KLRG1信号传导治疗的制作方法
本发明总体上涉及klrg1信号传导治疗，并且在各个实施方案中更具体地涉及基于klrg1的癌症治疗。
背景
免疫细胞上的免疫检查点信号传导分子的表达对免疫系统调节很重要。检查点分子的共表达可以发生在t细胞以及癌细胞上。t细胞长时间暴露于癌细胞和暴露于已经加工癌抗原的树突细胞会导致它们的免疫效应功能的完全或部分丧失，导致免疫耗竭。因此，抑制检查点分子，如ctla-4和pd-1可以再激活免疫系统并实现有效的肿瘤治疗。已经确定了许多在t细胞以及其它免疫细胞上表达的检查点信号传导分子。但是，基于这些信号传导分子的治疗性开发是有限的，并且仍然有对利用用于医学治疗的免疫检查点信号传导途径的新疗法的需求。
发明概述
本发明至少部分基于杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)可以像许多其他t细胞共抑制受体，如ctla-4、pd-1、lag-3和tim-3一样起到共抑制受体的作用的发现。与在小鼠中和许多先前的研究的教导不同，klrg1在人中是用于免疫治疗，如癌症免疫治疗的有利的靶点。例如，给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂可以破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。因此，本发明具有多种治疗用途。例如，本发明可以用于通过给予有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂治疗癌症。
本发明的优点包括优先靶向cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的能力。本发明的优点包括更高的疗效和降低的副作用。例如，表达klrg1的免疫细胞群比表达ctla-4或pd-1的免疫细胞群更大量地表达细胞毒性分子，因而具有更高疗效的潜力；并且，klrg1是随抗原表达增加、预测更具体的抗原引导的免疫应答的标志物，因此具有降低副作用的潜力。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)拮抗剂，其包括(i)杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，或(ii)抑制klrg1表达的rnai剂。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了编码根据本发明的klrg1拮抗剂的mrna或cdna。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中和klrg1/钙粘素(例如，e-钙粘素)结合并破坏klrg1信号传导，从而激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。结合剂可以与克隆13f12f2、14c2a07、sa231a2、2f1、13a2或rea261中的至少一种交叉竞争(crosscompete)。结合剂可以是人或人源化单克隆抗体、或其结合片段、或抗体模拟物。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗受试者的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的klrg1拮抗剂，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的klrg1拮抗剂。
本发明提供了治疗黑色素瘤的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物。
本发明提供了治疗肺癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物。
本发明提供了治疗胰腺癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物。
本发明提供了治疗胶质瘤的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物。
本发明提供了治疗乳腺癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物。
本发明提供了治疗卵巢癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物。
在各个实施方案中，受试者是哺乳动物，如人。
在各个实施方案中，根据本发明的方法在体内实施(例如，与离体相反)。
在各个实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物。
在各个实施方案中，抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物包括人或人源化抗体。
在各个实施方案中，抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物包括：
a.结合klrg1的全长抗体fab部分；
b.结合e-钙粘素的全长抗体fab部分；
c.结合n-钙粘素的全长抗体fab部分；
d.结合r-钙粘素的全长抗体fab部分；
e.融合蛋白e-钙粘素/fc；
f.融合蛋白r-钙粘素/fc；
g.融合蛋白n-钙粘素/fc；
h.嵌合抗原受体；或
i.多特异性抗体。
在各个实施方案中，结合剂是嵌合抗原受体并且所述嵌合抗原受体包含移植到t细胞上的klrg1抗体的特异性部分。
在各个实施方案中，结合剂是多特异性抗体。多特异性抗体可以包括双特异性或三特异性抗体。
在各个实施方案中，结合剂结合klrg1。
在各个实施方案中，klrg1是人klrg1的胞外域。
在各个实施方案中，结合剂结合klrg1配体。
在各个实施方案中，klrg1配体是人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素。
在各个实施方案，结合剂在klrg1/钙粘素结合位点结合klrg1和/或钙粘素。
在各个实施方案中，受试者患有上皮癌。
在各个实施方案中，受试者患有癌。
在各个实施方案中，受试者患有葡萄膜黑色素瘤、子宫癌、子宫癌肉瘤、甲状腺癌、胸腺瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、直肠腺癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、胰腺癌、卵巢囊腺癌、间皮瘤、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝脏肝细胞癌、肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、结肠腺癌、胆管癌、宫颈癌和/或子宫颈内癌、乳腺浸润性癌、脑低级别胶质瘤、膀胱癌或急性髓性白血病。
