治疗性SALL4肽的制作方法
本申请要求2016年4月28日提交的美国临时申请62/329,010的权益。该申请的全部教导都通过援引并入本文中。
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背景技术：
spalt样转录因子4(sall4)在发育事件和干细胞多能性的维持中有不可或缺的作用。sall4是锌指转录因子，其与pou5fi(oct4)、nanog和sox2一起形成核心转录网络，该网络激活与胚胎干细胞(esc)的增殖相关的基因。sall4与视网膜母细胞瘤结合蛋白4(rbbp4，其是核小体重塑和组蛋白脱乙酰化(nurd)复合体的亚基)结合，结合有sall4的复合体被募集到包括转录因子在内的多种下游靶标处。据报道，除了nurd复合体外，sall4还结合其他表观遗传修饰因子，由此改变基因表达。sall4与nurd复合体的结合允许sall4充当多种下游靶标的转录抑制因子。这种下游靶标的实例包括但不限于磷酸酶和张力蛋白同源物(pten)，其是白血病干细胞(lsc)自我更新所必需的因子。
sall4是一种可行的潜在靶标，因为它在包括实体瘤和其他血液肿瘤的多种病况或疾病状态中异常表达。在过去几年中，已经进行了很多努力来开发基于肽的抗癌药物。这种基于肽的疗法的主要局限在于缺乏靶标特异性。如果没有关于所要靶向的细胞或组织的表面分子(例如，受体)上的特异性结合口袋或特异性相互作用位点的信息，则难以将肽靶向至特定的组织或细胞。
因此，需要包含改进的基于肽的药物的组合物，特别是用于治疗实体瘤和血液肿瘤的这种组合物。还需要使用这种组合物的方法。
技术实现要素：
本文描述了靶向sall4-rbbp4相互作用的分离的肽。已经提出sall4是某些疾病(例如癌症)的可行靶标，因为sall4在这些疾病中选择性表达。然而，sall4属于所谓的非成药性靶标类别，因为它缺乏供抑制剂结合的典型的可成药口袋。最近确定了sall4-rbbp4复合体的晶体结构，由此鉴定了这两种蛋白之间关键相互作用的位点。基于结构-功能研究，本文显示出阻断sall4-rbbp4相互作用的分离的肽在具有表达sall4的细胞的多种疾病中具有治疗价值。例如，许多实体瘤具有异常的sall4表达，而正常组织不表达sall4。
因此，在一方面，本发明涉及分离的肽，其抑制sall4与rbbp4的结合。本发明提供了分离的肽，其与rbbp4蛋白结合，以使得所述分离的肽与野生型(wt)sall4肽竞争与rbbp4蛋白中同一位点的结合。在一个实施方式中，本发明中描述的分离的肽对rbbp4的结合亲和力高于wtsall4肽。
在另一方面，本发明涉及包含本发明的分离的肽的药物组合物。这些组合物可用于多种应用，例如，用于治疗肝细胞癌。
在又一方面，本发明涉及一种通过使表达sall4的细胞与至少一种本文所述的分离的肽接触来抑制sall4与rbbp4的结合的方法。
在另一方面，本发明涉及一种治疗由sall4或nurd的失调介导的病症的方法。在又一方面，本发明涉及一种治疗由磷光体akt、ccnd2、oct4、znhit6、wkn1或snhg12的失调介导的病症的方法。该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述药物组合物。
作为参与正常发育的干细胞因子，sall4在大多数成体组织中不表达，而是在多种患病组织中表达。因此，靶向sall4的所述分离的肽是非常有选择性的，其克服了基于肽的治疗剂的选择性靶向性的最大障碍。特异性是任何治疗性肽的重要标准之一，因为肽的特异性越高，其带来的副作用越少。因此，本文所述的分离的肽、药物组合物和方法具有某些有利的性质，其可用于多种治疗和非治疗应用。
附图说明
2016年4月28日提交的美国临时申请62/329,010('010申请)包含对应于本申请的附图的彩色附图。关于本文提供的对附图的当前描述中的颜色指示，请参考'010申请的那些相应附图和相关描述。
通过以下对本发明的示例实施方式的更具体的描述，前述内容将变得显而易见，如附图中所示，其中相同的附图标记在不同的视图中指相同的部分。附图不一定按比例绘制，而是意在着重说明本发明的实施方式。
图1a-1b.wtsall4(1-12aa)对rbbp4的结合亲和力。图1a显示了针对rbbp4滴定的wtsall4肽的等温量热测定(itc)谱，其以原始数据(上图)和1:1结合模型中的模拟曲线(下图)显示。图1b是表面等离子共振的传感图，其显示了wtsall4肽与固定在葡聚糖涂覆的芯片上的rbbp4的结合。
图2a-2d.sall4-rbbp4复合体的晶体结构。图2a显示了sall4-rbbp4复合体的正视图。rbbp4以黄色、绿色(β折叠)和红色(α螺旋)绘出，并且sall4肽以蓝色绘出。rbbp4的n端和c端被标记。图2b显示了由红色(酸性曲片)、白色(中性)和蓝色(碱性)表示的静电势。or图表示静电势。酸性曲片用红色表示，中性为白色，碱性为蓝色。图2c显示了从met1到ile12的sall4肽的关键残基的最终2f0-fc电子密度图(以1σ绘出轮廓)。图2d显示了与sall4肽(蓝色)相互作用的rbbp4侧链(绿色)，以棒状图显示。在框中示出了sall4-rbbp4的独特相互作用。本文中所有与结构相关的图都是使用pymol程序制作的。
图3a-3e。参与sall4(1-12)-rbbp4结合的关键残基。图3a显示了对sall4肽的所有12个残基进行的计算丙氨酸扫描(cas)。计算了丙氨酸突变体的结合自由能(δg突变体，ala7突变为甘氨酸)和野生型的结合自由能(δg野生型)之差(δδg结合)(δδg结合＝δg突变体-δg野生型)。将δδg结合制成表格(左)并以条形图(右)作图。图3b显示了突变肽的比对。突变的残基以红色突出显示。通过荧光偏振(fp)确定了每种肽(包括wt)的ic50。将不同浓度的每种肽滴定到0.04μmbrbp4和0.01μmc标记的fitc-sall4wt肽的混合物中。偏振以mp度量。图3c显示了通过fp获得的sall4wt和双突变体3,5a的代表性ic50曲线。图3d显示了对用sall4wt或突变体3,5a肽处理的snu398细胞进行的细胞活力测定。将pep-1载体添加到肽中以促进肽的细胞穿透。图3e显示了使用定量实时pcr测量的sall4-rbbp4下游基因pten的转录本水平。
图4a-4b.ffw肽的结合亲和力。图4a显示了ffw(seqidno:14)和wtsall4(seqidno:13)肽与rbbp4结合的计算模型。图4b显示了与原始的12残基sall4wt肽相比ffw的荧光偏振测定(ic50＝0.023μm相对于1.30μm)。
图5a-5b.有效力的治疗性肽ffw的开发。图5a显示了将穿膜肽(penetratin)序列(seqidno:2)添加至wt(seqidno:13)、mut(seqidno:39)和ffw(seqidno:14)肽中以辅助细胞穿透。图5b显示了在snu398细胞中对穿膜肽缀合的肽进行细胞活力测定，证明了pen-ffw的高效力。
图6a-6b.pen-ffw在hcc细胞系中的治疗窗。图6a：将肽加入高表达sall4的hcc细胞系snu398中。图6b：不表达sall4的hcc细胞系snu387，并且在温育72小时后测量细胞活力。
图7a-7e.候选治疗性肽ffw的抗肿瘤活性。图7a：将7.2×105个snu398细胞皮下接种到nod/scid/γ小鼠(nsg小鼠)的右胁腹中。使肿瘤生长一周，然后每隔一天施用肽进行处理，共注射五次。图7b：通过绘制肿瘤体积-时间的关系图来记录肿瘤生长。与施用pen(p＝0.0008)、pen-mut(p＝0.001)和pen-wt(p＝0.01)时相比，施用了pen-ffw的小鼠的hcc异种移植物生长速率显著降低。图7c：在第20天切除的肿瘤的相对尺寸。图7d：确定肿瘤重量(n＝5)。与pen(μ＝1550.78mg)、pen-mut(μ＝1273.46mg)和pen-wt(μ＝563.46mg)相比，pen-ffw处理的小鼠具有最小的肿瘤(μ＝88.34mg)。图7e：从切除的肿瘤中分离出总rna，并使用实时pcr测量pten的表达。
图8.通过荧光偏振(fp)来确定sall4突变肽的代表性ic50曲线。
图9a-9e.与索拉非尼相比，pen-ffw的临床意义。图9a：将经pen-ffw处理的snu398肿瘤异种移植物与经索拉非尼处理的异种移植物比较。图9b：将经pen-ffw处理的plc8024肿瘤异种移植物与经索拉非尼处理的异种移植物比较。测量了小鼠体重以获得各种肽的毒性。图9c：第17天小鼠的体重。图9d：与第0天(如图7a最左侧的箭头所示)相比体重的变化。图9e：在图9a所示的实验中第19天的小鼠体重。图9a比较了索拉非尼和pen-ffw的效果。数据代表平均值±s.d.(n＝5)。
图10a-10c.pen-ffw在人血浆中的体外药代动力学。图10a：用lc-ms/ms监测最多24小时的pen-ffw降解曲线。图10a的插图显示，发现pen-ffw对血浆蛋白酶稳定，30分钟后超过90％的肽保留在血浆中。图10b：用lc-ms/ms监测最多1500分钟的对照尤卡托品(eucatropine)的降解曲线，其显示尤卡托品迅速降解。图10b的插图显示，尤卡托品在30分钟内迅速降解至40％。图10c：用n端fitc缀合的pen-ffw处理的snu398细胞的活细胞成像。在第一个小时期间以2分钟的间隔对这些细胞进行活细胞成像，并且在随后的23小时期间以5分钟的间隔进行活细胞成像，以评估fitc-pen-ffw的渗透性和稳定性。
图11a-11d.pen-ffw在c57bl/6小鼠(n＝4)中的毒性。在17天的进程中，每隔一天向小鼠腹膜内(ip)施用pen-ffw(30mg/kg)或载剂(10％dmso)，至累积剂量为270mg/kg。图11a：显示了小鼠的跟踪体重或终点体重。这些小鼠没有表现出明显的毒性迹象，例如体重减轻、嗜睡或丧失运动性。图11b：测量小鼠的血清ast和alt，两组没有显著变化。图11c：测量这些小鼠的血细胞计数，并且未观察到血细胞计数的显著变化。图11d：来自从用载剂对照和pen-ffw处理的动物采集的主要器官(心脏、肝脏、肺、脾、胃)的组织切片的代表性显微照片。显微镜检下未观察到组织损伤。
图12a-12b.用tcgahcc患者rna-seq数据集进行kaplanmeier存活率分析。图12a：使用来自pen-ffwdeg的9基因子集的单个基因，用tcgahcc患者rna-seq数据集进行kaplanmeier存活率分析。显示了六个单独的deg的预测力，如图中的“p”值所示。图12b：用各自没有预测力的多种pen-ffwdeg进行组合研究的实例。当用作单个基因时，这些deg在预测患者结果方面没有统计学效力，如左图和中图所示。但是当组合使用时，观察到显著的低风险比，如右图所示。
具体实施方式
分离的肽和包含分离的肽的组合物
本发明涉及包含氨基酸的分离的肽，所述氨基酸是基于发明人对人类spalt样转录因子4(sall4)的片段与视网膜母细胞瘤结合蛋白4(rbbp4)的相互作用进行的结构-功能研究而选出的。本文所用的术语“肽”是指具有以链形式连接的两个以上氨基酸的化合物，每个酸的羧基通过-oc-nh-型键与下一个酸的氨基连接。“肽”是本领域技术人员公知的。
