聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物、及其载药纳米粒子和制备方法与流程

本发明涉及一种纳米制剂，具体涉及一种聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素，尤其还涉及聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子的制备方法、载药聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子和制备方法。

背景技术

纳米粒子载药系统是药物递送系统(drugdeliverysystem，dds)中最重要的一个组成部分，因为其具有诸多优势，如增加难溶性药物的溶解度和稳定性，体内给药后实现药物的缓释和控释，以及基于epr效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect)的“被动靶向”作用，因此在生物医药领域得到了广泛的应用。由两亲性高分子在水中通过自组装形成的聚合物胶束纳米粒子是一种非常有潜力的载药纳米粒子，除具有纳米载药系统的所有优点之外，还可以将所需要的治疗剂包封或缀合在其基质内，故容易达到联合用药的目的。

研制纳米粒子载药系统的关键在于制备纳米粒子的材料的选择。在已经报道过的作为药物载体的纳米粒子所用材料中，壳聚糖(cs)由于其聚阳离子结构以及无毒性，可生物降解性和生物相容性等特点，受到广泛的研究与关注。但是，由于壳聚糖中大量氨基的存在，导致其仅溶于酸性水溶液，壳聚糖的低水溶性是限制其应用的主要因素(jnanopartres,2014,16:2312)，因此需要良好的改性剂对其进行修饰，提高其溶解性，改善其性能。亲水性的peg(聚乙二醇)作为纳米粒子的表面改性剂受到越来越多的应用，将材料进行peg修饰能在纳米粒子表面形成致密的构象云，使纳米粒子具有良好的生物相容性，形成立体位阻保护微粒不被血液中的调理素识别，逃避网状内皮系统的吞噬，延长纳米粒子在体液中的循环时间(advhealthcmater,2014,3(9):1439–1447.)。并且已经有相关研究将peg接枝在壳聚糖的氨基上(中国专利：cn103877585)。

姜黄素(cur)是一种来自中药姜黄中的天然二酚类化合物，已被证明其能够调控癌细胞生长，炎症，侵袭，细胞凋亡和细胞死亡的细胞内信号传导通路，揭示其抗癌潜能(drugdiscovtoday,2012,17:71-80.)。最近的证据表明，姜黄素是一种高度多功能的分子，具有多效抗肿瘤作用，抑制多种肿瘤细胞的增殖(biochempharmacol,2008,75:787-809.)。然而，姜黄素在水性介质中的低溶解度和高分解速率，是其生物利用度和临床疗效的主要障碍。作为一种解决方法，已经尝试将其包封在几种药物递送系统中。yallapu等人总结了作为姜黄素递送平台的纳米制剂，作为未来治疗癌症的纳米药物(drugdiscovtoday,2012,17:71-80.)。但大多是将姜黄素包封在纳米粒子基质中，并不能够阻止姜黄素在血液中的部分释放从而被分解。

技术实现要素：

基于此，有必要针对现有的姜黄素递送平台的纳米制剂并不能够阻止姜黄素在血液中的部分释放的问题，提供一种聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物、及其载药纳米粒子和制备方法。

一种聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物，结构式如式(i)所示：

进一步地，聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物为聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子。

一种聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物的制备方法，包括以下步骤：

将姜黄素与琥珀酸酐反应生成羧基化姜黄素。

将羧基化姜黄素的羧基活化后，与壳聚糖溶液反应生成姜黄素-壳聚糖聚合物。

将羧基化聚乙二醇的羧基活化后与姜黄素-壳聚糖聚合物的乙酸溶液在保护气体氛围下搅拌反应48h～96h，纯化得到聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物。

进一步地，将姜黄素与琥珀酸酐反应生成羧基化姜黄素的步骤具体为：

将姜黄素与琥珀酸酐溶解于二甲基亚砜中，加入催化剂4-二甲氨基吡啶，在60℃下搅拌反应24～48h，将反应液滴入冷乙醚中，边滴边搅拌，析出黄色沉淀，分离并洗涤黄色沉淀，将得到的黄色固体在常温下真空干燥，即得羧基化姜黄素。优选的，姜黄素，琥珀酸酐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1.2：1。