在各个实施方案中，受试者患有黑色素瘤。
在各个实施方案中，受试者患有肺癌。
在各个实施方案中，受试者患有胰腺癌。
在各个实施方案中，受试者患有胶质瘤。
在各个实施方案中，受试者患有乳腺癌。
在各个实施方案中，受试者患有卵巢癌。
在各个实施方案中，所述方法还包括给予受试者有效量的检查点调节剂治疗。
在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂和检查点调节剂治疗具有协同作用。
在各个实施方案中，所述方法还包括给予受试者有效量的癌症疫苗治疗。
在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂和癌症疫苗治疗具有协同作用。
在各个实施方案中，本发明可以使用klrg1/配体结合剂和一种或多种另外的活性药物成分(api)的组合。在一些实施方案中，api可以是多核苷酸(包括寡核苷酸)、蛋白质或小分子。api可以包括例如抗癌剂、抗生素药剂、抗病毒剂、抗真菌剂或止痛剂。
在各个实施方案中，所述方法还包括给予受试者有效量的癌症化疗。
在各个实施方案中，所述检查点调节剂治疗包括抗pd-1、抗pd-l1或抗-ctla-4治疗。
在各个实施方案中，所述受试者先前的癌症治疗失败或未响应先前的癌症治疗。
在各个实施方案中，所述受试者的klrg1表达升高。所述klrg1表达升高可以包括cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞上的klrg1表达升高。在各个实施方案中，所述方法还可以包括测试受试者的klrg1表达升高(例如，在开始前和/或在治疗期间)。
在各个实施方案中，所述受试者的钙粘素表达升高(例如，e-钙粘素)。所述钙粘素表达升高可以包括癌细胞上的钙粘素表达升高。在各个实施方案中，所述方法还可以包括测试受试者的钙粘素表达升高(例如，在开始前和/或在治疗期间)。
在各个实施方案中，治疗可以延长受试者的存活。在各个实施方案中，治疗可以避免或减少癌症的进展和/或转移。
在各个实施方案中，通过向受试者提供编码结合剂的mrna给予结合剂。
在各个实施方案中，拮抗剂破坏klrg1信号传导，从而激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。
在各个实施方案中，拮抗剂结合人klrg1的胞外域或结合klrg1配体。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括抗体或抗原结合片段。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括fc-钙粘素融合蛋白。
在各个实施方案中，抗体是单克隆的。
在各个实施方案中，抗体是人的或人源化的。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括阻断klrg1-配体结合或与klrg1-配体结合竞争的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与人和猕猴klrg1的胞外域，或人和猕猴klrg1配体交叉反应的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与(i)klrg1的胞外域的表位或(ii)klrg1配体的表位结合的结合剂，其中所述表位在人和猕猴中至少90％相同。在一个实施方案中，klrg1拮抗剂包括结合于与克隆13f12f2、14c2a07、sa231a2、2f1、13a2或rea261中任一种相同的表位的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与klrg1结合，并且不是克隆13f12f2、14c2a07、sa231a2、2f1、13a2或rea261(或另一种之前描述的抗klrg1抗体)的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与klrg1结合，并且不是小鼠抗体的结合剂。
在各个实施方案中，拮抗剂或结合剂与克隆13f12f2、14c2a07、sa231a2、2f1、13a2或rea261中的至少一种交叉竞争。
在各个实施方案中，拮抗剂，例如结合剂中和klrg1/e-钙粘素结合。
在各个实施方案中，结合剂是人或人源化单克隆抗体或其结合片段，或抗体模拟物。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括rnai剂。rnai剂尤其可以是sirna或mrna。
当参考附图和以下说明时，本发明的技术的这些和其他优点将显而易见。
附图简述
图1显示与辅助t细胞相比，人klrg1在更高比例的细胞毒性t细胞和nk细胞上表达。
图2a和2b显示t细胞上的klrg1的表达随分化增加而升高的进展。
图3显示对各个制药公司公布的用于共抑制受体调节的药物开发计划的概述。
图4a和4b显示与细胞毒性t细胞(cd8+)或nk细胞相比，ctla-4和pd-1在t辅助细胞(cd4+)上更高地或相似地表达，而与cd4+t辅助细胞相比，cd8+t细胞和nk细胞上的krlg1表达更高。
图5显示许多肿瘤类型被表达klrg1的t细胞广泛浸润，和klrg1配体e-钙粘素在这些肿瘤样品中的表达。
图6a和6b显示免疫的小鼠对klrg1的血清反应。
图7显示源自杂交瘤克隆的抗体与人klrg1胞外域的结合。
图8显示对基因表达数据集的分析证明与cd4+t辅助细胞相比，klrg1在cd8+细胞中的表达更高。
图9a和9b显示如细胞毒性分子颗粒酶和细胞因子的基因表达所反映的，cd8+t细胞的细胞毒性潜力与klrg1的表达高度相关，但不与其它检查点抑制剂靶点共抑制受体的表达相关。
图10显示e-钙粘素在各种癌细胞系中过表达。
图11显示与正常皮肤组织相比，黑色素瘤tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。
图12显示与正常肺组织相比，肺癌tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。
图13显示与正常胰腺组织相比，胰腺癌tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。