在某些实施方式中，本发明提供了包含式(i)所示的氨基酸序列的分离的肽：
rrkx1x2x3x4x5x6x7(i)
式(i)中的氨基酸序列遵循表示肽的氨基酸序列的标准惯例。式(i)中的氨基酸从n端(左侧)到c端(右侧)书写。本申请及其序列表中提到的所有式和序列遵循相同的惯例。式(i)中的氨基酸残基由本领域技术人员熟知的单字母符号表示。例如，式(i)中使用的单字母代码具有以下含义：r＝arg＝精氨酸，k＝lys＝赖氨酸。式(i)中的氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6或x7独立地指具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链或在中性ph下带正电荷的极性侧链的氨基酸。本文所用的表述“非极性侧链”是指天然存在的或非天然的氨基酸的侧链“r”基团，其在生理ph下不带电荷且不能形成或参与氢键。具有非极性侧链的氨基酸的实例包括但不限于甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、脯氨酸(pro)、苯丙氨酸(phe)、甲硫氨酸(met)和正亮氨酸(nle)。色氨酸(trp)是例外的非极性氨基酸，因为其侧链中存在氢供体原子。具有“非极性侧链”的氨基酸是本领域技术人员公知的。本文所用的表述“在中性ph下不带电荷的极性侧链”是指天然存在的或非天然的氨基酸的侧链“r”基团，其在生理ph下实质上不带电荷，并且在其侧链中具有可以参与氢键的氢供体或受体原子。具有在中性ph下实质上不带电荷的极性侧链的氨基酸的实例包括但不限于丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、天冬酰胺(asn)、谷氨酰胺(gln)和酪氨酸(tyr)。具有“在中性ph下不带电荷的极性侧链”的氨基酸是本领域技术人员公知的。本文所用的表述“在中性ph下带电荷的极性侧链”是指天然或非天然存在的氨基酸的侧链“r”基团，其在生理ph下实质上带电，并且因其在其侧链中具有氢供体或受体原子而可以参与氢键。具有在生理ph下实质上带电的极性侧链的氨基酸的实例包括但不限于精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、鸟氨酸(orn)和组氨酸(his)、天冬氨酸(asp)和谷氨酸(glu)。具有“在中性ph下带电的极性侧链”的氨基酸是本领域技术人员公知的。本文所用的术语“实质上”是指“大部分”或“主要地”或“至少部分地”。例如，谷氨酸被认为在中性ph下带负电荷，因为羧酸侧链失去h+离子(质子)。实际上，在肽中，在谷氨酸的带负电的非质子化形式和不带电荷的质子化形式之间存在动态平衡。谷氨酸被认为在中性ph下具有“实质”负电荷，因为动态平衡向非质子化形式移动，而溶液中的“主要”物种是带负电荷的物种。在某些实施方式中，x1是具有非极性芳族侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x2是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x3是具有非极性侧链的氨基酸，或是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x4是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x5是具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、在中性ph下带实质负电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x6是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x7是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x1是具有非极性芳族侧链的氨基酸；x2是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x3是具有非极性侧链或在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x4是具有非极性侧链的氨基酸；x5是具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、在中性ph下带实质负电荷的极性侧链的氨基酸；x6是具有非极性侧链的氨基酸；x7是具有非极性侧链的氨基酸。在一些实施方式中，本发明提供了分离的肽，其包含式(i)中所示的氨基酸序列，其中氨基酸x1、x2、x3、x4、x5、x6或x7中的一个以上是可选的。在一些实施方式中，式(i)不包括由氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)表示的wtsall4肽。术语“非天然氨基酸”或短语“非天然存在的氨基酸”是指不属于20种天然存在的氨基酸或硒代半胱氨酸之一的任何氨基酸、修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物。例如，非天然氨基酸包括但不限于20种天然存在的氨基酸的d-对映异构体、鸟氨酸和β-赖氨酸。生理ph或中性ph是指ph值为7.0。示例性非天然氨基酸如下所示，不应被解释为是限制性的。
leu和ile类似物
phe和trp类似物
lys和arg类似物
在一些实施方式中，本发明提供了包含式(ia)所示的氨基酸序列的分离的肽：
x0rrkx1x2x3x4x5x6x7(ia)
式(ia)中的氨基酸x0、x1、x2、x3、x4、x5、x6或x7独立地指具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、或在中性ph下带正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x0是具有非极性侧链或在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。例如，x0可以是由具有以下含义的单字母代码表示的氨基酸：o＝orn＝鸟氨酸，z＝β-lys＝β赖氨酸，u＝nor＝正缬氨酸。在某些实施方式中，x1是具有非极性芳族侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x2是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x3是具有非极性侧链的氨基酸，或是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x4是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x5是具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、在中性ph下带实质负电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x6是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x7是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x0是具有非极性侧链或在中性下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x1是具有非极性芳族侧链的氨基酸；x2是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x3是具有非极性侧链或在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x4是具有非极性侧链的氨基酸；x5是具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、在中性ph下带实质负电荷的极性侧链的氨基酸；x6是具有非极性侧链的氨基酸；x7是具有非极性侧链的氨基酸。在一些实施方式中，本发明提供了分离的肽，其包含式(ia)中所示的氨基酸序列，其中氨基酸x0、x1、x2、x3、x4、x5、x6或x7中的一个以上是可选的。
在一些实施方式中，本发明提供了包含式(ii)所示的氨基酸序列的分离的肽：
a-x0rrkx1x2x3x4x5x6x7-b(ii)
式(ii)中的氨基酸x0、x1、x2、x3、x4、x5、x6或x7独立地指具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、或在中性ph下带正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x0是具有非极性侧链或在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。例如，x0可以是由具有以下含义的单字母代码表示的氨基酸：o＝orn＝鸟氨酸，z＝β-lys＝β赖氨酸，u＝nor＝正缬氨酸。在某些实施方式中，x1是具有非极性芳族侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x2是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x3是具有非极性侧链的氨基酸，或是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x4是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x5是具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、在中性ph下带实质负电荷的极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x6是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x7是具有非极性侧链的氨基酸。在某些实施方式中，x0是具有非极性侧链或在中性下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x1是具有非极性芳族侧链的氨基酸；x2是具有在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x3是具有非极性侧链或在中性ph下带实质正电荷的极性侧链的氨基酸；x4是具有非极性侧链的氨基酸；x5是具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、在中性ph下带实质负电荷的极性侧链的氨基酸；x6是具有非极性侧链的氨基酸；x7是具有非极性侧链的氨基酸。在一些实施方式中，本发明提供了分离的肽，其包含式(ii)中所示的氨基酸序列，其中氨基酸x0、x1、x2、x3、x4、x5、x6或x7中的一个以上是可选的。在一些实施方式中，式(ii)不包括由氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)表示的wtsall4肽。