进一步地，将羧基化姜黄素的羧基活化后，与壳聚糖溶液反应生成姜黄素-壳聚糖聚合物的步骤具体为：

羧基化姜黄素和4-二甲氨基吡啶溶解于二甲基亚砜或n，n’-二甲基甲酰亚胺中，室温下搅拌反应2h，使羧基化姜黄素的羧基活化。

将壳聚糖溶于1％的乙酸水溶液中，将羧基化姜黄素的羧基化溶液滴入到壳聚糖溶液中，在保护气体氛围下继续搅拌反应48h～96h，然后将得到的悬浮液滴入到乙醇中，分离并洗涤沉淀，干燥，即得姜黄素-壳聚糖聚合物。

优选的壳聚糖的分子量为50000～200000。

优选的羧基化姜黄素与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：1，羧基化姜黄素与壳聚糖单元的摩尔比为1：4。

进一步地，将羧基化聚乙二醇的羧基活化的步骤具体为：

将聚乙二醇、琥珀酸酐和4-二甲氨基吡啶溶于二氯乙烷中，在常温下搅拌反应48小时。然后将反应液滴到到无水乙醚中，在-20℃放置至析出白色沉淀，分离并洗涤沉淀，干燥，得到羧基化聚乙二醇。优选的，聚乙二醇、琥珀酸酐和4-二甲氨基吡啶的摩尔配比为1：2：1。

将羧基化聚乙二醇、n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于二甲基亚砜或n，n’-二甲基甲酰亚胺中，室温下搅拌反应2h，使羧基化聚乙二醇的羧基活化。优选的羧基化聚乙二醇，n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔配比为1：1：1.2，羧基化聚乙二醇与壳聚糖中氨基的摩尔比为1：10。

进一步地，纯化聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物的步骤具体为：

将羧基化聚乙二醇的羧基活化液与姜黄素-壳聚糖聚合物乙酸溶液的反应悬浮液滴入二氯乙烷和甲醇混合液中，析出沉淀，分离沉淀，并用二氯乙烷/甲醇洗涤，将固体加入到二氯乙烷和甲醇混合液中，离心清除上清液，用去离子水漂洗沉淀，冷冻干燥后得到聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物。

进一步地，还包括将聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物制备聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子的步骤，具体为：

将聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物溶解在1％的乙酸水溶液中，在截留分子量为12-14kda的条件下，加入纯水透析，通过6次换水，透析24小时以除去溶剂。然后对溶液超声波处理3次，脉冲开两秒，关两秒，再通过0.45μm的微孔滤膜过滤，得到聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子。

一种载药聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子，包括上述的聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物的纳米粒子和负载其上的抗癌药物，优选的，抗癌药物为疏水性抗癌药物，更优的，疏水性抗癌药物为米托蒽醌、多柔比星、表柔比星、全反式维甲酸、紫杉醇或甲氨蝶呤。

一种载药聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

将抗癌药物溶解于n，n’-二甲基甲酰亚胺中，聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子溶解于乙酸水溶液中，在截留分子量为12-14kda的条件下避光透析，再通过0.45μm的微孔滤膜过滤，得到载药聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子。优选的，透析过程为：每次加500ml纯水，前3h每1h换水一次，后6h每2h换水一次。

上述的聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物，将姜黄素作为疏水基团接枝到纳米粒子的骨架材料上，帮助形成纳米粒子，形成姜黄素的新剂型，并且作为其他疏水性抗癌药的载体，达到联合用药的目的。

附图说明

图1为姜黄素(a),聚乙二醇(b),壳聚糖(c),姜黄素-壳聚糖聚合物(d)和聚

图2为姜黄素,聚乙二醇,壳聚糖,姜黄素-壳聚糖聚合物和聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物的核磁共振氢谱图；

图3为pccnp的尺寸分布图。

图4为pccnp的zeta电位分布图。

图5为pccnp的透射电镜图。

图6为在pccmnp在ph为7.4，6.8和4.0的缓冲液中的mto和cur的药物释放图。

图7为pccmnp和游离的mto对肝癌hepg2细胞的体外存活率的影响图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一种聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物，结构式如式(i)所示：

在聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物中，姜黄素作为疏水基团接枝到该聚合物上，其为该聚合物结构的一部分，而并非简单包封在聚合物中，因而其结构稳定，不容易因在血液中的部分释放而被分解，因而可更好的发挥姜黄素自身的药效。并且姜黄素作为疏水基团有助于该聚合物形成纳米粒子，负载喜树碱及其衍生物，多柔比星，表柔比星等抗肿瘤药物，达到联合用药的目的进而增强药效。

