本发明涉及抗乳腺癌药物，尤其涉及胡黄连苷ii在抗乳腺癌药物中的应用。
背景技术：
乳腺癌是女性中最常被诊断出的、主要导致癌死亡的恶性肿瘤之一。有学者认为，乳腺癌将成为影响女性健康的主要因素。据世界卫生组织国际癌症研究中心统计，2012年，乳腺癌新发病例约占癌症总发病人数的25.1％(1,671,149例)；死亡人数占癌症总死亡人数的14.7％(521,907例)。与其他许多国家情况相似，乳腺癌已成为中国女性中最为常见的恶性肿瘤。据统计，中国每年新增的乳腺癌病例约占全球乳腺癌病例总数的12.2％(187,213例)，而死亡人数约占总数的9.6％(47,984例)。尽管随着治疗手段的不断改进，患者生存率有所改善，但其死亡率仍然居高不下。
癌转移的发生是导致乳腺癌病人死亡的主要原因。乳腺癌细胞因具有极强的转移能力，容易转移到全身各个器官，故一旦发生转移就极难治愈，导致预后不良。据报道，乳腺癌转移病人的五年生存率低于25％，而晚期乳腺癌患者的平均存活时间约为18～30个月。当前，现有的治疗手段对转移性乳腺癌的治疗具有一定的局限性，临床上也尚未有有效治疗肿瘤转移的药物，已有的化疗及放疗手段起到的作用也较为有限。因此，为了提高病人的存活率，改善病人生活质量，急需建立能够有效应对乳腺癌转移的诊治方案，开发能够有效抑制乳腺癌转移的特异性药物，以确保能够在癌细胞转移发生前或转移早期对其进行检测，并进行及时治疗。
目前，临床上常用的治疗癌症的手段主要有手术、放疗、化疗。这三种治疗手段的疗效固然显著，但对人体都会产生不同程度的损伤或毒副作用。采用西医的化学合成药物来治疗癌症，疗效显著，但是容易产生耐药性，使其在临床的应用受到限制。因此，寻找开发新的、高效的抗肿瘤药物已经刻不容缓。中药因其具有良好的治疗效果、不良反应少、遗传毒性低以及不易产生耐药性等特点，而受到广泛关注。现今，许多用于临床的药物，如紫杉醇、羟基喜树碱等，都直接或间接的来源于天然药物。有研究表明，传统中草药能够有效改善乳腺癌患者病情，提高患者的生活质量。因此，从中药中开发寻找新的抗肿瘤药物具有广阔的前景。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胡黄连苷ii在抗乳腺癌药物中的应用，胡黄连苷ii能够有效抑制乳腺癌细胞的转移和生长，为临床治疗乳腺癌提供了一种新思路。
本发明的具体技术方案为：胡黄连苷ii在抗乳腺癌药物中的应用，所述抗乳腺癌药物中含有胡黄连苷ii。
胡黄连苷ii在抗乳腺癌转移药物中的应用，所述抗乳腺癌转移药物中含有胡黄连苷ii。
肿瘤转移主要指恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的过程。目前抗肿瘤转移药物的研究主要针对肿瘤转移的各个环节来开发寻找具有不同药理作用的药物。研究较多的有抑制癌细胞粘附、抑制癌细胞运动、抑制蛋白水解酶对基底膜降解、抑制肿瘤新生血管形成、抗血管内凝聚以及抗信号转导的制剂等。其中细胞粘附分子、基质金属蛋白酶、新生血管生成因子等是当前抗肿瘤转移药物研究的热点。前期血管生成抑制剂tnp-470、钙通道拮抗剂cai和金属蛋白抑制剂bb94进入临床研究，为癌侵袭、转移治疗的突破带来了希望。
天然来源的抗肿瘤侵袭和转移药物的研究越来越受到医学界的关注，中药单体成分姜黄素、莪术醇、β-榄香烯等以其疗效确切、毒副作用小、不易产生耐药等优势，现已成为防治肿瘤侵袭转移药物研究与开发的热点。此外，已有研究证明清热解毒药、补益药、化湿利水药、活血化瘀药等都表现出抑制肿瘤细胞转移的作用，而大部分药物的作用机制与抑制癌细胞迁移、抑制细胞外基质的降解、抑制细胞粘附和肿瘤血管生成等有关。中药为抗肿瘤侵袭和转移药物的研究提供了广阔的药物资源。
