安全性缺乏足够的证据(参见aha/asa指南)。如果患者已超过这个时间窗，临床医师按标准接诊程序是不会冒险去溶栓的，只进行抗血小板、调脂和控制危险因素的治疗(见上述2014指南)。但实践中，超过这个时间窗的患者其实很多。有些患者发病后不能及时被发现、或不能及时送到医院。即使患者被送达医院，也不能马上给予溶栓治疗。虽然溶栓治疗开始得越早越好，但接诊医生需要按照上述诊治指南，进行基本的身体检查，询问病史以确定发病时间，抽取血液等标本送实验室化验，并送患者去接受影像学检查，以确定患者是否适合溶栓治疗。比如卒中患者如果被诊断为急性脑出血，就不能接受溶栓治疗。从接诊到实施溶栓，整个过程可能要花费40分钟～1小时，甚至更长时间。而溶栓时间窗是从发病开始起算，不是从接诊开始起算。因此，如果有办法能延长溶栓治疗的时间窗，无疑能够使更多的患者接受这种有效的治疗，对脑梗死患者有重大生命意义。技术实现要素：本申请提供了一种延长脑梗死溶栓时间窗的化合物和方法。就本申请人所知，脑梗死发作后，往往形成中心梗死区、以及周围的“缺血半暗带”(也称“环状半影”或“缺血半影区”)。梗死区内的脑细胞处于不可逆转的坏死状态。缺血半暗带则存在大量处于休眠或半休眠状态的脑细胞，由于血流低于正常水平，这些细胞虽能维持形态，但无法行使正常功能。如不能及时恢复供血，半暗带区域将最终进展为坏死；反之，如能及时恢复供血(再灌注)，就有可能重新激活奄奄一息的细胞，恢复脑功能，此为半暗带的挽救。这样的挽救，有很强的时间紧迫性，需抢在缺血半暗带细胞未进展为彻底坏死之前。在本申请之前，虽然临床上已知脑梗死溶栓有严格时间窗，缺血半暗带坏死是限制rtpa超过时间窗应用的效力的重要影响因素。但并没有人把缺血半暗带的挽救与免疫干预联系起来。本申请人是首次发现，通过免疫调节，减少脑缺血后炎症反应，能够挽救缺血半暗带。在脑缺血后，缺血半暗带内细胞快速死亡，导致缺血半暗带缩小、而梗死区扩大，在发病4.5小时之后半暗带基本已无可挽救的细胞；而通过保护缺血半暗带细胞，延缓其坏死，可阻止梗死区扩大，使得在4.5小时之后仍有可挽救的组织，则可以使rtpa静脉溶栓时间窗得到扩展。因此，本申请涉及能保护脑梗死缺血半暗带的免疫调节剂与溶栓联合治疗脑梗死的方法。也即，本申请中能保护脑梗死缺血半暗带的免疫调节剂可用于制备辅助脑梗死溶栓治疗的药物。本文中，“缺血半暗带”是指缺血坏死区周围的供血不足区。经病理生理、生物化学、局部脑血流(regionalcerebralbloodflow，rcbf)、或正电子发射断层扫描(positronemissiontomography，pet)等检查，该缺血半暗带区域既不同于核心坏死区，也不同于更外围的正常组织区。例如，核心坏死区的rcbf非常低下，基本处于cbf的“膜泵衰竭”阈水平或阈值之下；而缺血半暗带的rcbf仍处在“膜泵衰竭”阈值之上。其它指标如总代谢率、氧摄取等也有助于鉴别缺血半暗带。pet既能检测表浅和深部脑组织的rcbf，也能检测局部脑代谢率，而且能对活体进行观察，因此是目前比较有效的缺血半暗带认识手段。多模态ct扫描也可以用于评价缺血半暗带的动态变化。本领域技术人员有能力选择合适的方法来探测缺血半暗带。本文中，“保护缺血半暗带”是指，缺血半暗带中有至少20％的区域恢复正常血流，例如有至少30％的区域恢复正常血流，或有至少40％的区域恢复正常血流，或有至少50％的区域恢复正常血流，或有至少60％的区域恢复正常血流，或有至少70％的区域恢复正常血流，或有至少80％的区域恢复正常血流，或有至少90％的区域恢复正常血流，或有至少100％的区域恢复正常血流。