上述的聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物，将姜黄素作为疏水基团接枝到纳米粒子的骨架材料上，帮助形成纳米粒子，形成姜黄素的新剂型，并且作为其他疏水性抗癌药的载体，达到联合用药的目的。

进一步地，聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物为聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子。

聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物中存在细小的纳米离子，将其分离即聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子(pccnp)，从而形成姜黄素的新剂型，并且其可以作为其他疏水性抗癌药物的载体，实现对药物的控缓释。聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子具有良好的生物相容性，以及长循环和逃避网状内皮系统吞噬的功能。该纳米粒子可作为递送姜黄素和其他疏水性抗肿瘤药物的共同递送系统(co-deliverysystem,cds),达到联合用药的目的，可以通过调节不同的信号途径改善治疗，同时，这种策略有助于最大限度地减少多药耐药发生，协同抑制肿瘤生长。所述的pccnp的平均粒径为137.4nm，平均zeta电位为34.4mv。

一种聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物的制备方法，包括以下步骤：

将姜黄素与琥珀酸酐反应生成羧基化姜黄素。

将羧基化姜黄素的羧基活化后，与壳聚糖溶液反应生成姜黄素-壳聚糖聚合物。

将羧基化聚乙二醇的羧基活化后与姜黄素-壳聚糖聚合物的乙酸溶液在保护气体氛围下搅拌反应48h～96h，纯化得到聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物。

本发明提供的一种聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子是以聚乙二醇(mpeg)，琥珀酸酐(sa)，壳聚糖，姜黄素为原料，摩尔比为1：1.2的姜黄素与丁二酸酐反应先合成羧基化姜黄素(curs)，在催化剂的存在下，羧基化姜黄素再与壳聚糖反应生成姜黄素-壳聚糖聚合物(ccs)。摩尔比为1：2的聚乙二醇与丁二酸酐反应生成羧基化聚乙二醇(mpegs)，在催化剂的存在下，羧基化聚乙二醇与姜黄素-壳聚糖聚合物反应生成聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物(pcc)。pcc是两亲性高分子，可以在水中通过自组装形成聚合物胶束纳米粒子。壳聚糖的分子量为50000～200000，该分子量范围的壳聚糖有助于合适大小的纳米粒子。

本发明所述的聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子的制备方法包括的具体步骤如下：反应物的配比主要关系到疏水取代度，只有药物的疏水取代度在一定范围内，才能自组装成纳米粒子，而反应物投料比又跟疏水取代度有关。本发明的各种反应步骤及催化剂的投料比正是基于此设计的，从而获得合适疏水取代度以在水中自组装成纳米粒子。

1)羧基化姜黄素(curs)的合成：将姜黄素与琥珀酸酐溶解于二甲基亚砜(dmso)中，加入催化剂4-二甲氨基吡啶(dmap)，在60℃下搅拌反应24～48h，将反应液滴入适量冷乙醚中，边滴边搅拌，析出黄色沉淀，抽滤后用冷乙醚进行三次洗涤，将得到的黄色固体在常温下真空干燥，即得curs。其中，cur，sa和dmap的摩尔比为1：1.2：1。

2)姜黄素-壳聚糖聚合物(ccs)的合成：将curs和dmap溶解于适量的二甲基亚砜(dmso)或n，n’-二甲基甲酰亚胺(dmf)中。室温下搅拌反应2h，使curs的羧基活化。将壳聚糖溶于1％的乙酸水溶液中，将上述curs反应液滴入到壳聚糖溶液中，在氮气保护下继续搅拌反应48h～96h。然后将得到的悬浮液滴入到无水乙醇中，析出沉淀，抽滤，然后分别用无水乙醇，四氢呋喃和乙醚洗涤产物。将得到的凝胶状固体在常温下真空干燥，即得ccs聚合物。其中，curs与dmap的摩尔配比为1：1，curs与壳聚糖单元的摩尔比为1：4。

3)羧基化聚乙二醇(mpegs)的合成：将mpeg2000，琥珀酸酐和dmap溶于适量二氯乙烷(dce)中，在常温下搅拌反应48小时。然后将反应液滴到到无水乙醚中，在-20℃放置过夜，析出白色沉淀，用冷乙醚洗涤3次。真空干燥后即得到mpegs。其中，mpeg2000,sa和dmap的摩尔配比为1：2：1。

4)聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物(pcc)的合成：将mpegs，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc-hcl)溶于适量的dmso或dmf中，室温下搅拌反应2h，使mpegs的羧基活化。将制备的ccs溶于1％的乙酸水溶液中，将上述mpegs反应液滴入到壳聚糖溶液中，氮气保护下继续搅拌反应48h～96h。

