用于神经损伤的联合治疗的制作方法
本发明在本发明的一些实施例中涉及用于神经损伤的联合治疗。
中枢神经系统(cns)损伤，例如：脊髓损伤(sci)等损伤迄今尚未有成功的治疗。sci与感觉及运动的活动力的一立即丧失有关，并且在损伤水平以下的多个反射功能中具有永久性缺陷。此外，多个cns损伤的特征通常是完全无法再生及愈合。在sci后发生的多个立即事件包括：由于多个毛细血管的细胞凋亡及坏死性伤害所造成的缺血、活化多个小胶质细胞的一免疫应答及来自于邻近的多个血管组织的多个受损的细胞的浸润。所述损伤同时伴有多个神经胶质细胞的多个非特异性反应性变化，例如：多个星形胶质细胞及多个巨噬细胞响应于所述伤害，包括：分泌多个结缔组织基质物质，例如：蛋白多糖(pg)、胶原蛋白及多个髓鞘衍生的残基。所述多个物质导致一瘢痕组织的形成，造成抑制轴突发芽及限制神经元再生。实际上，多份科学报告描述了以多个抗神经胶质增生因子(例如：软骨素酶abc)来治疗，以诱导所述突触可塑性及多个再生参数的改善(例如：bradburyej等人，《自然》(nature)ll；416(6881)：636至40，2002；及barrittaw等人，《神经科学杂志》(jneurosci)18；26(42):10856至67，2006)。
水合凝胶(水凝胶)在多个生理温度及ph下是粘性的半固体实体，可用于组织工程及再生医学。例如：多个透明质酸基的水凝胶为多个细胞及多个组织提供一生长支持环境，例如：用于神经再生(suzuki等人，2003；itoh等人，2005)，同时引导趋养性抗氧化剂物质的迁移及再生。
国际专利申请公开号第wo2009/022339号公开了含有所述抗氧化剂钠歧化酶及一层粘连蛋白肽的一透明质酸基水凝胶应用于神经组织再生及修复的用途。
技术实现要素：
根据本发明一些实施例的一个方面，提供了一种组合物，所述组合物包括一透明质酸、一层粘连蛋白多肽、一抗氧化剂及一抗神经胶质增生剂的组合物。
根据本发明一些实施例的一个方面，提供了一种产生一水凝胶的方法，所述方法包括：
(i)将包含一透明质酸、一层粘连蛋白多肽及一抗氧化剂的一组合物悬浮于水中，以获得包含至少40％水的一悬浮液；及
(ii)向所述悬浮液中加入一抗神经胶质增生剂，
从而产生所述水凝胶。
根据本发明的一些实施例，所述抗氧化剂为超氧化物歧化酶(sod)。
根据本发明的一些实施例，所述sod包括：由seqidno：4所示的胺基酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述层粘连蛋白多肽由seqidno：1所示。
根据本发明的一些实施例，所述抗氧化剂为包含由seqidno：4所示的胺基酸序列的超氧化物歧化酶(sod)，以及所述层粘连蛋白多肽由seqidno：1所示。
根据本发明的一些实施例，所述抗神经胶质增生剂为选自于由抗nogoa及软骨素酶abc所组成的一群组中的一个。
根据本发明的一些实施例，所述层粘连蛋白多肽由seqidno：1所示，以及所述抗神经胶质增生剂包括抗nogoa。
根据本发明的一些实施例，所述层粘连蛋白多肽由seqidno：1所示，以及所述抗神经胶质增生剂包括软骨素酶abc。
根据本发明的一些实施例，所述透明质酸、所述抗氧化剂及所述层粘连蛋白多肽为交联连结的。
根据本发明的一些实施例，所述基质包括本发明的所述组合物。
根据本发明的一些实施例，所述水凝胶包括本发明的所述组合物。
根据本发明的一些实施例，所述透明质酸在所述水凝胶中的一浓度范围为约0.5至1.5％。
根据本发明的一些实施例，所述层粘连蛋白多肽在所述水凝胶中的一浓度范围为20至100微克/毫升。
根据本发明的一些实施例，所述抗氧化剂在所述水凝胶中的一浓度范围为约5至40微克/毫升。
根据本发明的一些实施例，所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂被提供的一总浓度为约0.01至0.6％。
根据本发明的一些实施例，所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂被提供的一总浓度为约0.4％。
根据本发明的一些实施例，所述抗神经胶质增生剂在所述水凝胶中的一浓度范围为约5至300微克/毫升。
根据本发明的一些实施例，提供了一种在一有需要的个体中诱导一神经元组织形成或再生的方法，所述方法包括将本发明的所述组合物、本发明的所述水凝胶植入到所述个体中，从而诱导所述个体中的所述神经元组织的形成或再生。
根据本发明的一些实施例，提供了一种治疗一有需要的个体的神经损伤的方法，所述方法包括将本发明的所述组合物、本发明的所述基质或本发明的所述水凝胶植入到所述个体的神经损伤处或附近，从而治疗所述个体的所述神经损伤。
根据本发明的一些实施例，提供了一种在一有需要的个体中预防或治疗神经损伤后的神经源性休克的方法，所述方法包括将本发明的所述组合物、本发明的所述基质或本发明的所述水凝胶植入到所述个体的神经损伤处或附近，从而预防或治疗所述个体的所述神经源性休克。
根据本发明的一些实施例，所述植入在所述神经损伤后48小时内进行。
根据本发明的一些实施例，所述神经损伤是在中枢神经系统(cns)中的一部分。
根据本发明的一些实施例，所述神经损伤包括脊髓损伤(sci)。
根据本发明的一些实施例，所述神经损伤包括多个创伤性脑损伤(tbi)或创伤性视神经病变(ton)。
除非另加说明，否则本说明书所使用的所有技术术语和/或科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。虽然本发明的实施方式可以通过类似或等同于本发明的实施方式所述的任何方法和材料实施或测试，本发明的实施方式、列举的方法和/或材料已在下面描述。在冲突的情况下，将以本专利说明书并且包括定义为准。此外，材料、方法及实施方式仅是举例性质，并且不必然用以限制。
附图说明
本发明的一些实施例在此仅通过举例的方式并参考多个附图來描述，通过详细说明附图具体的参考资料，应当强调所示的细节仅为举例，用以说明本发明实施例的目的。基于这点，结合所述附图及描述使得本领域技术人员能清楚的实施本发明的实施例。
在附图中：
图1显示了与多个未处理的细胞及单独以引导再生凝胶(grg)或以多个抗神经胶质增生剂处理的多个细胞相比，以多个抗神经胶质增生的引导再生凝胶(agrg)处理的多个神经元细胞培养的多个显微照片。放大倍数为20倍(x20)。所述多个细胞的形态评量示出了以agrg3(grg+抗nogoa)处理导致最高的多个神经元细胞的数量及密度；其次是agrg1(grg+软骨素酶abc)、agrg2(grg+丝裂霉素c)及agrg4(grg+软骨素酶abc+丝裂霉素c+抗nogoa)。以三种抗神经胶质增生剂(软骨素酶abc+丝裂霉素c+抗nogoa，表示为对照组)的处理导致多个神经元细胞的数量非常少。
图2a至2c显示了脊髓损伤(sci)后60天的贝托-贝蒂-布雷斯纳汉(basso-beattie-bresnahan，bbb)功能性评量多个大鼠的多个肢体的多个代表性照片。图2a展示了在一只未处理的对照组大鼠中没有运动(评分为0)，图2b展示了一只植入grg的大鼠的轻微移动(评分为2)，图2c展示了一只植入agrg3(grg+抗nogoa)的大鼠的先前瘫痪的肢体中的两个关节的主动性运动及第三关节的轻微运动(评分为6)。
图3显示了在脊髓损伤(sci)的大鼠模型中体感觉诱发电位(ssep)的多个代表性图表，展示出植入agrg3(grg+抗nogoa)导致恢复的电导率。图中显示的为：在所述sci前的ssep(基线)、sci后的那一刻(第0天)及第60天，所述多个黑色箭头表示所述多个刺激，而所述多个红色箭头表示所述被诱发的电位。
图4显示了多个代表性组织学显微照片，展示了植入agrg3(grg+抗nogoa)的多个sci大鼠的轴突发芽。放大倍数为x40。图中显示的为：从一只植入agrg3并以nf染色的大鼠中获得的近端、病变及远端部分的多个横截面。多个箭头表示所述多个观察到的神经纤维很少；轴突发芽被视为明亮的颜色。
图5显示了与多个对照组未治疗的sci大鼠相比，多个植入agrg(grg+抗nogoa、grg+软骨素酶abc)的sci大鼠的多个存活率(百分比)的一表格及图表。*与对照组相比的p<0.05；**与对照组相比的p<0.1。
具体实施方式
本发明在本发明的一些实施例中涉及用于神经损伤的联合治疗。
在详细说明本发明的至少一个实施方式之前，应当理解本发明不限定于在以下的描述或所示例的多个实施例的所述多個细节的应用。本发明能够以其他实施方式或以各种方法来实施或应用。
在将本发明减少到实践的同时，本发明人设计了一种用于治疗神经损伤及预防或治疗神经损伤后神经源性休克的联合疗法，所述联合治疗是基于与透明质酸、一抗氧化剂、一层粘连蛋白肽(seqidno：1)及一抗神经胶质增生剂(例如：软骨素酶abc、抗nogoa)的一联合治疗，所述联合治疗能够支持神经元组织的再生。当被配制成一凝胶时，所述制剂被称为agrg，即抗神經膠質增生的引导再生凝胶。
如下文及随后的实施例部分所示，本发明人展示了以包含软骨素酶abc或抗nogoa作为所述抗神經膠質增生组分的agrg的处理在体外增加多个神经元细胞的存活及质量，一个无法通过单独以grg[即透明质酸、一抗氧化剂及一层粘连蛋白肽(seqidno：1)]或单独以抗神经胶质增生剂治疗(实施例2，图1)实现的效果。此外，本发明人展示了在一sci大鼠模型中将由grg及抗nogoa组成的agrg植入在脊髓损伤(sci)的部位处或附近促进了神经再生；并且特别改善了运动，促进了先前瘫痪肢体中导电性的恢复，并且促进了轴突穿过所述神经胶质瘢痕屏障(示例4，图2a至2c，3及4)。此外，本发明人展示了由grg及抗nogoa或软骨素酶abc所组成的agrg对脊髓性休克具有一保护作用，并降低所述多个经sci处理的大鼠的死亡率(示例6，图5)。
因此，根据本发明的一第一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含一透明质酸、一层粘连蛋白多肽、一抗氧化剂及一抗神经胶质增生剂。
如本说明书所用的术语“透明质酸(ha)”，也称为玻尿酸(hyaluronan)，透明质酸盐(hyaluronate)，是指一种未硫酸化糖胺聚糖，由通过交替β-1,4及β-1,3糖苷键连接在一起的n-乙酰葡糖胺(glcnac)及葡糖醛酸(glcua)的多个重复的双糖单元组成。根据多个具体实施例，所述透明质酸为透明质酸钠(na-ha)。根据多个具体实施例，所述透明质酸的一分子量为约104道尔顿至约3×106道尔顿。透明质酸的所述分子量可以通过例如：以一数字粘度计(布鲁克菲尔德(brookfield)品牌的锥/板式dvii+per(布鲁克菲尔德工程实验室公司，米德尔伯勒，ma02346-1031usa)来评量。透明质酸的所述分子量也可以通过迪什(dische's)分析中获得的数字相对于用于多个还原糖的帕克-约翰逊(park-johnson)分析中获得的数据之间的差异来计算(parkj.t.、johnsonm.j.的《葡萄糖的亚显微测定》(asubmicrodeterminationofglucose)《生物化学杂志》(j.biol.chem.)，181，149至151，1949)。
本说明书所述的透明质酸包括天然存在的ha、合成的ha或其组合。根据多个具体实施例，所述透明质酸可以从一生物体(例如：多个公鸡鸡冠或多个脐带)中萃取及分离，或从多个细菌培养物(例如：溶血性a组链球菌或c组链球菌的中提取或分离，或可以使用多个熟知的方法合成生产。艺术。
根据本发明的多个具体实施例，对于多个化学或生物组分而言，所述透明质酸为足够纯净的，因此它在生物学上是惰性的，在多个普通条件下与其它物质的反应率低。