式(ii)中的“a”是与x0的α-氨基共价键合的乙酰基或n端保护基。本文所用的“n端保护基”是指意在例如阻断、保护和/或修饰氨基酸或肽的α-n端的物理、化学和/或生物学性质、或者在合成过程中保护氨基酸或肽的氨基免受不希望的反应的那些基团。常用的n-保护基公开于greene，“protectivegroupsinorganicsynthesis”(johnwiley&sons，newyork(1981))中，将该文献通过援引并入本文。代表性的n端保护基是c1-c8低级烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基等)。另外，保护基团可用作前药，其容易在体内裂解，例如通过酶促水解来裂解，以释放出生物活性母体。α-n端保护基包括：c1-c8低级烷酰基，例如甲酰基、乙酰基(“ac”)、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基等；其它c1-c8酰基，包括2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，例如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成性基团，例如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对-硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、3,5-二甲氧基苄氧基羰基、2,4-二甲氧基苄氧基羰基、4-乙氧基苄氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊基氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己基氧基羰基、苯硫基羰基等；芳基烷基，例如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)等；和甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基等。
式(ii)中的“b”是与x7的末端羰基共价键合的胺基或c端保护基。“c端保护基”或术语“羧基保护基”是指用来例如阻断、保护和/或修饰该羧基部分的物理、化学和/或生物学性质的羧酸保护基(例如酯或酰氨基)。羧酸(或羧基)保护基公开于greene，“protectivegroupsinorganicsynthesis”第152-186页(1981)中，将该文献通过援引并入本文。另外，羧基保护基可用作前药，由此羧基保护基能够容易在体内裂解，例如通过酶促水解来裂解，以释放出生物活性母体。这些羧基保护基是本领域技术人员所熟知的，已广泛用于保护青霉素和头孢菌素领域中的羧基，如美国专利3,840,556和3,719,667中描述的，将其公开内容通过援引并入本文。代表性的羧基保护基有：c1-c8低级烷基(例如甲基、乙基或叔丁基等)；芳基-(c1-c8)烷基，例如苯乙基或苄基及其经取代的衍生物，例如烷氧基苄基或硝基苄基等；芳基烯基，例如苯乙烯基等；芳基及其经取代的衍生物，例如5-茚满基等；二烷基氨基烷基，例如二甲基氨基乙基等；烷酰氧基烷基，例如乙酰氧基甲基、丁酰氧基甲基、戊酰氧基甲基、异丁酰氧基甲基、异戊酰氧基甲基、1-(丙酰氧基)-1-乙基、1-(新戊酰氧基)-1-乙基、1-甲基-1-(丙酰氧基)-1-乙基、新戊酰氧基甲基、丙酰氧基甲基等；环烷酰氧基烷基，例如环丙基羰基氧基甲基、环丁基羰基氧基甲基、环戊基羰基氧基甲基、环己基羰基氧基甲基等；芳酰氧基烷基，例如苯甲酰氧基甲基、苯甲酰氧基乙基等；芳基烷基羰氧基烷基，例如苄基羰基氧基甲基、2-苄基羰基氧基乙基等；烷氧基羰基烷基或环烷氧基羰基烷基，例如甲氧基羰基甲基、环己氧基羰基甲基、1-甲氧基羰基-1-乙基等；烷氧基羰基氧基烷基或环烷氧基羰基氧基烷基，例如甲氧基羰氧基甲基、叔丁氧基羰氧基甲基、1-乙氧基羰氧基-1-乙基、1-环己氧基羰氧基-1-乙基等；芳氧基羰基氧基烷基，例如2-(苯氧基羰基氧基)乙基、2-(5-茚满基氧基羰基氧基)乙基等；烷氧基烷基羰基氧基烷基，例如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-酰基氧基)乙基等；芳基烷氧基羰氧基烷基，例如2-(苄氧基羰氧基)乙基等；芳基烯氧基羰氧基烷基，例如2-(3-苯基丙烯-2-基氧基羰氧基)乙基等；烷氧基羰基氨基烷基，例如叔丁氧基羰基氨基甲基等；烷基氨基羰基氨基烷基，例如甲基氨基羰基氨基甲基等；烷酰基氨基烷基，例如乙酰基氨基甲基等；杂环羰基氧基烷基，例如4-甲基哌嗪基羰基氧基甲基等；二烷基氨基羰基烷基，例如二甲基氨基羰基甲基、二乙基氨基羰基甲基等；(5-((c1-c8)低级烷基)-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，例如(5-叔丁基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等；和(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)烷基，例如(5-苯基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基等。例如，式(ii)中的“b”可以是通过“c端保护基”与氨基酸x7的末端羧基反应而形成的酯或酰胺。
在第一实施方式中，本发明提供了包含以下序列的肽：rrkx1akpqhi(seqidno:4)，其中x1是具有非极性芳族侧链的氨基酸。本发明的第二实施方式提供了包含以下序列的肽：rrkqx2kpqhi(seqidno:5)，其中x2是具有在中性ph下带正电荷的极性侧链的氨基酸。在第三实施方式中，本发明提供了包含以下序列的肽：rrkqax3pqhi(seqidno:6)，其中x3是具有非极性侧链和/或在中性ph下带正电的极性侧链的氨基酸。在第四实施方式中，本发明提供了包含以下序列的肽：rrkqakx4qhi(seqidno:7)，其中x4是具有非极性侧链的氨基酸。本发明的第五实施方式提供了包含以下序列的肽：rrkqakpx5hi(seqidno:8)，其中x5是具有非极性侧链、在中性ph下不带电荷的极性侧链、在中性ph下带负电荷的极性侧链或其组合的氨基酸。在第六实施方式中，本发明提供了包含以下序列的肽：rrkqakpqx6i(seqidno:9)，其中x6是具有非极性侧链的氨基酸。在第七实施方式中，本发明提供了包含以下序列的肽：rrkqakpqhx7(seqidno:10)，其中x7是具有非极性侧链的氨基酸。在第八实施方式中，本发明提供了包含以下序列的肽：rrkx1akx4qx6i(seqidno:11)，其中x1、x4或x6独立地选自具有非极性侧链的氨基酸。本发明的第九实施方式提供了包含以下序列的肽：x0rrkqakpqhi(seqidno.12)，其中x0是具有非极性侧链或在中性ph下带正电荷的极性侧链的氨基酸。本发明的第十实施方式提供了可以是以下肽序列中任一种的肽：rrkqakpqhi(seqidno:3)、rrkaakpqhi(seqidno:15)、rrkfakpqhi(seqidno:16)、rrkqkkpqhi(seqidno:17)、rrkqrkpqhi(seqidno:18)、rrkqaapqhi(seqidno:19)、rrkqavpqhi(seqidno:20)、rrkqalpqhi(seqidno:21)、rrkqafpqhi(seqidno:22)、rrkqarpqhi(seqidno:23)、rrkqakfqhi(seqidno:24)、rrkqakpahi(seqidno:25)、rrkqakpehi(seqidno:26)、rrkqakpnhi(seqidno:27)、rrkqakpvhi(seqidno:28)、rrkqakplhi(seqidno:29)、rrkqakpqai(seqidno:30)、rrkqakpqfi(seqidno:31)、rrkqakpqyi(seqidno:32)、rrkqakpqwi(seqidno:33)、rrkqakpqvi(seqidno:34)、rrkqakpqha(seqidno:35)、rrkqakpqhv(seqidno:36)、rrkqakpqhl(seqidno:37)、rrkqakpqhf(seqidno:38)、rrkfakfqwi(seqidno:14)、rrkhakpqhi(seqidno:40)、orrkqakpqhi(seqidno:41)、hrrkqakpqhi(seqidno:42)、rrkqpkpqhi(seqidno:43)、hrrkqakpqhi(seqidno:44)、urrkqakpqhi(seqidno:45)或zrrkqakpqhi(seqidno:46)。
在上述所有实施方式中，末端可以是游离的，或受到保护以使得肽的氨基和羧基末端如上所述受到保护。保护可以通过“n端保护基”和/或“c端保护基”来实施，使用或不使用额外的细胞穿透序列。在一些实施方式中，具有上述第十实施方式中的氨基酸序列的肽的n端受乙酰基保护。在一些其他实施方式中，具有上述第十实施方式中提供的氨基酸序列的肽的c端受胺基保护。在某些实施方式中，具有上述第十实施方式中提供的氨基酸序列的肽通过肽的末端羧基与“c端保护基”反应形成酯或酰氨基而受到保护。在其他实施方式中，具有上述第十实施方式中提供的氨基酸序列的肽的n端受酰基保护且c端受胺保护。
在另一实施方式中，本发明提供了还包含细胞穿透肽的本发明的分离的肽。本文所用的“细胞穿透肽”或“cpp”或“肽载体”是指能够穿透或跨过活细胞的细胞膜的任何短肽。这些短肽能够自身或与其他肽连接时穿透细胞膜。在本文中，cpp是一种分子，其核心是肽。然而，其他化学基团可以共价结合至所述肽核心，以改善分子的整体稳定性和/或为其提供额外的性质，例如靶向能力。例如，本发明的细胞穿透肽可以包括与细胞穿透肽的c端末端共价连接的本发明中描述的任何一种分离的肽。在一些实施方式中，本发明的分离的肽与细胞穿透肽的n端末端共价连接。在一些实施方式中，具有上述第十实施方式中提供的氨基酸序列的肽与细胞穿透肽的c端或n端末端共价连接。在特定实施方式中，具有第十实施方式中提供的氨基酸序列的任何一种肽与包含rqikiwfqnrrmkwkk(seqidno:2)所示的氨基酸序列的细胞穿透肽的c端末端共价连接。作为模拟seqidno:2的肽功能的功能等价物或同源物的其他肽也可以通过与本发明的任一种分离的肽共价连接而用作细胞穿透肽。本文所用的术语“共价连接”是指通过任何原子间吸引力而产生的任何相互作用，其足够强以允许组合的聚集体作为单元起作用。这包括但不限于：化学键，例如共价键(例如极性或非极性)，和非共价键，例如离子键、金属键和/或桥键。将细胞穿透肽与其他分离的肽共价连接的方法、细胞穿透肽和分离的肽之间的共价连接类型惯常地用于本发明的领域中，并且也是本领域技术人员公知的(drugdiscoverytoday.vol17.15/16,850-860,8月，2102)。
