本发明涉及动物药理实验技术领域，更具体的说是涉及一种新型磁微粒集聚脑缺血动物模型的构建方法。
背景技术：
短暂性脑缺血发作(tta)是颈动脉或椎-基底动脉系统发生短暂性血液供应不足，引起局灶性脑缺血导致突发的、短暂性、可逆性神经功能障碍。发作持续数分钟，通常在30分钟内完全恢复，超过2小时常遗留轻微神经功能缺损表现，或ct及mri显示脑组织缺血征象。tia好发于34～65岁，65岁以上占25.3％，男性多于女性。发病突然，多在体位改变、活动过度、颈部突然转动或屈伸等情况下发病。发病无先兆，有一过性的神经系统定位体征。一般无意识障碍，历时5～20分钟，可反复发作，但一般在24小时内完全恢复，无后遗症，颈内动脉系统的tia最常见的症状为单瘫、偏瘫、偏身感觉障碍、失语、单眼视力障碍等，亦可出现同向性偏盲等。主要表现：单眼突然出现一过性黑蒙，或视力丧失，或白色闪烁，或视野缺损，或复视，持续数分钟可恢复。对侧肢体轻度偏瘫或偏身感觉异常。优势半球受损出现一过性的失语或失用或失读或失写，或同时面肌、舌肌无力。偶有同侧偏盲。其中单眼突然出现一过性黑蒙是颈内动脉分支眼动脉缺血的特征性症状。短暂的精神症状和意识障碍偶亦可见。
在临床实验中通过建立脑缺血动物模型进行研究脑缺血对机体所造成影响，但是现有技术中，目前多用麻醉动物，在通过外科手段压迫或者截断来制作脑缺血动物模型，其对血栓形成的模拟与实际不符，同时其对血管可能造成直接损伤，死亡率较高，操作复杂，个体变异大，其操作不具有可逆性，由于短暂性脑缺血具有多次复发的可能，无法建立一个可持续性的脑缺血动物模型。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种新型磁微粒集聚脑缺血动物模型的构建方法，能够高度吻合脑缺血的症状，对动物模型损伤较小，其动物模型构建的死亡率较低。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种新型磁微粒集聚脑缺血动物模型的构建方法，该方法步骤如下，
(1)取带有磁性的纳米颗粒配置成的缓冲液，将该缓冲液注射至动物活体内；
(2)将动物模型称重、麻醉；
(3)将动物模型的四肢固定和手术准备；
(4)将动物模型取3cm颈部正中切口，依次暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉；
(5)在颈内动脉包绕软性线状磁条；
(6)在缺血2h后，再次麻醉动物，解开取出线形磁条，缝合组织切口；
(7)恢复血液灌注24h。
作为本发明的进一步改进，磁性颗粒包裹有惰性材料。
作为本发明的进一步改进，所述磁性纳米颗粒为小于150nm的金属磁性纳米颗粒。
作为本发明的进一步改进，所述惰性材料为聚乙二醇、葡萄糖或葡聚糖。
作为本发明的进一步改进，所述聚乙二醇的分子量为1000-2000。
作为本发明的进一步改进，所述磁性颗粒在包裹惰性材料后的颗粒大小为100-200nm。
作为本发明的进一步改进，所述磁性颗粒在缓冲液的浓度为5-20mg/ml。
作为本发明的进一步改进，所述步骤一中的缓冲液的注射方式为：颈动脉注射，根据体重计算注射总剂量80-150ug/g。
作为本发明的进一步改进，在建模过程中实时监控动物模型的肛温，保持大鼠的肛温在36.5-37.5℃。
