使用包含抗ERBB3抗体的联合疗法治疗ER+、HER2-、HRG+乳腺癌的方法与流程
本申请要求2016年3月15日提交的美国临时申请nos.62/308,783、2016年6月29日提交的62/356,127和2016年12月7日提交的62/431,242的优先权。上述申请的内容通过引用并入本文。
背景技术：
细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)和密切相关的细胞周期蛋白依赖性激酶6(cdk6)是哺乳动物有丝分裂的调节因子，其作用是促进dna合成的开始以准备细胞分裂。cdk4和6的几种选择性抑制剂(“cdk4/6”抑制剂)处于不同的开发阶段，其中一种，帕博西尼目前在美国被批准用于与基于内分泌的治疗剂(来曲唑或氟维司群)联合治疗激素受体(hr)阳性、人表皮生长因子受体2(her2)-阴性晚期或转移性乳腺癌。这些组合非常有效，并且正迅速成为这类患者的护理标准剂。
乳腺癌仍然是美国最常见和最致命的癌症之一，仅2014年预计就有232670例新诊断病例和40000例相关死亡病例。其中，最大的分子诊断亚组(～70％)包括患有激素受体阳性(er+/pr+；er+/pr-；或er-/pr+)和her2阴性(ihc<3+且非fish阳性)疾病的患者。对于转移性疾病患者，报道的中位生存期为18-36个月。转移性乳腺癌不被认为是可治愈的。然而，随着改进的系统性(systemic)治疗的引入，已经获得了显著的生存改善。
所有er/pr阳性转移性乳腺癌患者的一般治疗目标是延长生存期并改善生活质量。这可以通过外科手术介入和药物治疗(可能的话)来实现。通常最初使用内分泌(抗激素的)药物，并保持直至出现耐药性。这些是优选的，因为它们是有效的且相对无毒，并且它们的使用避免了基于化疗方案的毒性。目前的美国国家综合癌症网络(nccn)治疗指南指出：“乳腺癌复发或iv期疾病的系统性治疗延长了生存期并提高了生活质量但不具有治愈性。因此，优选的是与最小毒性相关的治疗。”
对于患有转移性疾病的er/pr阳性乳腺癌患者，存在几种一线内分泌治疗方案。在本上下文中使用时，术语“一线”表示转移性疾病出现后的第一线治疗，即使患者先前已经按转移前设定进行了治疗。在转移性设定中，氟维司群或芳香酶抑制剂(ai，例如来曲唑)通常优选作为一线治疗的单一药剂。氟维司群是选择性雌激素受体下调剂(serd)，并且被指明用于在抗雌激素治疗后疾病进展的绝经后患者中治疗激素受体阳性转移性乳腺癌。芳香酶抑制剂阻断了雌激素合成的关键步骤。
对于未经内分泌治疗(在辅助治疗结束后进展超过12个月)或再发生转移性乳腺癌的转移性乳腺癌的绝经后患者，治疗选项包括ai加帕博西尼或者使用氟维司群或ai的单药治疗。
帕博西尼(以前称pd0332991)是一种细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(cdk4/6)的抑制剂。帕博西尼加来曲唑于2015年获得美国食品药品管理局(fda)加速批准作为治疗转移性er-阳性人表皮生长因子受体2(her2)-阴性乳腺癌的一线治疗剂。用来曲唑加帕博西尼的治疗导致联合应用中的无进展生存期(pfs)统计学意义上显著增加。总体存活率似乎也利于联合应用，但没有达到统计学意义。仍然存在使用ai依西美坦(其是最常用的药物之一)和serd氟维司群(其是另一种既定选项)在转移性设定中有限的二线和超出内分泌治疗的选项。
在这种情况下，对内分泌治疗的先天性和获得性耐药性造成了重大的治疗挑战，因为只有那些对内分泌治疗持续敏感的患者才能以较好的生活质量长期存活。不幸的是，许多患者对内分泌治疗产生耐药性，有时导致治疗持续时间非常短，加速了对开始实施细胞毒性的化疗的需要。
与用于治疗癌症的其他激酶抑制剂一样，cdk4/6抑制剂的有效使用受到耐药性的限制，在某些情况下预先存在且在大多数情况下在治疗一段时间后发生。因此，用于治疗对cdk4/6抑制剂治疗有耐药性的患者的低毒性方法的需求是存在的。
本公开解决了针对预防或消除耐药性的无毒疗法的需求并提供额外的益处，所述耐药性针对内分泌和cdk抑制疗法。
附图说明
图1.调节蛋白mrna在人er阳性、her2阴性乳腺癌肿瘤中普遍存在。(a)从tcga数据库中提取的er阳性、her2阴性乳腺癌肿瘤的hrgmrna的表达。(b)使用hrgrna-ish测定法测量具有er阳性、her2阴性乳腺癌的197个患者肿瘤样品中hrgmrna的表达，其中两种方法均发现约45％的样品表达hrgmrna。
图2.hrg促进er阳性、her2阴性乳腺癌细胞系的增殖。用hrg刺激mcf7、t47d和hcc1428细胞6天并通过ctg测定法测量增殖。
图3.hrg增强了氟维司群在er阳性、her2阴性乳腺癌细胞系中的活性，并且seribantumab恢复了氟维司群的活性。用雌二醇、氟维司群、氟维司群与雌二醇、或者氟维司群和雌二醇加seribantumab处理mcf7和t47d细胞6天，并通过ctg测定法测量增殖。
图4.hrg抑制er阳性、her2阴性mcf7乳腺癌细胞系中的cdk抑制剂的活性，并且seribantumab恢复敏感性。(a)单用帕博西尼、hrg或者与seribantumab联合处理mcf7细胞。(b)单用abemaciclib、hrg或者与seribantumab联合处理mcf7细胞。(c)单用帕博西尼、hrg或者与seribantumab联合处理mcf7细胞。处理细胞6天，通过ctg测定法测量增殖。
图5.hrg抑制er阳性、her2阴性zr75-1乳腺癌细胞系中cdk抑制剂的活性，并且seribantumab恢复敏感性。(a)单用帕博西尼、hrg或者与seribantumab联合处理zr75-1细胞。(b)单用abemaciclib、hrg或者与seribantumab联合处理zr75-1细胞。(c)单用瑞博西尼、hrg或者与seribantumab联合处理zr75-1细胞。处理细胞6天，通过ctg测定法测量增殖。
图6.hrg在er阳性、her2阴性mcf7乳腺癌细胞系中抑制cdk4/6抑制剂与氟维司群联合的活性，并且seribantumab恢复敏感性。(a)用帕博西尼、hrg、氟维司群和seribantumab的联合处理mcf7细胞。(b)用abemaciclib、hrg、氟维司群和seribantumab的联合处理mcf7细胞。(c)用瑞博西尼、hrg、氟维司群和seribantumab的联合处理mcf7细胞。处理细胞6天，通过ctg测定法测量增殖。
图7.hrg在er阳性、her2阴性mcf7乳腺癌细胞系中抑制cdk4/6抑制剂与他莫昔芬联合的活性，并且seribantumab恢复敏感性。(a)用帕博西尼、hrg、他莫昔芬和seribantumab的联合处理mcf7细胞。(b)用abemaciclib、hrg、他莫昔芬和seribantumab的联合处理mcf7细胞。(c)用瑞博西尼，hrg、他莫昔芬和seribantumab的联合处理mcf7细胞。处理细胞6天，通过ctg测定法测量增殖。
图8.hrg激活mcf7乳腺癌细胞中的cdk2，而seribantumab阻断hrg在cdk2活化上的激活作用。
图9.氟维司群抑制mcf7细胞中的cdk2活化，而hrg可以在氟维司群存在下激活cdk2。在氟维司群存在下，seribantumab阻断hrg在cdk2活化上的激活作用。
图10.cdk4/6抑制剂减少mcf7细胞中的cdk2活化，而hrg可以在帕博西尼或abemaciclib存在下激活cdk2。seribantumab在帕博西尼或abemaciclib存在下，阻断hrg在cdk2活化上的活化作用。
图11.hrg是一种高效力配体，其抑制氟维司群、帕博西尼及其联合在er阳性、her2阴性乳腺癌细胞中的活性。mcf7细胞用(a)氟维司群、(b)帕博西尼和(c)它们的联合在1nm的针对erbb家族受体(hrg、btc、egf、hb-egf、tgf-α、ar、epg或epr)、雌激素受体(e2)、胰岛素样生长因子1受体(igf-1)、c-met(hgf)或成纤维细胞生长因子受体(fgf)的配体存在下处理6天，并通过ctg测定法测量增殖。
图12.hrg是一种高效力配体，其抑制氟维司群、帕博西尼及其联合在er阳性、her2阴性乳腺癌细胞中的活性。t47d细胞用(a)氟维司群、(b)帕博西尼和(c)它们的联合在1nm的针对erbb家族受体(hrg，btc，egf，hb-egf，tgf-α，ar，epg或epr)、雌激素受体(e2)、胰岛素样生长因子1受体(igf-1)、c-met(hgf)或成纤维细胞生长因子受体(fgf)的配体存在下处理6天，并且通过ctg测定法测量增殖。