当前，已有的治疗手段对转移性乳腺癌的治疗具有一定的局限性，临床上也尚未有有效治疗肿瘤转移的药物，已有的化疗及放疗手段起到的作用也较为有限。临床抗肿瘤转移研究多根据临床症状、体征、细胞学及影像学等检查结果，观察治疗期间出现远处转移及原位复发情况，对于抗肿瘤转移药物的临床研究缺乏客观、公认的疗效评价标准。现在临床上使用的许多药物虽有抗转移作用，但都没有以抗转移药物出现，可能原因是这类药物同时具有抗原发肿瘤增殖和抗肿瘤转移作用，此外，临床上也很难有明确的指标来评价抗肿瘤转移作用。
胡黄连为玄参科胡黄连属植物，作为一种传统中药材，用药历史悠久，广泛应用于临床，常用于治疗肝病、上呼吸道感染等疾病。现代药理学研究表明胡黄连具有保肝利胆、调节血脂、抗炎等作用。目前，胡黄连中已分离得到多种化合物，主要有环烯醚萜苷、葫芦烷型三萜苷、苯乙醇苷、葫芦素、芳香酸和新苷等。胡黄连苷ii为胡黄连根茎主要药用成分环烯醚萜类的主要有效成分，有明显的抗炎、神经保护、保护肝脏损伤、抗氧化作用等作用。
本发明通过体外细胞模型的研究发现，胡黄连苷ii可显著抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移，同时抑制金属蛋白酶mmp-2和mmp-9的活性；体内研究发现，胡黄连苷ii可显著抑制肿瘤的增殖，免疫组化分析结果表明，瘤块内mmp-9的表达量显著下降。由此证明胡黄连苷ii在体内外均具有良好的抗转移作用。
作为优选，所述乳腺癌的细胞株为mda-mb-231。
作为优选，所述胡黄连苷ii能够抑制体外乳腺癌细胞的侵袭和转移。
作为优选，所述胡黄连苷ii还能够抑制mmp-2和mmp-9酶的活性和蛋白质的表达。
作为优选，所述胡黄连苷ii的化学结构式为：
作为优选，所述胡黄连苷ii在体外实验中的有效浓度为40μm以上。
当药物浓度低于40μm时，胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞的活力几乎没有影响，并且其抗迁移活性效果呈良好的剂量依赖性。
作为优选，所述胡黄连苷ii在动物实验中的给药剂量为40-60mg/kg。
作为优选，所述胡黄连苷ii在动物实验中的给药剂量为50mg/kg。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：胡黄连苷ii在体内外均具有良好的抗转移作用，可显著抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移，在体内可显著抑制肿瘤的增殖，胡黄连苷ii为天然来源，毒副作用小、不易产生耐药，遗传毒性低，为抗肿瘤侵袭和转移药物的研究提供了药物资源，为临床治疗乳腺癌提供了一种新思路。
附图说明
图1为不同浓度胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞增殖的影响
图2为创口愈合试验中胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞迁移的影响；
图3为transwell肿瘤细胞迁移及侵袭实验；
图4为胡黄连苷ii对mmp-2/-9酶活性的影响；
图5为胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞中mmp-2/-9蛋白表达水平的影响；
图6为胡黄连苷ii体内抗肿瘤活性；(a)肿瘤体积变化图；(b)免疫组化分析瘤块中mmp-9表达量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1.胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞活力的影响
mda-mb-231细胞用不同浓度(0～40μm)的胡黄连苷ii作用24、48、72h，加mtt(20μl，5mg/ml)试剂，在多功能酶标仪上测定吸光度值。如图1所示，当药物浓度低于40μm时，胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞的活力几乎没有影响。因此，以上浓度将进一步用于评价胡黄连苷ii的抗侵袭和抗迁移作用。
