本发明涉及医药领域，具体涉及一种丹参酮iia衍生物在制备缺血性脑卒中药物中的应用，该化合物对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
背景技术：
：近年来，随着我国老龄化的加快，脑血管疾病的发病率呈逐年上升的趋势。脑血管疾病绝大多数是由缺血引起的脑卒中，即中风，严重危害着人类的健康。目前，临床上对于缺血性脑卒中的主要处理原则是：及时恢复血管的血流再灌注，改善脑的血液循环，增加缺血区血液和氧的供应，其主要目的是挽救缺血半暗带区尚存的神经元，减少脑梗死的面积。(appelboomg，strozykd，meyerspm，higashidart(2010)currentrecommendationsforendovascularinterventionsinthetreatmentofischemicstroke.curratherosclerrep12：244-250.)但是，在大量的临床和实验研究中发现了一系列反常现象，对缺血组织的再灌注可能会加重组织器官的损伤和功能障碍，对机体形成二次打击，即所谓的缺血再灌注损伤，如心脏手术、冠脉搭桥、脏器血供梗塞后再通、器官移植以及休克脏器低灌流纠正后都可能发生再灌注损伤。截止目前，临床上使用的所有的针对缺血性脑卒中的治疗策略都存在缺陷，因此，寻找新的安全有效的治疗药物和其他策略显得尤为重要。丹参为唇形科植物丹参(salviamiltiorrhizabge.)的干燥根和根茎，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。丹参中含有十余种活性单体成分，其中丹参酮iia是其主要的有效活性成分。丹参酮iia具有多种药理学作用，包括抗肿瘤，抗氧化，抗炎症，抗菌，扩血管，心肌修复及降血脂等作用。也有文献报道，丹参酮iia对脑缺血再灌注损伤具有保护作用(丹参酮iia对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究，陈晏林)，但丹参酮iia对大鼠脑缺血再灌注损伤的脑保护作用不是很显著。而且，丹参酮iia因其结构的原因，水溶性差，导致生物利用度低，进一步减弱了对于脑缺血再灌注损伤的保护作用。技术实现要素：本发明提供了一种丹参酮iia衍生物在制备心脑血管药物中的应用，具体涉及对脑缺血再灌注所致的脑梗死及脑水肿的保护作用，以解决丹参酮iia水溶性差，生物利用度低，以及对脑缺血再灌注所致的脑梗死及脑水肿的保护作用不显著的问题。本发明所述的丹参酮iia衍生物具有如式(i)所示的结构，其中，x为丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸，以及两种氨基酸组成的二肽；peg的平均分子量为600、800、1000、1500、2000、4000、6000、8000、10000、20000。本发明以peg为载体，通过共价键与丹参酮iia连接，所得的化合物显著改善了丹参酮iia的水溶性，增加生物利用度。合成的化合物经神经元mtt筛选，选取能显著提高造模后神经元细胞的存活率的几个化合物，经进一步药理实验证明，这几个化合物对于脑缺血再灌注损伤具有保护作用，并且活性显著优于先导化合物丹参酮iia以及阳性对照药金纳多，具有显著的进步。结合以往相关的研究基础，采用sd(spraguedawley)大鼠的中脑动脉闭塞(mcao)动物模型，通过神经功能评分、梗塞率以及脑含水量的测试对上述丹参酮iia衍生物的脑缺血再灌注损伤保护作用进行评价。结果表明，丹参酮iia衍生物能不同程度明显改善脑缺血损伤大鼠的神经功能，有的效果优于金纳多阳性药，且成剂量依赖性。同时，丹参酮iia衍生物能显著改善mcao大鼠脑梗死和脑水肿的情况，个别化合物的高剂量组的改善效果优于金纳多阳性药。本发明所述的药物由有效量的活性成分式(i)化合物与一种或多种药学上可接受的载体制成药物组合物。本发明所述的药物组合物为临床上任何可接受的剂型，包括口服及肠胃外给药形式的各种剂型，如片剂、胶囊、口服液、糖尿、颗粒、滴丸；水针、冻干粉针、无菌粉针、输液。所述片剂为口崩片、缓释片、控释片；所述缓释胶囊、控释胶囊；所述药学上可接受的载体选自填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、表面活性剂、吸附载体；溶剂、抗氧剂、助溶剂、吸附剂、渗透压调节剂、ph调节剂。本发明的剂型可使用药物制剂工艺学中惯常使用的任何方法生产，没有特别限制。具体实施方式下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的表述，但是本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。下面通过药效学试验来进一步说明本发明的效果。实施例1：丹参酮iia衍生物初筛实验一、试验方法1、大鼠原代皮层神经元细胞氧糖剥夺/复氧(ogd/r)模型的建立在低糖dmem培养基中加入的连二亚硫酸钠(na2s2o4)干粉充分溶解，使终浓度20mm，用nahco3调ph为7.2，即为缺氧液。原代皮层神经元细胞在24孔板细胞培养板中培养7-10天，选取生长状态良好的细胞进行实验。给药前轻轻吸去24孔板中的培养基，用pbs缓冲液洗涤2次后，用含药培养基继续培养。实验共包括空白对照组、模型对照组、丹参酮iia衍生物组、丹参酮iia组。24h后去除含药的培养基，置换成缺氧液，空白对照组中加入等体积的维持培养基(neurobasalmedia49ml+b27-supplement1ml)。将培养基在培养箱中孵育2h后完全去除上清液，用pbs缓冲液洗涤两次后加入维持培养基。再次放入37℃，5％co2孵箱中继续培养2h后，造模完成，神经元细胞可用于实验。2、药物对神经元缺氧、复氧损伤后存活率的影响造模后将细胞培养板置于倒置显微镜下观察皮层神经元细胞的生长及细胞损伤情况。除去24孔板内的培养基，加入维持培养基450μl后每孔再加入mtt溶液(5mg/ml)50μl，放入37℃孵育4h。弃含mtt的培养基之后，每孔加入dmso液200μl，放在摇床上震荡10min。从每孔中取出150μl移至96孔板中，在酶标仪490nm处测定各孔的od值，以od值反映细胞的存活情况。