根据本发明的多个具体实施例，所述透明质酸足够纯净，使得所述透明质酸为生物相容的，例如：当与一生物体的多个细胞、多个组织或体液接触时，不会引起多个不良反应，例如：多个免疫反应及/或免疫排斥、细胞死亡等。
根据多个具体实施例，所述透明质酸的纯度为至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。
根据多个具体实施例，所述透明质酸是分析级的(即99.5％至100％)或药用级(98％至100％)的透明质酸。
本说明书所述的透明质酸能够在多个水溶液中形成多个高度水合的凝胶。
本发明的所述组合物中ha的总含量可以通过多个本领域已知的方法来测定，例如但不限于：通过采用所述咔唑试剂的迪什(dische)的常规试验来测定糖醛酸(葡糖醛酸)的含量(dischez.《己糖醛酸的一种新的特定颜色》，《生物化学杂志》(j.biol.chem.)，167，189至197，1947)。
如本说明书所用的术语“层粘连蛋白”是指多个细胞外基质的糖蛋白家族，形成基底膜的主要的非胶原成分。多个层粘连蛋白涉及多种多样的生物过程，包括：细胞粘附、分化、迁移、信号传导、神经突生长及转移。多个层粘连蛋白由3个不相同的支链组成：层粘连蛋白α、β及γ，各自由一不同的基因来编码。
如本说明书所用的短语“层粘连蛋白多肽”是指一种包含一层粘连蛋白多肽的至少4个连续胺基酸的胺基酸序列，并且所述胺基酸序列表现一生物活性(例如：支持细胞存活、生长、增殖、分化及/或迁移)。
根据本发明的一些实施例，所述层粘连蛋白多肽可包括一层粘连蛋白α链的一胺基酸序列，例如：lama1(例如：基因银行(genbank)登录号：np_005550.2)、lama2(例如：genbank登录号：np_000417.2及np001073291.1)、lama3(例如：genbank登录号：np_937762.1及np_000218.2)、lama4(例如：genbank登录号：np001098677.1、np001098676.1、np002281.2、np001098679.1及np_001098678.1)及lama5(例如：genbank登录号：np_005551.3)；一层粘连蛋白β-链，例如：lamb1(例如：genbank登录号：np_002282.1)、lamb2(例如：genbank登录号：np_002283.3)、lamb3(例如：genbank登录号：np_000219.2及np_001017402.1)及lamb4(例如：genbank登录号：np_031382.2)；及/或一层粘连蛋白γ链，例如：lamc1(例如：genbank登录号：np_002284.3)、lamc2(例如：genbank登录号：np_005553.2及np_061486.2)及lamc3(例如：genbank登录号：np_006050.3)。
根据本发明的多个具体实施例，所述层粘连蛋白多肽包括：一层粘连蛋白序列的一重复的胺基酸序列(例如：一4或5个胺基酸的重复序列)。
本发明的所述组合物中可包括的多个层粘连蛋白多肽的多个非限制性示例包括：由seqidno：1、2或3中所示的所述多个肽。[ksikvavrsyigsrcv(seqidno：1)、ikvav(seqidno：2)、yigsr(seqidno：3)]。
根据多个具体实施例，所述层粘连蛋白多肽由seqidno：1(ksikvavrsyigsrcv)示出。
根据多个具体实施例，所述层粘连蛋白多肽的长度为5至50、5至25、5至20、16至50或16至25个胺基酸。
根据多个具体实施例，所述层粘连蛋白多肽的长度为至少16个胺基酸，但所述长度短于50个胺基酸。
本说明书可互换地使用的术语“多肽”或“肽”涵盖：多个天然肽(多个降解产物、多个以合成方法合成的肽或多个重组肽)及多个肽模拟物(通常为多个以合成方法合成的肽)，以及多个拟肽及多个半肽类，所述多个拟肽及多个半肽类为多个肽类似物，所述肽类似物可以具有例如：使得肽在一身体内更稳定或更能够渗透到多个细胞中的多个修饰，所述多个修饰包括但不限于：n末端修饰、c末端修饰、肽键修饰，包括但不限于：ch2-nh、ch2-s、ch2-s＝o、o＝c-nh、ch2-o、ch2-ch2、s＝c-nh、ch＝ch或cf＝ch、多个骨架修饰及残基修饰。用于制备多个拟肽化合物的方法是本领域熟知的，并且阐述在例如：《定量药物设计》(quantitativedrugdesign)，加利福尼亚州，拉姆斯登gd.(ramsdengd.)，第17.2章，f.肖普林·佩加蒙(f.choplinpergamon)出版社(1992)，其通过引用并入本说明书，如同在本说明书中阐述。
在下文中提供了这方面的进一步细节。
在所述肽内的多个肽键(-co-nh-)可以被取代，例如：n-甲基化键(-n(ch3)-co-)、酯键(-c(r)h-c-o-o-c(r)-n-)、酮亚甲基键(-co-ch2-)、α-氮杂键(-nh-n(r)-co-)，其中r为任何烷基，例如：甲基；碳-氮键(-ch2-nh-)、羟基乙烯键(-ch(oh)-ch2-)、硫代酰胺键(-cs-nh-)、烯属双键(-ch＝ch-)、反式酰胺键(-nh-co-)、肽衍生物(-n(r)-ch2-co-)，其中r是“正常”侧链，天然存在于所述碳原子上。
所述多个修饰可以在所述肽链上的所述多个键结中任一个处发生，甚至同时在多个个(2至3个)处发生。
多个天然的芳族胺基酸：色胺酸(trp)、酪胺酸(tyr)及苯丙胺酸(phe)可以被取代，以成为合成的非天然酸，例如：异喹啉-3-羧酸(tic)、萘基丙胺酸(nol)、苯丙胺酸的多个环甲基化衍生物、苯丙胺酸的多个卤代衍生物或邻甲基酪胺酸。
除上述之外，本发明的所述多个肽还可包括一种或多种修饰的胺基酸或一种或多种非胺基酸单体(例如：脂肪酸、复合的碳水化合物等)。
术语“胺基酸”或“多个胺基酸”应当理解为包括20种天然存在的胺基酸；所述多个胺基酸经常在体内受到转译后的修饰，包括例如：羟脯胺酸、磷酸丝胺酸及磷酸苏胺酸；及其他不寻常的胺基酸，包括但不限于：2-胺基己二酸、羟赖胺酸、异赖胺酸、降缬胺酸、降亮胺酸及鸟胺酸。此外，术语“胺基酸”包括：d-胺基酸及l-胺基酸。
以下的表1及表2列出了可以与本发明一起使用的多个天然存在的胺基酸(表1)及多个非常规的或经修饰的胺基酸(例如：合成的，表2)。
表1：
表2：
本发明的所述多个肽优选地以一线性形式使用，但应当理解，在环化不严重干扰肽的特征的情况下，也可以使用所述肽的多个环状形式。
由于本发明的多个肽可用于需要所述多个肽为可溶形式的多个治疗剂或多个诊断剂中，本发明的所述多个肽优选地包括：一种或多种非天然或天然极性胺基酸，包括但不限于：丝胺酸及苏胺酸，由于它们的含羟基的侧链，因此能够增加肽的溶解度。
本发明的所述多个肽可以通过肽合成的领域的多个技术人员已知的任何技术来合成。对于固相的肽合成，所述多个技术的总结可以在j.m.stewart及j.d.young，w.h.弗里曼公司(w.h.freemanco.)(旧金山)，1963及(j.meienhofer，《荷尔蒙蛋白质及多个肽》，第2卷，第46页,学术出版社(纽约)，1973年。对于经典溶液合成，参见g.schroder及k.lupke，《所述多个肽》，第1卷,学术出版社(纽约)，1965年。
通常地，所述多个方法包括：将一个或多个胺基酸或多个适当地保护的胺基酸顺序加入一生长的肽链中。一般地，第一个胺基酸的所述胺基或羧基被一合适的保护基团保护。然后，在多个适于形成所述酰胺键结的条件下，通过在具有所述适当地保护的互补(胺基或羧基)基团的序列中加入下一个胺基酸，将所述保护的或衍生的胺基酸连接到一惰性固体载体上或使用于溶液中，然后从所述新添加的胺基酸残基中去除所述保护基团，然后加入下一个胺基酸(被适当地保护的)等。以适当的顺序连接所有的所需的胺基酸后，依次或同时去除任何剩余的保护基团(及任何固体支持物)，得到最终的肽化合物。通过对所述一般方法的简单修饰，可以一次向一生长链中添加多于一个胺基酸，例如：通过将(在不使手性中心外消旋的条件下)一被保护的三肽与一被适当地保护的二肽偶联，以在去保护后形成五肽等。肽的合成的进一步描述公开于美国专利号第6,472,505号。
制备本发明的所述多个肽化合物的一种优选的方法包括：固相的肽合成。
大规模的肽的合成被描述在安德森生物聚合物(anderssonbiopolymers)2000；55(3)：227-50中。
在需要大量或长的多肽(例如：长度大于20个胺基酸)的情况下，可以使用如bitter等人，(1987)《酵素学中的多个方法》(methodsinenzymol.)153:516至544，studier等人(1990)《酵素学中的多个方法》(methodsinenzymol.)185:60至89，brisson等人(1984)，《自然》(nature)310：511至514，takamatsu等人(1987)，欧洲分子生物学组织杂志(emboj.)，6：307至311，coruzzi等人(1984)欧洲分子生物学组织杂志(emboj.)，3：1671至1680，brogli等人(1984)，《科学》(science)，224：838-843，gurley等人(1986)，分子与细胞生物学，6：559至565及weissbach与weissbach，1988，《植物分子生物学方法》(methodsforplantmolecularbiology)，学术出版社，纽约，第八节，第421至463页。
所述组合物还包含一抗氧化剂，可以保护多个细胞或多个大分子(例如：多糖)免受到氧化应激(由多个自由基所引起的氧化伤害)。因此，所述抗氧化剂可以通过防止所述多个大分子的氧化解聚来延长所述多个大分子的存活。
多个合适的抗氧化剂的多个非限制性实例包括例如：谷胱甘肽、维生素c(抗坏血酸钠)、维生素e(生育酚及生育三烯酚)、n-ac-l-半胱胺酸、对苯二酚、谷胺酸或多个酶，例如：过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽的过氧化物酶或其他过氧化物酶，以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)(参见osmeni.、naziroglum.、okutanr.，多个抗氧化酶在多个兔子中的植入物周围的多个组织中的比较研究，《细胞生物化学杂志》(cell.biochem.)，24:275至281,2006)。
根据多个具体实施例，所述抗氧化剂为超氧化物歧化酶(sod)。
如本说明书所用的术语“超氧化物歧化酶”e.c.号：1.15.1.1是指一种交替地催化所述超氧化物(o2-)自由基的歧化(或分配)成一般的分子氧气(o2)或过氧化氢(h2o2)的酶。超氧化物歧化酶除了作为一抗氧化剂的已知活性外，还可以在体内使用时用作一抗炎剂。可用于本发明的所述组合物的多个超氧化物歧化酶(sod)的多个非限制性实例包括：sod-1(可溶性)、sod-2(线粒体)或sod-3(细胞外)，例如：可溶性的人类超氧化物歧化酶1(sod-1)，基因银行(genbank)登录号为np_000445(seqidno：4)；人类线粒体超氧化物歧化酶2(sod-2)，genbank登录号为np_001019637.1(异构体b)，np_001019636.1(异构体a)、np_000627.2(异构体a)；人类细胞外超氧化物歧化酶3(sod-3)，genbank登录号为np_003093.2；酵母菌(saccharomycescerevisiae)sod-1，genbank登录号为np_012638.1；及褐家鼠(rattusnorvegicus)sod-1，genbank登录号为np_058746。