2.胡黄连苷ii体外抑制mda-mb-231细胞的迁移
为了进一步检测胡黄连苷ii的体外抗转移活性，创口愈合试验被用于本发明。将mda-mb-231细胞以每孔1×105细胞接种于24孔培养板中，培养24h后，用1000μl移液器枪头垂直划制创口，随后用pbs轻轻洗涤细胞3次，去除悬浮在培养液中的细胞，加入不同浓度的含药培养基，放入37℃5％co2培养箱培养。分别在0、6、12、24h后取样，拍照。使用imagej软件对图片进行分析，计算细胞间距离的均值。如图2所示，胡黄连苷ii可以显著抑制创口愈合，并且呈良好的剂量依赖性。当细胞经20μm和40μm的胡黄连苷ii作用后，与对照组相比，创口愈合率显著降低。
除此之外，transwell迁移实验也证实了胡黄连苷ii的抗迁移活性。将transwell倒置，在transwell的pvpf膜(0.8μm)的下表面均匀涂布fibronectin(25μg/ml，50μl)，放超净台内阴干。用前用pbs洗净，放入加有600μl含药培养基(含10％fbs)的24孔板内，向小室内加mda-mb-231细胞悬液(100μl，含0.1％bsa的无血清培养基)，放入培养箱，6～12h后，取出transwell，用棉签擦去pvpf膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醇室温固定1min，苏木精和伊红染色，封片，100倍显微镜下随机取五个视野，拍照，计数。如图3a所示，细胞经胡黄连苷ii(40μm)作用后，肿瘤细胞迁移率显著降低。以上实验结果表明胡黄连苷ii能有效抑制mda-mb-231细胞的迁移。
3.胡黄连苷ii在体外抑制mda-mb-231细胞的侵袭
为进一步研究胡黄连苷ii的抗转移活性，transwell侵袭实验被用于评估胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞的抗侵袭活性。将transwell倒置，在transwell的pvpf膜(0.8μm)的下表面均匀涂布fibronectin(25μg/ml，50μl)，放超净台内。干燥后，再在上面加基质胶(10μg/ml，50μl)，超净台内过夜，pbs洗涤后，放入加有600μl含药培养基(含10％fbs)的24孔板内，在小室内加入一定数量的mda-mb-231细胞悬液(100μl，含0.1％bsa的无血清培养基)，放入培养箱，12～24h后，取出transwell，用棉签擦去pvpf膜靠近内室那一面的细胞，固定，染色，封片，拍照，计数。如图3b所示，实验结果表明胡黄连苷ii能够显著抑制肿瘤细胞的侵袭。肿瘤细胞经胡黄连苷ii(40μm)处理后，与对照组相比，给药组mda-mb-231细胞的数量显著低于对照组。以上实验结果表明胡黄连苷ii能有效抑制mda-mb-231细胞的侵袭。
4.胡黄连苷ii抑制mda-mb-231细胞中的mmp-2和mmp-9酶的活性
为了研究胡黄连苷ii对mda-mb-231细胞侵袭的抑制作用是否与mmps的活性相关，本研究中利用明胶酶谱法测定药物对mmp-2和mmp-9的活性的影响。取对数期的mda-mb-231细胞(2×105细胞/孔)，在含药血清培养基dmem中培养24h。次日移除培养基，更换成无血清培养基，继续培养24h，收集上清液，将上清液移入离心管中3000rpm离心10min；根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度，与2倍上样缓冲液1∶1混合。4℃进行sds-page电泳(100v，1.5h)。电泳结束后，将凝胶置于洗脱液(2.5％tritonx-100，50mmtris-hcl，5mmcacl2，ph7.6)中振荡洗脱2次，每次45min，然后用漂洗液(除不含tritonx-100外其余同洗脱液)漂洗2次，每次30min，随后将凝胶置于孵育液(50mmtris-hcl，5mmcacl2，0.02％brij-35，ph7.6)中37℃孵育42h。