用于通过离心制备脂质体的方法和装置与流程

根据35u.s.c.§119(e)，本申请要求2016年5月26日提交的美国临时专利申请序列号62/342,112的申请日的优先权；将所述申请的公开内容通过引用并入本文。

引言

脂质体是具有一个或多个脂双层的球形囊泡。包括单个脂双层的脂质体可以称为单层脂质体，而包括多个脂双层的脂质体可以称为多层囊泡。脂质体可以使用不同方法制备，这可以取决于以下因素，如脂质体脂双层的脂质组成、脂质囊泡分散于其中的介质的类型、脂质体的所需尺寸、脂质体的所需多分散性、生产方法的稳健性和批次间重现性以及其他因素，如所得脂质体的预期用途。例如，脂质体可以包含诸如药物等物质，并且可以用于将所述物质递送到患者的目标区域。因此，用于产生此类脂质体的方法还可以取决于待包埋在脂质体中的物质的物理化学特征、包埋物质的浓度或在将脂质体施用/递送给患者期间所涉及的其他过程。

在已经产生脂质体悬浮液(如大的多层囊泡的悬浮液)之后，可能需要产生具有一定尺寸范围内的尺寸的脂质体。用于确定脂质体尺寸的一种常用技术是超声处理，在这种情况下可以使用声能破坏大的多层囊泡。例如，超声处理可以用于从大的多层囊泡产生小的单层囊泡。

技术实现要素：

提供了用于产生脂质体的方法和装置。所述方法的方面包括以足以使脂质体通过多孔膜的方式向脂质体悬浮液施加离心力以产生脂质体群。本发明的方面还包括用于执行所述方法的装置、系统和套件。

附图说明

图1a是根据本公开的实施方案的脂质体挤出装置的图示。

图1b是根据本公开的实施方案的使用脂质体挤出装置产生脂质体群的方法的图示。

图2a和图2b提供了来自通过本发明的离心方法制备的脂质体的流式细胞术分析的数据，其示出了侧向散射(scc)(图2a)或荧光素荧光(图2b)与脂质体尺寸之间的线性相关性。

具体实施方式

提供了用于产生脂质体群的方法和装置。所述方法的方面包括以足以使脂质体通过多孔膜的方式向脂质体悬浮液施加离心力以产生脂质体群。本发明的方面还包括用于执行所述方法的装置、系统和套件。

在更详细地描述本公开的实施方案之前，应理解这些实施方案不限于所描述的特定实施方案，因为这些实施方案可以变化。还应理解本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并不旨在是限制性的，因为本公开的实施方案的范围将仅由所附权利要求限定。

在提供值的范围的情况下，应理解除非上下文另外清晰地指示，该范围的上限和下限与在该陈述范围内的任何其他所陈述或中间值之间的每个中间值(直到下限的第十个单位)均被涵盖在本公开的实施方案之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内，并且也被涵盖在本公开的实施方案之内，受所陈述范围内任何特别排除的限值的限制。在所陈述范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些被包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本公开的实施方案之内。

除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本公开的实施方案的实践或测试中，现在将对代表性的说明性方法和材料进行描述。

在本说明书中引用的所有出版物和专利都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利被确切地且单独地指示为通过引用并入，并且通过引用并入本文从而结合引用的出版物披露和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引用内容是针对在申请日之前的公开内容，并且不能理解为承认因为先前发明而本公开的实施方案不能获得比这些出版物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地证实。

应注意，如在本文以及在所附权利要求中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清晰地指示。还应注意，权利要求可以撰写成排除任何任选的要素。因此，此陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。

如对于本领域技术人员将显而易见的，阅读本公开时，本文描述和说明的单独实施方案中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不背离本公开的实施方案的范围或精神的情况下易于与任何其他一些实施方案的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来执行任何所叙述的方法。

如上文综述的，本公开提供了用于产生脂质体群的方法。在进一步描述本公开的实施方案时，首先更详细地描述主题方法。接下来，描述可用于执行所述方法的装置。此外，还提供了包括主题装置的系统以及套件。

用于产生脂质体的方法

本公开的方面包括用于产生脂质体群的方法。在一些实例中，通过所述方法产生的脂质体群是具有确定的尺寸的脂质体群。确定的尺寸意指由于制备脂质体的方式，群体中各个脂质体的尺寸是已知的，并且具体地说，群体中脂质体尺寸的范围是已知的。在一些情况下，脂质体具有基本上相同的平均尺寸。例如，在球形脂质体的情况下，脂质体群可以具有基本上相同的平均直径。“平均值”意指算术平均值。基本上相同的值包括彼此相差50％或更少(如45％或更少、或40％或更少、或35％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或20％或更少、或15％或更少、或10％或更少、或5％或更少、或3％或更少、或1％或更少、或0.5％或更少)的值。在一些情况下，基本上相同的值包括彼此相差10％或更少的值。在一些情况下，基本上相同的值包括彼此相差5％或更少的值。在一些情况下，基本上相同的值包括彼此相差3％或更少的值。在一些情况下，基本上相同的值包括彼此相差1％或更少的值。在一些情况下，基本上相同的值包括彼此相差0.5％或更少的值。在一些实例中，脂质体的平均尺寸可以变化50％或更少，如45％或更少、或40％或更少、或35％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或20％或更少、或15％或更少、或10％或更少、或5％或更少、或3％或更少、或1％或更少、或0.5％或更少。在一些情况下，脂质体的平均尺寸变化10％或更少。在一些情况下，脂质体的平均尺寸变化5％或更少。在一些情况下，脂质体的平均尺寸变化3％或更少。在一些情况下，脂质体的平均尺寸变化1％或更少。在一些情况下，脂质体的平均尺寸变化0.5％或更少。

在某些实施方案中，脂质体群可以通过脂质体的多分散性来描述。“分散性”或“多分散性”是混合物中颗粒尺寸的不均匀性的量度。在脂质体的背景下，多分散性的范围可以是0到1，其中多分散性为0表示单分散的脂质体群(例如，具有相同平均尺寸的脂质体)，并且其中多分散性为1表示脂质体的异质混合物。在一些情况下，脂质体的尺寸(并且因此多分散性)可以通过动态光散射(dls)来确定。

在某些实施方案中，本公开的方法足以从脂质体悬浮液(例如，脂质体的水性悬浮液)产生脂质体群。在一些情况下，脂质体的起始悬浮液包括具有不同尺寸的脂质体群。因此，本公开的方法包括以脂质体悬浮液(例如，具有不同尺寸的脂质体群)开始以及从脂质体的起始悬浮液产生脂质体群。

在一些实施方案中，所述方法包括从异质脂质体的悬浮液产生脂质体群，其中脂质体群的平均尺寸变化50％或更少，如45％或更少、或40％或更少、或35％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或20％或更少、或15％或更少、或10％或更少、或5％或更少、或3％或更少、或1％或更少、或0.5％或更少。在一些情况下，所述方法包括从异质脂质体的悬浮液产生脂质体群，其中脂质体群的平均尺寸变化10％或更少。在一些情况下，所述方法包括从异质脂质体的悬浮液产生脂质体群，其中脂质体群的平均尺寸变化5％或更少。在一些情况下，所述方法包括从异质脂质体的悬浮液产生脂质体群，其中脂质体群的平均尺寸变化3％或更少。在一些情况下，所述方法包括从异质脂质体的悬浮液产生脂质体群，其中脂质体群的平均尺寸变化1％或更少。在一些情况下，所述方法包括从异质脂质体的悬浮液产生脂质体群，其中脂质体群的平均尺寸变化0.5％或更少。在又其他实例中，群体的不同脂质体成员的平均尺寸可以变化50％或更多，如75％或更多，包括100％或更多。

在一些实例中，与所产生的脂质体群相比，脂质体的起始悬浮液具有更高的多分散性。因此，本公开的方法可用于产生具有比脂质体的起始悬浮液的多分散性小的多分散性的脂质体群。在一些情况下，所产生的脂质体群的多分散性为0.9或更小，如0.8或更小、或0.7或更小、或0.5或更小、或0.4或更小、或0.3或更小、或0.2或更小、或0.1或更小、或0.05或更小、或0.01或更小。例如，所产生的脂质体群的多分散性可以为0.5或更小。在一些情况下，所产生的脂质体群的多分散性可以为0.4或更小。在一些情况下，所产生的脂质体群的多分散性可以为0.3或更小。在一些情况下，所产生的脂质体群的多分散性可以为0.2或更小。在一些情况下，所产生的脂质体群的多分散性可以为0.1或更小。在一些情况下，所产生的脂质体群的多分散性可以为0.05或更小。在一些情况下，所产生的脂质体群的多分散性可以为0.01或更小。在某些实例中，所产生的脂质体群的多分散性的范围是0.01到0.5，如0.01到0.4、或0.01到0.3、或0.01到0.2、或0.01到0.1。在其他实施方案中，所产生的脂质体群的多分散性的范围是0.01到0.5，如0.01到0.5、或0.01到0.4、或0.01到0.3、或0.01到0.2。在其他实施方案中，所产生的脂质体群的多分散性的范围是0.01到0.5，如0.05到0.5、或0.1到0.5、或0.1到0.4、或0.1到0.3。在其他实施方案中，所产生的脂质体群的多分散性的范围是0.01到0.5，如0.05到0.5、或0.1到0.5、或0.2到0.5、或0.2到0.4。

