一种石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于分子生物学及免疫学领域，具体涉及到一种具有免疫保护性的新加坡石斑鱼虹彩病毒重组主要衣壳蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：
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石斑鱼是一种经济价值高的海洋鱼类。近年来沿海石斑鱼养殖规模扩大,但养殖环境日益恶化，各种病害特别是病毒性疾病频繁爆发，造成了重大的经济损失。虹彩病毒是石斑鱼的重要致病病原，它可以造成鱼类的死亡率从30％(成鱼中)到100％(幼苗阶段)。这种病毒在亚洲，特别是在25℃以上的高水温时，极易感染东亚和南亚等区域养殖的海水名贵鱼类，如石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、牙鲆和大黄鱼等，致使鱼类大量死亡，造成严重经济损失。新加坡石斑鱼虹彩病毒(singaporegrouperiridovirus，sgiv)是从养殖的石斑鱼中分离到的一株新的虹彩病毒，可导致石斑鱼幼苗死亡率达90％以上，给石斑鱼的养殖带来巨大的经济损失。因此，如何防治虹彩病毒病已成为当今石斑鱼养殖业急需解决的重要问题。

众所周知，疫苗作为化学药品和抗生素的替代品，是治疗疾病、特别是病毒病的最好选择。疫苗接种是防治病毒曼延的有效手段，包括灭活疫苗、dna核酸疫苗、减毒疫苗和重组蛋白亚单位疫苗等。针对石斑鱼虹彩病毒sgiv，已经开发出全病毒灭活疫苗、dna核酸疫苗。制备全病毒灭活疫苗需要进行细胞培养、病毒扩增，对细胞培养技术、设备使用及培养基、材料如血清等消耗要求较高；由于在制备全病毒灭活疫苗过程中可能存在病毒抗原丢失、抗原结构被破坏而造成免疫效果不稳定。dna核酸疫苗虽然制备比较简单，且可产生持久免疫应答，但核酸dna可能诱导产生自身免疫反应，持续表达外源抗原，可能导致机体对该抗原产生免疫耐受。重组蛋白亚单位疫苗绝对不含活毒成分，生产和使用过程无散毒可能，消除了污染的可能性，且免疫特异性强、重复性较好，可以通过发酵大规模生产，成本较低，是值得积极推广使用的安全疫苗。随着分子生物学技术的发展，对病毒基因结构与功能的研究深入，研制基因工程重组蛋白亚单位疫苗日趋成熟，是国内外发展的主要方向，已经广泛应用于多种人和动物疫苗的生产。目前没有针对新加坡石斑鱼虹彩病毒sgiv的重组亚单位疫苗报道。因此急需研发该病毒的重组亚单位疫苗产品，能够在低成本条件下大规模生产应用，快速、安全、有效预防控制该病毒的传播，从而保障石斑鱼养殖业的健康发展。

技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供一种疫苗稳定，保护率高的石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗。

本发明的石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗，其特征在于，所述的石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗是seqidno.1所示的核苷酸序列编码的多肽。

进一步优选，所述的seqidno.1所示的核苷酸序列编码的多肽与佐剂氢氧化铝混合形成石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗。

本发明的第二个目的是提供一种石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，将seqidno.1所示的核苷酸序列转入到表达载体中，再将此表达载体转入宿主菌中，表达seqidno.1所示的核苷酸序列编码的多肽，然后纯化收集此多肽，即得石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗。

优选，所述的表达载体为质粒pet-32a。

优选，所述的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)。

进一步优先，所述的石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗是通过以下方法制备的：

1)质粒pet-32a-vp72的构建：将质粒pet-32a用bamhi/xhoi酶切，回收5.9kb片段；以新加坡石斑鱼虹彩病毒sgiv基因组dna为模板，用引物vp72-f和vp72-r进行pcr扩增，产物纯化后用bamhi/xhoi酶切，回收1.1kb片段，将其与上述5.9kb片段连接，连接液转化大肠杆菌dh5α后在含氨苄青霉素的lb固体培养基上培养，并筛选转化子提取质粒，即为质粒pet32a-vp72；

所述引物vp72-f为5’-taaggatccatgcaagagttttcggtcgg-3’，引物vp72-r为5’-aatctcgagtggacattgttacagtgatgctagc-3’；