本发明提供了分离的肽，其与rbbp4蛋白结合以使得所述分离的肽与wtsall4肽竞争与rbbp4蛋白中同一位点的结合。因此，在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其结合亲和力高于由氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)表示的wtsall4肽的结合亲和力。在一个特定实施方式中，本发明提供了分离的肽，其结合亲和力是由氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)表示的wtsall4肽的结合亲和力的至少2倍。在另一实施方式中，本发明的分离的肽的结合亲和力是seqidno:13的wtsall4肽的结合亲和力的至少3倍。本文所用的术语“结合亲和力”是指任何两种肽之间的相互作用的强度和/或特异性的量度。通常，结合亲和力由解离常数(kd)表示。例如，两种肽之间的高亲和力相互作用通常具有低kd值，通常在亚微摩尔至皮摩尔范围内。作为另一选择，结合亲和力也经常报告为ic50值。本发明中使用的“ic50值”是指半数最大抑制浓度，在该浓度下测试肽与rbbp4蛋白的结合导致对表达sall4的细胞的生长抑制。“结合亲和力”可以用本领域技术人员已知的任何方法测量，包括但不限于荧光偏振(fp)测定、等温量热(itc)测定和表面等离子共振(spr或biacore)。术语“结合亲和力”、“解离常数”和“ic50值”在本文中均以本领域技术人员已知的相同含义使用。本发明中描述的分离的肽的结合亲和力数据显示在下表1中。
表1：
在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其ic50值至少低于由氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)表示的wtsall4肽的ic50值。在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其ic50值至少低于约1.0μm。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其ic50值至少低于约0.5μm。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其ic50值至少低于约0.25μm。在又一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其ic50值至少低于约0.1μm。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其ic50值至少低于约0.05μm。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其kd值至少低于由氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)表示的wtsall4肽的kd值。在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其kd值至少低于约1.0μm。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其kd值至少低于约0.5μm。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其kd值至少低于约0.25μm。在又一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其kd值至少低于约0.1μm。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其kd值至少低于约0.05μm。在本申请中使用的术语“约”是指该术语所修饰或指示的值的±10％的值。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述结合抑制了rbbp4的活性。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述结合抑制了seqidno:13的wtsall4肽与rbbp4蛋白之间的相互作用。在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述结合抑制了sall4的表达。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述结合抑制了sall4的功能活性。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述结合抑制了sall4的下游信号传导。在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述结合促进磷酸酶和张力蛋白同源物(pten)的表达。在另一实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述结合促进了磷酸酶和张力蛋白同源物(pten)的功能活性。本文所用的“抑制”是指阻断或预防。本文所用的“促进”是指增加或增强。
在一个实施方式中，本发明提供了分离的肽，其以比氨基酸序列msrrkqakpqhi(seqidno:13)所表示的wtsall4肽更高的结合亲和力与组蛋白结合蛋白rbbp4的同一结合位点结合，其中所述分离的肽的长度为10或11个氨基酸。
本文所用的“sall4”是指在发育阶段必需的锌指转录因子，因为它是强效的干细胞因子。sall4与oct4、nanog和sox2形成核心转录网络，并控制鼠胚胎干细胞(esc)的自我更新性质。本文所用的“rbbp4”是指视网膜母细胞瘤结合蛋白4，其是作为更大的mi-2/nurd复合体的一部分的组蛋白结合蛋白。该复合体参与与组蛋白脱乙酰化相关的染色质重塑和转录抑制。
本发明的分离的肽可用于多种应用，例如，作为用于治疗肝细胞癌的药物制剂(参见例如本申请的实施例和图4-7)。或者，本发明的分离的肽可用于治疗和诊断多种其他治疗应用，包括但不限于自身免疫疾病、炎性疾病、实体瘤、血液肿瘤等。
因此，本发明还涵盖包含至少一种本发明所述的分离的肽的药物组合物。在一些实施方式中，本发明提供包含至少一种本发明所述的分离的肽的药物组合物，所述肽与细胞穿透肽的c端或n端末端共价连接。在特定实施方式中，本发明提供包含至少一种本发明所述的分离的肽的药物组合物，所述肽与包含rqikiwfqnrrmkwkk(seqidno:2)所示的氨基酸序列的细胞穿透肽的c端或n端末端共价连接。在特定实施方式中，所述药物组合物包含具有氨基酸序列rrkfakfqwi(seqidno:14)的分离的肽。
在某些实施方式中，用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂将本文所述的本发明的药物组合物配制成用于治疗(例如，药物)用途。通常，药学上可接受的载体或赋形剂可以以对组合物中的疏水性化合物的稳定性和释放速率特征没有实质性影响的量存在。合适的赋形剂/载体是本领域熟知的，包括在gennaro等，remington'spharmaceuticalsciences(第18版，mackpublishingcompany，1990，特别参见第8部分：pharmaceuticalpreparationsandtheirmanufacture)中描述的那些，通过援引将其全部内容并入本文。
本发明的药物组合物可以是固体形式或液体形式。通常，它们是单位剂型，例如片剂、粉末、小袋、珠、弹丸剂、渗透剂型等，但它们也可以是液体、乳膏或气溶胶形式，以用于各种应用(用于例如局部、肠胃外、口服、颊部、眼部、鼻部、皮肤、直肠和肺部途径)。
本发明的药物组合物可以配制成用于不同的施用模式，包括但不限于肠胃外、口服、颊部、眼部、鼻部、皮肤、直肠和肺部途径。在一个实施方式中，组合物是口服递送形式，例如片剂、胶囊或渗透剂型。在另一实施方式中，组合物为适于注射施用的形式。在另一实施方式中，组合物为静脉内施用。在一个实施方式中，组合物是局部递送形式，例如凝胶、粉末或软膏形式。在另一实施方式中，组合物是适于植入施用的形式。
抑制和治疗方法
sall4具有多种功能。它能够激活基因或抑制基因。已知sall4在多数成体组织中下调或不存在，但在包括癌症在内的许多疾病状态中被重新激活。之前报道了sall4与nurd复合体的相互作用在促进表达sall4的细胞中的肿瘤发生中起重要作用。sall4诱导的肿瘤发生背后的机制之一是通过其与nurd复合体的相互作用来抑制肿瘤抑制基因pten。因此，本发明公开了使用本文所述的特异性的分离的肽来破坏sall-nurd，特别是破坏sall4-rbbp4蛋白的相互作用。
因此，在多个实施方式中，本发明提供了在表达sall4的细胞中抑制sal样蛋白4(sall4)与组蛋白结合蛋白rbbp4结合的方法。所述方法包括使细胞与至少一种本申请文本中描述的分离的肽接触。至少一种所述分离的肽与rbbp4的结合破坏了sall4-rbbp4相互作用，从而抑制了sall4。在本文所述的方法中，抑制sall4可包括抑制sall4的活性、sall4的表达或其组合。即，本发明的任何一种分离的肽都能够部分或完全下调(降低)sall4的表达和/或活性。在特定实施方式中，所述方法包括使表达高水平的sall4的细胞与至少一种本文所述的分离的肽接触。在另一实施方式中，所述方法包括使表达低水平的sall4的细胞与至少一种本文所述的分离的肽接触。在又一实施方式中，所述方法包括使不表达sall4的细胞与至少一种本文所述的分离的肽接触。在上述任一实施方式中，“至少一种分离的肽”是指具有氨基酸序列rrkfakfqwi(seqidno:14)的分离的肽。
如本文所用的术语“细胞”是指任何活细胞。此类活细胞可以包括但不限于哺乳动物细胞、细菌细胞或植物细胞。此外，活细胞可以源自“受试者”，或活细胞可以源自细胞系。细胞系可以包括但不限于hek-293t细胞、ht1080细胞、hela细胞、daudi细胞、k562细胞或cos细胞。
如本领域技术人员所理解的，高水平的sall4是指与正常(例如，健康)细胞(例如非肿瘤细胞)或正常个体(没有肿瘤的个体)中所见的低水平sall4相比增加的量的sall4，其通常出现在患有某种肿瘤的患者中。例如，高水平的sall4是指与没有肝肿瘤(例如，来自个体肝脏的组织和/或细胞，其中所述个体不具有肝肿瘤，例如健康个体)的个体中存在的sall4水平相比，具有肝肿瘤(例如，来自个体肝肿瘤的组织和/或细胞)的个体中存在的升高水平的sall4。