将得到的悬浮液滴入dce/甲醇(体积比：4:1)中，析出沉淀，抽滤，并用dce/甲醇(体积比：4:1)洗涤三次。然后将固体加入到适量的dce/甲醇(体积比：4:1)中，在每分钟8500轮(rpm)离心10分钟后，清除上清液，以除去未反应的任何杂质，用去离子水漂洗沉淀，冷冻干燥后得到pcc聚合物。

其中，pegs，nhs和edc的摩尔配比为1：1：1.2，pegs与壳聚糖中氨基的摩尔比为1：10。

此时，聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物制备完成。当需要制备聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子时则需要进行步骤5)。

5)聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子(pccnp)的制备：将少量pcc聚合物溶解在适量的1％的乙酸水溶液中，将溶液转移到截留分子量为12-14kda的透析袋中，每次用1000ml蒸馏水透析，通过6次换水，透析24小时以除去dmso或dmf。然后用的探针式超声波仪器在100w下将溶液超声波处理3次，脉冲开两秒，关两秒，以防止超声处理时的热积聚。接下来通过用0.45μm膜过滤除去较大尺寸的聚集的pccnp，便得到pccnp。

一种载药聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子，包括上述的聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物的纳米粒子和负载其上的抗癌药物，优选的，抗癌药物为疏水性抗癌药物，更优的，疏水性抗癌药物为米托蒽醌、多柔比星、表柔比星、全反式维甲酸、紫杉醇或甲氨蝶呤。

一种载药聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

将抗癌药物溶解于n，n’-二甲基甲酰亚胺中，聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子溶解于乙酸水溶液中，在截留分子量为12-14kda的条件下避光透析，再通过0.45μm的微孔滤膜过滤，得到载药聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子。优选的，透析过程为：每次加500ml纯水，前3h每1h换水一次，后6h每2h换水一次。

实施例1：聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物(pcc)的化学合成

其合成路线为：

1)姜黄素-壳聚糖(ccs)聚合物的合成

取cur2g(5.4mmol)，sa0.65g(6.5mmol)和dmap0.66g(5.4mmol)溶解于20mldmso中，在50～60℃下搅拌反应48h。将反应液滴入到100ml冷乙醚中，边滴边搅拌，析出黄色沉淀，抽滤，每次用50ml冷乙醚洗涤，进行三次。得到的黄色固体在常温下真空干燥，即得到黄色的curs纯品。取0.72gcurs和0.20gdmap溶解于10mldmso中，室温下搅拌2h以活化curs。称取壳聚糖1.0g溶解于10ml1％的乙酸水溶液中(curs与壳聚糖单元的摩尔比约为1：4)，将活化的curs反应液滴入到壳聚糖溶液中，向反应瓶中充入氮气，密封，搅拌反应72h。将得到的混悬液滴入200ml无水乙醇中，析出淡黄色沉淀，抽滤，分别用50ml无水乙醇，四氢呋喃和乙醚进行洗涤，到得凝胶状淡黄色固体，在常温下真空干燥后即得到ccs聚合物。

2)聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素聚合物(pcc)的合成

取mpeg20005g(2.5mmol)，sa0.5g(5.0mmol)和dmap0.30g(2.5mmol)溶于20ml二氯乙烷(dce)中，在室温下搅拌反应48h，停止反应，将反应液滴加到100ml无水乙醚中，在-20℃下放置过夜，析出白色固体，抽滤，用冷乙醚洗涤三次，常温下真空干燥即得mpegs纯品；取mpegs1.0g，nhs0.055g和edc-hcl0.1g溶于10mldmso，室温下搅拌活化两小时。取上述制备的ccs聚合物的4/5溶于10ml1％的乙酸水溶液中(pegs与壳聚糖单元的摩尔比约为1：10)，将活化的mpegs反应液滴入到ccs溶液中，氮气保护下搅拌反应72h。得到的悬浮液滴入150mldce/甲醇(体积比：4:1)中，析出沉淀，抽滤，并用50mldce/甲醇(体积比：4:1)洗涤，进行三次。然后将固体加入到30ml的dce/甲醇(体积比：4:1)中，在每分钟8500轮(rpm)离心10分钟，清除上清液，以除去未反应的任何杂质，用少量去离子水漂洗沉淀，冷冻干燥后得到pcc聚合物。