所谓正常血流，是指与一同检测的脑部未发病区域的血流表现相同。本文中，用于保护缺血半暗带的免疫调节剂优选是使缺血半暗带的细胞免于坏死的化合物，更优选是抑制血液循环中免疫细胞进入脑中的化合物。所述抑制可以是，抑制淋巴细胞从淋巴器官进入血液循环、和/或减少血液循环中免疫细胞的数量(尤其是减少急性期状态下血液循环中免疫细胞的数量)、和/或阻止脑部血管内的免疫细胞穿越血脑屏障(尤其是穿越受损的血脑屏障)，等等。本文中，免疫细胞包括中性粒细胞，单核-巨噬细胞，淋巴细胞，如t、b淋巴细胞(简称t、b细胞)，自然杀伤细胞，等等。本文中，溶栓时间窗是指各国权威医学指南所述的急性脑梗死能够接受溶栓的最长时间。优选地，本申请将该溶栓时间窗延长为超过发病后4.5小时。在具体实施方案中，本申请将该溶栓时间窗延长为发病后4.5～6小时，更优选为发病后4.8～6.0小时，或为发病后5.0～6.0小时，或为发病后5.0～5.7小时。本文中，优选的脑梗死溶栓治疗是rtpa溶栓治疗。本文中，治疗起点是指开始治疗的时间，表示为从发病时到开始治疗时所经历的时间。例如，rtpa治疗起点是从发病开始起算，到给予rtpa溶栓药物时所经历的时间；又例如，芬戈莫德治疗起点为300分钟，是指从发病开始起算，到第300分钟之时给予芬戈莫德。本文中，缺血半暗带挽救体积是指，治疗开始后某个时间点(例如24小时之时)的缺血半暗带体积减去治疗起点时的缺血半暗带体积的差值，以毫升(ml)表示。本申请人发现，给急性脑梗死患者施用保护缺血半暗带的药物，结果缺血半暗带挽救体积相比于未用药患者显著增加(图3)，相应的预后结果也显著更好(图4)。在一个具体实施方案中，本申请的保护缺血半暗带的免疫调节剂是减少血液循环中淋巴细胞数量的化合物。其能延长脑梗死的溶栓时间窗。在一个更具体实施方案中，减少血液循环中淋巴细胞的数量是通过限制淋巴细胞从次级淋巴器官迁入血液来实现的。已知表达在淋巴细胞表面的s1p受体可介导淋巴细胞从次级淋巴器官迁出而进入血循环。本申请人确认，s1p受体的调节剂能有效保护脑梗死患者缺血半暗带，抑制梗死核心灶扩大，从而为rtpa静脉溶栓争取可挽救的脑组织和可挽救的时间。故本申请的保护缺血半暗带的免疫调节剂优选是s1p受体调节剂。根据本申请，s1p受体调节剂能延长脑梗死的溶栓时间窗。s1p受体调节剂通过阻止淋巴细胞从淋巴器官进入血液循环，使血液循环中的淋巴细胞数量减少，能够随血流到达脑部的淋巴细胞也减少，脑部血管内有可能穿越血脑屏障的细胞也减少，攻击缺血半暗带或在缺血半暗带区域引发其他不利效果的细胞减少，则缺血半暗带细胞的存活机会增加，存活时间可能延长，这就为溶栓争取了时间。本文中，“s1p受体”与“s1pr”可互换使用。已知s1p受体有5种亚型(s1p1～s1p5)，其中s1p1(也即s1pr1)、s1p2(也即s1pr2)、s1p3(也即s1pr3)可见于心脏组织。s1p4(也即s1pr4)强烈地表达于淋巴和造血系统的多种细胞中。本文中，“s1p受体调节剂”是调节s1p受体活性的化合物。所述“调节”包括激动作用，相应地，s1p受体调节剂包括s1p受体激动剂。