本发明的有益效果为：通过在动物模型的颈动脉上包裹软性线性磁铁，并灌注含有磁性纳米颗粒的缓冲液，含有磁性纳米颗粒的缓冲液在体内循环，在经过放置磁体条的颈动脉位置时形成栓塞，并可以通过调节磁条的磁性来设定栓塞的程度，整体建模时间短，避免传统脑缺血模型对血管的直接损失，对动物模型的伤害程度低，提高了动物模型的建模成功率，并且其栓塞形成的物理原理与实际形成栓塞的物理原理接近，能更好的模拟活体脑血管栓塞对机体的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明做进一步的详述。
1.实验材料：
1.1动物材料
选择sd大鼠，雄性，断奶鼠(出生第21天)，从复旦大学医学院动物中心购得。动物购回后，随机分组，分笼饲养。饲养期间保持安静舒适的环境，让其自由饮水和进食。实验开始前的两天实验者每天上下午各抚摸、抓握大鼠一次，并让大鼠适应实验装置及所用器，以求尽可能排除实验环境对大鼠造成的应激刺激、确保实验结果的准确性。
在饲养到鼠龄120±10天时，选用体重230±30g的大鼠。
1.2主要试剂
75％酒精、碘伏、10％水合氯醛(或戊巴比妥钠)、、1％肝素、氯化三苯基四氮唑(triphenylterazoliumchloride，ttc)、pbs；
1.3主要仪器
大鼠板、绑线(线绳)、软性线状磁条、粗剪刀、手术刀、止血钳、眼科剪、眼科弯镊、外科剪、外科镊，玻璃分针，医用干棉球或纱布块、5ml注射器、酒精灯、石蜡、烧杯、平皿、毛细滴管、剃须刀片、角针、弯盘、自制拉钩、乳胶手套、劳动手套及长皮手
1.4实验仪器
切片机：leicacm1800。
恒温毯：alc-htp
电热恒温干燥箱：jkdp-1型。
电子天平：tianfudt-200a。
显微镜及配套数码相机：olmpusix71。
2.方法：
2.1软性线性磁条的制作
市售直径0.28mm软性磁条，准确切取6cm，镜下观断端平齐钝圆后，每2cm做一标记，置75％酒精浸泡10min，头端蘸取热融的石蜡使其光滑呈球型，置1％肝素浸泡备用。
2.2含有磁性纳米颗粒的缓冲溶液的制备
选用fe、co、ni磁性纳米颗粒或者四氧化三铁磁性纳米颗粒或者三氧化二铁磁性纳米颗粒，优选选用直径大小为小于150的金属磁性纳米颗粒，其金属磁性纳米颗粒外层裹覆有惰性材料，可以采用聚乙二醇、葡萄糖或葡聚糖，优选的采用分子量为1000-2000的聚乙二醇，裹覆惰性材料后的金属磁性纳米颗粒的颗粒大小为100-200nm，置75％酒精浸泡10min后，生理盐水冲洗，并通过和生理盐水配比成5-20mg/ml，优选的配置为10mg/ml，配置好的缓冲溶液，磁性纳米颗粒其颗粒均匀，在缓冲液中的分散良好。
2.3本发明模型制作
(1)称量大鼠体重，根据大鼠体重对其颈动脉注射上述配置的含有磁性纳米颗粒的缓冲溶液80-150ug/g，必要时也可以选择颈静脉或者尾静脉注射；
(2).根据体重计算麻醉所需剂量(3ml/kg)，配制10％水合氯醛麻醉药，给药方式采取腹腔注射麻醉，待角膜反射消失及麻醉充分，将大鼠采取仰卧姿势固定于鼠板，四肢使用医用胶布轻柔固定。取无菌清洁棉花球擦拭口腔并清除呼吸道分泌物；
(3).用组织镊拉出大鼠的舌头并置于口角一侧，以防止舌后坠影响大鼠呼吸。手术操作区域剃毛备皮、碘伏消毒，取3cm颈部正中切口，依次钝性分离颈部皮下组织，按照解剖顺序暴露左侧颈总动脉(cca)、颈外动脉(eca)和颈内动脉(ica)，用拉钩固定手术切口。暴露目标血管时，手法轻柔谨慎，避免周围其他组织、血管、神经及甲状腺、甲状旁腺的损伤。
(4).将软性线状磁条环状包绕颈内动脉ica，以贴近血管包绕，不造成压迫为宜。控制造模时间于20分钟内完成。
(5).缺血2h，随后再次用10％水合氯醛腹腔注射麻醉动物，轻微解开线形磁条，缓慢轻柔取出，再重新缝合组织切口，碘伏消毒，恢复血液灌注24h，监控其脑循环。