根据多个具体实施例，所述sod包括由seqidno：4所示的胺基酸序列。
本发明的所述抗氧化剂可以通过多个重组技术生产，例如：如哈特曼jr.(hartmanjr.)等人，1986(美国国家科学院院刊(proc.nati.acad.sci.usa)，第83卷，第7142至7146页)中所述。例如：可以将编码在超氧化物歧化酶1的一多核苷酸(genbank登录号为nm_000454；seqidno：5)连接到适于在一宿主细胞(例如：细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞)中表达的一核酸构建体中。所述核酸构建体包括一个用于以一构成方式或可诱导的方式引导所述多核苷酸序列在所述细胞中进行转录的启动子序列，并且还可以包括多个使所述载体适于在多个原核生物、真核生物或优选两者中复制及整合的序列(例如：穿梭载体)；转录及转译起始序列、增强子、转录终止子及转译终止子，以及可以提高信使核糖核酸(mrna)的转译效率的一多腺苷酸化信号；用于分泌的一信号序列；经过加工以增强被表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产量或毒性的多个序列。
可以使用各种标准蛋白质纯化技术来回收及纯化所述抗氧化剂，例如但不限于：亲和性层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水性相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、刀豆蛋白a层析、铬酸盐集中法及差异性溶解法。
根据本发明的多个具体实施例，回收所述抗氧化剂，使得所述抗氧化剂在多个化学或生物组分中的纯度足够允许所述重组多肽作为一抗氧化剂的有效使用。所述抗氧化剂(例如：sod)的活性，可以通过本领域熟知的方法来测定，并且包括在560纳米(nm)下进行测量，以作为在黄嘌呤氧化酶氧化黄嘌呤的期间产生超氧阴离子自由基时抑制硝基四唑蓝还原的速率。
根据多个具体实施例，所述抗氧化剂(例如：sod)为至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的纯度。
根据多个具体实施例，所述抗氧化剂(例如：sod)为分析级或药用级的抗氧化剂。
如本说明书所用的术语“神经胶质增生症”是指多个神经胶质细胞(例如：星形胶质细胞及巨噬细胞)响应于中枢神经系统(cns)的伤害的一非特异性变化。通常地，神经胶质增生涉及神经胶质细胞的增殖、神经胶质细胞的肥大及多个结缔组织基质物质的分泌，例如：蛋白聚糖(pg)、胶原蛋白及髓磷脂衍生的残基。神经胶质增生症在其极端形式下导致在cns中形成一瘢痕组织，包括在多个受伤害的区域中的神经胶质细胞的致密纤维网络，导致抑制多个轴突发芽及限制神经元再生。
多个测定多个神经胶质增生症的方法为本领域已知的，并且在以下的示例部分中进一步描述，并且包含在体外测定神经元细胞存活及星形胶质细胞存活及质量、抑制性细胞内组分、细胞周围组分及细胞外(ecm)组分(例如：多种gag)的生物合成及聚集的多个方法；及在体内测定响应于cns损伤(例如：sci)的神经元再生的多个方法。
如本说明书所用的术语“抗神经胶质增生剂”是指能够降低神经胶质增生症程度的一试剂。通常地，一抗神经胶质增生剂通过降解所述瘢痕屏障及/或抑制所述瘢痕屏障的进一步形成来减少神经胶质增生症的程度。根据多个具体实施例，与不存在所述抗神经胶质增生剂的情况相比，所述减少为至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍。
根据其他具体的实施例，与不存在所述抗神经胶质增生剂的情况相比，所述减少为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
根据多个具体实施例，所述组合物包括至少一种抗神经胶质增生剂。
根据多个具体实施例，所述组合物包括一种抗神经胶质增生剂。
根据其他具体的实施例，所述组合物包括多个不同的(例如2、3、4、5个)抗神经胶质增生剂。
根据一个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂为一种针对一糖蛋白的抗体，即参与所述神经胶质增生过程的一糖蛋白。
根据另一个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂为一种可以缓解所述神经胶质增生过程的酶。
根据另一个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂为一种可以缓解所述神经胶质增生过程的肽。
根据另一个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂为一种可以缓解神经胶质增生过程的生长因子。
根据另一个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂为一种可以缓解神经胶质增生过程的小分子。
根据另一个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂为一种可以缓解神经胶质增生过程的多核苷酸分子。
多个抗神经胶质增生剂的多个非限制性实例包括：软骨素酶abc(e.c.号：4.2.2.4)、β-d-木糖苷(e.c.号：217.897.1)、i型胶原蛋白酶(e.c.号：232-582-9)、丝裂霉素-c(casno)50-07-7)、mmp-3-基质金属蛋白酶(e.c.号：3.4.24，抗nogoa、抗tgfp1、2及3、血管紧张素转换酶(acea，e.c.号：3.4.15.1)、抗ng-2结构域、核心蛋白聚糖(decorin)(例如：人类核心蛋白聚糖，例如：uniprot登录号第p07585号，papn-β胺基丙酰基、甘露糖-6-磷酸(casno：3672-15-9)、被氧化的重组人数半乳凝素-1、柯佩松(copaxone)(醋酸格拉替雷)及三肽(ser-gly-gly)。
根据多个具体实施例，所述抗心绞痛药是选自于由抗nogoa及软骨素酶abc所组成的群组中的一个。
根据多个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂包含抗nogoa.
如本说明书所用的术语“nogoa”也称为内质网蛋白4(reticulon4)、神经内分泌特异性蛋白、神经突生长抑制剂、nogo、神经突生长抑制剂220，是指rtn4基因的表达产物，例如：蛋白质。根据多个具体实施例，所述nogoa蛋白质是指人类蛋白质，例如：在以下genbank编号为np_008939、np_065393、np_722550、np_997403及np_997404中所提供的。
本发明中使用的术语“抗体”包括多个完整的分子及其与一抗原的一表位结合的多个功能性片段(例如：fab、f(ab’)2、fv、scfv、dsfv或多个单结构域分子，例如：vh及vl)。
用于实施本发明的一些实施例的多个合适的抗体片段包括：一免疫球蛋白轻链的一互补决定区(cdr)(本说明书称为“轻链”)、一免疫球蛋白重链的一互补决定区(本说明书称为“重链”)、一轻链的一可变区、一重链的一可变区、一轻链、一重链、一fd片段及多个包含轻链及重链的基本上所有的可变区的抗体片段，例如：fv、一单链的fvfv(scfv)、一被二硫键稳定化的fv(dsfv)、一fab、一fab’及一f(ab‘)2。
根据多个具体实施例，所述抗体是一单克隆抗体。
根据其他具体的实施例，所述抗体是一多克隆抗体。
多个产生多个多克隆及单克隆抗体及其多个片段的方法为本领域所熟知(参见例如：harlow及lane，《多个抗体：一实验室手册》(antibodies:alaboratorymanual)，冷泉港实验室，纽约，1988，通过引用并入本说明书)。
根据多个具体实施例，所述抗体为一人类抗体或一人源化抗体。
多个产生多个人类抗体及人源化多个非人类的抗体的方法为本领域所熟知。
多个非人类(例如：鼠类)的抗体的多个人源化形式为多个免疫球蛋白、多个免疫球蛋白链或其多个片段(例如：fv、fab、fab’、f(ab’)、多个抗体的sub.2或其他抗原结合子序列)的多个嵌合分子，所述多个嵌合分子含有来自于非人类的免疫球蛋白的最小序列。多个人源化抗体包括：多个人免疫球蛋白(受体抗体)，其中形成所述受体的互补决定区(cdr)的多个残基被来自于非人类物种(供体抗体)的一cdr的多个残基替换，所述非人类物种例如：具有所需的特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔子。在一些情况下，所述人类免疫球蛋白的多个fv框架残基被多个相应的非人类残基取代。多个人源化抗体还可以包括既不在所述受体抗体中，也不在所述输入的cdr或多个框架序列中发现的多个残基。通常地，所述多个人源化抗体将包括基本上全部可变结构域中的至少一个，且通常是两个可变结构域，在所述多个可变结构域中的全部或基本上全部的所述cdr区中，对应于一非人类免疫球蛋白及所有或基本上所有的所述fr区的cdr区为一人类免疫球蛋白共有序列的多个cdr区。所述人源化抗体最佳地还将包括至少一部分的免疫球蛋白恒定区(fc)，通常地为一人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区[jones等，《自然》(nature)，321：522至525(1986)；riechmann等，《自然》(nature)，332：323至329(1988)；及presta，结构生物学新观点(curr.op.struct.biol.)，2：593至596(1992)]。
可以与本发明的多个具体实施例一起使用的多个抗-nogoa抗体为本领域已知的，并且可以在商业上从例如：生物测试有限公司(biotestltd.)，abcam及emdmillipore中获得。
根据其他具体的实施例，所述抗神经胶质增生剂包括软骨素酶abc。
如本说明书所用的术语“软骨素酶abc”e.c.号：4.2.2.4，也称为软骨素abc裂解酶、软骨素酶及软骨素abc消除酶，是指作用于4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素及硫酸皮肤素的酶，并催化以下反应：将含有1,4-β-d-己糖胺基及1,3-β-d-葡糖醛酸基或1,3-α-l-己醛醣基的多个多糖与含有4-脱氧-β-d-葡聚糖-4-烯脲基的多个双糖进行消除性降解。
所述酶作用于4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素及硫酸皮肤素。
软骨素酶abc可以在商业上获得，例如：从西格玛(sigma)及r&d系统(r&dsystems)获得。
根据多个具体实施例，提供了一种组合物，所述组合物包括一透明质酸，如seqidno：1所示的一层粘连蛋白多肽、一抗氧化剂及一抗神经胶质增生剂，所述抗神经胶质增生剂包括抗nogoa。
根据多个具体实施例，提供了一种组合物，所述组合物包括一透明质酸，如seqidno：1所示的一层粘连蛋白多肽、一抗氧化剂及一抗神经胶质增生剂，所述抗神经胶质增生剂包括软骨素酶abc。
根据多个具体实施例，所述多个组合物的所述多个组分为交联连结的。
根据多个具体实施例，所述组合物的所述透明质酸、所述抗氧化剂及所述层粘连蛋白肽是交联连结的。
可以使用本领域已知的任何交联剂或偶联剂进行所述组合物中包含的所述多个组分的交联连结(即通过共价键或离子键结合)。基本上，交联连结的原理是将多个游离的伯胺基与多个羧基结合，或在多个邻近的羟基之间氧化，形成多个活性醛基，以在它们彼此之间或与额外的共轭物的多个胺相互作用，可通过多个硫醇残基形成。