s1p受体调节剂的例子有，芬戈莫德(fingolimod)，siponimod(作用于s1p1、s1p5)，amiselimod(作用于s1p1)，ozanimod(作用于s1p1)，ponesimod(作用于s1p1)，等。其中，只有芬戈莫德已获批能用于人体。因此，本文所述的临床试验采用芬戈莫德作为s1p受体调节剂的例子。但本领域技术人员能想到，其它的s1p受体调节剂也能发挥本申请中芬戈莫德所示的作用，例如保护缺血半暗带的作用、延长溶栓时间窗的作用，等等。相应地，本申请的s1p受体调节剂优选为芬戈莫德(亦称“fty720”)，即2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]-1,3-丙二醇盐酸盐，cas登记号为162359-56-0。它最初是由冬虫夏草(子囊菌亚门赤僵菌)培养液提取的抗生素成分myriocin(isp-i)经化学修饰后合成。它是鞘氨醇的结构类似物，在体内可与淋巴细胞表面的s1p受体结合，诱导受体内陷，从而抑制s1p介导的淋巴细胞迁移，使淋巴细胞停留、甚至回迁淋巴结而远离中枢神经系统(cns)，达到免疫调节效果。芬戈莫德还可作用于神经血管单元的细胞如内皮细胞、星形胶质细胞等，增加血脑屏障的致密性，调整星形胶质细胞的功能而促进组织修复。由于其也能作用于s1p3受体，可降低心率，并因此可能影响脑部血液供应，这大大限制了其应用。本申请人意外发现，对于发病时间超过4.5小时的脑梗死患者，先给予口服芬戈莫德，然后进行rtpa静脉溶栓，结果有效挽救了更多的缺血半暗带，抑制了梗死体积的扩大，改善了患者神经功能缺损症状。这证明，缺血后早期给予s1p受体调节剂可有效保护缺血半暗带和冻结梗死核心灶的扩大，使得更多可挽救的脑组织的存活时间得以延长，提高了在现有时间窗之外应用rtpa的安全性和疗效。因此，本申请涉及用保护缺血半暗带的化合物与溶栓联合治疗脑梗死的方法，包括先给予保护缺血半暗带的化合物，再进行溶栓，其中所述溶栓是在发病4.5小时以后进行。无论是保护缺血半暗带的化合物，还是溶栓药物，原则上都是越早施用越好。例如保护缺血半暗带的化合物如果已知没有严重副作用，可以在接诊当时立即给患者施用，尽早发挥其保护效果。优选保护缺血半暗带的化合物是口服给予。给予保护缺血半暗带的化合物之后，要间隔多长时间才施用溶栓药物，取决于就医流程所能达到的效率。当检测手段改进或溶栓标准发生变化，使得甄别符合溶栓条件的患者所需的时间特别短，保护缺血半暗带的化合物也能与溶栓药物同时给予，或仅间隔几分钟到十几分钟后给予。优选地，本申请所述的联合治疗是s1p受体调节剂与rtpa的联合。本申请明确了鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂对于脑缺血后急性期微循环血流灌注障碍所导致的缺血半暗带坏死具有缓解作用，该缓解作用能与rtpa静脉溶栓作用组合，对错过rtpa溶栓时间窗的患者进行治疗。本申请还涉及抑制血液循环中免疫细胞进入脑中的化合物用于挽救缺血半暗带的用途。本申请还涉及抑制血液循环中免疫细胞进入脑中的化合物用于制备挽救缺血半暗带的药物的用途。所述抑制可以是，抑制淋巴细胞从淋巴器官进入血液循环、和/或减少血液循环中免疫细胞的数量(尤其是减少急性期状态下血液循环中免疫细胞的数量)、和/或阻止脑部血管内的免疫细胞穿越血脑屏障(尤其是穿越受损的血脑屏障)，等等。优选地，所述抑制血液循环中免疫细胞进入脑中的化合物是s1p受体调节剂。