实施例2：cur、mpeg、cs,ccs和pcc聚合物的ftir光谱测定

取少量固体cur、mpeg、cs,ccs和pcc与红外干燥的溴化钾粉末均匀混合(质量比约为1：200)，仔细研磨后，压成透明的样品薄膜，置于红外光谱仪中测定红外光谱。

(a)cur，(b)mpeg，(c)cs，(d)ccs和(e)pcc聚合物的ftir光谱见图1。与cur(图1a)和cs(图1b)相比，ccs(图1c)的红外谱图保持了在1558cm-1的特征吸收峰，此峰来自于cs中1597cm-1处-nh2的n-h键，并且在1728cm-1处出现了一个较强的峰，此峰是cur与cs之间形成的酯键中的c＝o键伸缩振动峰，说明cur与cs之间成功的酯化反应。在pcc(图1e)的图谱中，在1634cm-1处出现了mpeg与ccs反应形成的酰胺键的c＝o伸缩振动峰，并且在2887cm-1处保持了mpeg的特征吸收峰，此峰是mpeg中众多ch2的c-h伸缩振动峰，说明了mpeg成功接枝在cs的氨基上。以上结果共同说明，通过在cs高度反应性的羟基的和氨基位置分别接枝cur和peg，成功得到pcc两亲性聚合物。

实施例3：cur、mpeg、cs,ccs和pcc聚合物的1hnmr光谱测定

取少量cur、mpeg固体溶于0.5mldmso-d6,取少量cs，ccs，pcc固体溶于0.606mlcd3cood/d2o中(1％,v/v)，移入核磁管中，置于500mhz的核磁共振仪中进行扫场记录，得到核磁共振氢谱图。

图2显示了cur，cs，mpeg，ccs和pcc的¹hnmr光谱。k，l和o在3.00ppm处的特征峰分别对应于cs，ccs和pcc中的单糖残基(ch-nh-)质子。在ccs的¹hnmr光谱中，2.54ppm处的特征峰(m)对应于cs和cur之间的琥珀酸酐连接臂中的亚甲基质子(ch2)，表明cur分子已经成功地与cs结合。在pcc的¹hnmr光谱中，3.57～3.52ppm范围内的增强峰(n)对应于mpeg的重复乙基(-ch2-ch2-o-)，而在2.49ppm处显着增强的峰(p)对应于mpeg和cs之间以及cur和cs之间的琥珀酸酐连接臂中的亚甲基(ch2)质子。两个峰(n，p)表明mpeg被移植到cs。¹hnmr谱的结果再一次验证了pcc聚合物的成功合成。

实施例4：聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素自聚集纳米粒子(pccnp)的制备

将10mgpcc聚合物溶解在5ml的1％的乙酸水溶液中，将溶液转移到截留分子量为12-14kda的透析袋中，用蒸馏水进行透析，每次用1000ml蒸馏水透析，通过6次换水，透析24小时后以除去dmf。然后，用100w的探针式超声波仪器将溶液超声波处理3次，脉冲开两秒，关两秒，以防止超声处理时的热积聚。接下来通过用0.45μm的微孔滤膜过滤除去较大尺寸的聚集的pccnp，便得到pccnp。

图3显示，动态光散射下pccnp的粒径呈单峰分布，平均粒径为137.4nm。图4显示,zeta电位也呈单峰分布，平均zeta电位为34.4mv，带正电荷。将一滴pccnp溶液滴于铜网，2％磷乌酸染色，置于tem中观察。pccnp的tem照片如图5所示，可以看出，pccnp的形态为球型，表面覆盖一层由亲水性的peg形成的构象云。

实施例5：负载疏水性抗癌药物的聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子的制备

将4mg米托蒽醌(mto)溶解于5mldmf中，40mgpcc聚合物溶解于1％的乙酸水溶液中，然后转入截留分子量为12-14kda的透析袋中避光透析，每次加500ml蒸馏水，前3h每1h换水一次，后6h每2h换水一次。接下来通过用0.45μm过滤膜过滤，即得到负载mto的聚乙二醇-壳聚糖-姜黄素纳米粒子(pccmnp)。动态光散射仪测得其平均粒径为183.1nm，平均zeta电位为34.0mv。