在一些实例中，脂质体的起始悬浮液包括具有大于所产生的脂质体群的尺寸的脂质体。在一些实例中，脂质体的起始悬浮液包括具有500nm或更大(如600nm或更大、或700nm或更大、或800nm或更大、或900nm或更大、或1000nm或更大、或1250nm或更大、或1500nm或更大、或1750nm或更大、或2000nm或更大、或2250nm或更大、或2500nm或更大、或2750nm或更大、或3000nm或更大)的平均尺寸(例如，平均直径)的脂质体，其中在一些实例中尺寸为5000nm或更小，如4000nm或更小，包括3000nm或更小。例如，脂质体的起始悬浮液可以包括大的多层囊泡(lmv)，例如具有200nm或更大(如范围是200nm到3,000nm)的平均尺寸的多层囊泡。在一些实例中，脂质体的起始悬浮液可以包括大的单层囊泡(luv)，例如具有100nm或更大(如范围是100nm到1000nm)的平均尺寸的单层囊泡。

在一些情况下，所述方法的实施方案可以包括产生脂质体的起始悬浮液的步骤。如上所述，脂质体悬浮液就脂质体悬浮液中脂质体的尺寸而言可以是异质的。异质脂质体的悬浮液可以使用用于产生脂质体的任何方便的方法来产生，如但不限于溶剂分散法(例如，bangham法，其包括将脂质溶解在有机溶剂中，然后除去有机溶剂，如通过蒸发有机溶剂)、洗涤剂去除法(例如，其中形成洗涤剂-脂质胶束，然后去除洗涤剂以形成脂质体)、注射法(例如，其中将脂质溶解于有机溶剂中并且将所得脂质溶液注入水性介质中)、微流体法(例如，其中使溶解在有机溶剂中的脂质流在微流体通道中的两个水流之间通过)、机械分散法、超声处理法、其组合等。

可用于本公开的实施方案的脂质体由脂质组成。在某些实施方案中，脂质是两亲的。两亲脂质可以包括亲水基团和与亲水基团共价键合的一个或多个亲脂基团。在一些情况下，亲水基团是带电基团，如阴离子基团或阳离子基团。在一些实例中，亲水基团是不带电的极性基团。在一些实施方案中，亲水基团包括带电基团和极性基团。亲水基团的实例包括但不限于磷酸根、磷酸胆碱、磷酸甘油、磷酸乙醇胺、磷酸丝氨酸、磷酸肌醇、乙基磷酸胆碱(ethylphosphosphorylcholine)、聚乙二醇、聚甘油、鞘氨醇、磷酸鞘氨醇(phosphoshingosine)、三次氮基三乙酸、三聚氰胺、葡糖胺、三甲胺、精胺、亚精胺、和共轭羧酸根、硫酸根、硼酸、磺酸根、硫酸根、碳水化合物、氨基酸等。在一些情况下，亲水基团包括磷酸胆碱。

在某些实施方案中，亲脂基团包括脂族链，如饱和或不饱和的、直链或支链的、取代或未取代的脂族链。例如，亲脂基团可以包括长度为2至40个碳原子的脂族链，并且可以是饱和或不饱和的、直链或支链的、取代的或未取代的。例如，亲脂基团可以包括具有2至40个碳原子(如4至30个碳原子、或4至25个碳原子、或6至24个碳原子、或10至20个碳原子)的饱和或不饱和的、直链或支链的、取代或未取代的烃链。在某些情况下，亲脂基团包括具有18个碳原子的饱和或不饱和的、直链或支链的烃链。在某些情况下，亲脂基团包括具有16个碳原子的饱和或不饱和的、直链或支链的烃链。

所述脂质体的实施方案可以包括具有可检测标记的脂质体。在一些情况下，可检测标记与支持物稳定地缔合。“稳定地缔合”意指某一部分在标准条件下与另一部分或结构结合或以其他方式与另一部分或结构缔合。键可以包括共价键和非共价相互作用，如但不限于离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力(例如，伦敦分散力)、偶极-偶极相互作用等。在某些实施方案中，可检测标记与脂质体共价地结合。例如，如上所述，包含脂质体的脂质可以包括亲水基团，其在一些情况下可以包括提供与可检测标记的共价连接的活化官能团。可用于化学合成的任何方便的活化官能团可以用于将可检测标记与脂质的亲水基团共价地键合，如但不限于胺、羧基、酰胺、羟基、叠氮化物、马来酰亚胺、溴乙酰基、2-吡啶基二硫醇、卤代烷基、烯烃或炔丙基等。

根据本公开的实施方案的脂质体可以包括与脂质体缔合的有效负载(payload)。如本文所用，“有效负载”是指包含在脂质体结构内、存在于脂质颗粒的双层中或附着于脂质体表面(例如，通过共价键或非共价相互作用)的组分。因此，有效负载可以包括由脂质体包封的组分(例如，药物活性剂、营养药剂、药妆剂、成像剂、放射性药剂、核磁共振造影剂等)。在某些实施方案中，所包封的有效负载在溶液中，或者可以作为晶体、粉末或其组合存在。例如，在期望提供具有包封的有效负载(例如，包封的剂、治疗剂、成像剂等)的脂质体的实施方案中，此类剂可以包含在脂质体内的水相中。可选地，在所述剂是疏水的并且因此在水中较不可溶的实施方案中，疏水剂可以包含在脂双层的一部分内。

所述方法的实施方案还可以包括制备脂质体挤出装置，用于产生脂质体群的方法。通常，根据本公开的实施方案的脂质体挤出装置包括多孔膜和被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件。脂质体挤出装置的更详细方面在下面的装置部分中描述。被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件在本文中也可以称为膜组件或膜支撑件。在一些实例中，膜组件在液体容器的内部支撑膜。在一些情况下，膜组件可从液体容器中移除。因此，所述方法的实施方案可以包括将膜组件定位在液体容器中，从而将膜定位在液体容器中。在将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中以产生脂质体群之前，可以将膜组件定位在液体容器中。

如上所示，所述方法的实施方案包括将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中。可以将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中，使得脂质体悬浮液被定位在膜的一侧。例如，脂质体悬浮液可以包含在膜的一侧的腔室(例如，由膜组件形成的腔室)中。在产生脂质体群期间，脂质体悬浮液可以从膜的一侧穿过多孔膜到达膜的另一侧。例如，脂质体悬浮液最初可以包含在膜的第一侧的第一腔室中，然后在产生脂质体群期间，可以穿过多孔膜以包含在膜的另一侧的第二腔室中。在一些情况下，第二腔室由包含膜组件的液体容器的一部分形成。在某些方面，使用任何方便的液体处理技术将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中。例如，可以使用任何方便的液体处理仪器(如但不限于注射器、针、移液管、抽滤管以及其他液体处理装置)将一定体积的脂质体悬浮液添加到脂质体挤出装置中。

本公开的方法可用于产生如上所述的脂质体群，例如具有确定的尺寸的脂质体群。在一些实施方案中，脂质体群具有小于脂质体的起始悬浮液的平均尺寸的平均尺寸。在一些情况下，所产生的脂质体群具有1000nm或更小(如900nm或更小、或800nm或更小、或700nm或更小、或600nm或更小、或500nm或更小、或400nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小、或100nm或更小、或75nm或更小、或50nm或更小、或25nm或更小、或20nm或更小、或15nm或更小、或10nm或更小、或5nm或更小、或1nm或更小)的平均尺寸(例如，平均直径)，其中在一些实例中，平均尺寸为1nm或更大，如5nm或更大。在某些实例中，所产生的脂质体群具有1000nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有800nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有500nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有400nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有300nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有250nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有200nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有100nm或更小的平均尺寸。在某些实例中，所产生的脂质体群具有50nm或更小的平均尺寸。如，所产生的脂质体群可以包括小的单层囊泡(suv)，例如具有100nm或更小(如范围是10nm到100nm)的平均尺寸的单层囊泡。

为了产生脂质体群，本公开的方法涉及使用如本文所述的脂质体挤出装置。如上所述，在某些实施方案中，脂质体挤出装置的膜是多孔膜，并且所述方法包括使脂质体悬浮液(例如，脂质体的异质群)通过多孔膜以产生脂质体群。在某些实施方案中，使脂质体悬浮液通过膜包括对脂质体悬浮液施加力，使得脂质体从膜的一侧穿到膜的另一侧。当脂质体穿过膜时，脂质体通过膜中的孔以产生脂质体群。所述方法的实施方案包括从多孔膜中挤出脂质体群。在某些实例中，脂质体的起始悬浮液具有大于膜的孔的平均尺寸。在一些实例中，使较大尺寸的脂质体通过膜中的较小尺寸的孔将脂质体的尺寸调整至与膜的孔的尺寸大致相同的平均尺寸。因此，在某些情况下，使脂质体通过膜产生脂质体群。