图13.(a)hrg促进er+her2细胞的s期细胞周期进展，并且(b)hrg抑制单用药剂氟维司群和(c)单用药剂帕博西尼或者(d)帕博西尼与氟维司群的联合对在er+阳性、her2阴性乳腺癌细胞中dna合成和s期进展的活性。seribantumab恢复了该联合的抑制活性。
图14.seribantumab的加入增强了氟维司群、帕博西尼以及氟维司群与帕博西尼的联合在er+her2乳腺癌的人原位异种移植物模型中的活性。
图15.hrg增强视网膜母细胞瘤蛋白(rb)的磷酸化，以促进细胞周期转变并抑制氟维司群的活性。cdk4/6抑制剂帕博西尼或abemaciclib对rb磷酸化和seribantumab可以通过阻断人er+her2-乳腺癌细胞中的hrg来恢复活性。(a)氟维司群抑制rb在丝氨酸807/811位的rb活化，而hrg通过增强rb在丝氨酸807/811位的活化来抵消氟维司群。seribantumab抑制hrg以恢复氟维司群对rb活化的活性。(b)cdk4/6抑制剂(帕博西尼和abemaciclib)降低rb在丝氨酸807/811位的rb活化。hrg通过增强rb在丝氨酸807/811位的活化来抵消帕博西尼和abemaciclib的活性。seribantumab抑制hrg以恢复帕博西尼和abemaciclib对rb活化的活性。(c)帕博西尼和氟维司群的联合降低rb在丝氨酸807/811和丝氨酸780位的rb活化，而hrg通过增强rb在丝氨酸807/811和丝氨酸780位的活化来抵消帕博西尼和氟维司群的活性。seribantumab抑制hrg以恢复帕博西尼-氟维司群联合的活性。
图16.seribantumab和来曲唑的共同治疗延迟了在mcf-7ca异种移植物中抗性的发生并恢复了对来曲唑的敏感性。
技术实现要素：
本文提供了在人类患者中治疗er+、her2-hrg+乳腺癌(例如转移性er+、her2-hrg+乳腺癌)的组合物和方法，包括根据特定的临床剂量方案(即，以特定剂量并根据特定给药日程)向患者施用抗erbb3抗体(例如seribantumab)、cdk4/6抑制剂(例如帕博西尼、abemaciclib或瑞博西尼)和基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)。
示例性的抗erbb3抗体是seribantumab(也称为“mm-121”或“ab#6”)或其抗原结合片段和变体。在一个实施方式中，抗erbb3抗体包含seribantumab的重链和轻链cdr或可变区。在一个实施方式中，抗体包含具有seqidno:10所示序列的seribantumab的vh区的cdr1、cdr2和cdr3结构域以及具有seqidno:12所示序列的seribantumab的vl区的cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方式中，抗体包含分别具有seqidno:1、2和3中所示序列的重链cdr1、cdr2和cdr3结构域，以及分别具有seqidno:4、5和6中所示序列的轻链cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方式中，抗体包含分别具有seqidno:10和seqidno:12所示氨基酸序列的vh和/或vl区。在另一个实施方式中，抗erbb3抗体包含分别由seqidno:9和11中所示的核酸序列编码的vh和/或vl区。在另一个实施方式中，抗erbb3抗体包含分别具有seqidno:7和seqidno:8中所示氨基酸序列的重链和/或轻链。
在另一个实施方式中，使用与上述抗体竞争结合和/或在人erbb3上结合相同表位的抗体。在一个具体实施方式中，表位包含人erbb3(seqidno:14)的残基92-104。在另一个实施方式中，表位包括人erbb3(seqidno:14)的第92-104位内的氨基酸残基。在另一个实施方式中，抗体与seribantumab竞争结合人erbb3并且与上述抗erbb3抗体具有至少90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与seqidno:10和seqidno:12至少约90％、95％或99％可变区同一性)。
示例性cdk4/6抑制剂是帕博西尼。在另一个实施方式中，cdk4/6抑制剂是abemaciclib。在另一个实施方式中，cdk4/6抑制剂是瑞博西尼。
示例性基于内分泌的治疗剂是来曲唑或氟维司群。
因此，在一个方面，提供了治疗患有er+、her2-乳腺癌的人类患者的方法，该方法包括向患者施用一种抗erbb3抗体(例如seribantumab)、一种cdk4/6抑制剂(例如帕博西尼)和一种基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)。
在另一个方面，提供了治疗患有er+、her2-乳腺癌的人类患者的方法，该方法包括向患者施用一种抗erbb3抗体(例如seribantumab)和一种基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)。在一个实施方式中，该方法不包括施用cdk4/6抑制剂(例如帕博西尼、abemaciclib或瑞博西尼)。在另一个实施方式中，该方法包括向患者施用抗erbb3抗体(例如seribantumab)和氟维司群。在另一个实施方式中，该方法包括向患者施用抗erbb3抗体(例如seribantumab)和来曲唑。
在一个实施方式中，不超过三种其他抗肿瘤剂(例如，cdk4/6抑制剂和/或基于内分泌的治疗剂)在治疗周期内与seribantumab联合给药。在另一个实施方式中，不超过两种其他抗肿瘤剂在治疗周期内与seribantumab联合给药。在另一个实施方式中，不超过一种其他抗肿瘤剂在治疗周期内与seribantumab联合给药。
在一个实施方式中，治疗周期是21天。在另一个实施方式中，治疗包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个周期。治疗持续任何合适的时间段(例如，直至达到完全响应(cr))。在一个实施方式中，治疗施用至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或11个月。在另一个实施方式中，治疗施用至少一年。在另一个实施方式中，治疗施用至少两年。
本文所述的治疗剂(例如，seribantumab，帕博西尼，来曲唑和氟维司群)可通过任何合适的方式给药于患者。在一个实施方式中，配制seribuantumab用于静脉内给药。在一个实施方式中，配制帕博西尼用于口服给药(例如，作为胶囊或片剂)。在一个实施方式中，配制来曲唑用于口服给药(例如，作为胶囊或片剂)。在一个实施方式中，配制氟维司群作为无菌溶液用于肌内注射。
在一个实施方式中，抗erbb3抗体(例如，seribantumab)、cdk4/6抑制剂(例如，帕博西尼)和基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)的剂量是固定剂量，而与患者的体重无关。例如，seribantumab可以以3g的固定剂量给药，而不考虑患者的体重。帕博西尼可以以125mg胶囊的固定剂量给药，而不考虑患者的体重。来曲唑可以以2.5mg的固定剂量给药，而不考虑患者的体重。氟维司群可以以500mg的固定剂量给药，而不考虑患者的体重。在某些实施方式中，调整剂量方案以提供最佳的所需响应(例如，有效响应)。
在一个方面，帕博西尼、来曲唑和seribantumab根据特定的剂量方案联合给药。在一个实施方式中，每天口服给药一次125mg帕博西尼胶囊，持续21天，然后停止治疗7天，作为一个28天的周期。在该实施方式中，每天一次持续给予2.5mg来曲唑，贯穿该28天的周期。在该实施方式中，通过静脉输液以每两周3g的剂量施用seribantumab贯穿该周期。
在另一个方面，帕博西尼、氟维司群和seribantumab根据特定的剂量方案联合给药。在该实施方式中，每天一次125mg帕博西尼胶囊口服给药，持续21天，然后停止治疗7天，作为一个28天的周期。在该实施方式中，在第1天、第15天、第29天且此后每月一次或者每28天一次以500mg剂量施用氟维司群。在该实施方式中，通过静脉输液以每两周3g的剂量施用seribantumab贯穿该周期。
因此，在一个方面，提供了治疗患有er+、her2-乳腺癌的人类患者的方法，该方法包括向患者施用：
i)每天一次口服一个帕博西尼125mg胶囊，持续21天，然后停止治疗7天，以组成一个28天的完整周期；
ii)a)或b)，其中a)是来曲唑，在贯穿28天的周期内持续每天一次给药2.5mg，且b)是在第1天、第15天、第29天且此后每月一次或每28天一次以500mg剂量施用氟维司群；