2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pet-32a-vp72转化大肠杆菌bl21(de3)，得转化子bl21/pet32a-vp72；将bl21/pet32a-vp72于含有氨苄青霉素的lb液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养液加入新鲜的lb液体培养基中，于37℃培养至od600为0.6，加入终浓度为0.8mm的iptg并于16℃继续培养6h，然后在离心后菌液中加入pbs缓冲液，采用超声波破碎菌体1-2小时，将菌体破碎液离心，回收上清；将上清液采用蛋白沉淀结合amylose树脂纯化方法,即得seqidno.1所示的核苷酸序列编码的多肽，即为石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗。

进一步优先，所述的步骤2)中的将菌体破碎液离心，回收上清，将上清液采用蛋白沉淀结合amylose树脂纯化方法是先采用质量分数30％的硫酸铵溶液沉淀杂蛋白，然后将菌体破碎液的上清用质量分数40％的硫酸铵溶液沉淀目的蛋白，将沉淀的目的蛋白与amylose柱结合2h后，用20个柱体积的过柱缓冲液洗脱杂蛋白，然后用10mm麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，收集初次和二次10mm麦芽糖溶液洗脱的蛋白，即得seqidno.1核苷酸序列编码的多肽，即为石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗。

本发明的第三个目的是提供seqidno.1所示的核苷酸序列编码的多肽在制备石斑鱼彩虹病毒的疫苗中的应用。

所述的石斑鱼彩虹病毒的疫苗为新加坡石斑鱼彩虹病毒的疫苗。

本发明的免疫保护性重组蛋白rvp72(seqidno.1所示的核苷酸序列编码的多肽)，或重组蛋白rvp72与氢氧化铝佐剂混合，所得为疫苗混合液，具有对新加坡石斑鱼虹彩病毒sgiv免疫保护的作用。将所述疫苗注射于石斑鱼的体内，30天后，注射sgiv病毒，观察、统计石斑鱼死亡率，并计算疫苗的相对保护率。结果表明，rvp72的相对保护率为56％，rvp72蛋白与氢氧化铝佐剂混合配伍后的相对保护率达到68％。

所述每毫升疫苗或疫苗混合液中含免疫保护性亚单位疫苗蛋白(免疫保护性重组蛋白rvp72)200μg；所述注射石斑鱼体内的亚单位疫苗或疫苗混合液为100μl。

本发明具有如下优点：

1.所述的bl21/pet-vp72重组菌可规模发酵培养，发酵菌体生物量可达湿重25g/l，经过细胞破碎、纯化，得到rvp72重组蛋白约250mg/l，纯度90％以上。所述生产疫苗简单方便、成本较低，产品安全，无毒、无污染、无扩散，且方便保存。

2.所述亚单位疫苗稳定，保护率较高。本发明的重组亚单位疫苗对石斑鱼的免疫保护效率达56％。

3.商业化佐剂氢氧化铝可以提高免疫保护效果。本发明的疫苗应用时添加氢氧化铝佐剂可以提高对石斑鱼的免疫保护效率达68％。

附图说明：

图1是疫苗蛋白rvp72的原核表达产物的纯化；

图2是重组亚单位疫苗rvp72对新加坡石斑鱼虹彩病毒sgiv的相对保护率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、dna(pcr)产物纯化、dna片段从凝胶中回收、细菌基因组dna提取皆使用“axygen爱思进生物技术(杭州)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、dna连接液转化进入大肠杆菌皆用hanahan方法(sambrookandrussell：molecularcloning：alaboratorymannual.coldspringharborlaboratorypress2001)；

所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“takara宝生物工程(大连)有限公司”。

实施例1

免疫保护性亚单位疫苗由序列表seqidno.1所示的vp72碱基序列所编码。

免疫保护性亚单位疫苗的制备方法：

1)质粒pet32a-vp72的构建

将质粒pet32(美国novagen)用bamhi/xhoi酶切，回收5.9kb片段。以自主分离保存的新加坡石斑鱼虹彩病毒sgivdna为模板，用引物vp72-f：5’-taaggatccatgcaagagttttcggtcgg-3’，引物vp72-r:5’-aatctcgagtggacattgttacagtgatgctagc-3’按下列条件进行pcr扩增vp72碱基序列(seqidno.1所示)，具体pcr条件是：95℃180s预变性模板dna，然后94℃30s，55℃60s，72℃60s，35个循环后，再在72℃延伸反应10min。pcr产物纯化后用bamhii/xhoi酶切，回收1.1kb片段，与上述5.9kb片段连接，连接后转化大肠杆菌dh5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的lb固体培养基上培养12-24小时，筛选转化子，培养，提取质粒，即为质粒pet32a-vp72(经测序确认seqidno.1所示的核苷酸序列插入到质粒pet32中，由此得到质粒pet32a-vp72)；所述lb固体培养基组成成分为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂10g/l。