在一个实施方式中，本发明提供了一种在表达sall4的细胞中抑制sall4与组蛋白结合蛋白rbbp4结合的方法，其中所述细胞是恶性的。本文所用的术语“恶性”是指表现出失控的过度生长或增殖的任何表达sall4的细胞或组织。在另一实施方式中，本发明提供了一种在表达sall4的恶性细胞中抑制sall4与组蛋白结合蛋白rbbp4结合的方法，其中对sall4与rbbp4结合的抑制作用减少了恶性细胞的增殖。在另一实施方式中，本发明提供了一种在表达sall4的恶性细胞中抑制sall4与组蛋白结合蛋白rbbp4结合的方法，其中对sall4与rbbp4结合的抑制作用抑制了恶性细胞的增殖。
本发明还提供了一种治疗患有由sall4失调介导的病症的受试者的方法。本文所用的术语“失调”是指改变sall4的上游或下游靶标的表达和/或功能。例如，下游靶标包括但不限于rbbp4、pten等。其他靶标的实例包括但不限于磷光体akt、ccnd2、oct4、znhit6、wkn1、snhg12等。所述方法包括向受试者(例如有需要的受试者)施用治疗有效量的本文所述的药物组合物。“药物组合物”包含作为活性成分的本文所述的(一种或多种)分离的肽和构成载体的惰性成分，例如生理学或药学上可接受的赋形剂。除了上文说明的肽之外，还可以使用其功能上等价的同源物或类似物，包括因引入结构约束物或其他化学约束物而模拟sall4中相应区段的三维结构的那些同源物或类似物。在特定实施方式中，用于治疗患有由sall4失调介导的病症的受试者的本文所述的方法的药物组合物包含具有氨基酸序列rrkfakfqwi(seqidno:14)的分离的肽。
本文所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的那些方式、手段、技术和程序，或者由这些从业者容易地从已知的方式、方法、技术和程序开发出的那些方式、手段、技术和程序。
本文所用的术语“治疗”是指将医学病况(例如局部炎症)抵消至根据临床可接受的标准所述医学病况有所改善的程度(例如，减少或消除局部炎症)。本文所用的术语“病症”是指活的动物或植物体或其一部分的正常状态受到的任何损害，其破坏或改变生活功能的发挥，通常体现为区别性的体征和症状。例如，病症可包括但不限于癌症疾病、心血管疾病、神经变性疾病、免疫疾病、自身免疫病、遗传疾病、传染病、骨病和环境疾病。
本文所用的“受试者”是指脊椎动物或哺乳动物(例如人、非人灵长类、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠和小鼠)。在特定实施方式中，受试者是人。在另一实施方式中，受试者是兽医动物。兽医动物的实例包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、豚鼠等。“有需要的受试者”是指具有或有风险发展能够通过所要施用的至少一种分离的肽而治疗(例如改善、转佳、预防)的疾病或病况的受试者(例如患者)。
用于治疗患有由sall4失调介导的病症的受试者的本文所述的方法的药物组合物可以作为预防性或治疗性组合物(例如，用来预防或治疗疾病或病况)或者作为诊断性组合物(例如，营养或化妆品组合物)施用给受试者。可以使用任何合适的施用途径，例如口服、饮食、局部、透皮、直肠、肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、皮下注射、皮内注射)、吸入(例如支气管内、鼻内或口腔吸入、鼻内滴剂)、眼部、肺和鼻部等。根据适应症，施用可以是局部的或全身的。优选的施用模式可根据所选的特定药剂而变化。合适的剂型包括片剂、锭剂、分散剂、悬浮液、溶液、胶囊、乳膏、软膏、气溶胶等。药物组合物可以单剂量(例如，一天内)或多剂量施用。此外，化合物可以在一天或多天(例如，连续几天或不连续的几天)内施用。
在治疗患有由sall4失调介导的病症的受试者的本文所述的方法的某些实施方式中，将治疗有效量的包含至少一种本发明所述的分离的肽的药物组合物施用给有需要的受试者。本文所用的“治疗有效量”或“有效量”是指会在组织、系统、受试者或人中引发所需生物学或医学响应的活性化合物(例如，至少一种本发明所述的分离的肽)的量，所述响应包括所治疗的病况(例如肿瘤)的全部或部分症状的减轻。在某些实施方式中，当施用给受试者时，本发明所述的药物组合物足以在施用条件下在受试者中达到所需的治疗效果，所述施用条件为例如足以抑制(例如，预防、减少、消除)受试者中sall4的上游或下游靶标(例如pten)的量。
在某些实施方式中，本发明还公开了一种通过向有需要的受试者施用包含本发明所述的分离的肽的药物组合物来治疗患有癌症的受试者的方法。在某些实施方式中，将本文的方法中描述的药物组合物施用给患有表达sall4的癌的受试者。在某些其他实施方式中，将本文的方法中描述的药物组合物施用给具有表达sall4的实体瘤的受试者。在其他实施方式中，将本文的方法中描述的药物组合物施用给具有表达sall4的实体瘤亚型的受试者，包括一些临床上具有挑战性的癌。在一些实施方式中，所述实体瘤表达高水平的sall4。在一个实施方式中，所述实体瘤具有降低的pten表达。在一些实施方式中，施用包含本发明所述的分离的肽的药物组合物抑制了sall4的活性或表达。在其他实施方式中，施用包含本发明所述的分离的肽的药物组合物抑制了sall4的活性和表达。在所述方法的特定实施方式中，用于治疗患有癌症的受试者的方法的药物组合物中的分离的肽是rrkfakfqwi(seqidno:14)。
本领域技术人员会理解，能够用本文所述的方法治疗的实体瘤包括乳腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤(例如肝细胞癌)、胃肿瘤、脑肿瘤、生殖细胞肿瘤等。在一方面，实体瘤是肝肿瘤。在另一方面，实体瘤是肺肿瘤(例如nsclc)。在特定方面，肺肿瘤包含呈表皮生长因子受体(egfr)突变阳性、egfr突变阴性或其组合的细胞。在另一方面，实体瘤是脑肿瘤。在特定方面，脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤脑肿瘤。在又一方面，实体瘤不是干细胞或祖细胞来源的肿瘤。
在一方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的表达sall4和nurd的(一种或多种)实体瘤的方法，所述方法包括向个体施用有效量的(一种或多种)抑制sall4与rbbp4结合的组合物。在另一方面，本发明涉及一种治疗有需要的个体中的表达sall4的肝肿瘤的方法，所述方法包括向个体施用有效量的抑制sall4的组合物。在又一方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的表达高水平的sall4和低水平的pten的(一种或多种)实体瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的(一种或多种)抑制sall4与rbbp4的结合并促进pten的表达的组合物。在另一方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者中的表达高水平的sall4和低水平的pten的(一种或多种)实体瘤的方法，所述方法包括向个体施用有效量的(一种或多种)抑制sall4与rbbp4的结合并促进pten的活性的组合物。
在某些实施方式中，向患有癌症的受试者施用本文的方法中描述的药物组合物，其中所述癌症是血液学癌症。血液学癌症的实例包括但不限于白血病(例如急性髓性白血病(aml))、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤(nhl))和多发性骨髓瘤。在该方法的特定实施方式中，血液学癌症具有表达sall4的癌细胞。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”和它们的同根词表示“包括但不限于”。术语“由……组成”表示“包括且限于”。本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式的指代物，除非上下文明确表明不是如此。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
应当理解，为了清楚起见而在单独的不同实施方式背景下描述的本发明的某些特征也可以以组合形式提供在单一实施方式中。相反，为了简洁起见而在单一实施方式的背景下描述的多个本发明的特征也可以单独地、或以任何适合的子组合的方式、或适当地提供在本发明的任何其他描述的实施方式中。在多种实施方式的背景下描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必需特征，除非该实施方式在缺乏这些要素时没有效果。
实施例
sall4与nurd的rbbp4结合
先前报道了sall4wt与nurd复合体结合并阻断了sall4-nurd相互作用。假设组蛋白结合蛋白rbbp4是nurd中的与sall4结合的亚基。为了确认sall4与rbbp4的直接结合，使用12个氨基酸的wtsall4t进行了结合测定(图1)。使用等温滴定量热法，证明了sall4与nurd复合体的rbbp4亚基之间存在直接相互作用。该12-aasall4肽与rbbp4结合的kd为1.04±0.06μm(图1a)。使用表面等离子共振进一步确认了结合动力学，其中sall4肽与rbbp4之间的结合kd经计算为1.5μm(kon＝16830±460m-1s-1；koff＝0.026±0.00045s-1)(图1b)。这些结果证明了sall4通过nurd的亚基rbbp4与nurd复合体直接结合。
rbbp4-sall4复合体的晶体结构
确定了rbbp4-sall4复合体的晶体结构，以鉴定这两种蛋白之间的关键相互作用。rbbp4-sall4复合体的晶体结构以
表2
计算分析鉴定出rrk残基对于rbbp4-sall4相互作用是必需的
对rbbp4-sall4复合体的结构分析表明sall4的arg3、arg4和lys5对于结合而言是必需的。使用计算丙氨酸扫描，对利用晶体接触点鉴定出的关键残基进行了计算机分析。arg3、arg4和lys5的丙氨酸替换极大地影响了结合自由能(分别为19、16和14kcal/mol)(图3a)。使用荧光偏振测定法，用一系列突变肽对影响结合自由能的那些残基进行生物化学丙氨酸扫描(图3b、3c和图8)。与wtsall4肽(ic50＝1.0μm)相比，携带r3a、r4a或k5a突变的肽显示出显著变差的ic50值(分别为3.8μm、8.9μm和7μm，图3b)，而q6a突变具有最小的影响(ic50＝1.3μm)。两个关键残基的双突变——r3a-r4a、r4a-k5a和r3a-k5a——消除了相互作用，其ic50值高于100μm，而仅缺失一个关键残基的双突变体显示出减少但仍为阳性的结合(ic50分别为4.4μm、4.1μm和4.7μm，图3b和图8)。这些发现证实了arg3、arg4和lys5是参与sall4-rbbp4相互作用的必需残基。