孵育结束后，经考马斯亮蓝染色液(0.05％coomassic亮蓝、30％甲醇、10％乙酸)染色3h后，用脱色液a、b、c(甲醇浓度分别为30％、20％、10％，乙酸浓度分别为10％、10％、5％)分别脱色0.5、1、2h后，显示出mmp-2(72kd)和mmp-9(92kd)位于蓝色背景上的透亮条带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。如图4所示，mda-mb-231细胞经胡黄连苷ii作用后，mmp-2和mmp-9的活性显著降低。该结果表明，从mda-mb-231细胞分泌的mmp-2和mmp-9蛋白的酶活性的降低可能与胡黄连苷ii的抗转移作用有关。
5.胡黄连苷ii下调mda-mb-231细胞中mmp-2与mmp-9的表达
细胞外基质(ecm)蛋白质的降解是肿瘤细胞侵袭和转移中的必需步骤，其主要由mmps如mmp-2和mmp-9介导。为了研究胡黄连苷ii是否通过影响基质金属蛋白酶的表达抑制肿瘤细胞的运动，通过westernblot实验，检测用胡黄连苷ii处理后的肿瘤细胞中mmp-2和mmp-9的表达。药物作用于乳腺癌细胞mda-mb-23124h后，收集细胞，提取蛋白，通过westernblot技术检测细胞内相关蛋白(mmp-2、mmp-9、肝素酶等)的变化。如图5所示，mmp-2和mmp-9的蛋白表达水平均显著下降。
6.胡黄连苷ii显著抑制体内肿瘤的增殖
为进一步证明药物的体内抗肿瘤作用，本研究通过建立裸鼠移植瘤模型，检测胡黄连苷ii对体内肿瘤的抑制作用。将人乳腺癌细胞mda-mb-231(5×105细胞/裸鼠)接种至裸鼠腹股沟处皮下，待瘤块生长至手可触及，将动物随机分为阴性对照组和给药组，腹腔注射给药(给药剂量为50mg/kg)，给药时间为30d。每隔2天，检测肿瘤生长、转移情况，并记录裸鼠的体重、瘤块体积、瘤块重量，对实验数据进行统计分析。如图6a所示，给药组肿瘤体积显著小于对照组，表明药物具有良好的抗肿瘤作用。
采用免疫组化分析，取福尔马林固定的瘤块组织，脱水后，进行包埋、切片，并将切片脱蜡水化。将脱蜡水化后的切片避光置于3％内源性过氧化物的阻断液中15min，而后用pbs洗涤2次，每次5min。95℃抗原修复，封闭，加入一抗，4℃过夜，将切片取出，恢复室温30min，再用pbs洗3次，每次5min。加入hrp标记聚合物，室温孵育30min后，用pbs洗3次，每次5min。dab显色2min，然后用苏木素复染5min，自来水除去多余染液。将切片依次置于80％乙醇(2min)、95％乙醇(2min)、100％乙醇(5min)。之后将组织切片放入二甲苯中(10min)，用中性树胶封片，拍照，保存。免疫组化结果显示(图6b)，肿瘤组织中，给药组瘤块mmp-9的表达量显著低于对照组。因mmp-9与癌细胞的转移具有非常密切的关系，其表达量的显著下降，表明胡黄连苷ii在抑制癌细胞转移中发挥了良好的作用。
实施例2
除动物实验中腹腔注射给药的给药剂量为40mg/kg，其余实验及检测方法与实施例1相同，结果显示药物具有良好的抗肿瘤作用。
实施例3
除动物实验中腹腔注射给药的给药剂量为60mg/kg，其余实验及检测方法与实施例1相同，结果显示药物具有良好的抗肿瘤作用。
本发明中胡黄连苷ii加入药学可接收的辅料，可按常规方法制成各种剂型，如各种规格的液体注射剂、粉针注射剂、注射用乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、膏剂、霜剂、贴剂、擦剂、粉剂、喷雾剂、植入剂、滴剂、栓剂、软膏剂、糖果剂等。
胡黄连苷ii的给药途径包括各种给药途径，如口服给药、注射给药、植入给药、腔内给药、舌下给药、透皮给药、内外敷等。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。