和
seribantumab，以每两周3g剂量通过静脉输液。
在另一个方面，提供了治疗患者的方法，该患者先前已经用帕博西尼和激素治疗剂治疗，并且其癌症在该治疗后已进展，所述方法包括向所述患者同时给药：
i)每天一次口服一个帕博西尼125mg胶囊，连续21天，然后停止治疗7天，以构成28天的完整周期；
ii)a)或b)其中a)是来曲唑，在贯穿28天的周期内持续每天一次给药2.5mg，并且b)是在第1天、第15天、第29天且此后每月一次或每28天一次以500mg剂量给药氟维司群，并且其中如果患者先前已经用氟维司群治疗，则患者被施用a)，和如果患者先前已经用来曲唑治疗，则患者被施用b)；
和
seribantumab，以每两周3g剂量通过静脉输液。
在另一个方面，提供了治疗患有表达hrg的er/pr+、her2-乳腺癌的患者的方法，表达hrg是通过rna原位杂交(rna-ish)测量的。在一个实施方式中，乳腺癌是局部晚期或转移性乳腺癌。在另一个实施方式中，方法包含一个28天的周期，其中：
i)在该周期的第1天和第15天以3000mg的剂量静脉内(iv)施用seribantumab，并且
ii)在该周期的第1天和第15天以500mg剂量肌内(im)施用氟维司群。
在一个实施方式中，方法包括至少一个后续治疗周期。在另一个实施方式中，氟维司群仅在每个后续治疗周期的第1天给药。
在另一个方面，治疗患有表达hrg的er/pr+、her2-乳腺癌患者的方法包含28-天的周期，通过rna原位杂交(rna-ish)测量的，其中：
i)在该周期的第1天和第15天以3000mg的剂量静脉内施用seribantumab，并且
ii)在所述周期内每天一次以2.5mg的剂量口服施用来曲唑。
在一个实施方式中，从治疗前的患者的生物样品中测量到调节蛋白rna原位杂交(rna-ish)分数为1+或更高。
可以使用任何合适的方法评估本文提供的治疗方法的功效。在一个实施方式中，治疗产生至少一种治疗效果，该治疗效果选自由肿瘤尺寸减小、转移减少、完全缓解、部分缓解、疾病稳定、总体响应率增加或病理完全响应组成的组。在一个实施方式中，治疗导致患者表现出疾病稳定、部分响应或完全响应。
进一步提供了包含抗erbb3抗体(例如seribantumab)、cdk4/6抑制剂(例如帕博西尼)和基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含：(a)一剂seribantumab，(b)一剂帕博西尼，(c)一剂来曲唑或氟维司群，和(d)在本文描述的方法中联合seribantumab和帕博西尼来使用来曲唑或氟维司群的说明书。在另一个实施方式中，试剂盒包含：(a)一剂seribantumab，(b)一剂来曲唑或氟维司群，和(c)在本文描述的方法中联合seribantumab来使用来曲唑或氟维司群的说明书。
具体实施方式
i.定义
本文中使用时，术语“受试者”或“患者”是人类患者(例如患有er+、her2-hrg+转移性乳腺癌的患者)。
本文中使用时，术语“雌激素受体阳性”(er+)指的是肿瘤(例如癌(carcinomas))，典型地乳腺肿瘤，其中肿瘤细胞对雌激素受体(er)的分数是阳性的(即，使用常规的组织病理学方法)。根据美国病理学家学会(cap)和美国临床肿瘤学会(asco)提供的建议，如果至少1％的肿瘤细胞测试(例如，通过免疫组织化学)得到er阳性，则肿瘤是er+。
本文中可互换使用的术语“erbb2,”、“her2,”和“her2受体,”是指人类neu癌基因的蛋白质产物，也称为erbb2致癌基因或her2致癌基因。根据cap和asco提供的指南，指定为her2阴性(her2-)的肿瘤是一种这样的肿瘤，其免疫测定例如免疫组织化学(ihc)测试显示在<30％的肿瘤细胞中没有染色或膜染色。对于一种这样的测定，以
本文中使用时，“hrg”表示调节蛋白(heregulin)(神经调节蛋白-1，“nrg”)的任何和所有同种型，一组天然存在的erbb3的配体。可以评估hrg的表达，例如使用基于rna原位杂交(ish)的测定，如根据ussn14/965,301的实施例1中描述的方案；wo2015/100459，其通过引用明确地并入本文。在一个实施方式中，通过生色信号读出rna-ish。在一个具体的实施方式中，用于通过rna-ish检测hrg的探针与包含genbank登录号nm-013956(seqidno:13)中所示核苷酸序列的核苷酸442-2977的核酸特异地杂交。在某些实施方式中，探针与编码每种hrg同种型α、β1、β1b、β1c、β1d、β2、β2b、β3、β3b、γ、γ2、γ3、ndf43、ndf34b和ggf2的rna特异性杂交。在另一个实施方式中，hrg分数通过使用对hrg特异的探针的rt-pcr来确定。
本文中可互换使用的术语“erbb3”和“her3,”指的是人erbb3蛋白，如美国专利no.5,480,968中所述。人erbb3蛋白序列示于美国专利no.5,480,968的seqidno:4，其中前19个氨基酸(aas)对应于从成熟蛋白质切割的前导序列。erbb3是受体的erbb家族的成员，其他成员包括erbb1(egfr)、erbb2(her2/neu)和erbb4。erbb3本身缺乏酪氨酸激酶活性，但其本身在erbb3与另一种erbb家族受体(例如为受体酪氨酸激酶的erbb1(egfr)、erbb2和erbb4，)二聚化后被磷酸化。erbb家族受体的配体包括调节蛋白(hrg)、β-细胞素(btc)、表皮生长因子(egf)、肝素结合表皮生长因子(hb-egf)、转化生长因子α(tgf-α)、双调蛋白(ar)、表皮蛋白(epg)和表皮调节蛋白(epiregulin，epr)。人erbb3的氨基酸序列由genbank登录号np_001973.2(受体酪氨酸-蛋白激酶erbb-3同种型1前体)提供，并指定为基因id:2065。
本文中使用时，术语“erbb3抑制剂”旨在包括抑制、下调、阻制或下调erbb3活性的治疗剂。该术语旨在包括化学化合物，例如小分子抑制剂，和生物制剂，例如抗体、干扰rna(shrna，sirna)、可溶性受体等。示例性的erbb3抑制剂是抗erbb3抗体，例如seribantumab。
本文中使用时，术语“试剂”是指活性分子，例如治疗性蛋白质，例如药物。
本文中使用时，“有效治疗”是指产生有益效果的治疗，例如疾病或病症的至少一种症状的改善。有益效果可表现为超过基线的改善的形式，即超过在根据该方法的治疗起始前进行的测量或观察的改善。有效治疗可指癌症的至少一种症状的减轻。
本文中使用时，术语“有效量”是指提供所期望的生物学、治疗和/或预防结果的试剂的量。该结果可以是疾病的体征、症状或原因中的一种或多种的减少、改善、缓和、变小、延迟和/或减轻，或生物系统的任何其他所期望的改变。可以在一次或多次给药中施用有效量。
本文中使用时，术语“给药”或“施用”指通过注射或以其它手段将存在于体外的物质(例如本文中所公开的分子的制剂)物理递送至患者体内的行为，例如通过粘膜、皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当治疗疾病或其症状时，物质的施用通常发生在疾病或其症状发生之后。当预防疾病或其症状时，物质的施用通常发生在疾病或其症状发生之前。
本文中使用时，术语“固定剂量”、“平坦剂量”和“平坦固定剂量”可互换使用，并且是指在不考虑患者体重或体表面积(bsa)的情况下给药患者的剂量。因此，固定剂量或平坦剂量不以mg/kg剂量提供，而是以试剂的绝对量提供。
本文中使用时，术语“治疗”是指本文所述的治疗或预防措施。“治疗”的方法对受试者施用给药本文公开的组合是为了预防、治愈、延缓、减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状或复发性疾病或病症，或为了延长受试者的存活期，超过在没有这种治疗的情况下所预测的存活期。
本文中使用时，辅助或联合给药(共同给药)包括将试剂以相同或不同剂型同时给药，或将试剂分开给药(例如顺序给药)。例如，可以将试剂配制成单独给药并同时或顺序给药。这种同时或顺序给药优选地导致试剂同时存在于治疗的患者体内。
ii.抗erbb3抗体
适用于本发明的抗erb3抗体(或由其衍生的vh/vl结构域)可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本领域公认的抗erbb3抗体，例如，av-203(如us8481687中所述)、gsk2849330(如us9085622中所述)、ktn3379(如us9220775中所述)、duligotuzumab(如us8597652中所述)、elgemtumab(如us8735551中所述)、futuximab(如wo2008/104183中所述)、lumretuzumab(如us8859737中所述)和patritumab(如us7705130中所述)。也可以使用与任何这些本领域公认的抗体竞争结合erbb3的抗体。