在一些实例中，对脂质体悬浮液施加力包括以足以使脂质体通过膜的方式向脂质体悬浮液施加离心力以产生脂质体群。例如，所述方法可以包括使用离心机，其中脂质体悬浮液被置于离心机中，并且离心机以足以对脂质体悬浮液施加离心力的方式操作。可以向脂质体悬浮液施加离心力，使得如上所述迫使脂质体通过膜的孔，从而从膜中挤出脂质体群。因此，在一些情况下，所述方法包括使脂质体悬浮液在离心机中旋转。脂质体悬浮液可以包含在容纳膜的液体容器中，并且因此所述方法可以包括使包含脂质体悬浮液的液体容器在离心机中旋转，使得如上所述迫使脂质体通过膜的孔。

在某些实施方案中，向脂质体悬浮液施加离心力包括施加足以使脂质体通过膜的孔的离心力。在一些情况下，所施加的离心力大于标准重力，例如像2g或更大、或5g或更大、或10g或更大、或25g或更大、或50g或更大、或100g或更大、或250g或更大、或500g或更大、或750g或更大、或1000g或更大、或1500g或更大、或2000g或更大、或2500g或更大、或3000g或更大、或3500g或更大、或4000g或更大、或4500g或更大、或5000g或更大、或5500g或更大、或6000g或更大、或6500g或更大、或7000g或更大、或7500g或更大、或8000g或更大、或8500g或更大、或9000g或更大、或9500g或更大、或10,000g或更大。

如上所述，在一些情况下，施加离心力包括使脂质体悬浮液在离心机中旋转，并且因此在这些实施方案中，施加足够的离心力可以包括以10rpm或更高(如50rpm或更高、或100rpm或更高、或250rpm或更高、或500rpm或更高、或750rpm或更高、或1000rpm或更高、或1500rpm或更高、或2000rpm或更高、或2500rpm或更高、或3000rpm或更高、或3500rpm或更高、或4000rpm或更高、或4500rpm或更高、或5000rpm或更高、或5500rpm或更高、或6000rpm或更高、或6500rpm或更高、或7000rpm或更高、或7500rpm或更高、或8000rpm或更高、或8500rpm或更高、或9000rpm或更高、或9500rpm或更高、或10,000rpm或更高)旋转。

在一些实例中，施加离心力持续一定量的时间。施加离心力的时间量可以是等于或大于在所施加的离心力下脂质体悬浮液通过膜的孔所需的时间的时间。例如，所述方法可以包括施加离心力持续一定时间，如1min或更长、或2min或更长、或3min或更长、或4min或更长、或5min或更长、或6min或更长、或7min或更长、或8min或更长、或10min或更长。在一些情况下，所述方法可以包括施加离心力持续一定时间，如10min或更短、或9min或更短、或8min或更短、或7min或更短、或6min或更短、或5min或更短、或4min或更短、或3min或更短、或2min或更短、或1min或更短。

在某些实施方案中，因为施加离心力以使脂质体穿过多孔膜，所以本公开的方法可以在大气压下进行。在一些情况下，主题方法包括在大气压下施加离心力。例如，本公开的方法可以不需要大于待向脂质体悬浮液施加的大气压的压力。在一些情况下，使用本公开的方法，在标准大气压下产生脂质体群。因此，主题方法的某些实施方案不包括对脂质体悬浮液施加压力，例如手动地或通过增加与脂质体悬浮液接触的气体或液体的压力。

如上所述，主题方法的实施方案包括以足以使脂质体通过膜的方式向脂质体悬浮液施加离心力以产生脂质体群。主题方法的一些实施方案包括以足以使脂质体通过膜的方式向脂质体悬浮液一次性施加离心力以产生脂质体群。在其他实施方案中，可以向脂质体悬浮液多于一次地施加离心力。例如，所述方法可以包括重复向脂质体悬浮液施加离心力。因此，可以将施加离心力重复两次或更多次。如上所述，施加离心力可以使得脂质体悬浮液从膜的一侧穿到膜的另一侧。在一些情况下，在第一次施加离心力之后，所述方法包括从液体容器中移除膜组件。从液体容器中移除膜组件可以允许接近已经穿过膜的脂质体的悬浮液。在一些情况下，可以从液体容器中收集脂质体悬浮液，并且可以在所收集的脂质体上再进行一次或多次所述方法，例如，可以如上所述重复所述方法。

在某些实施方案中，所述方法包括在施加离心力之前密封脂质体挤出装置。密封脂质体挤出装置可以有助于在施加离心力的同时将脂质体悬浮液保留在脂质体挤出装置内。例如，在一些情况下，液体容器包括密封件，如盖或可移除的盖。因此，在某些实施方案中，脂质体挤出装置是密封的脂质体挤出装置，如其中脂质体挤出装置包括密封件(例如，不透水的和/或不透气的密封件)。在这些实例中，所述方法可以包括在将一定体积的脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中之前移除密封件。移除脂质体挤出装置上的密封件可以使脂质体挤出装置的内容物暴露于周围环境并且允许进入脂质体挤出装置的内部体积。因此，可以进入脂质体挤出装置的内部体积的使用者可以将所述体积的脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中以产生脂质体群。

在某些实施方案中，所述方法还包括在将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中之后混合脂质体挤出装置的内容物。可以使用任何方便的方案进行混合。例如，可以使用搅拌器进行混合。搅拌器可以是足以在液体容器内混合液体的任何方便的搅拌器，包括但不限于涡旋器、超声波仪、振荡器(例如，手动、机械或电动振荡器)、摇杆、振荡板、磁力搅拌器、静态混合器、旋转器、共混器、混合器、转筒、定轨振荡器以及其他搅拌方案。

在一些情况下，所述方法还包括测定所产生的脂质体群。可以使用任何合适的测定仪器进行脂质体群的测定。例如，测定可以用于确定脂质体群的平均尺寸、脂质体群的多分散性或其组合。在一些情况下，可以通过动态光散射(dls)进行测定。在一些情况下，测定仪器可以是流式细胞仪。在这些实施方案中，测定包括流式细胞术地分析脂质体群。在某些实施方案中，脂质体包括荧光标记，因此测定的某些实施方案包括使脂质体群与电磁辐射(例如，光)接触，如具有对应于脂质体的荧光标记的激发最大值的波长的电磁辐射。测定还可以包括检测来自激发的荧光标记的发射光。例如，所述方法可以包括在对应于荧光标记的发射最大值的一个或多个波长处检测来自激发的荧光标记的发射光。在某些实施方案中，脂质体群可以用于校准流式细胞仪的方法中，例如，脂质体群可以用作流式细胞仪的校准标准。

在某些实施方案中，荧光标记包括基于例如荧光发射最大值、荧光偏振、荧光寿命、光散射、质量、分子量或其组合可检测的一种或多种可检测的部分或标志物。在某些实施方案中，荧光标记包括荧光团(即，荧光标记，荧光染料等)。感兴趣的荧光团可以包括但不限于适用于分析应用(例如，流式细胞术，成像等)的染料。大量染料(例如，非聚合染料)可从各种来源商购获得，例如像molecularprobes(eugene，俄勒冈州)和exciton(dayton，俄亥俄州)。例如，染料的荧光团可以是4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸基二苯乙烯-2,2’二磺酸；吖啶和衍生物，如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和吖啶异硫氰酸酯；5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)；4-氨基-n-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐(luciferyellowvs)；n-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；亮黄(brilliantyellow)；香豆素和衍生物，如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(amc，coumarin120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(coumaran151)；花菁和衍生物，如焰红染料(cyanosine)、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5和cy7；4’,6-联脒(diaminidino)-2-苯基吲哚(dapi)；5’,5”-二溴邻苯三酚-磺酞(bromopyrogallolred)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素；二乙基氨基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯；4,4’-二异硫氰酸基二氢-二苯乙烯-2,2'-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸基二苯乙烯-2,2’-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(dns，丹磺酰氯)；4-(4’-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(dabcyl)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(dabitc)；曙红和衍生物，如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物，如赤藓红b和赤藓红异硫氰酸酯；溴化乙锭(ethidium)；荧光素和衍生物，如5-羧基荧光素(fam)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(dtaf)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(joe)、异硫氰酸荧光素(fitc)、氯三嗪基荧光素(fluoresceinchlorotriazinyl)、萘并荧光素和qfitc(xritc)；荧光胺；ir144；ir1446；绿色荧光蛋白(gfp)；礁珊瑚荧光蛋白(reefcoralfluorescentprotein，rcfp)；lissamine^tm；丽丝胺罗丹明，荧光黄；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红(nilered)；俄勒冈绿(oregongreen)；酚红；b-藻红蛋白(pe)；邻苯二甲醛；芘和衍生物，如芘、芘丁酸盐和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸盐；活性红4(reactivered4)(cibacron^tmbrilliantred3b-a)；罗丹明和衍生物，如6-羧基-x-罗丹明(rox)、6-羧基罗丹明(r6g)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明b磺酰氯、罗丹明(rhod)、罗丹明b、罗丹明123、罗丹明x异硫氰酸酯、磺酰罗丹明b、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红(texasred))、n,n,n’,n’-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tritc)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；呫吨；类胡萝卜素-蛋白质复合物，如多甲藻素-叶绿素蛋白(percp)；别藻蓝素(apc)；或其组合。