在缺血期间以及恢复血液灌注24h内，所有动物进行肛温实时监测，保持大鼠的肛温在36.5-37.5℃之间，通过恒温毯或者恒温箱控制以提高大鼠的存活率。
2.4空白对照组的制备
其他操作一样，灌注等量的含有磁性纳米颗粒的缓冲液，将软性线状磁条替换为软性橡胶条。
2.5线栓法大鼠脑缺血模型的制备
(1).线栓制备：市售单股直径0.28mm鱼线，准确切取6cm，镜下观断端平齐钝圆后，每2cm做一标记，置75％酒精浸泡10min，头端蘸取热融的石蜡使其光滑呈球型，置1％肝素浸泡备用。
(2)手术操作
大鼠腹腔注射10％的水合氯醛(3ml/kg)，背位固定后颈部剪毛消毒，取颈正中切口，钝性分离右颈总动脉(cca)，颈内动脉(ica)和颈外动脉(eca)并挂线备用，结扎eca和cca，用动脉夹夹闭ica远心端后，迅速于cca上做一切口，从切口插入上述备好的鱼线，线插入ica后，打开夹闭ica的动脉夹，轻柔送线接近18mm处(分叉处到大脑中动脉的解剖)，有阻力则止，固定栓线，2h后轻拔鱼线，扎紧ica，缝合皮肤。
将本发明的建模方法作为实验组一，线栓法的建模方法为实验组二，实验组一、实验组二和空白对比组分别选用12只大鼠，实验组一的死亡率为91.7％，实验组二的死亡率为50％，空白组的死亡率为91.7％
3.神经功能缺陷评分
参考longa及bederson的5分制法在动物麻醉清醒后24h进行评分。
0分：无神经损伤症状；
1分：不能完全伸展对侧前爪；
2分：向对侧转圈；
3分：向对侧倾倒；
4分：不能自发行走，意识丧失。
分值越高，说明动物行为障碍越严重。
模型成功的标准为：躯体向左侧屈曲，右侧前爪伸长强于左侧，尾弯向左侧；提尾悬空时呈强迫性体态。
症状2-3分的死亡率高，1-2分的死亡率低，有的大鼠第二天或几天后可无明显症状，但取脑后还是有梗死灶的。
4.实验结果
参照longa及bederson的5分制法。评分0分(无神经损伤症状)可视为造模失败，死亡的大鼠同样视为造模失败，这两类评分的大鼠均剔除，其余分值动物均纳入实验。
实验组一除去死亡的大鼠，剩余11只大鼠参照longa及bederson的5分制法的评分结果分别为：1、1、1、2、1、3、2、1、1、1、1，模型成功率为83.3％，
实验组二除去死亡的大鼠，剩余6只大鼠参照longa及bederson的5分制法的评分结果分别为：2、4、2、3、2、4，模型成功率为25％，
空白对照组除去死亡的大鼠，剩余11只大鼠参照longa及bederson的5分制法的评分结果为0、0、0、0、0、0、0、0、0、0、0，模型成功率为0％。
通过以上实验数据可以得出含有磁性颗粒的缓冲液不影响血液循环，实验组一的建模成功率较高，并且建模成功的动物模型的评分无显著性差异，实验组二的建模成功率较低，并且建模成功的动物模型的评分显著性差异较大。
5.脑缺血动物模型的应用
通过以下实验观察脑缺血动物模型的体损伤程度：
ttc(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色：大鼠缺血2h再灌注24h后立即断头取脑，快速冷冻后，由前向后共切取5张脑片，厚度约为2mm，置于2％ttc溶液中37℃孵育30min，严格避光，每隔5min摇动一次，最后置10％多聚甲醛液中固定，后通过显微镜观察，来观察栓塞后动物模型的脑梗死体积，对脑缺血对机体的伤害有进一步更加准确直观的了解，能够更好的应用到教学实验或者新药研发药物实验中。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。