示例性抗erbb3抗体是seribantumab(也被称为"mm-121"或"ab#6")或其抗原结合片段和变体。seribantumab是人单克隆抗erbb3igg2(参见，例如美国专利7,846,440；8,691,771和8,961,966；8,895,001,美国专利公开20110027291、20140127238、20140134170和20140248280)，以及国际公开wo/2013/023043、wo/2013/138371、wo/2012/103341和us临时专利申请62/090,780，其教导通过引用明确并入本文中。
在一个实施方式中，抗erbb3抗体包含seribantumab的可变区或重链和轻链cdr。因此，在一个实施方式中，抗体包含具有seqidno:10所示序列的seribantumab的vh区的cdr1、cdr2和cdr3结构域以及具有seqidno:12所示序列的seribantumab的vl区的cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方式中，抗体包含分别具有seqidno:1、2和3中所示序列的重链cdr1、cdr2和cdr3结构域，以及分别具有seqidno:4、5和6中所示序列的轻链cdr1、cdr2和cdr3结构域。在另一个实施方式中，抗体包含分别具有seqidno:10和seqidno:12所示氨基酸序列的vh和/或vl区。在另一个实施方式中，抗erbb3抗体包含分别由seqidno:9和11中所示的核酸序列编码的vh和/或vl区。在另一个实施方式中，抗erbb3抗体包含分别具有seqidno:7和seqidno:8所示氨基酸序列的重链和/或轻链。在另一个实施方式中，使用竞争结合和/或结合到与上述抗体在人erbb3上的相同表位的抗体。在一个具体实施方式中，表位包含人erbb3的残基92-104(seqidno:14)。在另一个实施方式中，抗体与seribantumab竞争结合人erbb3，并且与上文描述的抗erbb3抗体具有至少90％的可变区域氨基酸序列同一性(参见，例如，美国专利号7,846,440和美国专利公开号20100266584)。
iii.cdk4/6抑制剂
可以使用本领域公认的cdk4/6抑制剂。示例性cdk4/6抑制剂是帕博西尼。帕博西尼(代号pd-0332991，商品名ibrance)是用于治疗er阳性和her2阴性乳腺癌的药物。它是细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4和cdk6的选择性抑制剂。用于口服给药的ibrance胶囊含有125mg、100mg或75mg的帕博西尼(一种激酶抑制剂)。帕博西尼的分子式是c24h29n7o2。分子量是447.54道尔顿。化学名是6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基]氨基}吡啶[2,3-d]嘧定-7(8h)-酮，并且其结构式是：
帕博西尼是黄色至橙色粉末，pka为7.4(仲哌嗪氮)和3.9(吡啶氮)。在ph4或低于4时，帕博西尼表现为高溶解度化合物。在高于ph4时，药物的溶解度显着降低。帕博西尼含有以下非活性成分：微晶纤维素、乳糖一水合物、淀粉乙醇酸钠、胶体二氧化硅、硬脂酸镁和硬明胶胶囊壳。浅橙色、浅橙色/焦糖色和焦糖色不透明的胶囊壳含有明胶、红色氧化铁、黄色氧化铁和二氧化钛；印刷油墨含有虫漆(shellac)、二氧化钛、氢氧化铵、丙二醇和二甲基硅油。
帕博西尼的推荐剂量是125mg胶囊，每天口服一次，连续21天，然后停止治疗7天，以形成一个28天的完整周期。ibrance应与食物一起服用。
当与帕博西尼共同给药时，来曲唑的推荐剂量是在整个28天周期内连续每天一次2.5mg。
当与帕博西尼共同给药时，氟维司群的推荐剂量是在第1天、第15天、第29天并且此后每月一次给药500mg。
另一个示例性cdk4/6抑制剂是abemaciclib。abemaciclib(代号ly2835219；商品名ibrance)是用于多种类型癌症的研究药物。它是细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4和cdk6的口服选择性抑制剂。abemaciclib的分子式是c27h32f2n8。分子量是506.61道尔顿。化学名是2-嘧啶胺,n-(5-((4-乙基-1-哌嗪基)甲基)-2-吡啶基)-5-氟-4-(4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1h-苯并咪唑-6-基)，并且其结构式是：
另一个示例性cdk4/6抑制剂是瑞博西尼。瑞博西尼(代号lee011；商品名kisquali)是用于治疗多种癌症(包括激素受体-阳性和her2-阴性晚期或转移性乳腺癌)的药物。它是一种可以口服的、细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4和cdk6的高选择性抑制剂。瑞博西尼的分子式是c23h30n8o。分子量是434.55道尔顿。化学名是7-环戊基-n,n-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7h-吡咯并[2,3-d]嘧定-6-羧酰胺，并且其结构式是：
建议kisqali片剂每天口服，与或不与食物一起。推荐的起始剂量：每天一次600mg口服(三片200mg片剂)，与或不与食物一起，连续21天，然后停止治疗7天。
iv.基于内分泌的治疗剂
可以使用本领域已知的基于内分泌的治疗剂。示例性的基于内分泌的治疗剂包括非甾体芳香酶抑制剂(例如，来曲唑，anostrozole)和选择性雌激素受体降解剂(例如氟维司群，brilanestrant，elacestrant)。
示例性基于内分泌的治疗剂是来曲唑。来曲唑(商品名femara)是非甾体芳香酶抑制剂(雌激素合成抑制剂)。来曲唑通过竞争性结合芳香酶的细胞色素p450亚基的血红素来抑制芳香酶，导致所有组织中雌激素生物合成减少。其化学描述为4,4'-(1h-1,2,4-三唑-1-基亚甲基)二苄腈，并且其结构式为
来曲唑是一种白色至淡黄色结晶粉末，几乎无味，易溶于二氯甲烷，微溶于乙醇，几乎不溶于水。它的分子量为285.31，实验式为c17h11n5，熔点范围为184℃-185℃。
femara(来曲唑片)可以作为2.5mg片剂用于口服给药。来曲唑含有以下非活性成分：胶体二氧化硅、氧化铁、羟丙基甲基纤维素、乳糖一水合物、硬脂酸镁、玉米淀粉、微晶纤维素、聚乙二醇、羟基乙酸淀粉钠、滑石和二氧化钛。
femara(来曲唑片)的推荐剂量是一片2.5mg的片剂，每天给药一次，不考虑进餐。
另一个示例性基于内分泌的治疗剂是阿那曲唑(商品名arimidex)。arimidex(阿那曲唑)是一种可以口服的、竞争性阻断外周(性腺外)组织中由雄激素向雌激素转化的芳香酶抑制剂。化学名是a,a,a′,a′-四甲基-5-(1h-1,2,4-三唑-1-基甲基)-1,3-苯二乙腈。分子式是c17h19n5并且其结构式：
阿那曲唑易溶于甲醇、丙酮、乙醇和四氢呋喃，极易溶于乙腈。每片含有非活性成分：乳糖、硬脂酸镁、羟丙基甲基纤维素、聚乙二醇、聚维酮、淀粉乙醇酸钠和二氧化钛。arimidex可以1mg片剂用于口服给药，并且areviidex的推荐剂量为每日一片。
另一个示例性基于内分泌的治疗剂是氟维司群(商品名faslodex)。用于肌内给药的faslodex(氟维司群)注射剂是雌激素受体拮抗剂。化学名为7-α-[9-(4,4,5,5,5-五氟戊基亚磺酰基)壬基]雌甾-1,3,5-(10)-三烯-3,17β-二醇。分子式是c32h47f5o3s并且其结构式是：
氟维司群是白色粉末，分子量为606.77。注射用溶液是透明的无色至黄色粘稠液体。每次注射含有非活性成分：10％w/v酒精，usp，10％w/v苯甲醇，nf，和15％w/v作为共溶剂的苯甲酸苄酯，usp，并用作为共溶剂和释放速率调节剂的蓖麻油,usp制成100％w/v。
faslodex的推荐剂量是500mg并且应当在第1天、第15天、第29天和此后每月一次肌肉内注射到臀部中(每次注射1-2分钟)，分为两个5ml注射剂，每半边臀部一个。对于有中度肝功能受损的患者，建议剂量为250mg，肌内缓慢注射到臀部中(1-2分钟)，一剂5ml在第1天、第15天、第29天以及此后每月一次注射。