用于分析可用于本发明方法的样品的合适的流式细胞术系统和方法包括但不限于以下文献中描述的那些：ormerod(编),flowcytometry:apracticalapproach,oxforduniv.press(1997)；jaroszeski等人(编),flowcytometryprotocols,methodsinmolecularbiology第91期,humanapress(1997)；practicalflowcytometry,第3版,wiley-liss(1995)；virgo等人(2012)annclinbiochem.1月；49(pt1):17-28；linden等人,seminthromhemost.2004年10月；30(5):502-11；alison等人jpathol,2010年12月；222(4):335-344；以及herbig等人(2007)critrevtherdrugcarriersyst.24(3):203-255；将其公开内容通过引用并入本文。在某些实例中，感兴趣的流式细胞术系统包括bdbiosciencesfacscanto^tm和facscantoii^tm流式细胞仪、bdbiosciencesfacsvantage^tm、bdbiosciencesfacsort^tm、bdbiosciencesfacscount^tm、bdbiosciencesfacscan^tm、和bdbiosciencesfacscalibur^tm系统、bdbiosciencesinflux^tm细胞分选仪、bdbiosciencesaccuri^tmc6流式细胞仪；bdbioscienceslsrfortessa^tm流式细胞仪、bdbioscienceslsrfortessa^tmx-20流式细胞仪、bdbiosciencesfacsverse^tm流式细胞仪、bdbiosciencesfacsaria^tmiii和bdfacsaria^tmfusion流式细胞仪、bdbiosciencesfacsjazz^tm流式细胞仪等。在某些实施方案中，主题系统是流式细胞术系统，如美国专利号3,960,449；4,347,935；4,667,830；5,245,318；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,643,796；5,700,692；6,372,506和6,809,804中描述的那些；将其公开内容通过引用以其整体并入本文。

也可以使用其他分析方法，如但不限于液相色谱-质谱法或气相色谱-质谱法系统。例如，测定可以包括使用分析分离装置，如液相色谱仪(lc)(包括高效液相色谱仪(hplc)、微米或纳米液相色谱仪或超高压液相色谱仪(uhplc)装置)、毛细管电泳(ce)或毛细管电泳色谱仪(cec)装置。质谱仪(ms)系统也可以用于测定染料组合物。质谱仪的实例可以包括但不限于电喷雾电离(esi)、大气压化学电离(apci)、电子轰击(ei)、大气压光电离(appi)、基质辅助激光解吸电离(maldi)或电感耦合等离子体(icp)电离或例如其任何组合。同样地，可以采用各种不同的质量分析器中的任何一种，包括飞行时间(tof)、傅立叶变换离子回旋共振(fticr)、离子阱、四极或双聚焦磁电扇区质量分析器或其任何混合。

在某些实施方案中，所述方法还包括将脂质体储存一段时间。脂质体可以在产生脂质体群之前和/或之后储存一段时间。在一些实例中，将脂质体储存一段时间，如1小时或更长、或4小时或更长、或6小时或更长、或12小时或更长、或18小时或更长、或24小时或更长、或48小时或更长、或72小时或更长、或4天或更长、或5天或更长、或6天或更长、或1周或更长。

所述方法的实施方案还可以包括将脂质体运送到远程位置。“远程位置”是脂质体产生位置以外的位置。例如，远程位置可以是同一城市中的另一位置(例如，办公室、实验室等)、不同城市中的另一位置、不同州中的另一位置、不同国家中的另一个位置等。因此，当一个项目被指示为与另一项目“远程”时，这意味着这两个项目可以在同一房间但是分开，或者至少在不同的房间或不同的建筑物中，并且可以相隔至少一英里、十英里或一百英里或更远。

脂质体挤出装置

本公开的方面包括脂质体挤出装置。本公开的脂质体挤出装置可用于产生脂质体群。根据本公开的某些实施方案的脂质体挤出装置包括多孔膜和被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件。下面更详细地描述了脂质体挤出装置的每个元件的其他方面。

如上所示，脂质体挤出装置包括多孔膜。多孔膜是在膜中包括多个孔的膜。孔可以是具有确定的孔径的孔。孔的尺寸可以测量为孔的开口的尺寸，如孔的开口的最大尺寸。例如，在一些情况下，孔是膜中具有基本上圆形的横截面的开口。因此，在这些情况下，孔径可以测量为孔的直径。例如，膜中的孔可以具有1000nm或更小(如900nm或更小、或800nm或更小、或700nm或更小、或600nm或更小、或500nm或更小、或400nm或更小、或300nm或更小、或250nm或更小、或200nm或更小、或150nm或更小、或100nm或更小、或75nm或更小、或50nm或更小、或25nm或更小、或20nm或更小、或15nm或更小、或10nm或更小、或5nm或更小、或1nm或更小)的孔径(例如，平均孔径)。在某些实例中，膜孔具有1000nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有800nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有500nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有400nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有300nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有250nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有200nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有100nm或更小的平均孔径。在某些实例中，膜孔具有50nm或更小的平均孔径。在一些实施方案中，膜中的孔基本上具有相同的尺寸。换句话说，膜中的孔的尺寸可以是均匀的。包括均匀尺寸的孔的多孔膜可以有助于脂质体群的产生。

在某些实施方案中，膜孔以非曲折路径通过膜。例如，多孔膜可以包括具有基本上垂直于膜表面的纵轴的孔。在一些情况下，多孔膜可以包括相对于膜表面具有小于90°的角的纵轴的孔。在某些实例中，多孔膜不包括孔网络相互连接从而形成通过膜的曲折路径的网状或矩阵结构。换句话说，多孔膜可以包括通过膜而不与膜中的其他孔相交的不同孔。

在某些实施方案中，多孔膜由一层或多层膜材料组成。例如，膜可以由单层膜材料组成。在其他实施方案中，膜由两层或更多层膜材料组成。例如，膜可以包括2层膜材料，如3层或更多层、或4层或更多层、或5层或更多层、或6层或更多层、或7层或更多层、或8层或更多层、或9层或更多层、或10层或更多层膜材料。在一些情况下，膜包括2层膜材料。在一些情况下，膜包括3层膜材料。在包括两层或更多层膜材料的实施方案中，每层的膜材料可以是相同的，或者可以是不同的。在某些实施方案中，膜材料的两层或更多层中的每一层的孔径是相同的。在其他实施方案中，膜材料的两层或更多层中的至少两层的孔径是不同的。

膜可以由任何合适的膜材料组成。在一些情况下，膜材料与和膜接触的液体和/或脂质体相容。例如，膜材料可以是液体相容的膜材料，如亲水膜材料。在一些情况下，脂质体可以在水性液体中，并且在这些情况下，膜材料可以与水性介质相容。“相容的”意指膜材料对于与膜接触的液体和/或脂质体或其他成分基本上是惰性的(例如，不显著与其反应)。合适的膜材料的实例包括聚合材料，例如聚合物，如但不限于聚碳酸酯、聚酯、尼龙、纤维素、乙酸纤维素、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。在一些实例中，膜材料是聚碳酸酯。在一些实例中，膜材料是聚酯。

主题脂质体挤出装置的实施方案还包括被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件。被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件在本文中也可以称为膜组件或膜支撑件。在一些实例中，膜组件在液体容器的内部支撑膜。另外，膜组件可以被配置成包含一定体积的液体(例如，脂质体悬浮液)。例如，膜组件可以包括第一端和与第一端相对的第二端。在一些实施方案中，第一端包括开口。在一些实例中，膜组件中的开口使膜组件的内部暴露于周围环境，例如，使得膜组件的内容物处于与周围环境相同的大气压下。例如，开口可以用于将脂质体悬浮液(例如，异质脂质体的悬浮液)引入膜组件的内部。在一些实施方案中，膜组件的第二端包括膜(例如，如本文所述的多孔膜)。膜组件还可以包括一个或多个侧壁，其在膜组件的第一端处的开口和膜组件的相对的第二端处的膜之间形成膜组件的侧面。在一些实例中，膜组件的膜和一个或多个侧壁之间没有间隙，使得膜形成抵靠膜组件的一个或多个侧壁的液密密封。因此，穿过膜的液体和/或脂质体可以仅通过膜中的孔。在某些实施方案中，膜组件呈圆筒的形状，其中圆筒在第一端具有开口，并且在圆筒的第二相对端具有膜。在一些情况下，膜组件具有圆形横截面。