更优选地，所述s1p受体调节剂是芬戈莫德。在具体实施方案中，本申请收治的脑梗死患者是发病后4.5小时至6小时期间接受溶栓的患者。相应地，本申请提供了针对发病4.5小时后的缺血性脑卒中患者的新药物组合疗法，所述疗法通过提前施用保护缺血半暗带的免疫调节剂，使得患者能安全溶栓的时间比现已知的4.5小时延长，例如延长到发病后4.5～6小时、或发病后4.8～6.0小时、或发病后5.0～6.0小时、或发病后5.0～5.7小时。本申请的免疫调节剂优选制成口服制剂，例如胶囊剂，片剂或颗粒剂。在芬戈莫德的情形下，本申请的每日有效剂量优选为0.25～1.5mg，更优选为0.5mg。本领域普通技术人员可以根据具体情况，选择合适的剂量。本申请扩大了鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂和rtpa的临床适应症，揭示了缺血半暗带的缩小是限制rtpa超过时间窗应用有效性的事实，本申请制备的药物组合对脑梗死损伤疗效显著，具有突出的推广前景。附图说明图1是本申请的临床试验流程图。如图所示，患者在发病后3.5～5小时期间、发病后1天和2天时，共3次施用芬戈莫德；在发病后4.5～6小时期间施用rtpa；在发病后施用芬戈莫德之前，以及发病后1、3、7、90天时进行临床评估(美国国立卫生院卒中评分，nihss)；在发病后施用芬戈莫德之前，以及发病后1、3、7天时接受流式细胞术分析以检测外周血的免疫细胞；在发病后施用芬戈莫德之前，以及发病后1天、7天时接受影像检查。图2a-2d是患者服用芬戈莫德后外周血免疫细胞数的变化，是取同组所有患者该细胞数的均值：(a)cd4+t细胞；(b)cd8+t细胞；(c)cd19+b细胞；(d)nk细胞。图3是对照组、rtpa组、芬戈莫德联合rtpa组分别在发病后24小时之时的缺血半暗带体积。图4是对照组、rtpa组、芬戈莫德联合rtpa组分别在发病后24小时之时的nihss评分与基线期nihss的比较。图5是对照组、rtpa组、芬戈莫德联合rtpa组分别在基线期、发病后24小时之时(“24小时”)、发病后第7天(“7天”)的病灶位置和缺血半暗带影像图。基线期和24小时的图中用最深黑表示的区域为梗死区，与该区域邻近的用亮白表示的区域为缺血半暗带。第7天的图中框出的区域是虽然血流恢复但功能未完全恢复的区域。实施例1.受试者33例已发病4.5至6小时的首发前循环脑梗死患者，nihss超过4分，且无心律失常、无黄斑水肿、未患有肿瘤及未应用免疫抑制剂的患者作为实验对象。表1.患者基线期临床和影像特征2、治疗将患者分成以下组：(1)对照组，接受标准脑梗死治疗(阿司匹林或者氯吡格雷抗血小板，他汀类药物调脂，并用药物控制血糖及血压，具体参见美国aha/asa指南)；(2)rtpa组，即rtpa单独用药组，接受标准rtpa溶栓治疗(0.9mg/kg体重，前10％静脉推注，剩余90％在1小时内静脉输入)，但不接受芬戈莫德治疗；(3)芬戈莫德联合rtpa组，接受标准rtpa溶栓治疗+芬戈莫德治疗(有效成分0.5mg/天，连续服用3天)。治疗开始于基线影像扫描后且不晚于发病后6小时。具体地，对照组10例患者从发病时起算的开始治疗时间是：244.6±56.8分钟，rtpa组10例患者从发病时起算的开始治疗时间是：319.6±28.0分钟，芬戈莫德联合rtpa组13例患者从发病时起算的开始治疗时间是：320.9±15.6分钟。