另一个示例性基于内分泌的治疗剂是brilanestrant(代码名称：gdc-0810、arn-810、rg-6046、ro-7056118)。brilanestrant是一种用于治疗转移性雌激素受体阳性乳腺癌的研究药物。它是一种非甾体联合选择性雌激素受体调节剂(serm)和选择性雌激素受体降解剂(serd)。化学名是(2e)-3-{4-[(1e)-2-(2-氯-4-氟苯基)-1-(1h-吲唑-5-基)丁-1-烯-1-基]苯基}丙-2-烯酸。分子式是c26h20clfn2o2并且其结构式为：
brilanestrant是可以口服的，并且不需要通过肌内注射给药。
另一个示例性基于内分泌的治疗剂是elacestrant(代码名称：rad-1901、er-306323)。elacestrant是一种用于治疗雌激素受体阳性乳腺癌、子宫内膜癌和肾癌的研究药物。它是一种非甾体联合选择性雌激素受体调节剂(serm)和选择性雌激素受体降解剂(serd)。化学名是(6r)-6-{2-[乙基({4-[2-(乙基氨基)乙基]苯基}甲基)氨基]-4-甲氧基苯基}-5,6,7,8-四氢萘-2-醇。分子式是c30h38n2o2并且其结构式为：
elacestrant是可以口服的，并且不需要通过肌内注射给药。
v.结果
本文中提供治疗在人类患者中er+、her2-乳腺癌(例如转移性er+、her2-乳腺癌)的组合物和方法，其包括向患者施用根据特定的临床剂量方案(即，以具体剂量并根据特定服药方案)的抗erbb3抗体(例如seribantumab或istiratumab)、cdk4/6抑制剂(例如帕博西尼、abemaciclib或瑞博西尼)和基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)。本文中还提供治疗在人类患者中er+、her2-乳腺癌(例如转移性er+、her2-腺癌)的组合物和方法，其包括向患者给药根据具体的临床剂量方案(即，以具体剂量并根据特定服药方案)的抗erbb3抗体(例如seribantumab或istiratumab)和基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)。
治疗结果可以使用肿瘤反应的标准量度来评估。靶病变(肿瘤)对治疗的反应分类为：
完全反应(cr)：所有靶病变消失。任何病理性淋巴结(无论靶或非靶)必须具有到<10mm的短轴缩减；
部分反应(pr)：将基线总和直径用作参考，靶病变的直径的总和减小至少30％；
进行性疾病(pd)：将研究的最小总和(如果其为研究的最小，那么这包括基线总和)用作参考，靶病变的直径总和增大至少20％。除20％的相对增大之外，总和还必须展现至少5mm的绝对增大。(注意：一个或多个新病变的出现也视为进展)；和
稳定性疾病(sd)：将在研究时的最小总和直径用作参考，既没有足够的收缩以认定pr也没有足够的增大以认定pd。(注意：不使直径的总和增大5mm或更多的20％或更少的改变被编码为稳定性疾病)。待被指定为稳定性疾病的状态，量度必须在研究以6周的最小间隔进行之后已经满足稳定疾病标准至少一次。
非靶病变对治疗的反应分类为：
完全反应(cr):所有非靶病变的消失和肿瘤标记物水平级的归一化。所有淋巴结必须在大小上是非病理性的(<10mm短轴)。如果肿瘤标记物初始地高于正常上限，那么它们必须对于患者归一化以被认为是完全临床反应；
非cr/非pd：—个或多个非靶病变的持续和/或肿瘤标记物水平维持高于正常界限值；和
进行性疾病(pd)：—个或多个新病变的出现和现有非靶病变的明确进展中的任一者或两者。在此情形下，明确进展必须表示整体疾病状态改变，非单个病变增大。
根据本文公开的方法治疗的患者优选地经历至少一种癌症迹象的改善。例如，治疗可产生至少一种选自以下的治疗效果：肿瘤尺寸减小、转移减少、完全缓解、部分缓解、疾病稳定、总反应率增加或病理完全反应。还可以通过减少可测量的肿瘤病变的数量和/或大小来测量反应。可测量的病变定义为可通过ct扫描(ct扫描切片厚度不大于5mm)在至少一个维度(最长直径将被记录)中精确测量为>10mm、通过临床检查10mm卡尺测量或胸部x光检查>20mm的那些病变。还可以测量非靶病变(例如病理性淋巴结)的大小以用于改善。可以使用例如x射线、ct或mri图像来测量病变。显微镜检查、细胞学检查或组织学检查也可用于评估对治疗的反应性。当可测量的肿瘤已经以别的方式满足反应或疾病稳定的标准时，在治疗期间出现或恶化的积液可以被认为是指示肿瘤进展，但是这仅当细胞学确认积液起源于肿瘤时成立。
在另一个实施方式中，如此治疗的患者经历肿瘤缩小和/或生长速率降低，即抑制肿瘤生长。在另一个实施方式中，减少或抑制肿瘤细胞增殖。或者，以下中的一个或多个可以表明对治疗的有益反应：可以降低癌细胞的数量；可以降低肿瘤大小；可以抑制、延迟、减慢或停止癌细胞浸润到外周器官；可以减缓或抑制肿瘤转移；可以抑制肿瘤生长；可以预防或延迟肿瘤复发；可以在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。有利反应的其他指征包括可测量的肿瘤病变或非靶病变的数量和/或大小的降低。
vi.试剂盒和单位剂型
本文中还提供试剂盒，其包含以适用于前述方法的治疗有效量的抗erbb3抗体(例如seribantumab或istiratumab)、cdk4/6抑制剂(例如帕博西尼、abemaciclib或瑞博西尼)和基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)。在另一个实施方式中，试剂盒包含以适用于前述方法的治疗有效量的抗erbb3抗体(例如seribantumab或istiratumab)和基于内分泌的治疗剂(例如来曲唑或氟维司群)。试剂盒可选地还可以包含说明书，例如包含给药方案，以允许从业者(例如，医生、护士或患者)将包含在其中的治疗剂给药于患有癌症的患者。该试剂盒还可包括注射器。给药药物组合物所必需的器械或装置也可包括在试剂盒中。
在一个实施方式中，本发明提供了试剂盒，其包含：(a)一剂seribantumab或istiratumab，(b)一剂帕博西尼，(c)一剂来曲唑或氟维司群，和(d)在本文所描述的方法中使用来曲唑或氟维司群与seribantumab或istiratumab和帕博西尼联合使用的说明书。在另一个实施方式中，试剂盒包含：(a)一剂seribantumab或istiratumab，(b)一剂来曲唑或氟维司群，和(c)在本文描述的方法中使用来曲唑或氟维司群与seribantumab或istiratumab组合的说明书。
以下实施例仅是说明性的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围，因为本领域技术人员在阅读本公开后将会明白许多变化和等同物。
本申请中引用的所有参考文献、genbank条目、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
材料和方法
细胞系、细胞培养和试剂
mcf-7、t47d、zr75-1和hcc-1428从美国典型培养物保藏中心(“atcc”rockville，md，usa)获得。所有细胞在补充有10％v/v热灭活的fbs、5％v/vl-谷氨酰胺和5％v/v青霉素-链霉素溶液的rpmi1640培养基中培养。除非另有说明，否则所有培养试剂均来自gibco。当需要无激素条件时，将细胞培养在不含酚红的rpmi1640培养基中，该培养基补充有10％v/v活性炭剥离、热灭活的fbs、5％v/vl-谷氨酰胺和5％v/v青霉素-链霉素溶液。为了确保用于生长因子刺激测定的低生长因子条件，将细胞在低血清条件下培养，例如3％v/v热灭活的fbs或1％v/v热灭活的fbs，其中正常补充其他培养基组分。所有细胞系在37℃、具有95％空气、5％co2的潮湿气氛中培养。所使用的所有细胞的身份通过atcc的微卫星分析进行验证。
重组调节蛋白(hrgβ1)来自r&dsystems(396-hb)。celltiter-glo测定试剂来自promega。雌二醇(e8875)和氟维司群(14409)来自sigma-aldrich。他莫昔芬(s1972)、帕博西尼(s1579)，abemaciclib(s7158)和瑞博西尼(s7440)均来自selleckchem。
增殖测试
将细胞一式两份或一式三份接种，每孔1500至5000个细胞，在96孔板中，具有透明底部的不透明壁96孔板：96孔，黑色/透明，带盖的平底，falcon，353219，以3％v/vfbs或1％v/vfbs在降低的血清条件下。铺板后第二天加入重组hrgβ1以产生10nm的终浓度。对照孔接收没有hrgβ1的培养基。然后将平板在37℃、95％空气、5％co2的潮湿气氛中孵育指定的4-6天的时间段。