根据多个具体实施例，交联连结不影响所述多个结合的组件的所述多个生物活性。
多个合适的交联剂的多个非限制性示例包括：辛二亚氨酸二甲酯(亚胺酸酯交联剂)；双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(bs3；nhs-酯交联剂)；甲醛；1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亚胺盐酸盐(edc；碳二亚胺交联剂)；n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)[maoj.s等人，生物材料(biomaterials)24，1621至1629，2003年；choiy.s.等人，《生物医学材料研究杂志》(j.biomed.mater.res.)48，631至639，1999；richertl.等人，《生物大分子》(biomacromolecules)，5，284至294，2004)]；二乙烯基砜(dvs)；及京尼平(genipin)[sungh.w.等人，《生物医学材料研究杂志》，64a：427至438，2003；chensc.等人，《控制释放杂志》(j.controlrelease.)96,285至300，2004；mwalef.等人，《组织工程学》(tissueeng)]，11，130至40，2005；chenh.等人《生物大分子》，7，2091至2098，2006]。对于离体或在体内交联，可以将多个光致反应性胺基酸类似物(例如：亮胺酸及甲硫胺酸的多个二氮吮类似物)加入到所述组合物中，并且在暴露于紫外光之后，所述多个二氮吮被活化并结合至多个相互作用的侧链(例如：，羧基或胺基)。
根据本发明的多个具体实施例，使用一个无毒及/或生物相容性试剂进行交联接结。多个示例包括但不限于：3-二甲基-胺基丙基)-n-乙基碳二亚胺(edc-n；西格玛-奥尔德里奇-弗卢卡(sigma-aldrich-fluka)，圣路易斯，密苏里州63178，目录编号：03459)、二乙烯基砜(dvs；西格玛，目录编号：v-370-0)及京尼平(西格玛，目录编号：g-4796)。
因此，根据多个具体实施例，提供了一种如本说明书所公开的组合物，其中所述透明质酸、所述抗氧化剂及所述层粘连蛋白多肽是交联连结的。
根据其他具体的实施例，提供了一种如本说明书所公开的组合物，其中所述透明质酸、所述抗氧化剂、所述层粘连蛋白多肽及所述抗神经胶质增生剂是交联连结的。
根据多个具体实施例，本说明书所述的组合物结合了对多个神经元细胞存活、神经元再生及/或神经胶质瘢痕组织生长的预防的改善的活性。如本说明书所用的短语“组合的改善的活性”是指至少附加地改善，但优选地协同地改善的活性。
应当注意，由于包含在本发明的所述多个组合物中的所述多个组分可以使用多个合成或重组技术来制备，因此，所述多个组合物是可获得的分析级或药物级的多个无菌制剂。
如上所述，本发明人已经从一透明质酸、一层粘连蛋白多肽(seqidno：1)、一抗氧化剂(超氧化物歧化酶)及一抗神经胶质增生剂(例如：抗nogoa、软骨素酶abc)产生一种新颖的水凝胶。
因此，根据本发明的多个具体实施例，提供了一种包含本说明书中所述的组合物的水凝胶。
根据本发明的另一方面，提供了一种产生一水凝胶的方法，所述方法包括：(1)将包含一透明质酸、一层粘连蛋白多肽及一抗氧化剂的一组合物悬浮于水中，以获得包含至少40％水的一悬浮液；及
(2)向所述悬浮液中加入一抗神经胶质剂，从而产生所述水凝胶。
根据多个具体实施例，步骤(1)是根据国际专利申请公开号第wo2009/022339的多个教导实现，其内容以其整体并入本说明书中。
如本说明书所用的术语“水凝胶”是指包含本发明的一些实施例中的所述组合物及水的一材料，其中水占40％以上。
根据本发明的多个具体实施例，所述水凝胶包含至少约50％、至少约60％的水、至少约70％的水、至少约80％的水、至少约90％的水、至少约95％的水、至少约96％的水、至少约97％的水、至少约98％的水、至少约99％的水。
根据多个具体实施例，所述水凝胶是粘性的(例如：在没有运动期间为大约0厘泊(cp)，在运动期间为110-130cp)。
根据多个具体实施例，所述水凝胶是透明的。
根据多个具体实施例，所述透明质酸在所述组合物(例如：水凝胶)中的一浓度范围为约0.3至2％，例如：约0.4至1.8％、例如：约0.5至1.6、例如：约0.5至1.5％、例如：约0.6至1.4、例如：约0.8至1.2％、例如：约1.2％水凝胶。
根据一个具体实施例，所述透明质酸在所述组合物(例如：水凝胶)中的一浓度范围为约0.5至1.5％。
根据一些实施例，所述层粘连蛋白多肽(例如：seqidno：1)在所述组合物(例如：水凝胶)中的一浓度范围为约10至100微克/毫升(μg/ml)，例如：约20至100微克/毫升、例如约50微克/毫升。
根据一个具体实施例，所述层粘连蛋白多肽在所述组合物(例如：水凝胶)中的一浓度范围为约20至100微克/毫升。
根据本发明的一些实施例，所述抗氧化剂(例如：超氧化物歧化酶)在所述水凝胶中的一浓度范围为约8微摩尔浓度(μm)(约0.25微克/毫升(μg/ml))至8毫摩尔浓度(mm)(约250微克/毫升)。例如：所述抗氧化剂(例如：超氧化物歧化酶)可以被提供的一浓度范围为约0.5微克/毫升至约200微克/毫升，例如：约1微克/毫升至约100微克/毫升、例如约2微克/毫升至约80微克/毫升、例如：约4微克/毫升至约40微克/毫升、例如：约5微克/毫升至约50微克/毫升、例如：约10微克/毫升至约50微克/毫升、例如：约15微克/毫升至约40微克/毫升、例如：约20微克/毫升至约30微克/毫升、例如：约25微克/毫升。
根据多个具体实施例，所述抗氧化剂在所述组合物(例如：水凝胶)中的一浓度范围为约5至40微克/毫升。
根据多个具体实施例，所述组合物(例如：水凝胶)中的所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂之间的比例为例如：介于ha0.01毫克：层粘连蛋白多肽50微克：sod250微克/毫升至ha1.2毫克：层粘连蛋白多肽50微克：sod250微克/毫升。
根据一个具体实施例，所述组合物(例如：水凝胶)中的所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂之间的比例为ha0.4毫克：层粘连蛋白多肽50微克：sod250微克/毫升。
根据多个具体实施例，所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂被提供的一总浓度为约0.01至0.6％。
根据多个具体实施例，所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂被提供的一总浓度为约0.02至0.5％。
根据多个具体实施例，所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂被提供的一总浓度为约0.4％。
根据多个具体实施例，所述透明质酸、所述层粘连蛋白多肽及所述抗氧化剂被提供的一总浓度为约0.2％。
根据多个具体实施例，所述抗神经胶质增生剂在所述组合物(例如：水凝胶)中的一浓度范围为约5至300微克/毫升。
根据本发明的一些实施例，所述方法还包括将所述组合物交联连结，多个可用于交联连结的方法及试剂是本领域熟知的，并且在上文中进一步描述。
根据本发明的多个具体实施例，通过本领域的多个熟知的方法冻干所述水凝胶，从而获得一干燥的基质。
根据多个具体实施例，所述干混合物包括小于50％、小于30％％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、或小于0.5％的水。应当注意，多个无水基质可以长时间保存而不会受到酶促降解或污染(例如：通过多个微生物)。
因此，根据多个具体实施例，提供了一种包括本说明书中所述组合物的基质。
如本说明书所用的短语“基质”是指包括本发明中的所述组合物的一个二维支架或一个三维支架(在本说明书中也称为支撑框架)。所述支架可进一步提供机械性稳定性及支撑。
所述基质可以根据预期的用途以干燥或湿润的形式保持，或可以被冷冻。
根据多个具体实施例，所述干燥基质可以在一水溶液(例如：水)中进一步水合直至形成一水凝胶。
根据多个具体实施例，所述基质的多个维度根据欲治疗的病变(例如：神经损伤，例如：脊髓损伤)而变化。例如：所述基质的尺寸可以小于或基本上与欲治疗的病变相同。替代地，所述基质的大小可以大于所述病变。
支架材料可包括多個天然或合成的有机聚合物，所述有机聚合物可凝胶化、或聚合或固化(例如：通过聚集、凝结、疏水性相互作用或交联连结)形成一个二维或一个三维结构。
本发明的所述支架可以由一单一聚合物、共聚物或其共混物均匀地加以制造。然而，还可以形成根据本发明的多种不同聚合物的一支架。用于形成所述支架的多个聚合物的数量或排列没有特定的限制，可以使用可形成多个纤维，并且可以以一合适的速率降解的任何的生物相容性的组合。
可以调节聚合物的选择及一共聚物中的多个聚合物的比例，以优化所述支架的刚度，还可以调节所述支架的分子量及交联连结的密度，以控制所述支架的机械性质及降解速率(对于多个可降解的支架)，还可以优化所述多个机械性质，以模拟在所述植入部位处的所述组织的多个机械性质。
多个用于多个支架材料组合物的聚合物可以是生物相容的、可生物降解的及/或可生物侵蚀的，并且可以作为用于多个细胞的多个粘合基质。在多个示例性的实施例中，多个结构性支架材料易于加工成多个复杂的形状，并且具有适于在多个体内的条件下保持所需形状的一刚性及机械强度。
在一些实施例中，所述结构性支架材料可以是非再吸收的或不可生物降解的聚合物或材料，所述多个非再吸收的支架材料可用于制造多个被设计为用于长期或永久植入一宿主生物体的材料。
本说明书所用的短语“不可生物降解的聚合物”是指至少基本上(即大于50％)在体内不降解或不侵蚀的一种或多种聚合物。术语“不可生物降解的”及“不可再吸收的”是等同的，并且在本说明书中可互换地使用。可用作多个支架材料的多个生物相容性不可生物降解的聚合物的多个示例包括但不限于：聚乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺(例如：尼龙)、聚酯、人造纤维、聚丙烯、聚丙烯腈、丙烯酸类、聚异戊二烯、聚丁二烯及聚丁二烯-聚异戊二烯共聚物、氯丁橡胶及丁腈橡胶、聚异丁烯、烯烃橡胶(例如：乙烯-丙烯橡胶、乙烯-丙烯-二烯单体橡胶及聚胺酯弹性体)、硅橡胶、含氟弹性体及氟硅橡胶、乙烯基乙酸酯的多个均聚物及多个共聚物(例如：乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、丙烯酸酯的均聚物及共聚物，例如：聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯及甲基丙烯酸羟甲酯)、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚酰胺、含氟聚合物(例如：聚四氟乙烯及聚乙烯氟、苯乙烯丙烯腈的多个均聚物及多个共聚物、乙酸纤维素、丙烯腈丁二烯苯乙烯的多个共聚物)、聚甲基戊烯、聚砜、聚酯、聚酰亚胺、聚异丁烯、聚甲基苯乙烯及本领域技术人员已知的其它类似的化合物。
在其他实施方案中，所述多个结构支架材料可以是一“可生物侵蚀的”或“可生物降解的”聚合物或材料。
本说明书所用的短语“可生物降解的聚合物”是指在体内降解的一聚合物或多个聚合物，其中所述聚合物或多个聚合物随时间的侵蚀与在所述组合物的释放的同时或之后发生。术语“可生物降解的”及“可生物侵蚀的”是等同的，并且在本说明书中可互换地使用。