用序列为msaraqakpqhi(标记为mut，seqidno:39)的肽进行细胞活力测定。该肽具有突变为丙氨酸的两个必需残基的双突变r3a-k5a。针对表达高水平的sall4的snu398hcc细胞，将该肽对细胞活力的影响与wtsall4肽进行比较。wt肽对细胞数发挥出抑制作用，但mut肽却没有(图3d)。进一步的q-pcr分析显示，与未处理的细胞相比，用wtsall4肽处理的细胞中的pten表达增加至3倍(p<0.0001)，而用mut处理的细胞再次没有显示出显著变化(p值不显著)(图3e)。这些发现表明mut肽不阻断rbbp4-sall4相互作用，因此不能从pten启动子上释放出抑制复合体，这与其wt对应物不同。
治疗性肽候选物的优化
基于rbbp4-sall4复合体的结构数据，进行基于肽底物的测定以选择和优化rbbp4-sall4相互作用的肽抑制剂。通过对wt肽的截短分析，确定了生物活性所需的肽的最小长度(表1；肽27)。去除前两个n端残基met和ser(肽5和6；表1)后，与wt相比增加了肽对rbbp4的结合亲和力(ic50分别为0.60μm和0.36μm对1.30μm)；而c端截短导致了结合亲和力的微小损失(肽2、3和4的ic50分别为1.40μm、0.80μm和1.96μm)。为了进一步提高结合效力，选择肽6作为序列模板，并用丙氨酸替换对其进行系统性单残基突变分析。用ala替换肽6的非必需残基后(表1；分别为肽11至16)，产生了效力更高的肽。这表明它们可以替换成其他氨基酸残基以进行序列优化。结果显示，替换肽6的gln4、pro7和his9后ic50降低。gln4位于由rbbp4的pro43、his71和glu395形成的小结合口袋中，该结合口袋能够容纳具有疏水性侧链的氨基酸残基。因此，用leu或phe替换gln4后(肽23和24)，导致结合亲和力提高，特别是phe，其诱导的结合亲和力增强至肽6的7倍(ic50为0.05μmvs.0.36μm；表1)。另外，将pro7替换为phe后(肽34)进一步增加了肽的效力(ic50为0.17μmvs.0.36μm；表s3)。最后，将his9替换为trp后使结合亲和力提高至肽6的3倍(ic50为0.12μmvs.0.36μm；表1)。
将这三个替换(gln4phe、pro7phe和his9trp)合并到肽46(rrkfakfqwi，将其命名为ffw，(seqidno:14))中。ffw至rbbp4的计算机建模预测出结合亲和力的提高(图4a)。荧光偏振测定证实了ffw的高效力，其亲和力超过原始12残基wt肽的亲和力的56倍(ic50为0.023μmvs.1.30μm；表1，图4b)。
治疗性肽ffw在培养物中和在体内抑制了sall4+肿瘤细胞生长
在细胞水平和小鼠中比较了ffw、wt和mut肽的功效。将穿膜肽序列(pen)连接到每个肽的n端以促进体外细胞穿透。如图5a和5b所示，pen-ffw使snu398细胞活力提高至pen-wt的4倍(ec50为7.6μmvs.30μm)，而pen-mut对细胞活力没有显著影响(ec50>100μm)。在snu387细胞(其是具有不可检测水平的sall4的hcc系)和snu398中评价了pen-ffw在表达sall4的hcc细胞中的治疗窗。mut和wtsall4肽也包括在该测定中用于比较(图6a和b)。结果证明，pen-ffw在靶向高sall4的hcc细胞(snu398)中具有特异性，突出了对治疗而言有价值的治疗窗。
在体内研究了pen-ffw的治疗效果。将snu398细胞皮下植入nod/scid/γ小鼠(nsg)的肋腹，并将小鼠随机分组以进行肽处理(n＝5)(图7a)。对于用pen(对照)或pen-mut处理的小鼠，肿瘤尺寸逐渐增大，表明这两种肽都不能抑制肿瘤生长(图7b)。相反，pen-wt显著破坏了肿瘤生长(p＝0.001)，而pen-ffw诱导了更强的治疗效果(p＝0.0008)，其肿瘤生长抑制率为85％。经pen-ffw处理的小鼠也显示出最小的肿瘤(图7c)，肿瘤重量显著更低(μ＝88mg，对比wt中的564mg，p＝0.02；图7d)。最后，测量所采集的肿瘤中的ptenmrna水平。与pen对照小鼠相比，发现来自用pen-ffw处理的小鼠的肿瘤中的pten表达增加至9倍。
针对使用索拉非尼的当前疗法进行了基准测试，由此在体内研究了pen-ffw的临床意义。将用pen-ffw处理的snu398肿瘤异种移植物与用索拉非尼处理的异种移植物进行比较(图9a)。如图9a所示，与载剂处理组相比，pen-ffw处理导致了比索拉非尼更强的抗肿瘤活性。此外，用pen-ffw联合索拉非尼处理的小鼠显示出最慢的肿瘤生长速率。在不同的处理组之间没有观察到小鼠体重的显著变化，如图9c-9e所示。这些结果证明了pen-ffw的治疗效果。还在体内研究了pen-ffw在索拉非尼治疗难治的hcc患者中的潜在治疗效果，对于该异种移植研究，使用了hcc细胞系plc8024，其为sall4阳性、cd133+且兼具化学抗性和放射抗性(li等，2016；ma等，2008)。如图9b所示，与对照组相比，在索拉非尼处理组中观察到更大的肿瘤生长(+1.5倍)。pen-ffw治疗也显示出了微小的肿瘤抑制效果。然而，在用两种药剂处理的小鼠中，观察到索拉非尼和pen-ffw的协同效应(图9b)(与对照组和索拉非尼处理组相比，肿瘤生长抑制率分别为57％和73％)。这些结果证明了单独使用或与索拉非尼联合使用的pen-ffw在索拉非尼抗性hcc患者中的潜在用途。
pen-ffw的类药性质：具有长期稳定性且无毒性
通过在0、5、10、15和30分钟的温育后用lc-ms/ms监测pen-ffw的降解来研究pen-ffw在人血浆中的体外药代动力学(图10a)。发现pen-ffw对血浆蛋白酶稳定，30分钟后仍有超过90％的肽保留在血浆中。相比之下，作为对照的尤卡托品在30分钟内迅速降解至40％(图10b)。将实验持续时间延长24小时，显示出在4小时后超过50％的肽在血浆中保持完整，在第24小时下降至约20％(图10a)。结果表明，pen-ffw是稳定的并且对血浆蛋白酶的降解作用具有抗性，能够潜在地被开发为静脉内药物。将fitc标签缀合至pen-ffw的n端，并用其处理snu398细胞。在第一个小时以2分钟的间隔对这些细胞进行活细胞成像，并且在随后的23小时以5分钟的间隔进行活细胞成像，以评估fitc-pen-ffw的渗透性和稳定性。如图10c所示，fitc-pen-ffw在t＝18min时开始穿透细胞，并在t＝22min时完成细胞核定位。在2.5小时时所有细胞都被fitc-pen-ffw穿透，直至24小时其表现都逐渐增(图10c，分别见中图和下图)。
在c57bl/6小鼠(n＝4)中体内研究了pen-ffw的毒性。在17天的进程中，每隔一天向小鼠腹膜内(ip)施用pen-ffw(30mg/kg)或载剂(10％dmso)，至累积剂量为270mg/kg。两组中的小鼠均保持警觉和应答性，并且没有表现出明显的毒性迹象，例如体重减轻、嗜睡或丧失活动力(图11a)。在7天的洗脱期后，进行了全血细胞计数和肝功能测定试验，采集器官用于组织学表征。通过测试血清ast(天冬氨酸氨基转移酶)和alt(丙氨酸氨基转移酶)的水平来研究肽处理所引起的潜在肝损伤。在处理组中未观察到这两种酶的升高(图11b)，表明处理后肝功能完整。同时，在处理组中未观察到血细胞计数的显著变化(图11c)。显微镜检下未观察到组织损伤(图11d)。
差异表达基因(deg)的转录组分析
转录组分析显示超过99％的pen-ffwdeg被上调。使用来自tcga肝细胞癌全转录组测序数据的hccrna-seq数据(n＝377)对这些上调的deg进行存活率分析，以了解这些上调的deg在患者中的预后价值。所获得的数据显示，由这些pen-ffwdeg中的9种基因组成的亚组预测了患者的结果。用该9基因亚组中的每一种对hcc患者进行kaplan-meier分析，结果表明每种转录本都可以预测患者的总体存活率，具有显著的负风险比，暗示良好的预后与这些基因的更高表达相关(图12a和表3)。
表3.单个基因在预测tcgahcc患者群(n＝377)的存活率中的预后价值
观察到pen-ffw肽处理同时上调了这些deg。用双基因组合进行了kaplan-meier分析以分析其余pen-ffwdeg的组合风险评分，因为pen-ffw肽处理同时上调了这些deg。测试了在单独使用时无法预测存活率的那些pen-ffwdeg的50种组合(表2)。所获得的数据证明，在单独使用时不能预测存活率的这些pen-ffwdeg现在在与其他上调的pen-ffwdeg组合时可以以显著的负风险比预测患者的总体存活率(图12b和表4)。所获得的数据表明pen-ffwdeg可用作预测hcc患者的正面和有利结果的预后标志物。
表4.单独和组合的基因在预测tcgahcc患者群的存活率中的预后价值
材料和方法
等温量热测定(tic)
使用来自microcalinc.的auto-itc200仪器在25℃进行itc。将ph7.4的50mmtris和100mmnacl中的20mmrbbp4加载到itc室中。将200mm的sall4肽自动加载到注射器中。通过注射18次2.4μl来在1000rpm搅拌下进行滴定，进行30分钟。使用来自microcal的origin软件分析itc数据。
表面等离子共振(spr)
使用biacoret200生物传感器(gehealthsciences)进行spr研究。通过胺偶联法将约12,000个共振单位(ru)的rbbp4固定在seriesscm5芯片(biacore,gehealthcare)的羧甲基化葡聚糖基质上。通过注射7次sall4肽(0.5μm-8μm)，在25℃进行多循环动力学分析。将结合时间和流速分别设定为60s和30μl/min。所获得的传感图具有良好的品质，并且通过曲线拟合确定了动力学速率常数。使用了50mmhepes(ph7.5)、150mmnacl、0.1％p20、3％dmso的运行缓冲液，并使用biacoret200评估软件(版本2.0，gehealthsciences)确定kd。
荧光偏振(fp)
将肽滴定到0.045μmrbbp4和0.1μmc端fitc标记的wt肽(由thermoscientific合成)的主混合物中。将反应物在室温温育，然后用envision仪器(perkinelmer)读板。使用prism(graphpad)确定肽的ic50值。
结晶和结构确定
使用hamptonresearch筛选系统，用悬滴蒸气扩散法进行结晶筛选。rbbp4蛋白购自sinobiological并在50mmtris100mmnacl中浓缩至8mg/ml。将浓缩的rbbp4蛋白与20mmsall4肽混合，并以1:1的比例设置结晶液滴。从含有0.2m氯化钠、0.1mbis-trisph5.5、25％peg3,350的储集溶液(indexscreen70)中获得衍射品质的rbbp4-sall4复合体晶体。晶体在4℃生长至多3周，并通过补充25％(w/v)甘油进行低温保护。rbbp4-sall4复合体晶体衍射分辨率最高为
计算丙氨酸扫描
对sall4肽的所有12个残基进行计算丙氨酸扫描(cas)。使用分子力学/广义伯恩表面积(mm/gbsa)来计算丙氨酸突变体的结合自由能(δg突变体，ala7突变为甘氨酸)与野生型的结合自由能(δg野生型)之差(δδg结合)，并且针对从rbbp4-sall4复合体最后20ns的md模拟中提取的200个等间距轨迹结构取平均值。基于下式计算结合自由能：δδg结合＝δg突变体-δg野生型。