对于包括靶向mab、seribantumab(mm-121)或cdk抑制剂(诸如帕博西尼，abemaciclib或瑞博西尼)erbb3和hrgβ1的研究，将细胞一式两份或一式三份接种，每孔1500至5000个细胞，在96孔板中，具有透明底部的不透明壁96孔板：纳米培养板，ms模式，低结合，scivaxlifesciencencp-ls96-10以3％v/vfbs或1％v/vfbs在降低的血清条件下。铺板后第二天加入重组hrgβ1以产生10nm的终浓度。对照孔接收没有hrgβ1的培养基。在指示的情况下，添加seribantumab以达到1μm的终浓度或整个稀释系列以实现每板10次稀释，以实现每行2个对照孔的剂量-反应曲线。在指示的情况下，以10μm加入cdk抑制剂，并进行稀释以产生剂量-反应曲线，每行2个对照孔。然后将板在37℃下在95％空气、5％co2的潮湿气氛中孵育指定的4-6天的时间段。生长抑制计算为在相同时间段内用生长因子或拮抗剂处理的细胞对仅用稀释剂处理的细胞生长的相对抑制或增殖的函数
对于包括靶向mab、seribantumab(mm-121)或cdk抑制剂(诸如帕博西尼，abemaciclib或瑞博西尼)erbb3和hrgβ1的研究，将细胞一式两份或一式三份接种，每孔1500至5000个细胞，在96孔板中，具有透明底部的不透明壁96孔板：纳米培养板，ms模式，低结合，scivaxlifesciencencp-ls96-10以3％v/vfbs或1％v/vfbs在降低的血清条件下。铺板后第二天加入重组hrgβ1以产生10nm的终浓度。对照孔接收没有hrgβ1的培养基。在指示的情况下，添加seribantumab以达到1μm的终浓度或整个稀释系列以实现每板10次稀释，以实现每行2个对照孔的剂量-反应曲线。在指示的情况下，以10μm加入cdk抑制剂，并进行稀释以产生剂量-反应曲线，每行2个对照孔。然后将板在37℃下在95％空气、5％co2的潮湿气氛中孵育指定的4-6天的时间段。
为了测量增殖，按照制造商的说明进行celltiter-glo(ctg)测定。具体地，将试剂-1和试剂-2平衡至室温，此时将试剂-1加入试剂-2中并通过涡旋混合。将含有细胞的测试板平衡至室温30分钟，此时将等体积的ctg试剂加入到测试板的每个孔中，典型地为100μl，以使每孔的最终体积为200μl。然后用箔板密封器密封每个板并在轨道振荡器上混合10分钟以裂解细胞并释放细胞atp。混合后，将板在室温下温育15分钟，以稳定发光信号。通过使用发光程序在synergyhi板读数器上测量相对发光来收集数据。计算生长并表示为每个单独板上未刺激的对照孔的相对值。生长抑制计算为在相同时间段内用拮抗剂处理的细胞对仅用稀释剂处理的细胞生长的相对抑制的函数。然后使用graphpadprism软件绘制数据。
实施例1：表型不同的hrg阳性癌细胞影响转移性乳腺癌模型中的护理治疗标准。
erbb3是人表皮生长因子受体(erbb或her)家族的成员，该家族由四种受体(erbb1-4)组成。erbb网络的一个典型义特征是该系列的两个成员erbb2和erbb3是非自主的。erbb2缺乏与生长因子配体相互作用的能力，而erbb3的激酶活性是有缺陷的。heregulin(hrg)是一种erbb3配体，其已被确定为增殖和增强存活的有效驱动力。hrg表达导致不同的肿瘤细胞表型，其特征在于不能响应多种护理标准(soc)疗法(包括化学疗法、抗激素剂和其他靶向疗法)的效果。
在hrg表达的调查中，hrg+细胞存在于大多数实体瘤类型的约50％的病例中。假设这些hrg+细胞受到保护免受soc治疗的影响并且即使在soc存在下也继续增殖，导致有限的临床收益。在该模型中，如果hrg活性被阻断，hrg+细胞变得对soc敏感，导致增强的临床收益。seribantumab是一种完全人源抗erbb3单克隆抗体，旨在通过抑制hrg与erbb3的结合来阻断hrg活性。在seribantumab存在下，预计hrg+肿瘤细胞能够响应共同给药的soc治疗。
对于激素受体阳性(hr+)乳腺癌来说，激素剥夺策略已经证明在佐剂和转移性设置中具有临床收益。不幸的是，这些疗法的临床收益在一些患者中可能是短暂的。这些患者的最佳临床管理需要对快速临床进展的驱动因素进行全面的分子理解。已经显示，在肿瘤样品中测量的hrgmrna表达定义了与那些肿瘤不表达hrg的患者相比仅从soc获得有限临床益处的患者亚组。这是在如下观察到的：在先前发表的依西美坦2期临床研究中，以及临床前使用多种类型的抗激素剂包括来曲唑和氟维司群治疗(目前代表hr+、her2阴性(her2-)晚期乳腺癌的主要治疗方案)。
数据支持了如下的假设：尽管使用soc和各种新型治疗方法，乳腺癌模型中表型不同的hrg+细胞仍然存在。此外，数据表明，将seribantumab添加到这些其他疗法对于持续治疗反应非常重要。hrg+细胞的持续扩增可能是在用soc治疗的乳腺癌患者中快速临床进展的关键。这些发现支持了在hr+、her2-晚期乳腺癌的3期临床试验中seribantumab与抗激素药物联合的开发。
实施例2：heregulinmrna在患有er+、her2-乳腺癌的患者中是普遍的。
乳腺癌细胞中的hrg表达可通过激活her3信号传导来促进癌症进展和对治疗的抗性。为了详细说明该发现，在tcga公共数据库中以及通过使用临床相关hrgrna-ish测定直接测量197个er阳性、her2阴性乳腺癌肿瘤中的hrgmrna，来检查了hrgmrna的患病率。发现tcga数据库和患者样品二者均表现出具有45％的hrgmrna的患病率(图1)。
实施例3：heregulin诱导er+、her2-乳腺癌细胞系的增殖
刺激具有hrg的er+、her2-乳腺癌细胞系6天，并在体外测量增殖。结果(图2)表明hrg诱导mcf7、t47d和hcc1428细胞系的增殖，所有这些细胞系都是er+、her2-细胞模型。这些数据支持以下结论：hrg的存在驱动癌细胞增殖。
实施例4：heregulin增加抗激素剂在er+、her2-乳腺癌细胞系中的活性。
氟维司群被归类为“serd”选择性雌激素受体降解剂，广泛用于治疗晚期er+乳腺癌患者。serd拮抗激素与受体的结合，并促进受体蛋白的降解，从而具有双重作用机制(moa)以抑制激素受体信号传导和癌细胞生长。如图3所示，hrg显著增加mcf7和t47d细胞的增殖，比雌二醇(e2)增加得更多。雌二醇和hrg的组合导致两种细胞系中的增殖增加。氟维司群(100nm)在mcf7和t47d细胞系二者中均有效抑制雌二醇诱导的增殖。然而，当存在hrg时，除雌二醇外，氟维司群活性也显著降低(图3)。最后，向用氟维司群、雌二醇和hrg处理的细胞中添加seribantumab导致氟维司群的活性恢复，在mcf7细胞中观察到最大程度的抑制。这些数据表明erbb3配体hrg(其在人er+、her2-乳腺癌中普遍存在)可以诱导乳腺癌细胞系的增殖并且可以抑制抗激素治疗剂(例如氟维司群)的有效性。此外，seribantumab可以恢复hrg介导的氟维司群抗性细胞中的氟维司群敏感性。
实施例5：hrg抑制cdk抑制剂在er+、her2-乳腺癌细胞系中的活性并且seribantumab恢复敏感性。
在加入或不加入seribantumab的情况下，在不存在或不存在hrg的情况下，用cdk4/6抑制剂处理er+、her2-乳腺癌细胞，然后使用ctg测定法测量增殖(图4)。在整个剂量范围内用单一试剂cdk4/6抑制剂处理的mcf7细胞(最左侧的点，a-c，图4)证明帕博西尼、abemaciclib和瑞博西尼以剂量依赖性方式和类似程度抑制增殖。还在整个相同剂量范围上用具有饱和剂量的hrg(10nm)的每种cdk4/6抑制剂处理mcf7细胞。hrg刺激显著压制cdk4/6抑制剂活性并且增加增殖(中间的点，a-c，图4)。seribantumab的添加恢复了cdk抑制活性(右手图，a-c，图4)。在另一种er+、her2-细胞系zr75-1中获得了类似的结果，其中hrg再次抑制cdk4/6抑制剂的活性，并且seribantumab恢复了敏感性(图5a-5c)。总之，这些数据表明hrg-erbb3信号传导促进对cdk4/6抑制剂的生长抑制作用的不敏感性。
实施例6：heregulin抑制cdk4/6抑制剂与内分泌治疗剂的联合在er+、her2-转移性乳腺癌细胞系中的活性并且seribantumab恢复敏感性。