实验重复3次。二、试验结果神经元细胞缺氧/复氧损伤后，模型组神经元细胞存活率和空白组相比极显著性降低(p＜0.01)。与模型组相比，丹参酮iia衍生物组和丹参酮iia可极显著性升高造模后神经元细胞的存活率。根据以上结果，选取效果较好的化合物w-1～w-5(如表1所示)进行进一步的脑缺血再灌注损伤保护的测试。表1神经元mtt初筛所得化合物化合物xpegw-1甘氨酸2000w-2缬氨酸4000w-3丙氨酸2000w-4丙氨酸4000w-5丙氨酸8000实施例2：丹参酮iia衍生物对脑缺血再灌注损伤保护作用的测定一、实验目的：建立sd大鼠mcao动物模型，观察受试药w-1～w-5对脑缺血再灌注所致的脑梗死及脑水肿的保护作用。二、实验方法1.大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型造模手术前24h禁食不禁水。参考longa等人的方法，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞(mcao)模型：大鼠用3％水合三氯乙醛(300mg/kg)腹腔注射(ip)麻醉，仰卧手术台上，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁乳突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪断颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉。在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用。然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将渔线(长40mm，直径0.26mm)经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，当渔线进入颈内动脉后松开颈内动脉上的动脉夹。以颈总动脉分叉处为标记，推进18mm左右时感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了mca的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。1.5小时后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成mcao导致局灶性脑缺血再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞mca。2.动物分组及给药实验分为4大组，每大组术后随机分为6组。分别为伪手术组(shamgroup)、模型组、金纳多(16mg/kg)及丹参酮iia衍生物高(16mg/kg)、中(8mg/kg)、低(4mg/kg)剂量组，给药容量为0.2ml/100g。存活小鼠术后立即尾静脉注射给药，伪手术组和模型组给予生理盐水，其他各组给予相应药物，连续给药3天。3.观察指标(1)神经功能评分按bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准如下：0分：未观察到神经症状；1分：提尾悬空时，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁；2分：将动物置于光滑平面上，推手术侧肩向对侧移动时，阻力降低；3分：动物自由行走时向手术对侧环转或转圈；4分；软瘫，肢体无自发活动。(2)脑梗死体积的测量断头处死大鼠，取出全脑，称重。在视交叉及其前后各2mm处，做冠状切四刀，切成五片后迅速将脑片置5ml含有1％ttc的磷酸缓冲溶液中，避光温孵30min，在温孵过程中每隔7～8min翻动一次，温孵30min后取出脑片，用数码相机拍照，之后用眼科镊分离苍白区(梗塞区)和非苍白区(正常区)，计算梗塞百分比如下：梗塞百分比(％)＝苍白区重量/(苍白区重量+非苍白区重量)×100％(3)脑含水量的测量将染色后的脑组织置于110℃烘箱烘干，对照大脑湿重求出脑含水量如下：脑组织含水量(％)＝(1-脑组织干重/脑组织湿重)×100％三、实验结果(1)神经功能评分如表2所示，手术造模后，与模型组相比，w-1～w-5给药组均能不同程度明显改善脑缺血损伤大鼠的神经功能。对比模型组，金纳多阳性药组和w-1，w-3，w-4中、高剂量组都极显著的降低神经行为学评分，表示w-1，w-3，w-4中、高剂量极显著的改善脑缺血损伤大鼠的神经功能。w-1～w-5高剂量作用均优于金纳多阳性药，以w-3的效果最为显著。(*p＜0.05，**p＜0.01，对比模型组；##p＜0.01，对比金纳多阳性药组)表2w-1～w-5对大鼠局灶性脑缺血神经功能的影响(2)脑梗死体积的测量表3所示，大鼠mcao手术后，手术侧脑组织经ttc染色后出现明显的梗死体积，正常脑组织染色后呈现红色，梗死区域不能着色，呈现脂肪样油白色。依次为假手术组，模型组，阳性药组，w-1～w-5低、中、高组。在给药三天后，同模型组相比，阳性药组以及w-1～w-5各剂量组均极显著的改善mcao大鼠脑梗死的情况，与此同时，在金纳多阳性药和w-1～w-5的比较中，w-1～w-5高剂量作用均优于金纳多阳性药，以w-3的效果最为显著。(**p＜0.01，对比模型组；##p＜0.01，对比金纳多阳性药组)。表3w-1～w-5对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的影响(3)脑含水量的测量脑缺血后血脑屏障被破坏，血脑屏障通透性增加，脑含水量增加。表4所示，给药三天后，同模型组相比，阳性药组以及w-1～w-5各剂量组均极显著的改善mcao大鼠脑水肿的情况，与此同时，在金纳多阳性药和w-1～w-5的比较中，w-1～w-5高剂量作用均优于金纳多阳性药，说明w-1～w-5对于脑缺血后的血脑屏障的破坏具有一定的减轻和改善作用，且w-3的作用效果最显著。(**p＜0.01，对比模型组；##p＜0.01，对比金纳多阳性药组)表4w-1～w-5对大鼠脑局灶性缺血后脑含水量的影响当前第1页12