2)疫苗蛋白rvp72的诱导表达和纯化

将上述步骤1)的质粒pet32a-vp72用常规方法转化大肠杆菌bl21(de3)(购自于天根生化科技有限公司，北京)，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb固体培养基上培养12-24小时，而后筛选抗氨苄青霉素的转化子，挑取一个转化子，将其命名为bl21/pet32a-vp72。将bl21/pet32a-vp72接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液将其加入100ml新鲜的含有氨苄青霉素(100μg/ml)的lb液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至od600为0.6，加入终浓度为0.8mm的isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside(iptg)，16℃继续以转速180rpm摇动培养6h，而后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，用pbs缓冲液重悬，超声波破碎1-2h，再次离心(5000g，4℃，10min)，收集上清液。将上清液先采用低浓度的硫酸铵(质量分数30％)溶液沉淀杂蛋白，收集上清，然后将菌体破碎液的上清用质量分数40％的硫酸铵溶液沉淀目的蛋白，收集沉淀。将沉淀的目的蛋白与amylose柱结合2h后，用20个柱体积的过柱缓冲液洗脱杂蛋白，然后用10mm麦芽糖溶液洗脱目的蛋白。通过sds-page电泳检测蛋白纯化情况，结果见图1。收集初次和二次10mm麦芽糖溶液洗脱的蛋白，即得序列表seqidno.1中的碱基序列所编码的免疫保护性亚单位疫苗蛋白，命名为亚单位疫苗蛋白rvp72。

实施例2

重组亚单位疫苗的免疫应用

步骤1)亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液的制备。

亚单位疫苗蛋白混合液：将实施例1纯化的亚单位疫苗蛋白rvp72(250mg/l，纯度90％以上)用pbs缓冲液调整为每升缓冲液中含200mg序列表seqidno1中的碱基序列编码的疫苗蛋白溶液(即含200mg亚单位疫苗蛋白rvp72/l)，得到亚单位疫苗蛋白混合液；

亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液：将实施例1纯化的亚单位疫苗蛋白rvp72(250mg/l，纯度90％以上)与氢氧化铝溶液混合均匀，用pbs缓冲液调整为每升缓冲液中含200mg序列表seqidno.1中的碱基序列编码的疫苗蛋白(亚单位疫苗蛋白rvp72)8及0.1mg/ml氢氧化铝的混合液(即含200mg亚单位疫苗蛋白rvp72/l和0.1mg/ml氢氧化铝)，得到亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液。

步骤2)重组亚单位疫苗的免疫应用。

将150条石斑鱼(每条重约5-8g)随机分为3组，每组50条。将这3组分别命名为a、b和c组。将a组每条鱼分别腹腔注射100μl上述步骤1)的含疫苗蛋白(200mg/l)的溶液[即步骤1)的亚单位疫苗蛋白混合液]，b组每条鱼分别腹腔注射100μl疫苗蛋白(200mg/l)与佐剂的混合液[即步骤1)的亚单位疫苗蛋白及佐剂混合液]。c组每条鱼分别腹腔注射100μlpbs缓冲溶液。a、b组为试验组，c组为对照组。

步骤3)重组亚单位疫苗针对新加坡石斑鱼虹彩病毒sgiv的免疫保护效果检测。

上述步骤2)疫苗免疫石斑鱼30天后，将a、b、c三组的每条鱼分别腹腔注射100μl新加坡石斑鱼虹彩病毒sgiv(tcid50＝2.0×10⁷)；15天内，观察a、b、c三组石斑鱼的死亡情况，统计疫苗保护率(见图2，其中vp72代表亚单位疫苗蛋白rvp72，vp72+氢氧化铝代表亚单位疫苗蛋白rvp72+佐剂氢氧化铝)。结果表明亚单位疫苗蛋白rvp72的相对保护率为56％，而亚单位疫苗蛋白rvp72与氢氧化铝佐剂配伍后的相对保护率达到68％，对照(c组)的相对保护率为0。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一种石斑鱼虹彩病毒的亚单位疫苗及其制备方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1062

<212>dna

<213>新加坡石斑鱼虹彩病毒(singaporegrouperiridovirus)

<400>1

atgcaagagttttcggtcggggttcccaggtcgggcgattacgtgctcaacgcctggctc60

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