mcf7细胞最初用各种组合来处理：1)帕博西尼或abemaciclib或瑞博西尼，2)hrg，3)氟维司群和4)seribantumab，并且通过ctg测定法测量增殖。当用cdk4/6抑制剂加氟维司群(50nm)的组合处理mcf7细胞时，增殖的抑制程度大于单独的cdk4/6抑制剂的活性(图6a-6c)。此外，对于每种cdk4/6抑制剂-氟维司群组合，通过添加hrg来阻断该组合的活性，并且seribantumab添加恢复对cdk4/6抑制剂-氟维司群组合的敏感性(图6a-6c)。使用相同的实验设计来测试其中他莫昔芬替代氟维司群的相匹配的组合，具有类似的结果(图7a-7c)。
实施例7：在先前未治疗转移性乳腺癌的患者中用帕博西尼、激素治疗剂和seribantumab治疗er+、her2-转移性乳腺癌。
患有er+、her2-转移性乳腺癌的患者用一个帕博西尼125mg胶囊治疗，每天口服一次，连续21天，然后停止治疗7天，以形成一个28天的完整周期。患者用来曲唑治疗同时治疗，在整个28-天的周期中每天一次连续给予2.5mg，者或用氟维司群同时治疗，在第1天、第15天、第29天并且此后每月一次以500mg剂量给药。患者也用通过静脉输注以每两周3g剂量的seribantumab同时治疗。这种治疗导致有益的结果，例如疾病稳定、部分反应或完全反应。
实施例8：用帕博西尼、激素治疗剂和seribantumab在先前已用帕博西尼和激素治疗剂治疗过且其癌症在该治疗后已经取得进展的患者中治疗er+、her2-转移性乳腺癌。
在先前已用帕博西尼和来曲唑或氟维司群治疗过且已经对这种治疗具有耐药性的患有er+、her2-转移性乳腺癌的患者用一个帕博西尼125mg胶囊治疗，每天口服一次，连续21天，然后停止治疗7天，以形成一个28天的完整周期。该患者用来曲唑(如果患者先前已经用氟维司群处理过)或氟维司群(如果患者先前已经用来曲唑处理过)同时治疗。来曲唑在整个28天周期内连续每天给予一次2.5mg剂量给药，或氟维司群在第1天、第15天、第29天并且此后每月一次以500mg剂量给药给药。患者还用通过静脉输注以每两周3g剂量的seribantumab同时治疗。这种治疗导致有益的结果，例如疾病稳定、部分反应或完全反应。
实施例9：通过heregulin(hrg)减轻氟维司群或cdk4/6抑制剂在hr+her2-乳腺癌细胞中的活性来激活cdk2，并且seribantumab恢复活性。
以下实验证明her3抑制剂能够通过药物(例如帕博西尼、abemaciclib和瑞博西尼)在cdk4/6抑制的存在下通过hrg阻断非典型的cdk2复合物。
如图8-10所示，将mcf7细胞用10nmhrg、100nm氟维司群、100nm帕博西尼、100nmabemaciclib或1μm的seribantumab单独或组合处理20-24小时。通过在mper裂解缓冲液中裂解并在冰上加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂30分钟来制备细胞裂解物。通过以10000rpm离心除去细胞碎片。根据标准方案通过蛋白质印迹来分析蛋白质。通过用β-肌动蛋白抗体(β-actin(13e5)rabbitmab#4970cellsignalingtechnology)进行印迹来估计蛋白质加载，并通过用pcdk2抗体(phospho-cdk2(thr160)抗体#2561,cellsignalingtechnology)检测cdk2的苏氨酸-160处的磷酸化来测量cdk2活化。
图8证明hrg能够激活hr+、her2-乳腺癌细胞中的cdk2，并且seribantumab能够阻断hrg对cdk2激活的活化作用。另外，抗激素剂、氟维司群和两种cdk4/6抑制剂(帕博西尼或abemaciclib)均抑制cdk2激活，并且hrg阻断这种抑制活性(图9和10)。此外，在存在氟维司群(图9)或cdk4/6抑制剂帕博西尼和abemaciclib的情况下，seribantumab阻断hrg介导的cdk2的激活(图10)。
这些发现的意义在于：hrg抑制内分泌治疗(例如氟维司群)和cdk4/6抑制剂(例如帕博西尼或abemaciclib)活性的机制之一可能是cdk2的非典型激活，以促进细胞周期转变。这些结果表明，seribantumab阻断了cdk2的这种激活，因此恢复了护理标准治疗剂(例如氟维司群和cdk4/6抑制剂)的活性。
实施例10：hrg是一种高效配体，其抑制氟维司群、帕博西尼及其组合在er阳性、her2阴性乳腺癌细胞中的活性。
用多种受体酪氨酸激酶配体(rtkl)或雌激素(e2)治疗er+her2-细胞系，表明调节蛋白(hrg)是抑制氟维司群、帕博西尼或者氟维司群与帕博西尼的组合的活性的最有效的rtkl。
该实验的目的是确定hrg对抗雌激素治疗剂(例如氟维司群)和cdk4-6抑制剂(例如帕博西尼)或其组合的活性的观察效果是否特异于hrg，或者是否存在可能由其他生长促进各种癌症中发现的rtk配体介导的更广泛的效果。为了验证这一假设，在下列配体(浓度1nm)存在下，用氟维司群(50nm)、帕博西尼(40nm)作为单一试剂或者帕博西尼加氟维司群(40nm+50nm)的组合进行处理er+her2-细胞系mcf7(图11)和t47d(图12)持续6天，此时使用ctg测定法测量细胞生长。
egf家族配体：
表皮生长因子(egf)
调节蛋白(hrg)
双调蛋白(areg)
β-细胞素(btc)
表皮调节蛋白(epr)
肝素结合表皮生长因子(hb-egf)
转化生长因子α(tgfα)
其他配体：
雌二醇(e2)
胰岛素样生长因子1(igf-1)
肝细胞生长因子(hgf)
碱性成纤维生长因子(fgf2)
数据表明，hrg是在抑制氟维司群活性、帕博西尼活性以及帕博西尼与氟维司群的组合中测试的所有配体中最有效的配体。这些包括egf家族配体和其他配体诸如e2、igf1和fgf2。
实施例11：hrg促进er+her2-细胞的s-期细胞周期进展。hrg抑制在er+阳性、her2-阴性乳腺癌细胞中帕博西尼与氟维司群联合对dna合成的活性。seribantumab恢复这种联合的抑制活性。
该实验的目的是确定hrg对帕博西尼和氟维司群在细胞周期进展水平上的活性的影响。此外，设计该实验以确定seribantumab是否通过阻断hrg的作用来恢复单个组分的细胞周期抑制活性或者临床批准的药物组合的附加活性。
将mcf7细胞用帕博西尼、氟维司群、hrg和seribantumab的组合处理24小时，用具有10μmedu的脉冲标记2小时，固定，用
数据表明hrg能够促进er+her2-乳腺癌细胞的s期细胞周期进展(图13a)，其中静息细胞的s期细胞的比例为15.8％，在hrg处理的样品中s期细胞的比例为55％，表明hrg能够介导dna合成和细胞周期向有丝分裂的进展。此外，在没有hrg的情况下，用氟维司群(图13b)或帕博西尼(图13c)作为单一试剂治疗mcf7细胞表明这两种药物都有效抑制s期细胞周期进展，发现这与对这些药物提出的行动机制和已发表的文献是一致的。然而，如图13a-13c所示，hrg的存在显著抑制了这些药物的细胞周期抑制活性，并且seribantumab恢复了这种活性。
最后，由于帕博西尼和氟维司群通常在er+、her2-乳腺癌患者中组合使用，因此测试了hrg对组合活性的影响以及seribantumab是否能够恢复该活性。与我们先前的发现一致，hrg阻断了帕博西尼-氟维司群组合的细胞周期抑制活性，并且seribantumab恢复了这种活性(图13d)。这些发现与我们的其他发现一致，即hrg能够阻断er+her2-晚期乳腺癌的临床相关和批准的药物组合的活性，并且seribantumab恢复该活性。
实施例12：seribantumab在er+、her2-乳腺癌的人原位异种移植物模型中增强氟维司群的活性或氟维司群与帕博西尼的组合的活性。
该实验的目的是，确定向氟维司群或帕博西尼或者其组合中添加seribantumab是否增加er+her2-乳腺癌的原位异种移植模型中的功效。
将8～10周龄的雌性sho小鼠(charlesriverlaboratories)植入17-β-雌二醇颗粒(0.72mg/丸)，并且2天后，注射100μl悬浮于50％dpbs/50％matrigel中的5×106mcf7细胞进入腹部乳房脂肪垫。每周监测肿瘤生长两次，并根据公式(肿瘤大小＝π/6×[长度×宽度2])在外部卡尺测量后计算肿瘤体积。一旦平均测量的肿瘤体积达到约200mm3，将小鼠随机分组并施用治疗。总体而言，每组的平均起始肿瘤体积在所有组中是相等的。经由皮下递送，以每只小鼠500μg每周一次给药氟维司群。以25mg/kg给药帕博西尼，每天口服，持续5天，周一至周五。经由腹膜内注射每周两次给予每只小鼠600μgseribantumab。