如上所述，膜组件可以被配置为容器，其中容器被配置成容纳一定体积的流体(例如，气体或液体)。在某些实施方案中，膜组件被配置为液体容器。例如，膜组件可以被配置成容纳一定体积的液体，如脂质体悬浮液。膜组件的尺寸可以取决于待容纳在膜组件中的液体体积。例如，膜组件可以被配置成容纳范围是0.1ml到1000ml(如0.1ml到900ml、或0.1ml到800ml、或0.1ml到700ml、或0.1ml到600ml、或0.1ml到500ml、或0.1ml到400ml、或0.1ml到300ml、或0.1ml到200ml、或0.1ml到100ml、或0.1ml到50ml、或0.1ml到25ml、或0.1ml到10ml、或0.1ml到5ml、或0.1ml到2ml、或0.1ml到1.5ml、或0.1ml到1ml、或0.1ml到0.5ml)的体积(例如，液体体积)。在某些实例中，膜组件被配置成容纳范围是0.1ml到5ml(例如像0.5ml、或1ml、或1.5ml、或2ml)的体积。在其他实例中，膜组件被配置成容纳范围是0.1ml到100ml(如50ml或25ml)的体积。

在某些实施方案中，膜组件具有范围是0.5cm到5cm(如0.5cm到4.5cm、或0.5cm到4cm、或0.5cm到3.5cm、或0.5cm到3cm、或0.5cm到2.5cm、或0.5cm到2cm、或0.5cm到1.5cm、或0.5cm到1cm)的宽度(对于圆柱形膜组件，其也可以称为直径)。在一些实例中，膜组件具有范围是0.5cm到2.5cm的宽度(或直径)。在一些实例中，膜组件具有范围是0.5cm到1cm的宽度(或直径)。在某些实施方案中，膜组件具有范围是1cm到20cm(如1cm到15cm、或1cm到10cm、或1cm到5cm、或1cm到2.5cm)的长度。在一些实例中，膜组件具有范围是1cm到10cm的长度。在一些实例中，膜组件具有范围是1cm到5cm的长度。在一些实例中，膜组件具有范围是1cm到2.5cm的长度。

膜组件的实施方案可以与可能和膜组件接触的液体和/或脂质体或其他成分相容。用于脂质体挤出装置的合适的膜组件材料的实例包括但不限于塑料，如聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(ptfe)、全氟醚(pfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、全氟烷氧基烷烃(pfa)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯(pe)、聚醚醚酮(peek)等。

在一些情况下，膜组件被配置成将膜定位在液体容器的内部。如上所述，膜组件可以在膜组件的一端包括多孔膜。因此，膜组件的至少一部分可以被定位在液体容器的内部，使得膜组件的膜被定位在液体容器的内部。在一些情况下，膜组件的至少一部分具有小于液体容器的内部尺寸(例如，内径)的外部尺寸(例如，外径)。换句话说，膜组件的至少一部分(如具有膜的组件的端部)的尺寸被确定为适于安装在液体容器内。在某些实例中，液体容器具有圆形横截面。在这些实例中，膜组件可以包括与液体容器的内部同心的圆筒。

如上所讨论，在某些实施方案中，膜组件被配置成将膜定位在液体容器的内部。因此，在一些实例中，脂质体挤出装置包括液体容器。主题液体容器的实施方案可以被配置成包含一定体积的液体(例如，脂质体悬浮液和/或脂质体群)。在一些实例中，液体容器包括第一端和与第一端相对的第二端。在一些实施方案中，第一端包括开口。在这些实例中，液体容器中的开口使液体容器的内部暴露于周围环境，例如，使得液体容器的内容物处于与周围环境相同的大气压下。例如，开口可以用于将膜组件定位在液体容器中以产生脂质体群。在一些情况下，膜组件的至少一部分(例如，具有膜的膜组件的端部)通过液体容器的开口插入液体容器中。在某些实例中，膜组件可从液体容器中移除，使得在以足以使脂质体通过膜的方式施加离心力之后，可以从液体容器中移除膜组件。在这些实例中，可移除的膜组件允许接近已经通过膜的脂质体。如上所述，可以收集并分析或再离心这些脂质体。

在一些实例中，液体容器包括与液体容器的开口端相对的封闭端。因此，如上所述，液体容器可以被配置成包含一定体积的液体。液体容器的尺寸可以取决于待容纳在液体容器中的液体体积。例如，液体容器可以被配置成容纳范围是0.1ml到1000ml(如0.1ml到900ml、或0.1ml到800ml、或0.1ml到700ml、或0.1ml到600ml、或0.1ml到500ml、或0.1ml到400ml、或0.1ml到300ml、或0.1ml到200ml、或0.1ml到100ml、或0.1ml到50ml、或0.1ml到25ml、或0.1ml到10ml、或0.1ml到5ml、或0.1ml到2ml、或0.1ml到1.5ml、或0.1ml到1ml、或0.1ml到0.5ml)的体积(例如，液体体积)。在某些实例中，液体容器被配置成容纳范围是0.1ml到5ml(例如像0.5ml、或1ml、或1.5ml、或2ml)的体积。在其他实例中，液体容器被配置成容纳范围是0.1ml到100ml(如50ml或25ml)的体积。

液体容器还可以包括一个或多个侧壁，其在液体容器的第一端处的开口和液体容器的第二封闭端之间形成液体容器的侧面。在某些实施方案中，液体容器呈圆筒的形状，其中圆筒在第一端具有开口和圆筒的封闭的第二相对端。在一些情况下，液体容器具有圆形横截面。液体容器的形状可以变化，并且可以取决于脂质体挤出装置的使用。例如，液体容器可以被配置成与本公开的方法相容的形状。例如，液体容器可以被配置成与用于执行所述方法的典型实验室设备相容的形状，如与离心机相容的形状。如上所述，液体容器可以被配置成容纳一定体积的液体。在这些实施方案中，液体容器可以是小瓶或试管。在某些情况下，液体容器是小瓶。在某些情况下，液体容器是试管。合适的液体容器的实例包括但不限于离心管、微量离心管、管等。

在某些实施方案中，液体容器具有范围是0.5cm到5cm(如0.5cm到4.5cm、或0.5cm到4cm、或0.5cm到3.5cm、或0.5cm到3cm、或0.5cm到2.5cm、或0.5cm到2cm、或0.5cm到1.5cm、或0.5cm到1cm)的宽度(对于圆柱形液体容器，其也可以称为直径)。在一些实例中，液体容器具有范围是0.5cm到2.5cm的宽度(或直径)。在一些实例中，液体容器具有范围是0.5cm到1cm的宽度(或直径)。在某些实施方案中，液体容器具有范围是1cm到20cm(如1cm到15cm、或1cm到10cm、或1cm到5cm、或1cm到2.5cm)的长度。在一些实例中，液体容器具有范围是1cm到10cm的长度。在一些实例中，液体容器具有范围是1cm到5cm的长度。在一些实例中，液体容器具有范围是1cm到2.5cm的长度。

液体容器的实施方案可以与可能和液体容器接触的液体和/或脂质体或其他成分相容。用于脂质体挤出装置的合适的液体容器材料的实例包括但不限于塑料，如聚丙烯、聚甲基戊烯、聚四氟乙烯(ptfe)、全氟醚(pfe)、氟化乙烯丙烯(fep)、全氟烷氧基烷烃(pfa)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚乙烯(pe)、聚醚醚酮(peek)等。

如上所述，膜组件可以被配置成当膜组件(例如，具有膜的膜组件的端部)插入液体容器中时将膜定位在液体容器的内部。在一些情况下，膜组件在液体容器的内部支撑膜。膜组件可以在液体容器的内部支撑膜，使得具有膜的膜组件的端部与液体容器的封闭端隔开一定距离。在这些实例中，脂质体挤出装置可以分成两个腔室。第一腔室可以由膜组件的内部体积形成。另外，因为膜组件在远离液体容器的封闭端一定距离处支撑膜，所以膜组件的膜和液体容器的封闭端之间的所述体积的空间可以形成第二腔室。在这些实施方案中，在使用脂质体挤出装置期间，可以将脂质体悬浮液(例如，脂质体的异质悬浮液)引入膜组件的内部体积中。然后，向脂质体悬浮液施加离心力可以迫使脂质体通过膜并进入膜组件的膜和液体容器的封闭端之间的所述体积的空间(例如，进入脂质体挤出装置的第二腔室)。