首次服药前和服药后1、3、7天，用流式细胞术对患者外周血淋巴细胞亚群进行计数，还进行神经功能残障nih卒中评分、以及评价残疾程度的改良rankin评分。影像方面，在发病后24小时之时进行多模态ct扫描，以便评价缺血半暗带挽救情况；另在发病后7天时复查患者的头部非增强ct，以便对梗死体积进行评价。整个治疗流程见图1的例示。3、结果1)服用芬戈莫德对脑梗死患者外周血淋巴细胞亚群的影响如图2所示，芬戈莫德联合rtpa组患者在首次服药后1天至3天，外周血中cd4+t、cd8+t、b、和自然杀伤(nk)细胞的数目明显低于对照组和rtpa组，表明芬戈莫德抑制血液中免疫细胞的作用未受rtpa用药的影响。2)芬戈莫德联合rtpa对脑梗死患者缺血半暗带的挽救作用如图3所示，芬戈莫德联合rtpa组的患者在24小时之时缺血半暗带的挽救体积(66.8±42.5ml)明显大于rtpa组(30.9±38.9ml,p＝0.045)和对照组(1.4±40.2ml,p＝0.001)。表2.芬戈莫德联合rtpa组的细节：病例编号芬戈莫德治疗起点(min)rtpa治疗起点(min)1280.03402270.03403260.03304265.03305240.03006230.03207240.03008245.03009240.032010265.033011240.030012270.033013265.03303)芬戈莫德联合rtpa对脑梗死患者临床评分的影响如图4和表3所示，在发病后24小时之时，芬戈莫德联合rtpa组患者的神经功能缺损症状明显减轻，表现为nihss评分改善明显优于rtpa组(3.4±2.5vs1.1±2.8,p＝0.04)和对照组(3.4±2.5vs-1.2±2.3,p<0.001)。此外，芬戈莫德联合rtpa治疗促进了神经功能的康复，3个月良好康复(改良rankin评分0-1)的比例高于对照组(39％vs20％,p＝0.405)和rtpa组(39％vs10％,p＝0.179)。表3.患者临床结局4)芬戈莫德联合rtpa对患者影像学指标的影响如图5所示，芬戈莫德联合rtpa治疗使得基线期的缺血半暗带(亮白色区域)在发病后24小时之时得以保护，避免进一步进展为梗死灶(最深黑色区域)，并使得最终梗死体积明显小于对照组和rtpa组。更具体地，开始治疗的24小时后，对照组病例绝大部分缺血半暗带都进展为梗死区；rtpa组病例的缺血半暗带波及区域比开始治疗时缩小，说明溶栓起到了一定疗效，但梗死区仍然是比开始治疗时扩大了；芬戈莫德联合rtpa组病例则无论梗死区还是缺血半暗带都缩小了，大部分病灶区域血流得以恢复。可见，芬戈莫德对于脑梗死早期微循环障碍所导致的缺血半暗带细胞的死亡有显著的治疗效果；通过保护早期缺血半暗带的缩小，冻结梗死核心灶的扩大，可以为rtpa溶栓治疗争取时间，扩展了rtpa的溶栓时间窗。芬戈莫德与rtpa组合，通过抑制脑缺血后早期脑微循环的炎性环境，保护了微循环功能，延缓了缺血半暗带神经细胞的死亡，延长了缺血半暗带细胞的存活时间，抑制了梗死核心区的扩大，为再灌注治疗赢得了时间，促进了再灌注的治疗效果，同时还减轻了再灌注损伤。这种组合可保护更多的脑组织不进展为梗死灶，改善患者神经功能缺损症状并促进康复。以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12