用于mm/gbsa计算的所有程序都是amber11软件套装的一部分。用sander模块计算分子力学能。使用onufriev等描述的改进的gb模型(27)，通过pbsa程序计算对溶剂化自由能的极性贡献；使用成对重叠线性组合法(将γ设定为
细胞培养和用肽进行处理
在补充有10％胎牛血清(fbs)的rpmi中，在5％co2的潮湿气氛中在37℃使snu398生长。在96孔板的每个孔中，用100μl培养基接种3000个细胞。在肽处理之前，用pbs洗涤细胞两次，并用optimem(lifetech)中的不同浓度的肽处理细胞。在37℃温育4小时后加入培养基，并再培养细胞68小时。在与肽温育72小时后加入四唑(celltiter96aqueousonesolutioncellproliferationassay，promega)，在37℃在黑暗中温育1小时，之后在平板读数仪上在490nm读板。
异种移植物研究
根据《实验室动物的护理和使用责任》来处理所有小鼠。在snu398体内研究中，将在2:1pbs/matrigel(bdbiosciences)中的7.2×105个细胞皮下接种至6-8周龄雌性c.b-17严重联合免疫缺陷(scid)小鼠(nsg)的肋腹中。然后使肿瘤发展至50-70mm3的尺寸，然后以2至3天的间隔腹膜内注射不同的肽，共注射5次。将小鼠随机分组(n＝6)，并用pen(穿膜肽对照)、pen-mut(突变体对照)、pen-wt(野生型对照)和pen-ffw(肽47)进行处理。每5天测量肿瘤体积，并在终点测量肿瘤重量。对于pen对照，给予22.5mg/kg；对于pen-mut、pen-wt和pen-ffw，根据其体重分别给予小鼠35.6mg/kg、37mg/kg和36mg/kg。使用vernier卡尺每周两次进行肿瘤测量。使用下式估算肿瘤体积：v＝0.5×宽度×宽度×长度。当肿瘤接近约50mm3时，将小鼠随机分组，每组5只，并通过腹膜内注射每周三次进行肽处理。所有统计学分析均使用单因素anova和学生t检验进行。
毒理学研究
对6-8周龄雌性c57bl小鼠每隔一天给予pen-ffw(30mg/kg)(n＝3)或dmso对照(n＝2)，共进行17天，至累积剂量为270mg/kg。在整个期间观察并称重小鼠。在7天的洗出期之后，处死小鼠并采集它们的血液和器官。立即用celltacαmek6450(nihonkohden，japan)进行血细胞计数，并在同一天对血清进行alt和ast测定。alt和ast根据制造商的方案(sigma-aldrich，merck，德国)进行。器官用中性缓冲的福尔马林固定，并包埋在石蜡中。然后由合格的病理学家检查组织切片。
pen-ffw的血浆稳定性
通过cyprotex(chesire，英国)进行血浆稳定性测定。将pen-ffw与人血浆(ph7.4)在37℃温育24小时(5个时间点)。温育以1μm的浓度进行(最终dmso浓度为2.5％)。通过加入2体积的含1％甲酸的甲醇，在0、5、10、15、30分钟或0、1、2、4和24小时终止反应。将样品离心(2500rpm，45分钟，4℃)，上清液用2体积的0.2％甲酸(aq)(含有美托洛尔(内标))稀释。然后通过lc-ms/ms分析它们的pen-ffw。根据lc-ms/ms峰面积比(化合物峰面积/内标峰面积)，计算每个时间点所保留的母体肽相对于0min样品的百分比。
活细胞成像
将snu398与hoechst33342一起温育5分钟，洗涤并与含7.5μmfitc-pen-ffw的培养基一起温育。使用zeissaxioobserver活细胞成像仪获得延时照片，前1小时间隔为2分钟，之后23小时间隔为5分钟，使用20倍物镜。用zen显微镜和zeiss的成像软件分析图像。
rna-seq数据分析
将snu398用pen、pen-mut、pen-wt和pen-ffw处理8小时，对经处理的样品进行双末端rna-seq。使用star比对软件将每个样品的rna-seq读出序列匹配至hg19。基于匹配的读出序列数量的比例进行样本间的归一化。使用跨所有外显子的两个样品之间的读出序列线性回归获得转录本的表达倍数变化。使用倍数变化阈值＝2来选择两个样本之间的差异表达。基于平均连锁来执行分层聚类，以产生聚类树以及热图。为了鉴定富集的基因集或途径，基于归一化的数据并使用gsea工具(http://www.broad.mit.edu/gsea/)和msigdbv5.0来进行基因集富集分析(gsea)。
定量实时pcr
将从小鼠中切除的肿瘤在trizol中匀浆。提取总rna，并用无rna酶的dna酶(qiagen)处理。使用superscriptiii逆转录酶进行逆转录。使用gotaqqpcrmastermix(promega)进行定量pcr。用corbettrotorgene6000(qiagen)进行扩增。每个样品以一式三份进行测定。所使用的引物序列如下所示：
pten正向(f):actattcccagtcagaggcg(seqidno:47)
pten反向(r):gaacttgtcttcccgtcgtg(seqidno:48)
18sf:ttaagagggacggccggggg(seqidno:49)
18sr:catcgccggtcggcatcgtt(seqidno:50)
lrrc4f:ccagtgctttcctgccttc(seqidno:51)
lrrc4r:gctgcacacagaatccacac(seqidno:52)
fam229af:aggaacgtgctctgtgaggt(seqidno:53)
fam229ar:ggcctcaatggggaatct(seqidno:54)
plin4f:ccggatgtgctcagtgtagg(seqidno:55)
plin4r:ttcatggggtggaagatgtc(seqidno:56)
mll2f:gtgcagcagaagatggtgaa(seqidno:57)
mll2r:gcacaatgctgtcaggagaa(seqidno:58)
ankrd30blf:aacacctgacacggctgaaa(seqidno:59)
ankrd30blr:tccccctcttgaattttaaaggat(seqidno:60)
loc284801f:ggaggtgctttgcctctgaa(seqidno:1)
loc284801r:ggtaccagcacagttggact(seqidno:61)。
序列表
<110>新加坡国立大学
新加坡科技研究局
布里格海姆妇女医院公司
刘美慧
d·g·特恩
柴立
谢青山
a·波尔森
<120>治疗性sall4肽
<130>4459.1138001
<140>pct/us2017/030164
<141>2017-04-28
<150>62/329,010
<151>2016-04-28
<160>61
<170>fastseqforwindowsversion4.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>1
ggaggtgctttgcctctgaa20
<210>2
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>2
argglnilelysiletrppheglnasnargargmetlystrplyslys
151015
<210>3
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>3
argarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>4
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>4
<223>xaa=具有非极性芳族侧链的氨基酸
<400>4
argarglysxaaalalysproglnhisile
1510
<210>5
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>5
<223>xaa=在中性ph下带正电荷的极性侧链
<400>5
argarglysglnxaalysproglnhisile
1510
<210>6
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>6
<223>xaa=具有非极性侧链或者带正电荷的极性侧链的氨基酸
<400>6
argarglysglnalaxaaproglnhisile
1510
<210>7
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>7
<223>xaa=具有非极性侧链的氨基酸
<400>7
argarglysglnalalysxaaglnhisile
1510
<210>8
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>8
<223>xaa=具有非极性侧链、在中性ph下不带电的极性侧链或在中性ph下带负电荷的极性侧链的氨基酸
<400>8
argarglysglnalalysproxaahisile
1510
<210>9
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>9
<223>xaa=具有非极性侧链的氨基酸
<400>9
argarglysglnalalysproglnxaaile
1510
<210>10
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>10
<223>xaa=具有非极性侧链的氨基酸
<400>10
argarglysglnalalysproglnhisxaa
1510
<210>11
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>4
<223>xaa=具有非极性侧链的氨基酸
<220>
<221>变体
<222>7
<223>xaa=具有非极性侧链的氨基酸
<220>
<221>变体
<222>9
<223>xaa=具有非极性侧链的氨基酸
<400>11
argarglysxaaalalysxaaglnxaaile
1510
<210>12
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>1
<223>xaa=具有非极性侧链或者在中性ph下带正电荷的极性侧链的氨基酸
<400>12
xaaargarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>13
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>13
metserargarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>14
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>14