所述可生物侵蚀或可生物降解的支架材料可用于制造多个临时结构。多个可用作多个支架材料的多个生物相容的可生物降解的聚合物的示例包括但不限于：聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯及其多个共聚物、聚酯(例如：聚乙交酯)、聚酐、聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯(例如：氰基丙烯酸正丁酯及氰基丙烯酸异丙酯)、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、多肽、聚胺甲酸乙酯、聚苯乙烯、聚苯乙烯磺酸、聚苯乙烯羧酸、聚环氧烷、藻酸盐、琼脂糖、糊精、右旋糖酐、聚酐、生物聚合物(例如：胶原蛋白及弹性蛋白)、藻酸盐、壳多糖、糖胺聚糖及所述多个聚合物的多个混合物。在其他实施例中，多个非生物可降解的及可生物侵蚀的及/或可生物降解的支架材料的一混合物可用于形成一仿生结构，所述仿生结构的一部分是永久性的，并且一部分是暂时的。
根据多个具体实施例，聚乳酸(pla)、聚麸胺酸(pga)及pla/pga共聚物用于形成本发明的所述多个支架。
在一个示例性实施例中，多个支架的多个材料可包括多个天然存在的物质，例如：纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、壳聚糖、胶原蛋白、藻酸盐、聚(n-异丙基丙烯酰胺)、白蛋白、胶原蛋白、合成的聚胺基酸、醇溶谷蛋白、多糖(例如：藻酸盐)、肝素及其他天然存在的可生物降解的糖单元聚合物。
根据多个具体实施例，本发明的所述多个支架是多孔的，孔隙率可以通过本领域技术人员已知的各种技术来控制。
根据本发明的一个具体实施例，所述多个支架由多个合成的生物材料加以制造，并且能够导电及在体内被自然地侵蚀。在一个示例性实施例中，所述多个支架包括能够导电的一生物相容性聚合物，例如：聚吡咯聚合物。聚苯胺、聚乙炔、聚对伸苯、聚对苯乙烯、聚噻吩及海莫辛(hemosin)为其它能够导电的多个生物相容性的聚合物的多个示例，并且可以与本发明结合使用。其他可侵蚀的导电聚合物为熟知的(例如：参见zelikin等人，《潜在生物医学应用的可腐蚀导电聚合物》(erodibleconductingpolymersforpotentialbiomedicalapplications)，《德国应用化学》(angew.chem.)英语国际版，2002，41(1)：141至144)。可以将任何前述的导电聚合物施加或涂覆到一可延展或可模塑的支架上。
所述多个支架可以通过本领域的技术人员已知的多种技术中的任何一种来制备。盐类浸出、致孔剂、固液相分离(有时称为冷冻干燥)及相转化制造均可用于制备多孔支架。纤维牵引及编织(参见例如：vacanti等人，(1988)《小儿外科杂志》(journalofpediatricsurgery)，23：3至9)可用于生产具有更多排列的聚合物线材的支架。本领域技术人员将认识到，可以利用多个标准聚合物加工技术来制备具有各种孔隙率及微结构的聚合物支架。
多个支架材料对于本领域普通技术人员而言是容易获得的，通常以一溶液的形式提供(多个供应商为例如：bdh，英国及普罗诺娃生物医学技术(pronovabiomedicaltechnology)，奧斯，挪威)。关于多个支架材料的选择及制备的一般概述，参见美国国家标准协会出版物第f2064-00号，标题为“旨在用于生物医学及组织工程医学产品应用的藻酸盐作为多个起始材料的表征及测试的标准指南”。
根据多个具体实施例，所述支架包括一可生物降解的膜，例如：一部硬膜，例如：冻结干燥硬膜(lyodura)，雅氏(aesculap)。
根据本发明的多个具体实施例，所述水凝胶或所述基质还包括多个离体繁殖的细胞，例如：多个干细胞或多个分化的细胞(例如：神经元的祖细胞)。
多个可用于本发明的干细胞的多个非限制性示例包括：胚胎干细胞、诱导多能干细胞(ips)、神经元的祖细胞、造血干细胞(例如：骨髓干细胞、脐带血细胞、外周血干细胞)、成体干细胞及间充质干细胞。
根据本发明的一些实施例，所述多个干细胞为多个神经元的祖细胞(例如从胚胎或胎儿神经元组织或脑中获得的所述多个干细胞)。
根据多个具体实施例，所述多个分化细胞为多个神经元细胞。
如上所述及如以下的示例部分中描述，本发明人已经发现一种组合物，所述组合物包括透明质酸、一层粘连蛋白多肽、一超氧化物歧化酶及一抗神经胶质增生剂(例如：以一水凝胶的一形式)的一组合物可以增加多个神经元细胞存活并支持神经元再生。
因此，根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种在一有需要的个体中诱导一神经元组织形成或再生的方法，所述方法包括将本发明的所述组合物、所述基质或所述水凝胶植入到所述个体中，从而诱导所述个体中的所述神经元组织的形成或再生。
如本说明书所用的术语“个体”是指任何性别及任何年龄的一哺乳动物个体(例如：人类)，包括：新生儿、婴儿、幼童、青少年、成年及老年。
根据本发明的多个具体实施例，术语涵盖多个患有如下所述的一病理学(例如：神经损伤、神经源性休克)的个体。
根据多个具体实施例，所述个体正在展示表征所述病理学的(多个)症状。
本发明还考虑了多个兽医用途，因此，根据多个具体实施例，选择本发明的所述组合物、所述基质及所述水凝胶的所述多个组分，避免多个异种反应。
根据本发明的一些实施例的另一个方面，提供了一种治疗一有需要的个体的神经损伤的方法，所述方法包括将本发明的所述组合物、本发明的所述基质或本发明的所述水凝胶植入到所述个体的神经损伤处或附近，从而治疗所述个体的所述神经损伤。
根据本发明的一些实施例的另一个方面，提供了一种将本发明的所述组合物、所述基质或所述水凝胶应用于治疗有此需要的个体的神经损伤的用途。
如本说明书所用的短语“神经损伤”是指表现出受到伤害的任何病症、疾病或病症(即非功能性组织、癌性或癌前组织、破损组织、骨折组织、纤维化组织或缺血性组织)或丧失。(例如：在一创伤、一传染病、一遗传疾病等之后)需要组织再生的神经组织。根据多个具体实施例，所述神经损伤是由创伤所引起，而非由一疾病引起。
根据多个具体实施例，所述神经元组织及/或所述神经损伤为中枢神经系统(cns)的一部分。
如本说明书所用的术语“中枢神经系统(cns)”可以指一个体的脑、脊髓及/或视神经。
根据多个具体实施例，所述神经损伤包括：脊髓损伤。
如本说明书所用的短语“脊髓损伤(sci)”是指由一创伤而非由疾病所引起的脊髓损伤。脊髓损伤有很多原因；根据多个具体实施例，所述sci是由多个机动车辆事故、跌倒、运动损伤或暴力造成的一重大创伤引起的。取决于所述脊髓及所述多个神经根受伤害的位置，所述多个症状可能具有很大的差异，例如：从疼痛到瘫痪到大小便失禁。所述sci可能是不完全性损伤或完全性损伤，所述完全性损伤意思是完全丧失功能。根据多个具体实施例，所述sci为完全性sci。
根据多个具体实施例，所述神经损伤包括创伤性脑损伤(tbi)。
如本说明书所用的短语“创伤性脑损伤(tbi)”是指由创伤而非疾病引起的脑损伤。多个tbi有很多原因；根据多个具体实施例，所述tbi由跌倒、车辆碰撞、运动碰撞或战斗所引起。所述短语包括：轻度及重度的tbi，包括：闭合性头部损伤、脑震荡或挫伤以及多个穿透性头部损伤。
根据多个具体实施例，所述神经损伤包括：创伤性视神经病变(ton)。
如本说明书所用的短语“创伤性视神经病变(ton)”是指由创伤而非疾病所引起的视神经的损伤。根据多个具体实施例，ton导致视力丧失，所述视力丧失可以是部分或完全的。多个ton具有很多原因；根据多个具体实施例，所述ton是由穿透性眼眶外伤、视神经管内的多个骨碎片或神经鞘血肿造成的所述视神经纤维的一解剖学破坏所引起。
短语“治疗”是指抑制、预防或阻止一病理(疾病、病症或病况)的发展和/或导致一病理的减少、缓解或压制。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法及分析来取得一病理的所述发展，相似地，各种方法及分析可用于取得一病理的减少、缓解或压制。根据多个具体实施例，所述治疗包括增加存活。
因此，根据本发明的一些实施例的另一个方面，提供了一种在一有需要的个体中增加神经损伤后的存活的方法，所述方法包括将本发明的所述组合物、所述基质或所述水凝胶植入到所述个体的神经损伤处或附近，从而增加所述个体的存活率。
根据本发明的一些实施例的另一个方面，提供了一种将本发明的所述组合物、所述基质或所述水凝胶应用于在一有需要的个体中增加神经损伤后的存活的用途。
根据多个具体实施例，与可以从数据库及已知文献中获得的不存在在本发明的组合物、所述基质或所述水凝胶的植入相比，所述增加为至少为1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍。
根据其他具体的实施例，与可以从数据库及已知文献中获得的不存在在本发明的组合物、所述基质或所述水凝胶的植入相比，所述增加为至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
根据多个具体实施例，与所述病理学(例如：神经损伤)相关的死亡率是由神经源性休克引起的。
因此，根据本发明的一些实施例的另一个方面，提供了一种在一有需要的个体中预防或治疗神经损伤后的神经源性休克的方法，所述方法包括将本发明的组合物、所述基质或所述水凝胶植入到所述个体的神经损伤处或附近，从而预防或治疗所述个体的所述神经源性休克。
根据本发明的一些实施例的另一个方面，提供了将本发明的组合物、所述基质或所述水凝胶应用于预防或治疗有需要的一个体的神经源性休克。
如本说明书所用的术语“预防”是指避免一疾病、病症或病况在可能有所述疾病的风险，但尚未被诊断为患有所述疾病、病症或病况的一个体中发生。本领域技术人员将会理解，可以使用各种方法及分析来评估一病理学的发展。
如本说明书所用的短语“神经源性休克”是指一种导致低血压的休克，偶尔伴有一减慢的心率，所述减慢的心率是归因于cns受到伤害(例如：sci)后发生的多个自主神经途径的破坏。多个诊断神经源性休克及评估其进展的方法在本领域中为已知的，包括但不限于：放射线照相成像、血液动力学监测及/或临床上的检查。
根据多个具体实施例，本发明的所述多个方法或所述多个组合物预防及/或治疗至少一种神经源性休克症状，包括但不限于：由于血管舒张及血管收缩障碍导致的突然大量血管舒张、温暖、发红的皮肤所引起的瞬时低血压；阴茎异常勃起，也是由于血管舒张造成的；由于丧失对肋间肌的神经控制(通常由于第5颈椎以下的损伤)而无法获得心动加速、心动过缓、膈肌呼吸、由于丧失对所述膈肌的神经控制而在所述受伤后立即呼吸停止(通常是由于对第3颈椎以上的损伤)、器官功能障碍或死亡。
根据多个具体实施例，本发明的所述多个方法或多个组合物治疗或预防由神经源性休克引起的器官功能障碍或死亡。
根据多个具体实施例，本发明的所述多个方法或多个组合物治疗展示了神经源性休克的至少一种症状的一个体，例如但不限于以上描述的多个症状。
根据多个具体实施例，本发明的所述多个方法或多个组合物治疗展示了神经源性休克的至少一种症状的一个体，所述症状是选自于低血压、心动过缓及膈肌呼吸所组成的群组。
本领域的技术人员能够测定何时以及如何植入所述组合物、所述基质或所述水凝胶，从而诱导例如：所述个体内的组织形成。参见例如：artziz等人，2005，《临床牙周病学杂志》(j.clin.periodontol.)32:193至9；butlerce及prietovg，2004，《整形与重建手术》(plast.reconstr.surg.)114:464至73.