在某些实施方案中，在具有膜的膜组件的端部和液体容器的封闭端之间的液体容器的体积等于或大于膜组件的体积。在这些实例中，脂质体挤出装置的第二腔室的相等或更大的体积可以允许膜组件中整个体积的脂质体悬浮液通过膜进入脂质体挤出装置的第二腔室。在某些实施方案中，当膜组件插入液体容器中时，膜和液体容器的封闭端之间的距离的范围是0.5cm到10cm，如0.5cm到7cm、或0.5cm到5cm、或0.5cm到3cm、或0.5cm到1cm。在一些实例中，膜和液体容器的封闭端之间的距离的范围是0.5cm到10cm。在一些实例中，膜和液体容器的封闭端之间的距离的范围是0.5cm到5cm。在一些实例中，膜和液体容器的封闭端之间的距离的范围是0.5cm到1cm。在一些实例中，当膜组件插入液体容器中时，膜和液体容器的封闭端之间的体积的范围是0.1ml到500ml，如0.1ml到400ml、或0.1ml到300ml、或0.1ml到200ml、或0.1ml到100ml、或0.1ml到75ml、或0.1ml到50ml、或0.1ml到25ml、或0.1ml到10ml、或0.1ml到5ml、或0.1ml到2.5ml、或0.1ml到2ml、或0.1ml到1.5ml、或0.1ml到1ml、或0.1ml到0.5ml。在某些实例中，膜和液体容器的封闭端之间的体积的范围是0.1ml到5ml，例如像0.5ml、或1ml、或1.5ml、或2ml。在其他实例中，膜和液体容器的封闭端之间的体积的范围是0.1ml到50ml，如25ml或10ml。

在一些实施方案中，如上所述，液体容器被配置为容器，其中容器被配置成容纳一定体积的液体。在一些实施方案中，液体容器可以是密封的。也就是说，液体容器可以包括基本上防止液体容器的内容物(例如，液体容器内的液体)离开液体容器的密封件。液体容器的密封件也可以基本上防止其他物质进入液体容器。例如，密封件可以是基本上防止液体进入或离开液体容器的不透水的密封件，或者可以是基本上防止气体进入或离开液体容器的不透气的密封件。在一些实例中，密封件是可移除的或易碎的密封件，使得液体容器的内容物可以在这样需要时暴露于周围环境，例如，如果需要移除液体容器的一部分内容物的话。在一些实例中，密封件由弹性材料制成，以提供用于将液体容器的内容物保留在液体容器内的屏障(例如，不透水的和/或不透气的密封件)。特定类型的密封件包括但不限于薄膜(如聚合物薄膜)、盖等，这取决于容器的类型。用于密封件的合适材料包括例如橡胶或聚合物密封件，如但不限于硅橡胶、天然橡胶、丁苯橡胶、乙烯-丙烯共聚物、聚氯丁二烯、聚丙烯酸酯、聚丁二烯、聚氨酯、苯乙烯丁二烯等及其组合。例如，在某些实施方案中，密封件是可被针、注射器或套管刺穿的隔膜。密封件还可以提供对容器中样品的方便的接近以及覆盖容器的开口的保护屏障。在一些实例中，密封件是可移除的密封件，如螺纹或卡扣盖或可以应用于液体容器的开口的其他合适的密封元件。例如，在将脂质体悬浮液添加到容器中之前或之后，可以将螺纹盖拧在开口上。在一些情况下，密封件是可移除的盖，如可以在将脂质体悬浮液添加到容器中之前或之后打开的卡扣盖。在一些实施方案中，密封件附接到液体容器。在一些实例中，密封件被配置成为液体容器的开口端提供封闭件。在一些实例中，密封件还被配置成为膜组件的开口端提供封闭件。换句话说，液体容器的开口和膜组件的开口都可以被配置成以相同类型的密封件操作。在这些实施方案中，当膜组件插入液体容器中时，相同的密封件可以用作液体容器或膜组件的封闭件。

脂质体挤出装置的某些实施方案包括多孔膜，其包括一层或多层如本文所述的聚碳酸酯材料。脂质体挤出装置还可以包括被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件。膜组件可以具有带开口的第一端和与第一端相对的第二端。膜组件的第二端可以包括多孔膜。

根据本公开的实施方案的脂质体挤出装置的实例示于图1a中。在图1a中，脂质体挤出装置被配置为小瓶。脂质体挤出装置包括呈小瓶(例如，eppendorf管)形式的液体容器40，其带有附接到液体容器40的盖50。脂质体挤出装置还包括膜组件10，其具有带开口的第一端30。膜组件的开放的第一端30使膜组件的内部体积暴露于周围环境。例如，膜组件内的压力可以与周围的大气压相同。膜组件10在与开放的第一端30相对的膜组件10的第二端还包括多孔膜20。如图1a所示，在使用期间，具有膜20的膜组件10的第二端可以被置于液体容器40内。膜组件10被配置成将膜20支撑为与液体容器的底部隔开一定距离，从而在膜20和液体容器40的底部之间形成一定体积的空间。如本文所述，膜20可以由一层或多层膜材料组成。

在膜组件10被定位在液体容器40中之后，可以将脂质体悬浮液60(如脂质体的异质悬浮液)引入膜组件10中，如图1b所示。可以关闭盖50(未示出)，然后可以将脂质体挤出装置置于离心机中。可以操作离心机以向脂质体悬浮液施加离心力，使得脂质体通过多孔膜20并进入膜20和液体容器40的底部之间的所述体积的空间。如本文所述，脂质体通过膜的孔挤出可以产生脂质体群70。

系统

本公开的系统包括如本文所述的脂质体挤出装置。例如，脂质体挤出装置可以包括多孔膜，其包括一层或多层如本文所述的聚碳酸酯材料。脂质体挤出装置还可以包括被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件。膜组件可以具有带开口的第一端和与第一端相对的第二端。膜组件的第二端可以包括多孔膜。此外，本公开的系统还可以包括如本文所述的液体容器，如离心管。

在某些实施方案中，脂质体挤出装置包括脂质体悬浮液。例如，在使用脂质体挤出装置期间，可以将异质脂质体的悬浮液引入膜组件中。如本文所述，然后可以向脂质体悬浮液施加离心力，使得脂质体通过多孔膜以产生脂质体群。因此，本公开的系统的某些实施方案还可以包括离心机。适用于主题系统的离心机包括各种类型的离心机中的任何一种。例如，合适的离心机可以包括被配置成向脂质体悬浮液施加离心力的离心机，其可以包括被配置成施加足以使脂质体通过膜的孔的离心力的离心机。在一些情况下，离心机被配置成施加大于标准重力的离心力，例如像2g或更大、或5g或更大、或10g或更大、或25g或更大、或50g或更大、或100g或更大、或250g或更大、或500g或更大、或750g或更大、或1000g或更大、或1500g或更大、或2000g或更大、或2500g或更大、或3000g或更大、或3500g或更大、或4000g或更大、或4500g或更大、或5000g或更大、或5500g或更大、或6000g或更大、或6500g或更大、或7000g或更大、或7500g或更大、或8000g或更大、或8500g或更大、或9000g或更大、或9500g或更大、或10,000g或更大、或15,000g或更大、或20,000g或更大、或25,000g或更大，其中在一些实例中，力为30,000g或更小，如27,500g或更小。在一些情况下，离心机被配置成通过以10rpm或更高(如50rpm或更高、或100rpm或更高、或250rpm或更高、或500rpm或更高、或750rpm或更高、或1000rpm或更高、或1500rpm或更高、或2000rpm或更高、或2500rpm或更高、或3000rpm或更高、或3500rpm或更高、或4000rpm或更高、或4500rpm或更高、或5000rpm或更高、或5500rpm或更高、或6000rpm或更高、或6500rpm或更高、或7000rpm或更高、或7500rpm或更高、或8000rpm或更高、或8500rpm或更高、或9000rpm或更高、或9500rpm或更高、或10,000rpm或更高)旋转来施加离心力。

套件

本公开的方面还包括包含主题脂质体挤出装置的套件。在某些实施方案中，所述套件包括主题脂质体挤出装置和被配置成容纳脂质体挤出装置的包装。包装可以是密封包装，例如防水和/或防水蒸汽的容器，任选地在气密和/或真空密封下。在某些实例中，包装是被配置成将封在包装中的装置保持在无菌环境中的无菌包装。“无菌”意指基本上没有微生物(如真菌、细菌、病毒、孢子形式等)。在一些实例中，所述套件还可以包括如本文所述的液体容器，如离心管。

所述套件还可以包括液体。例如，所述套件可以包括缓冲液，如样品缓冲液、洗涤缓冲液、测定缓冲液等。在一些情况下，所述套件可以包括适用于脂质体悬浮液的液体。所述套件还可以包括另外的试剂，如但不限于可检测标记(例如，荧光标记、比色标记、化学发光标记、多色试剂、亲和素-链霉亲和素相关检测试剂、放射性标记、金颗粒、磁性标记等)等等。

在某些实施方案中，所述套件还可以包括校准标准品。例如，所述套件可以包括一组标记的珠，如一组荧光标记的标准珠。校准标准品可用于确定测定仪器的准确度和确保后续测定之间的一致性。例如，校准标准品可用于确定流式细胞仪的准确度。在一些情况下，校准标准品包括标记的珠，如荧光标记的珠。荧光标记的珠可以是通常用作校准标准品的荧光标记的标准珠。荧光标记的标准珠的实例包括但不限于荧光标记的微粒或纳米颗粒。在一些情况下，荧光标记的珠被配置成使得它们保持悬浮在测定混合物中并且基本上不沉降或聚集。在一些实施方案中，荧光标记的珠包括但不限于荧光标记的聚苯乙烯珠、荧光素珠、罗丹明珠和用荧光染料标记的其他珠。荧光标记的珠的其他实例描述于美国专利号6,350,619；7,738,094；和8,248,597中，将其中每一篇的公开内容通过引用以其整体并入本文。