图14a-14b显示当单独使用任一种试剂时，添加seribantumab增加氟维司群(图14a)和帕博西尼(图14b)的抗肿瘤功效。此外，图14c显示seribantumab增加了帕博西尼和氟维司群的组合的生长抑制。
该数据与更广泛的体外发现一致，即hrg可以阻断抗内分泌治疗剂(诸如他莫昔芬或氟维司群)、cdk4-6抑制剂(例如，帕博西尼、瑞博西尼或abemaciclib)及其组合的活性。
实施例13：hrg增强rb的磷酸化以促进细胞周期转变并抑制氟维司群、cdk4/6抑制剂(例如，帕博西尼或abemaciclib)对rb磷酸化的活性。seribantumab能够通过阻断人er+her2-乳腺癌细胞中的hrg来恢复活性。
该实验的目的是检查hrg对关键细胞周期蛋白rb的影响，其涉及通过cdk4/6活性介导细胞周期进展。cdk4/6抑制剂(例如，帕博西尼、瑞博西尼和abemaciclib)具有依赖于细胞周期蛋白d-cdk4/6复合物和rb蛋白的作用机制。cdk4/6抑制剂引起rb蛋白的去磷酸化，其抑制e2f基因的转录以及由此的细胞周期抑制。
如上所述培养mcf7细胞。如图15所示，用10nmhrg、50nm氟维司群、40nm帕博西尼、40nmabemaciclib或1μm的seribantumab单独或组合处理细胞20-24小时。通过在mper裂解缓冲液中裂解并在冰上加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂30分钟来制备细胞裂解物。通过以10000rpm离心除去细胞碎片。根据标准方案通过蛋白质印迹来分析蛋白质。通过用β-肌动蛋白抗体(β-actin(13e5)rabbitmab#4970cellsignaling)进行印迹来估计蛋白质加载，并通过在prb(s807/811):cat#8516prb(s780):cat#8180处检测rb(prb)的磷酸化来测量rb激活。对照抗体如下总akt：cat#9272pakt:cat#4060。
图15显示hrg促进rb的磷酸化和激活，其抵消氟维司群和cdk4/6抑制剂、帕博西尼和abemaciclib单独或组合的活性。此外，seribantumab恢复氟维司群和cdk4/6抑制剂、帕博西尼和abemaciclib单独或组合的活性。
实施例14：seribantuma和来曲唑共同治疗延迟了抗性的发作并恢复了mcf-7ca异种移植物中对来曲唑的敏感性。
使用绝经后er+乳腺癌的模型来确定阻断hrg介导的erb3信号传导和/或雌激素介导的er激活对肿瘤生长的影响(图16)。在雌性卵巢切除的裸鼠中产生mcf-7ca异种移植物肿瘤，其随机接受载体(“对照”；在0.9％nacl中的0.3％羟丙基纤维素(hpc)，每周两次(q2w)，腹膜内注射(ip)；15只小鼠/组)、seribantumab(750μg/小鼠，q2w，ip；15只小鼠/组)、来曲唑(10μg/小鼠/天x5天/周(qdx5)，皮下注射(sq)；60只小鼠/组)或者来曲唑与seribantumab的组合(按照单一治疗剂所示的剂量(15只小鼠/组))。通过卡尺测量每周测定平均肿瘤体积(±sem)的变化。在产生对来曲唑的耐药性(第14周)后，将仅给药来曲唑的组中的小鼠再次随机分成15只小鼠/组，以接受：单独使用来曲唑；单独使用seribantumab；或来曲唑与seribantumab的组合。
mcf-7ca衍生的异种移植物肿瘤最初对来曲唑有反应，但在治疗约7-8周后开始产生耐药性(图16)。然而，当小鼠与来曲唑和seribantumab共同处理时，肿瘤生长受到抑制，并且对来曲唑的抗性显著延迟。这表明hrg/erbb3信号传导在研究开始时是活跃的，或者在对来曲唑治疗反应时相对快速地发展。一旦明确建立对来曲唑的抗性(第14周)，将来曲唑处理组中的小鼠再次随机分为两个群组中的一个：(i)继续进行来曲唑单一治疗或(ii)seritrantumab与来曲唑组合。值得注意的是，与单独使用来曲唑治疗相比，对来曲唑抗性的肿瘤在用来曲唑和seribantumab共同治疗时显示出显著降低的肿瘤生长。这与以下假设一致：阻断雌激素/er-和hrg/erbb33二者驱动的信号传导提供了比单独阻断任一途径更强的抗肿瘤活性。
实施例15：对患有er/pr阳性、her2阴性局部晚期或转移性乳腺癌且其肿瘤表达通过rna原位杂交(rna-ish)测定的hrg的患者给予以下两种治疗方案中的一种。
治疗a
·seribantumab：在每个28天周期的第1天和第15天，固定剂量3000mgiv
·氟维司群：在第1周期的第1天和第15天以及在随后的每个28天周期的第1天，肌内注射(im)500mg
治疗b
·seribantumab：在每个28天周期的第1天和第15天，固定剂量3000mgiv
·来曲唑：2.5mgpo，每天一次
这种治疗方案产生有益的结果，例如疾病稳定、部分反应或完全反应。
在某些情况下，患者符合以下一些或任何入选标准：
a)组织学或细胞学证实的er+和/或pr+(染色>1％细胞)乳腺癌
b)用促性腺激素释放激素(gnrh)激动剂(例如戈舍瑞林)确认的由于手术/自然绝经或卵巢抑制(在第1周期第1天之前至少28天开始)引起的绝经后状态
c)根据asco/cap指南her2阴性
d)通过集中测试未染色的肿瘤组织确定的具有≥1+分数的heregulin的阳性原位杂交(ish)测试
e)必须具有至少一个可以进行针穿刺活检或细针穿刺的病变
f)在局部晚期或转移性疾病设置中进行至少一次但不超过三次的先前全身性治疗后进展
·接受用于局部晚期或转移性疾病的先前基于cdk抑制剂的治疗
·接受不超过一个用于局部晚期或转移性疾病的先前化疗线
g)由recistv1.1定义的局部晚期或转移性疾病的记录的进展。例外：如果患有仅骨转移性疾病的患者在ct或mri上可见至少2个溶解性病变，并且根据新病变的出现已经记录了先前治疗后的疾病进展，则该患者符合条件。
·接受过对仅骨转移性病变进行放射治疗的患有仅骨病变的患者必须在放射治疗后已经记录了进展。
h)能够理解并签署知情同意书(或有能够这样做的法律代表)
i)0或1的ecog性能分数(ps)
j)足够的骨髓储备，由如下所证实：
·anc>1500/μl
·血小板计数>100000/μl；并且
·血红蛋白>9g/dl
k)充足的肝功能，由如下所证实：
·除morbusgilbert患者外，血清总胆红素≤1.5xuln
·天冬氨酸氨基转移酶(ast)，丙氨酸氨基转移酶(alt)和碱性磷酸酶≤2.5xuln(如果存在肝转移，≤5xuln是可接受的，并且如果存在骨转移，则≤5xuln的碱性磷酸酶是可接受的)
l)足够的肾功能，由血清肌酐≤1.5xuln来证明
m)从任何既往手术、放射治疗或其他抗肿瘤治疗的临床显著效果中恢复。
n)根据美国临床肿瘤学会(asco)指南，可以用骨修饰剂(例如双膦酸盐或核因子κ-b(rank)受体活化剂-配体试剂(例如狄迪诺塞麦)治疗患者；在可能的情况下，需要骨修饰剂的患者应在研究治疗前>7天开始治疗，并应在整个研究期间继续使用相同的药物，除非临床上有必要改变
o)年龄≥18岁
p)在签署主要同意书后60天内经历过静脉血栓栓塞事件的患者应在本研究开始治疗前至少7天用抗凝血剂治疗。
在某些情况下，患者不符合以下任何排除标准：
a)用抗erbb3抗体预先治疗
b)在局部晚期或转移性设置中使用氟维司群预先治疗
c)不受控制的cns疾病或存在软脑膜病
d)在过去2年中需要全身性治疗的另一种活动性恶性肿瘤的病史。具有原位癌症或基底或鳞状细胞皮肤癌的既往病史的患者是合格的
e)在筛选访视期间或在施药的第一个预定日期，活动性感染或不明原因发热>38.5℃，研究者认为这可能会影响患者参与试验或影响研究结果。根据研究者的判断，可以招募患有肿瘤发热的患者
f)已知对seribantumab、氟维司群的任何成分具有超敏性，或者对完全人单克隆抗体有超敏反应
g)接受过其他近期抗肿瘤治疗，包括：
·在本研究的第一个预定给药日之前、在28天或5个半衰期内(以较短者为准)进行的研究性治疗
·本研究中第一次预定剂量前14天内的放射或其他标准全身治疗，此外包括(如有必要)解决此类放射引起的任何实际或预期毒性的时间范围
h)nyhaiii或iv级充血心力衰竭
i)患有心脏病史(即不受控制的血压，不稳定性心绞痛，1年内心肌梗死，或者需要药物治疗的室性心律失常)的患者也被排除在外
j)需要静脉注射抗生素、抗病毒药物或抗真菌药的不受控制的感染；或活动性的人类免疫缺陷病毒(hiv)感染、活动性乙型肝炎感染或者活动性丙型肝炎感染
k)研究者认为可能干扰患者签署知情同意书的能力、干扰患者合作和参与研究的能力或干扰结果演绎的任何其他医疗状况
序列总结
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