argarglysphealalyspheglntrpile
1510
<210>15
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>15
argarglysalaalalysproglnhisile
1510
<210>16
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>16
argarglysphealalysproglnhisile
1510
<210>17
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>17
argarglysglnlyslysproglnhisile
1510
<210>18
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>18
argarglysglnarglysproglnhisile
1510
<210>19
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>19
argarglysglnalaalaproglnhisile
1510
<210>20
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>20
argarglysglnalavalproglnhisile
1510
<210>21
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>21
argarglysglnalaleuproglnhisile
1510
<210>22
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>22
argarglysglnalapheproglnhisile
1510
<210>23
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>23
argarglysglnalaargproglnhisile
1510
<210>24
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>24
argarglysglnalalyspheglnhisile
1510
<210>25
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>25
argarglysglnalalysproalahisile
1510
<210>26
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>26
argarglysglnalalysprogluhisile
1510
<210>27
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>27
argarglysglnalalysproasnhisile
1510
<210>28
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>28
argarglysglnalalysprovalhisile
1510
<210>29
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>29
argarglysglnalalysproleuhisile
1510
<210>30
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>30
argarglysglnalalysproglnalaile
1510
<210>31
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>31
argarglysglnalalysproglnpheile
1510
<210>32
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>32
argarglysglnalalysproglntyrile
1510
<210>33
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>33
argarglysglnalalysproglntrpile
1510
<210>34
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>34
argarglysglnalalysproglnvalile
1510
<210>35
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>35
argarglysglnalalysproglnhisala
1510
<210>36
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>36
argarglysglnalalysproglnhisval
1510
<210>37
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>37
argarglysglnalalysproglnhisleu
1510
<210>38
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>38
argarglysglnalalysproglnhisphe
1510
<210>39
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>39
metseralaargalaglnalalysproglnhisile
1510
<210>40
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>40
argarglyshisalalysproglnhisile
1510
<210>41
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>1
<223>xaa=吡咯赖氨酸
<400>41
xaaargarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>42
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>42
hisargarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>43
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>43
argarglysglnprolysproglnhisile
1510
<210>44
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>44
hisargarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>45
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<220>
<221>变体
<222>1
<223>xaa=硒代半胱氨酸
<400>45
xaaargarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>46
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>46
glxargarglysglnalalysproglnhisile
1510
<210>47
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>47
actattcccagtcagaggcg20
<210>48
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>48
gaacttgtcttcccgtcgtg20
<210>49
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>49
ttaagagggacggccggggg20
<210>50
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>50
catcgccggtcggcatcgtt20
<210>51
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>51
ccagtgctttcctgccttc19
<210>52
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>52
gctgcacacagaatccacac20
<210>53
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>53
aggaacgtgctctgtgaggt20
<210>54
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>54
ggcctcaatggggaatct18
<210>55
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>55
ccggatgtgctcagtgtagg20
<210>56
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>56
ttcatggggtggaagatgtc20
<210>57
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>57
gtgcagcagaagatggtgaa20
<210>58
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>58
gcacaatgctgtcaggagaa20
<210>59
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>59
aacacctgacacggctgaaa20
<210>60
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>60
tccccctcttgaattttaaaggat24
<210>61
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡肽
<400>61
ggtaccagcacagttggact20
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