除了上述组分之外，主题套件还可以包括用于实践主题方法的说明书。这些说明书能以各种形式存在于主题套件中，其中的一种或多种可以存在于套件中。这些说明书可以存在的一种形式是作为打印在合适的介质或基片(例如，在其上打印信息的一张或多张纸)上、打印在套件的包装中、打印在包装插页等中的信息。另一种手段将是计算机可读介质，例如其上已经记录或储存信息的cd、dvd、blu-ray、计算机可读存储器(例如，闪存)等。可以存在的又另一种形式是可以在远离的地方经由因特网来获取信息的网址。任何方便形式的说明书均可以存在于套件中。

实用性

主题方法、装置和系统可用于可能需要具有确定的尺寸的脂质体群用于研究或实验室测试的应用中。在一些实施方案中，主题方法、装置和系统有助于准确分析从生物样品(例如，器官、组织、组织碎片、流体)获得的分析物(例如，细胞)。在某些实例中，主题方法、装置和系统可用于测试用于分析供研究或实验室测试的此类分析物的仪器的准确度。例如，主题方法、装置和系统可用于测试流式细胞仪的准确度。在一些情况下，使用本公开的方法、装置和系统产生的脂质体群体用作仪器(如流式细胞仪)的校准标准品。因此，主题方法、装置和系统可用于从异质脂质体的悬浮液中有效制备脂质体群。此外，主题方法、装置和系统可用于制备脂质体群而不需要专门的脂质体挤出系统，如需要注射器或气体/液体处理组件对脂质体悬浮液施加增加的压力以迫使脂质体通过挤出膜的脂质体挤出系统。在一些实例中，主题方法、装置和系统可用于在标准大气压下使用标准实验室设备产生脂质体群。换句话说，主题方法、装置和系统可用于在不对脂质体悬浮液施加增加的压力的情况下产生脂质体群。

如从上文提供的公开内容可以理解的，本公开的实施方案具有各种各样的应用。因此，本文呈现的实例是出于说明目的而提供的，并不旨在以任何方式解释为对本公开的实施方案的限制。本领域普通技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本上相似的结果的各种非关键参数。因此，提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本公开的实施方案的完整公开内容和描述，并且所述实施例不旨在限制诸位发明人认为是他们的发明的内容的范围，也不旨在表示以下实验是全部的实验或仅进行的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指示，份是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。

实施例

实施例1

进行实验以产生根据本公开的实施方案的脂质体群。

通过在惰性气体流下冷冻干燥或干燥，然后通过真空干燥来制备干燥的脂质混合物。将干燥的脂质用水性溶液(例如，缓冲盐水溶液)水合30-60min。对于具有高相变温度的脂质，将水性溶液预热，然后添加到干燥的脂质中。如果需要，可以使经水合的脂质悬浮液经历一个或多个冷冻/解冻循环，例如3至5个冷冻/解冻循环。

将膜组件置于离心管中。对于具有高相变温度的脂质，将膜组件预热。在用水性溶液水合干燥的脂质之后，将水性悬浮液样品加载到膜组件中。将样品离心。离心时间和速度(rpm)根据所使用的膜的类型而变化。必要时重复离心。

使用由54mol％1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、45mol％胆固醇和1mol％n-(荧光素-5-硫代氨基甲酰基)-1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺三乙基铵盐(dhpe-f)组成的大的多层囊泡(lmv)，根据上述程序制备脂质体群。

进行实验，其中将lmv在根据本公开的脂质体挤出装置中离心3次，所述脂质体挤出装置包括孔径为200nm的聚碳酸酯膜。如通过动态光散射(dls)测定的，所产生的脂质体群的尺寸是223.6±0.6nm。

进行实验，其中将lmv在根据本公开的脂质体挤出装置中离心一次，所述脂质体挤出装置包括3个聚碳酸酯膜，每个膜具有200nm的孔径。如通过dls测定的，所产生的脂质体群的尺寸是210.0±8.2nm。

进行实验，其中将lmv在根据本公开的脂质体挤出装置中离心一次，所述脂质体挤出装置包括2个聚碳酸酯膜，每个膜具有400nm的孔径。如通过dls测定的，所产生的脂质体群的尺寸是315.6±9.1nm。

实施例2

使用孔径为200、400、800或1000nm的聚碳酸酯膜以及由42mol％1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(pmpc)、30mol％胆固醇、14mol％1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(dops)、13mol％1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)和1mol％n-(荧光素-5-硫代氨基甲酰基)-1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dhpe-f)组成的lmv，根据上述程序制备四个脂质体群。使用dls分析脂质体大小并确定其尺寸。利用bdlsrfortessa流式细胞仪来分析所制备的脂质体纳米颗粒的侧向散射(ssc)和荧光素荧光。结果显示ssc(图2，a)或荧光素荧光(图2，b)和脂质体尺寸之间存在明显的线性相关性。

实施方案

在一个实施方案中，本公开提供了用于产生脂质体群的方法。所述方法包括将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中。所述脂质体挤出装置包括多孔膜和被配置成将膜定位在液体容器的内部的组件。所述方法还包括以足以使脂质体通过膜的方式向脂质体悬浮液施加离心力以产生脂质体群。

在一些实施方案中，所述方法包括在将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中之前将所述组件定位在液体容器中。

在一些实施方案中，所述液体容器是离心管。

在一些实施方案中，所述组件包括与液体容器的内部同心的圆筒。

在一些实施方案中，所述组件包括具有开口的第一端以及包括膜的与第一端相对的第二端。在一些实施方案中，所述组件的第二端与液体容器的封闭端隔开一定距离。在一些实施方案中，所述组件的第二端和液体容器的封闭端之间的液体容器的体积等于或大于所述组件的内部体积。

在一些实施方案中，所述膜具有1000nm或更小的孔径。在一些实施方案中，所述膜具有500nm或更小的孔径。在一些实施方案中，所述膜具有250nm或更小的孔径。

在一些实施方案中，所述膜包括一层或多层膜材料。在一些实施方案中，所述膜材料是聚合物。在一些实施方案中，所述聚合物包括聚碳酸酯。

在一些实施方案中，所述膜包括两层或更多层膜材料。在一些实施方案中，所述膜材料的两层或更多层中的每一层的孔径是相同的。在一些实施方案中，所述膜材料的两层或更多层中的至少两层的孔径是不同的。

在一些实施方案中，所述液体容器包括密封件。在一些实施方案中，所述密封件包括可移除的盖。

在一些实施方案中，施加离心力包括使液体容器在离心机中旋转。

在一些实施方案中，将施加离心力重复一次或多次。

在一些实施方案中，施加离心力在大气压下进行。

在一些实施方案中，所述方法还包括制备脂质体悬浮液。在一些实施方案中，所述脂质体悬浮液包括具有不同尺寸的脂质体群。

在一些实施方案中，所述脂质体包括荧光标记。

在一些实施方案中，所述脂质体群具有1000nm或更小的平均直径。在一些实施方案中，所述脂质体群具有500nm或更小的平均直径。在一些实施方案中，所述脂质体群具有250nm或更小的平均直径。

本公开的实施方案包括脂质体挤出装置，其包括具有一层或多层聚碳酸酯材料的多孔膜以及被配置成将膜定位在液体容器的内部并且包括具有开口的第一端和包括膜的与第一端相对的第二端的组件。

在一些实施方案中，所述脂质体挤出装置还包括液体容器。在一些实施方案中，所述液体容器是离心管。

本公开的实施方案包括用于产生脂质体群的系统。所述系统包括液体容器和定位在液体容器中的脂质体挤出装置。所述脂质体挤出装置包括具有一层或多层聚碳酸酯材料的多孔膜以及被配置成将膜定位在液体容器的内部并且包括具有开口的第一端和包括膜的与第一端相对的第二端的组件。

在一些实施方案中，所述脂质体挤出装置包含脂质体悬浮液。

在一些实施方案中，系统还包括离心机。

本公开的实施方案包括套件。所述套件包括脂质体挤出装置和被配置成容纳所述装置的包装。所述脂质体挤出装置包括具有一层或多层聚碳酸酯材料的多孔膜以及被配置成将膜定位在液体容器的内部并且包括具有开口的第一端和包括膜的与第一端相对的第二端的组件。