取3mgpccmnp冻干制剂溶于0.5mldmso中，超声2分钟。用酶标仪在608nm和425nm处分别测量溶液吸光度，计算mto和cur的浓度，从而计算出药物的含量。mto的包封效率(ee)和负载能力(lcm)和cur的负载能力(lcc)计算如下：

pccmnp的表征结果见于下表。pccmnp对mto具有较高的包封效效率，减少了对药物的浪费。对cur与mto均具有比较强的负载能力，为该np体内给药后达到应有的血药浓度提供了保障。pccmnp的尺寸在183.1nm左右，这种尺寸的np在肝脏组织中有最好的倾向性富集。zeta电位在+34.0mv左右，能够增加np的细胞摄取。

表1：

实施例6：体外药物释放实验

将适量的pccmnp冻干制剂分散在装有pbs缓冲溶液的透析管(截留分子量为8-12kda)中，并在37℃，100rpm摇动下，在ph7.4,6.8或4.0的25mlpbs释放培养基中透析。对照组用游离的mto在相同条件下透析。以等时间间隔(tn，n＝0,0.5,1,2,4,8,12,24和48h)对释放介质进行取样，每次取样2ml，同时加入2ml相同的新鲜介质。所取的样品通过酶标仪分别在608nm和425nm测量其吸光度，然后计算mto和cur的含量，药物释放百分比(q％)如下计算。

其中w是np重量，cn是时间tn时的药物浓度，v是释放介质的总体积，vn是样品体积(2ml)，ci是时间ti时的样品浓度(i＝0,0.5,1,…,n小时，v0和c0都等于0)。

pccmnp中mto与cur在不同ph环境下的体外释放曲线见于图6。对于mto的释放，游离的mto在8小时内完全释放，而pccmnp则显示出两个阶段的释放曲线，在10小时内快速释放，随后在48小时内持续释放，在10小时内快速释放的mto可能来自于表面吸附的mto，随后的48小时则是封装的mto缓慢释放，说明pccmnp具有良好的缓释效果。pccmnp在48h积累的mto释放量，ph为7.4环境下是47.54％，ph为6.8环境下是59.96％，ph为4.0环境下是69.65％，说明mto的释放对环境的ph具有一定的依赖性。

对于cur的释放，几乎只能在ph为4.0换几个下才能检测到较为明显的释放，在ph6.8和ph7.4时，cur释放接近零。这符合我们的期望，因为cur的释放需要酸性环境促进cs与cur之间酯键的水解，但我们肯定np若被肿瘤细胞摄取，则会在细胞内特定的酸性环境和水解酶的作用下，导致cur的完全释放，当然这可能需要一定的时间。因此这样一种策略极大程度的改善了传统姜黄素剂型的不足。

实施例7：体外细胞毒性实验

将人肝癌细胞系hepg2培养于补充有10％胎牛血清(fbs)和100u青霉素-链霉素的dulbecco's改良的eagle培养基(dmem)中，置于含有95％空气和5％co2的潮湿气氛的37℃培养箱中孵育。使用dmso溶解pccmnp冻干制剂和游离的mto以制备储存溶液(mto的浓度为20mg/ml)，用dmem培养基进一步稀释以达到所需的mto浓度(0.125,0.25,0.5,1.0，2.0μg/ml)。实验培养基中dmso的终浓度小于0.5％(v/v)，不影响细胞活性。根据pccmnp对mto负载量计算pccmnp中mto的质量[表1]。

使用mtt法测定pccmnp的细胞毒性。将hepg2细胞以20000个细胞/孔接种在96孔板中并孵育过夜，细胞达到s型曲线生长。然后用上述制备的pccmnp和游离mto溶液处理。药物孵育24h后，取出培养基。然后向每个孔中加入100ulmtt(0.5mg/ml，溶解在pbs中)，将细胞在37℃下孵育4小时。之后，弃去培养基，向各孔中加入100μldmso，彻底溶解后。通过紫外分光光度法在490nm处测量吸光度。无细胞培养基的吸光度为空白。以未经处理的细胞的存活率记为100％，计算药物处理的细胞存活率的百分比。

游离mto与pccmnp体外孵育hepg2细胞24h后的细胞存活率见于图7。显示pccmnp具有比游离mto更高的细胞毒性(p<0.05)，这是因为pccmnp同时负载了mto和cur，两种药物在细胞外和细胞内释放后，可以协同抑制肿瘤细胞。因此本发明提供的pccnp，可以同时负载姜黄素和米托蒽醌，具有比单一用药更高的细胞毒性，达到联合用药的目的，是一种优良的共同递送系统。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。