根据多个具体实施例，本发明的所述组合物、所述基质或所述水凝胶局部地植入到所述神经损伤的部位。
例如：为了治疗多个脊髓损伤，将所述组合物、所述基质或所述水凝胶直接植入到所述病变部位(例如：进入所述损伤的中央)，并且在所述病变部附近(例如：距离所述受伤部位约0.5公分的距离)。植入所述植入物后，可以通过多个外科粘合剂(例如：拜欧古陆(bioglue)，跨奥(cryolife))固定；并且最后关闭并缝合所述肌肉及皮肤平面。
根据多个具体实施例，所述组合物、所述基质或所述水凝胶在所述神经损伤后12小时内、24小时内、48小时内、72小时内或96小时内植入，每种可能性代表本发明的一独立的实施例。
根据多个具体实施例，在所述神经损伤后48小时内植入所述组合物、所述基质或所述水凝胶。
根据多个具体实施例，在所述神经损伤后24小时内植入所述组合物、所述基质或所述水凝胶。
如果需要，本发明的所述多个组合物、所述基质及/或所述水凝胶可以存在于一包装或分配器装置中，例如：一fda(美国食品和药物管理局)批准的套组，所述套组可以包含一种或多种包含所述活性成分的单位剂量。所述包装可以例如：包括金属或塑料箔，例如：一泡罩包装。所述包装或分配器装置可伴随有多个用于给药的说明书，所述包装或分配器还可以伴随有所述容器相关联的一注意事项，所述注意事项是以由管理多个药品的制造、使用或销售的一政府机构所规定的一形式，所述注意事项反映由人类的多个组合物的形式或兽医管理的机构所发出的批准。所述注意事项可以是例如由美国食品和药物管理局批准用于多个处方药的标签或一批准的产品说明书。如上文进一步所详述，还可制备被配制在一相容性药物载体中的本发明所述多个组合物、基质、水凝胶，并放置在一合适的容器中，以及被标记为用于一指定的病况。
如本说明书所使用的术语“约”是指±10％。
术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包含(including)”、“具有(having)”及其词形变化是指“包括但不限于”。
所述术语“由…组成(consistingof)”意思是“包括及不限于”。
所述术语“主要由…组成(consistingessentiallyof)”意思是所述组合物，方法或结构可以包括额外的成分、步骤和/或部件，但只有当额外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新特征。
本说明书所用的单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”除非在上下文另有明确指出，否则本发明可包括复数个参考物。例如：术语“一化合物(acompound)”或“至少一化合物(atleastonecompound)”可以包括多个化合物，包括它们的混合物。
在整个本申请中，本发明的多个实施例可以结合参考文献以一范围格式来呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对本发明范围的严格的限制。因此，对范围的描述应当被认为是具体公开的所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值，例如：描述一范围像是从1到6(from1to6)应被理解为揭露多个子范围，例如：从1到3(from1to3)、从1到4(from1to4)、从1到5(from1to5)、从2到4(from2to4)、从2到6(from2to6)、从3到6(from3to6)等；亦揭露在此范围内的各个数字,例如：1、2、3、4、5及6，无论范围的宽度如何都适用于此。
每当在本说明书中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。多个短语：第一指示数字及第二指示数字“之间的范围”及第一指示数字“到”第二指示数字“的范围”在本说明书中可互换，并指包括第一及第二指示数字，及其之间的所有分数及整数。
如本说明书所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式，手段，技术及程序，包括但不限于已知的方式，手段，技术及程序，或者从已知方式，方法，化学，药理学，生物学，生物化学及医学领域的从业者的技术及程序。
应当理解，本发明的某些特征，为了清楚阐明，描述在多个独立的实施例的上下文中，也可以是在一单一实施例中以组合提供。相反，本发明的各种特征，为了简明，在一单一实施例的上下文中描述，也可以单独或以任何合适的子组合或以适合于本发明的任何其它描述的实施方式来提供。在各种实施例的上下文中描述的部分特征不应被认为是那些实施例的主要特征，除非所述实施例在没有这些组件的情况下不运作。
如上文描绘和下文权利要求部分所要求的本发明的各种实施例和各個方面可在下文的多個实施例中找到实验支持。
多个示例：
现在参考以下实施例，连同以上的多個描述一起以一非限制性方式说明本发明的一些实施例。
通常地，本说明书使用的命名法及本发明中使用的实验室步骤包括：分子、生物化学、微生物学及重组脱氧核糖核酸(dna)技术，这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如：“分子克隆：实验室手册”，sambrook等人，(1989)；“分子生物学中的当前的操作流程”第1至3卷，ausubel，r.m.，编辑(1994)；ausubel等人，“分子生物学中的当前的操作流程”，johnwiley及其儿子，巴尔的摩，马里兰州(1989)；perbal，“分子克隆的一实践指南”，johnwiley及其儿子，纽约(1988)；watson等人，“重组脱氧核糖核酸”，科学美国图书，纽约；birren等人(编辑)“基因组分析：实验室手册系列”，第1至4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；美国专利第4,522,587号第4,666,828号；4,683,202；4801531；5,192,659和5,272,057中所述的多个方法；“细胞生物学：实验室手册”，第1至3卷，cellis，j.e.，编辑(1994)；由freshney，wiley-liss所著的“动物细胞培养-基础技术手册”，纽约(1994)，第三版；“免疫学中的现有方案”第1至3卷，coliganj.e.，编辑(1994)；stites等人(编辑)，“基础与临床免疫学”(第8版)，appleton&lange，norwalk，ct(1994)；mishell及shiigi(编辑)，“细胞免疫学中的多个选择方法”，w.h.弗里曼公司，纽约(1980)；专利及科学文献中广泛描述了多个可用的免疫测定法，参见，例如：第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771及5,281,521号；“寡核苷酸合成”gait，m.j.，编辑(1984)；“核酸杂交”hames，b.d.及higginss.j.，编辑(1985)；“转录与翻译”hames，b.d.及higginss.j.，编辑(1984)；“动物细胞培养”freshney，r.i.，编辑(1986)；“固定化细胞及酶”irl出版社，(1986)；“分子克隆的一实践指南”perbal，b.，(1984)以及“酶学方法”第1至317卷，学术出版社；“聚合酶链式反应(pcr)操作流程：方法及应用指南”，学术出版社，圣地亚哥，加利福尼亚州(1990)；marshak等人，“蛋白质纯化及表征策略-实验室课程手册”cshl出版社(1996年)；所有的这些文献均通过引用并入本说明书，如同在本说明书中完全阐述一样。本说明书文档中提供了其他一般参考文献，当中的多个步骤被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的，其中包含的所有信息都通过引用并入本说明书。
示例1：
多个抗神经胶质增生剂对多个星形胶质细胞存活的体外效应：
多个材料及多个方法：
多个化学物质：一剂量为1毫摩尔浓度(mm)的bt-camp(n6,2’-o-二丁酰基腺苷3’,5’-环单磷酸，钠盐，西格玛(sigma)目录编号：d0627，分子量：491.37)；及一剂量为0.25至0.5毫摩尔浓度的茶碱(茶碱无水-1,3-二甲基黄嘌呤，西格玛目录编号：t1633，分子量：180.2)被用于活化多个星形胶质细胞。
所使用的多个抗神经胶质增生剂为：
(1)软骨素酶abc(西格玛目录编号：c2905)，来自于普通变形杆菌(proteusvulgaris)，软骨素酶abc为一种糖胺聚糖类(gags)降解酶，作用在所述神经胶质瘢痕中的所述聚集的gag。
(2)β-d-木糖苷(也称为对硝基苯基-β-d-木吡喃糖苷或4-硝基苯基β-d-吡喃木糖苷，西格玛目录编号：c3667或n2132，分子量：271.2)。β-d-木糖苷为多个gag链的一人工受体，取代所述天然的受体，即所述核心蛋白，产生多个可溶的、较小分子量的gag链，所述gag链在培养的细胞外环境中发现，并且在体内通过肾脏排出。
(3)胶原蛋白酶第i型(西格玛目录编号：c0130)，来自于溶组织棱状芽胞杆菌(clostridiumhistolyticum)，胶原蛋白倾向于聚集在所述胶质瘢痕中，导致抑制神经元生长及抑制纤维发芽。
(4)丝裂霉素-c(西格玛目录编号：m0503)，来自于头状链霉菌(streptomycescaespitosus)，所述试剂特异性地消除多个星形胶质细胞，从而减少神经胶质的反应性。
(5)mmp-3-基质金属蛋白酶，人类基质溶解素str1(西格玛目录编号：srp7783)。mmp-3-基质金属蛋白酶为一种内切蛋白酶聚集蛋白聚糖酶，表达出在维持及重塑细胞外基质(ecm)、降解gag、纤连蛋白、层粘连蛋白及胶原蛋白中起作用的催化活性；并且阻止多个正常的蛋白多糖(pgs)的合成。
(6)兔源抗nogoa，重组体(恩科科学服务有限公司(encoscientificservicesltd.)，目录编号：sc-25660)。nogo为一种源自于髓鞘的残基，为cns白质的一种抑制生长的组分。