在一些实施方案中，所述套件还包括液体容器。

在一些实施方案中，所述套件包括一组荧光标记的标准珠。

尽管有附加条款，但本文所述的公开内容也由以下条款限定：

1.一种用于产生脂质体群的方法，所述方法包括：

将脂质体悬浮液引入脂质体挤出装置中，所述脂质体挤出装置包括：

多孔膜；和

被配置成将所述膜定位在液体容器的内部的组件；以及

以足以使所述脂质体通过所述膜的方式向所述脂质体悬浮液施加离心力以产生脂质体群。

2.根据条款1所述的方法，其还包括在将所述脂质体悬浮液引入所述脂质体挤出装置中之前将所述组件定位在所述液体容器中。

3.根据条款1或2所述的方法，其中所述液体容器包括离心管。

4.根据条款1至3中任一项所述的方法，其中所述组件包括与所述液体容器的内部同心的圆筒。

5.根据条款1至4中任一项所述的方法，其中所述组件包括具有开口的第一端以及与所述第一端相对并且包括所述膜的第二端。

6.根据条款5所述的方法，其中所述组件的第二端与所述液体容器的封闭端隔开一定距离。

7.根据条款6所述的方法，其中所述组件的第二端和所述液体容器的封闭端之间的所述液体容器的体积等于或大于所述组件的内部体积。

8.根据条款1至7中任一项所述的方法，其中所述膜具有1000nm或更小的孔径。

9.根据条款1至8中任一项所述的方法，其中所述膜具有500nm或更小的孔径。

10.根据条款1至9中任一项所述的方法，其中所述膜具有250nm或更小的孔径。

11.根据条款1至10中任一项所述的方法，其中所述膜包括一层或多层膜材料。

12.根据条款11所述的方法，其中所述膜材料包括聚合物。

13.根据条款12所述的方法，其中所述聚合物包括聚碳酸酯。

14.根据条款11至13中任一项所述的方法，其中所述膜包括两层或更多层膜材料。

15.根据条款14所述的方法，其中所述膜材料的两层或更多层中的每一层的孔径是相同的。

16.根据条款14所述的方法，其中所述膜材料的两层或更多层中的至少两层的孔径是不同的。

17.根据条款1至16中任一项所述的方法，其中所述液体容器包括密封件。

18.根据条款17所述的方法，其中所述密封件是可移除的盖。

19.根据条款1至18中任一项所述的方法，其中施加离心力包括使所述液体容器在离心机中旋转。

20.根据条款1至19中任一项所述的方法，其中将施加离心力重复一次或多次。

21.根据条款1至20中任一项所述的方法，其中施加离心力在大气压下进行。

22.根据条款1至21中任一项所述的方法，其还包括制备所述脂质体悬浮液。

23.根据条款1至22中任一项所述的方法，其中所述脂质体悬浮液包括具有不同尺寸的脂质体群。

24.根据条款1至23中任一项所述的方法，其中所述脂质体包括荧光标记。

25.根据条款1至24中任一项所述的方法，其中所述脂质体群具有1000nm或更小的平均直径。

26.根据条款1至25中任一项所述的方法，其中所述脂质体群具有500nm或更小的平均直径。

27.根据条款1至26中任一项所述的方法，其中所述脂质体群具有250nm或更小的平均直径。

28.一种脂质体挤出装置，其包括：

包括一层或多层聚碳酸酯材料的多孔膜；以及

被配置成将所述膜定位在液体容器的内部并且包括具有开口的第一端和与所述第一端相对并且包括所述膜的第二端的组件。

29.根据条款28所述的装置，其还包括所述液体容器。

30.根据条款28或29所述的装置，其中所述液体容器包括离心管。

31.根据条款28至30中任一项所述的装置，其中所述组件包括与所述液体容器的内部同心的圆筒。

32.根据条款28所述的装置，其中当所述组件的第二端插入所述液体容器中时，所述组件的第二端与所述液体容器的封闭端隔开一定距离。

33.根据条款32所述的装置，其中所述组件的第二端和所述液体容器的封闭端之间的所述液体容器的体积等于或大于所述组件的体积。

34.根据条款28至33中任一项所述的装置，其中所述膜具有1000nm或更小的孔径。

35.根据条款28至34中任一项所述的装置，其中所述膜具有500nm或更小的孔径。

36.根据条款28至35中任一项所述的装置，其中所述膜具有250nm或更小的孔径。

37.根据条款28至36中任一项所述的装置，其中所述膜包括一层或多层膜材料。

38.根据条款37所述的装置，其中所述膜包括两层或更多层膜材料。

39.根据条款38所述的装置，其中所述膜材料的两层或更多层中的每一层的孔径是相同的。

40.根据条款38所述的装置，其中所述膜材料的两层或更多层中的至少两层的孔径是不同的。

41.根据条款28至40中任一项所述的装置，其中所述液体容器包括密封件。

42.根据条款41所述的装置，其中所述密封件是可移除的盖。

43.一种用于产生脂质体群的系统，所述系统包括：

液体容器；以及

定位在所述液体容器中的脂质体挤出装置，其中所述脂质体挤出装置包括：

包括一层或多层聚碳酸酯材料的多孔膜；和

被配置成将所述膜定位在所述液体容器的内部并且包括具有开口的第一端和与所述第一端相对并且包括所述膜的第二端的组件。

44.根据条款43所述的系统，其中所述脂质体挤出装置包含脂质体悬浮液。

45.根据条款43或44所述的系统，其中所述液体容器包括离心管。

46.根据条款43至45中任一项所述的系统，其还包括离心机。

47.根据条款43至46中任一项所述的系统，其中所述组件包括与所述液体容器的内部同心的圆筒。

48.根据条款43所述的系统，其中当所述组件的第二端插入所述液体容器中时，所述组件的第二端与所述液体容器的封闭端隔开一定距离。

49.根据条款48所述的系统，其中所述组件的第二端和所述液体容器的封闭端之间的所述液体容器的体积等于或大于所述组件的体积。

50.根据条款43至49中任一项所述的系统，其中所述膜具有1000nm或更小的孔径。

51.根据条款43至50中任一项所述的系统，其中所述膜具有500nm或更小的孔径。

52.根据条款43至51中任一项所述的系统，其中所述膜具有250nm或更小的孔径。

53.根据条款43至52中任一项所述的系统，其中所述膜包括一层或多层膜材料。

54.根据条款53所述的系统，其中所述膜包括两层或更多层膜材料。

55.根据条款54所述的系统，其中所述膜材料的两层或更多层中的每一层的孔径是相同的。

56.根据条款54所述的系统，其中所述膜材料的两层或更多层中的至少两层的孔径是不同的。

57.根据条款43至56中任一项所述的系统，其中所述液体容器包括密封件。

58.根据条款57所述的系统，其中所述密封件是可移除的盖。

59.一种套件，其包括：

脂质体挤出装置，所述脂质体挤出装置包括：

包括一层或多层聚碳酸酯材料的多孔膜；和

被配置成将所述膜定位在液体容器的内部并且包括具有开口的第一端和与所述第一端相对并且包括所述膜的第二端的组件；以及

被配置成容纳所述装置的包装。

60.根据条款59所述的套件，其还包括所述液体容器。

61.根据条款59或60所述的套件，其中所述液体容器包括离心管。

62.根据条款59至61中任一项所述的套件，其中所述组件包括与所述液体容器的内部同心的圆筒。

63.根据条款59所述的套件，其中当所述组件的第二端插入所述液体容器中时，所述组件的第二端与所述液体容器的封闭端隔开一定距离。

64.根据条款63所述的套件，其中所述组件的第二端和所述液体容器的封闭端之间的所述液体容器的体积等于或大于所述组件的体积。

65.根据条款59至64中任一项所述的套件，其中所述膜具有1000nm或更小的孔径。

66.根据条款59至65中任一项所述的套件，其中所述膜具有500nm或更小的孔径。

67.根据条款59至66中任一项所述的套件，其中所述膜具有250nm或更小的孔径。

68.根据条款59至67中任一项所述的套件，其中所述膜包括一层或多层膜材料。

69.根据条款68所述的套件，其中所述膜包括两层或更多层膜材料。

70.根据条款69所述的套件，其中所述膜材料的两层或更多层中的每一层的孔径是相同的。

71.根据条款69所述的套件，其中所述膜材料的两层或更多层中的至少两层的孔径是不同的。

72.根据条款59至71中任一项所述的套件，其中所述液体容器包括密封件。

73.根据条款72所述的套件，其中所述密封件是可移除的盖。

74.根据条款59至73中任一项所述的套件，其还包括一组荧光标记的标准珠。

虽然前述发明已经通过说明和举例的方式出于清楚理解的目的进行了相当详细的描述，但是本领域普通技术人员根据本公开传授的内容很容易明白可以在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。

因此，前述内容仅说明了本公开的实施方案的原理。应理解的是，本领域技术人员将能够设计不同的安排，所述不同的安排虽然没有在本文明确地描述或显示，但体现本公开的实施方案的原理并且被包括在其精神和范围之内。此外，本文叙述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本公开的实施方案的原理而不限于此类具体叙述的实例和条件。此外，本文叙述本公开的实施方案的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构等效物和功能等效物两者。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者，即所开发的执行相同功能的任何要素，而不考虑结构。因此，本公开的实施方案的范围不旨在受限于本文示出和描述的示例性实施方案。相反，本公开的实施方案的范围和精神由所附权利要求体现。