(6)鼠源抗tgfβ1、2及3(单克隆小鼠igg克隆#1011，生物测试有限公司，卡法萨巴，以色列，目录编号：mar1835)。
(7)血管紧张素转换酶(ace)人类重组体(生物测试有限公司，卡法萨巴，以色列，目录编号：929-znace/cd143)，所述酶是一体细胞形式的蛋白酶清除肽受质，包括：多个蛋白聚糖(pg)的核心蛋白。
细胞培养：衍生自多个星形胶质细胞的人类脑细胞的星形胶质细胞的培养(u-87mg，
(1)未经处理的对照组；
(2)2个被活化的对照组[单独以bt2-camp(1毫摩尔浓度)或与茶碱(0.25毫摩尔浓度)组合来活化的多个星形胶质细胞]；及
(3)8个被活化及以不同的抗神经胶质增生剂处理(即用bt2-camp(1毫摩尔浓度)及茶碱(0.25毫摩尔浓度)+所示的抗神经胶质增生剂来活化的多个星形胶质细胞)。
所述多个抗神经胶质增生剂的添加如下：软骨素酶abc(0.2单位/毫升(u/ml))、胶原酶(2毫克(mg)，50微升)、β-d-木糖苷(2.5毫摩尔浓度，20微升)、mmps-3(0.5微克，20毫升))、抗tgfβ1、2及3(10微克，20微升)、丝裂霉素c(50微克，25微升)、ace人类重组体(0.5微克、25微升)及抗-nogoa(5单位，25微升)。每个处理中的1个孔板在37±10℃，5％co2下温育48±1小时，然后通过形态评量及计数。为了从所述多个细胞(细胞内及细胞周围)及所述培养基中分离及定量出多个35s-gag分子，每个处理中的额外3个孔板加入20微居里(μci)放射性35s-放射性核苷酸[一种通过放射性来标记所述多个聚集的生物合成的gag分子的无载体硫酸盐(35s-gag)，新英格兰核电站，由珀金-埃尔默目录编号nex041h表示，比活度(specificactivity)：1050至1600居里/毫摩尔浓度(ci/mm)]并且温育48小时。如weintstein等人所述进行35s-gag分离(《结缔组织研究》(connecttissueres)2012；53(2):169至79)。
多个结果：
为了检查多个抗神经胶质增生剂对于多个活化的星形胶质细胞的活性，通过bt2-camp及茶碱活化多个星形胶质细胞的多个体外培养物，并用多个抗神经胶质增生剂处理。所述多个星形胶质细胞活化剂，尤其是茶碱，使所述培养物中的多个星形胶质细胞的数量显著地减少至15.9％，而所述bt2-camp则导致较轻微地减少至32.8％(表3)。如下表3中所示，添加到所述多个被活化的星形胶质细胞培养物中的大多数抗神经胶质增生剂从所述活化诱导的细胞凋亡中拯救了所述多个星形胶质细胞。
表3：多个抗神经胶质增生试剂对于多个星形胶质细胞的存活的体外作用。
*相对于多个未处理的培养物，在多个星形胶质细胞的培养物中的细胞百分比。
多个星形胶质细胞的活化导致多个培养物中的糖胺聚糖(gag)的聚集，包括在细胞内、细胞周围及细胞外。因此，多个gag可以作为一种形成或消除所述瘢痕屏障的示踪剂。
如上所述(表3)，以bt2-camp及茶碱活化48小时，使细胞存活量分别显著地降低至32.8％及15.9％。因此，为了观察与bt2-camp及茶碱一起温育的所述抗胶粘剂的实际效果，在以bt2-camp及茶碱培养48小时后，根据多个活细胞存活者的数量将所述被分离的35s-gag标准化。因此，所述茶碱的孔及所述所有处理的孔的所述分离了35s-gag的分子数量以倍数增加了6倍。总结在以下的表4中的多个结果显示，8种测试试剂中的5种能够减少所述多个活化的星形胶质细胞培养物中多个聚集的gag的程度。在减少多个gag聚集的最有效的抗神经胶质细胞增生剂为软骨素酶abc，相对于茶碱对照组，将35s-gag的聚集降低至5.5％；其次是抗nogoa(15.3％)、抗tgfβ1、2及3(19.8％)、丝裂霉素c(20.2％)及ace人类重组体(22.9％)。
表4：多个抗神经胶质增生剂对gag聚集的体外作用。
*相对于bt2-camp及茶碱控制组中的活细胞存活者的数量来计算多个细胞中的所述分离的多个35s-gag。
**相对于所述茶碱对照组，多个星形胶质细胞的多个培养物中的多个gag的百分比。
示例2：
agrg对多个神经元细胞存活的多个体外影响：
多个材料及多个方法：
多个化学物质：如以上的示例1中所述的多个抗神经胶质增生剂。
引导再生凝胶(grg)及抗神经胶质增生的引导再生凝胶(agrg)：如国际专利申请公开号wo2009/022339中所公开的，产生含有所述抗氧化剂钠歧化酶及一层粘连蛋白肽(ksikvavrsyigsrcv，seqidno：1)的透明质酸基水凝胶，在本说明书中表示为引导再生凝胶(grg)。简而言之，例如：从以下三个组分制备一个0.02％的grg：
1.透明质酸(ha)：将1个注射器的1％透明质酸(ha)的2毫升的凝胶在pbs(1：1w/w)(生物技术运输，以色列生物技术有限公司，以色列)加入到一50毫升的管体中。
2.层粘连蛋白肽：模拟层粘连蛋白的十六个合成胺基酸(seqidno：1)，其中含有两个细胞生物活性五肽：ikvav及yigsr，ikvav为负责促进神经元生长(seqidno：2)的层粘连蛋白的表位，而yigsr为负责促进细胞受质粘附的层粘连蛋白(seqidno：3)的表位，获取ln，中中国肽有限公司国际市场部，中国。所述层粘连蛋白肽以50微克溶解于1毫升的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的浓度来使用，并通过0.45微米的滤纸过滤。将1毫升的ln肽的过滤溶液加入到含有所述ha的50毫升的管体中，全部都在多个无菌条件下进行。
3.超氧化物歧化酶(sod)：将20微克sod人类重组体(默克密理博水银公司，以色列)溶解于1毫升的pbs中。
然后，将1毫升的无菌过滤的lm、1毫克无菌sod溶液、0.2毫升透明质酸及2.8毫升pbs混合，直至得到浓度为0.02％的5毫升的grg。将所述grg保持在2至4℃，形成均匀的透明凝胶。
抗神经胶质增生的引导再生凝胶(agrg)是一种由grg及多个抗神经胶质增生剂的一组合所组成的水凝胶。多种agrg是通过将多个相应的抗神经胶质增生剂加入到一grg中并混合来产生。将所述agrg保持在2至4℃直至使用。使用一移液管向5mlgrg0.02％添加以下的多个抗胶质增生剂：将所述软骨素酶abc(5单位/毫升的储备浓度)以1:50(10微升)稀释在用于agrg1、agrg4及最后一组的细胞分析培养基中，所述丝裂霉素c(2毫克/毫升的储备浓度以1:80(6.25微升)稀释在用于agrg2、agrg4及最后一组的细胞分析培养基中，所述抗人nogo(100μg/ml储备浓度)以1:40(12.5微升)稀释用于agrg3、agrg4及最后一组的细胞分析培养基中。
细胞培养：来自于转移部位：骨髓的人类脑细胞的多个神经元的培养(神经母细胞瘤，sk-n-sh(
(1)多个未处理的细胞，
(2)grg0.02％，
(3)软骨素酶abc+grg0.02％(在本说明书中表示为agrg1)，
(4)丝裂霉素c+grg0.02％(在本说明书中表示为agrg2)，
(5)抗人类nogoa+grg0.02％(在本说明书中表示为agrg3)，
(6)软骨素酶abc+丝裂霉素c+抗人类nogoa+grg0.02％(在本说明书中表示为agrg4)及
(7)软骨素酶abc+丝裂霉素c+抗人类nogo。
对每一处理组分析三重覆。
在37±1℃，5％co2下温育48±1小时后，对每个处理组中的多个细胞进行计数，并且拍摄所述剩余的重复以及根据制造商的多个指示，通过bca蛋白质测定法(赛默飞世尔科技，目录编号：23225)进行蛋白质测定。
多个结果：
为了在体外检查各种agrg组合对神经元细胞的活性，用包含grg及软骨素酶abc、抗-nogoa或丝裂霉素c中的一者的agrg或具有软骨素酶abc、抗nogoa及丝裂霉素c的grg处理多个神经元培养物；并与对照组培养物(多个未处理细胞、单独以grg处理的多个细胞、或以三种抗神经胶质增生剂处理的多个细胞)进行比较。
如图1所示并总结于以下的表5中，加入agrg3(grg+抗nogoa)显著地增加所述培养物中的多个神经元细胞的数量，而以grg、三种抗神经胶质增生剂的组合及其他agrg组合的治疗减少了多个细胞的数量。以agrg2及所述三种抗神经胶质增生剂的组合的多个结果示出了所述抗神经胶质增生剂丝裂霉素c对多个神经元细胞具有高度的毒性，尽管它对多个活化的星形胶质细胞具有一强烈的抗神经胶质增生的影响(如以上的示例1中所示)。
表5：agrg对多个神经元细胞的存活的体外作用。
*相对于多个未处理的细胞培养物，多个神经元培养物中的细胞百分比。
蛋白质含量可以示出多个细胞的状况，因为通常地高的蛋白质含量表示一更好的状况。因此，为了进一步检查细胞质量，进行以上的培养物的蛋白质浓度分析。如下表6所示，与所述未处理的对照组相比，agrg3处理后的蛋白质含量为88.07％，而agrg2处理后的蛋白质含量非常少。令人惊讶的是，与所有其他的处理相比，agrg1处理后的蛋白质含量最高(97.14％)，而多个细胞的数量减少至61％(以上的表6)；示出了软骨素酶abc为所述agrg的一额外的抗神经胶质增生的候选物。
总结，在所述多个星形胶质细胞培养分析(示例1，软骨素酶abc、抗-nogoa及丝裂霉素c)中发现的三种最有效的抗神经胶质增生剂中，抗nogoa是最有希望与grg联合的抗神经胶质增生剂。
表6：agrg对多个神经元细胞的蛋白质含量的体外影响
*相对于多个未处理的细胞培养物，多个神经元培养物中的蛋白质百分比。
示例3：
与grg或多个抗神经胶质增生剂的比较，agrg对多个星形胶质细胞及多个神经元细胞的共培养的体外作用：
多个化学物质：如以上的示例1中所述的多个抗神经胶质增生剂。
grg及agrg：如以上的示例2中所述，制备介于0.02％至0.6％之间的各种浓度的grg。
多个星形胶质细胞的细胞培养：如以上的示例1中所述。
多个处理组包括：
神经元细胞培养：如以上的示例2中所述。
多个处理组包括：
(1)多个未处理的细胞，
(2)grg，
(3)抗nogoa，
(4)软骨素酶abc，
(5)包含grg+antinogoa的agrg，
(6)包含grg+软骨素酶abc的agrg，
(7)抗nogoa+软骨素酶abc，
(8)包含grg+抗nogoa+软骨素酶abc的agrg。
结合多个星形胶质细胞及多个神经元细胞的培养：来自星形胶质细胞瘤的人脑细胞的细胞培养物及来自转移部位的人脑细胞：骨髓(u-87mg，
使用以下多个浓度：bt2-camp：1毫摩尔浓度、茶碱：0.25毫摩尔浓度、grg：介于0.02％至0.5％之间的各种浓度、抗nogoa：200微克/毫升的储备液浓度以1:40(12.5微升)稀释于细胞分析培养基中以及软骨素酶abc：5单位/毫升的储液浓度以1:50(10微升)稀释于细胞分析培养基中。将每个处理中的一个孔板在37±10℃，5％co2下温育48小时；并且在温育后评估形态及计数，在每个处理中的额外3个孔板中加入一20微居里放射性35s放射性核苷酸，并如以上的示例1中所述的进行处理。
示例4：
agrg对于神经元再生的多个体内作用：
多个材料及多个方法：
多个化学物质：如以上的示例1中所述的多个抗神经胶质增生剂。
grg及agrg：如以上的示例2中所述，具有以下多个修饰：grg浓度0.4％(1毫升的无菌过滤的lm、1毫升的无菌sod溶液、2毫升的透明质酸及1毫升pbs混合直至得到5毫升的浓度为0.4％的grg、5微升的抗nogoa(200单位、恩科科学服务有限公司、以色列)、4微升的软骨素酶abc(5u，西格玛奥德里奇以色列有限公司，以色列)。
急性完全性脊髓损伤(sci)模型：对每只重量为约250克(gr)的20只斯普拉格-道利(sprague-dawley)大鼠进行操作，并跟踪长达6个月。所有外科手术均使用一高倍显微镜进行。通过一背侧的方式暴露所述脊髓。多个覆盖其上的肌肉收缩，并且去除t7至t8的多个椎板，使用微型剪刀完全横切所述脊髓，去除一2毫米的脊髓区段。根据所述研究开始前产生的一随机化列表，每只动物均被耳朵标记并随机地分配到不同的治疗组中：
1.对照组：患有完全性sci的大鼠，无进一步的治疗。
2.在所述脊髓的所述横切区域植入grg，直接接触两个残余端部的多个边缘。
3.在所述脊髓的所述横切区域植入agrg(grg及抗nogoa)，直接接触两个残余端部的多个边缘。
所述病变的整个区域覆盖着一可生物降解的薄膜(冻结干燥硬膜(lyodura)，雅氏(aesculap))，所述可生物降解的薄膜由所述生物性共聚物组成，通过外科粘合剂(拜欧古陆(bioglue)，跨奥(cryolife))附接，用于将所述多个植入物固定在多个所需位置。最后，关闭并且缝合所述肌肉及皮肤平面。
进行术后动物护理以使不适及疼痛最小化，手术后的前两周被认为是所述多个大鼠存活的最关键因素；因此，在所述手术后的前5天内给予镇痛，其包括多个抗生素及止痛药。此外，在一兽医的帮助下，每天两次帮助所述多个大鼠排尿及排便。将多个动物保持在多个通风的笼子中，其包含无菌木屑及无菌食物。所述多个截瘫大鼠保持在多个独立的笼子中，但是每天1小时在一个大型设施中集合到多个群组中。监测所述大鼠长达6个月，同时监测每组中的几只大鼠1或3个月。在所述多个实验结束时，在全身麻醉下犠牲所述多个动物(每组数量(n)＝3)。
多个电生理测量：术后立即记录每只大鼠的体感诱发电位(ssep)，之后每月一次。通过刺激坐骨神经并且记录放置在所述多个大鼠的多个头皮上的两个记录电极(活动电极及参考电极)来研究所述脊髓的电导率。所述多个电极附着在所述头皮上：一活动电极位于中线上的体感皮层上，而一参比电极位于两只眼睛之间。接地电极被放置在所述刺激的侧部的大腿上。通过一双极刺激电极刺激所述坐骨神经，以3s-1的一速率产生265个持续时间为0.1毫秒(ms)的刺激脉冲，逐渐地增加刺激的强度，直到检测到所述肢体的轻微抽搐。多个诱发电位的出现作为对于在两次连续测试中的刺激的一反应，所述多个诱发电位被认为是阳性。
多个功能测试：根据21分的开放区域的贝托-贝蒂-布雷斯纳汉(basso-beattie-bresnahan，bbb)量表评量多个个体动物的活动能力。没有自发的后肢运动的一评分为0，而评分为21表示一正常的活动力，所述试验是在手术后每7天进行一次。
组织学：犠牲多个大鼠并从所有被测试的大鼠中收集多个脊髓节段，将所述多个样品取自于所述损伤部位的近端及远端，并且在4％多聚甲醛溶液中进行固定。从每个脊髓样品制作三个横截面：近端部分、病变区域及远端部分。修剪所述组织，包埋在石蜡中，进行切片至厚度为约2至3微米，并以胆碱乙酰转移酶(chat，对运动神经元进行染色)或神经丝(nf，对所有神经纤维进行染色)进行染色。使用一荧光显微镜评估所述多个样品，对所述多个神经纤维的数量及所述多个纤维的尺寸进行计数(4微米以下或超过4微米)。
多个结果：
使用一种由grg及抗nogoa所组成的agrg在一完整的脊髓损伤(sci)大鼠模型中评估agrg对神经再生的体内作用，所述多个结果清楚地显示出所述agrg植入到sci的部位处或附近，在所述模型中促进神经再生；并且具体地：
1.改善多个先前瘫痪的肢体的运动：所述agrg组的贝托-贝蒂-布雷斯纳汉(bbb)量表评分在sci后60天达到6分；即所述大鼠能够广泛地移动至少一个或两个关节及轻微移动第三关节，而在所述未治疗的对照组中，所述评分达到0到1之间，而在以grg治疗的大鼠中，评分达到3，仅检测到一轻微的运动(图2a至2c)。
2.促进多个先前瘫痪的肢体的传导性的恢复：在sci后60天开始，所述agrg组明显恢复电导率(体感诱发电位)，而所述未治疗的对照组未发现电导率(图3)。
3.通过所述神经胶质瘢痕屏障促进轴突穿透：神经丝(nf)染色，其对所有神经纤维进行染色，显示出被植入agrg的所述受损的脊髓的所有横切面：近端位置、病变区域及远端位置中的多个神经纤维(图4)，即agrg能够促进轴突发芽穿过所述神经胶质瘢痕。相比之下，一未处理的对照组的大鼠的脊髓的nf染色仅有在所述近端位置及所述远端位置处显示出神经纤维，而在所述病变区域没有发芽。
总结，包含grg及抗nogoa的agrg一方面通过增强轴突生长及发芽，而另一方面通过减少瘢痕屏障并防止其进一步形成，为神经元再生提供了一个最佳的环境。
示例5：
与grg或多个抗神经胶质增生药物相比，agrg对于神经再生的多个体内效应：
多个化学物质：如以上的示例1中所述的多个抗神经胶质增生剂。
grg及agrg：如以上的示例2中所述，制备介于0.02％至0.6％之间的grg的各种浓度。
急性完全性脊髓损伤(sci)模型-如以上的示例4中所述。
多个治疗组包括：
1.对照组：多个完全性sci的大鼠，无需进一步治疗。
2.在所述脊髓的所述横切区域植入grg，直接接触两个残余端部的多个边缘。
3.在所述脊髓的所述横切区域植入agrg(grg及抗nogoa)，直接接触两个残余端部的多个边缘。
4.在所述脊髓的所述横切区域植入agrg(grg及软骨素酶abc)，直接接触两个残余端部的多个边缘。
5.在所述脊髓的所述横切区域植入agrg(grg及软骨素酶abc及抗nogoa)，直接接触两个残余端部的多个边缘。
6.在所述脊髓的所述横切区域植入抗nogoa。
7.在所述脊髓的所述横切区域植入软骨素酶abc。
8.在所述脊髓的所述横切区域植入抗nogoa+软骨素酶abc。
多个电生理测量、多个功能性测试及组织学：如以上的示例4中所述。
示例6：
agrg对于预防神经源性休克及脊髓损伤后的死亡率的多个体内影响：
多个材料及多个方法：
多个化学物质：如以上的示例1中所述的多个抗神经胶质增生剂。
agrg：如以上的示例2中所述，制备一浓度为0.4％的grg。
急性完全性脊髓损伤(sci)模型：如以上的示例4中所述。
多个治疗组包括：
1.对照组：多个完全性sci的大鼠，无需进一步治疗。
2.在所述脊髓的所述横切区域植入agrg(grg及抗nogoa)，直接接触两个残余端部的多个边缘。
3.在所述脊髓的所述横切区域植入agrg(grg及软骨素酶abc)，直接接触两个残余端部的多个边缘。
统计分析：卡方检定被用于评量所述多个治疗组之间的存活率的统计学显著性。
多个结果：
为了评量agrg对于sci后的神经源性休克及发病率的影响，对所述多个大鼠的存活率(在手术后的前7周内，为了组织学评估而犠牲的多个大鼠不列入考量)进行评量。如图5所示，agrg对于脊髓性休克具有一保护作用：所述多个对照组大鼠中的大约一半在最初的72小时内死于脊髓性休克(由所述sci手术程序造成)，而以所述多个agrg中任一种治疗的所述多个大鼠中的约80％的大鼠幸存。总结，包含grg及抗nogoa或软骨素酶abc的agrg降低了被所述sci处理的大鼠的所述死亡率。
虽然本发明已经结合其特定实施例进行了描述，但是显而易见的是，许多备选方案，修饰以及变化对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在涵盖所有落入所述权利要求的精神和范围内的所有这样的备选方案、修饰以及变化。
在本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请以其整体作为参考文献并入本说明书中，其程度如同各独立的出版物、专利或专利申请案被明确地且个别地标示为以引用的方式并入本文中。此外，本申请中任何参考文献的引用或证明不应被解释为承认所述参考文献可作为本发明的现有技术。本申请中标题部分在本文中用于使本说明书容易理解，而不应被解释为必要的限制。
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(在正文中引用的多个额外的参考文献)
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洛奇肯德,希蒙
尼沃,齐维
<120>用于神经损伤的联合治疗
<130>71633
<150>pct/us62/428,621
<151>2016-12-01
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