图14显示与正常脑组织相比，胶质瘤tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。
图15显示与正常乳腺组织相比，乳腺癌tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。
图16显示与正常卵巢组织相比，卵巢癌tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。
图17a-d显示大比例的黑色素瘤浸润性t细胞，包括pd-1阴性t细胞表达klrg1。图17a显示表达klrg1或pd-1的浸润性cd8+t细胞的比例的比较。图17b显示表达klrg1的pd-1阴性cd8+t细胞的比例。图17c显示表达klrg1的pd-1阴性cd8+t细胞的比例，由17名黑色素瘤患者样品中的每一种组织而成(例如p53为来自geo数据库中的数据集gse72056的患者53)。图17d显示单一cd8+t细胞的klrg1表达水平(每百万的转录物数的log2)，由每种患者样品组织而成。
图18a-d显示与pd-1配体pd-l1和pd-l2相比，恶性黑色素瘤细胞表达的klrg1配体e-钙粘素和n-钙粘素高得多。图18a显示1184名患者活组织检查黑色素瘤细胞中的klrg1和pd-1配体表达的单细胞rna-seq分析表明，与pd-l1和pd-l2相比，e-钙粘素和n-钙粘素表达明显更高。显示了平均值和sem。图18b显示的十四名黑色素瘤患者样品显示表达e-钙粘素或n-钙粘素的黑色素瘤细胞的平均值为76％，相比之下表达pd-l1或pd-l2的为11％。图18c和18d显示单一黑色素瘤细胞(1184个细胞)的e-钙粘素的表达水平(每百万的转录物数“tpm”的log2)(图18c)，由每种大大超过pd-l1的表达水平的患者样品组织而成(图18d)。
图19显示癌组织和正常的匹配组织的e-钙粘素和pd-l1的相对表达的对比的概述。
图20显示示例性患者中的klrg1+细胞浸润黑色素瘤肿瘤。
图21显示示例性患者中的klrg1+细胞浸润肾细胞癌肿瘤。
图22显示示例性患者中的klrg1+细胞浸润非小细胞肺癌肿瘤。
图23呈现与板包被的hklrg1结合的可溶性he-钙粘素的结果。
图24呈现测试三种嵌合抗体中和he-钙粘素/hklrg1结合的结果，其中仅一种嵌合抗体显示中和活性。
图25呈现与板包被的klrg1以剂量依赖性方式结合的三种嵌合抗体的结果。
虽然本发明包括多种形式的实施方案，但仅有几个具体实施方案显示在附图中并且将在本申请中详细描述，应理解本申请的公开内容将被认为是技术原理的范例，并且不意欲将本发明限制到所说明的实施方案。
序列简述
seqidno:1为人klrg1ecd同种型1的序列。
seqidno:2为人klrg1ecd同种型2的序列。
seqidno:3为猕猴klrg1ecd的序列。
seqidno:4为人e-钙粘素的序列。
seqidno:5为人n-钙粘素的序列。
seqidno:6为人r-钙粘素的序列。
seqidno:7为人klrg1mrna的序列。
详述
本发明至少部分基于klrg1可以像许多其他t细胞共抑制受体，如ctla-4、pd-1、lag-3和tim-3一样起到共抑制受体的作用的发现。与小鼠中和许多先前的研究的教导不同，klrg1在人中是有利的用于免疫治疗(例如，癌症免疫治疗)的靶点。例如，给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂可以破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。因此，本发明具有许多治疗用途。例如，本发明可以通过给予治疗有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂用于治疗癌症。
本发明的优点包括优先靶向cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的能力。本发明的优点包括更高的疗效和降低的副作用。例如，表达klrg1的免疫细胞群比表达ctla-4或pd-1的免疫细胞群更大量地表达细胞毒性分子，因而具有更高疗效的潜力；并且，klrg1是随抗原经历增加、预测更具体的抗原引导的免疫应答的标志物，因此具有降低副作用的潜力。
因此，在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗受试者的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)拮抗剂，其包含(i)杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，或(ii)抑制klrg1表达的rnai剂。本发明还提供了编码根据本发明的klrg1拮抗剂的mrna或cdna。本发明还提供了治疗受试者的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的klrg1拮抗剂，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。本发明还提供了治疗癌症的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的klrg1拮抗剂。
本发明的各个特征，如klrg1及其配体、结合剂、组合疗法、治疗和给予、癌症和说明性的实例依次在下文讨论。
杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)及其配体
杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)是调节t细胞和nk细胞的活性的ii型跨膜蛋白表面共抑制受体。其细胞外部分包含c型凝集素结构域，其已知的配体是钙粘素，并且其细胞内部分包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结构域，负责t细胞受体(tcr)介导的信号传导的共抑制(tessmer等，2007)。在各个实施方案中，配体可以是e-钙粘素、n-钙粘素、r-钙粘素、或其组合。
与人相比，klrg1在啮齿动物中的分布和功能有所区别。klrg1最初是在啮齿动物肥大细胞系上鉴定的(guthmann等，1995)，在人肥大细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞或中性粒细胞上不表达(voehringer等，2002)。人klrg1是比小鼠klrg1更强效的共抑制受体。用人淋巴细胞仅观察到生理条件下klrg1介导的抑制，因为klrg1二聚体比单体具有更强的效力，并且人klrg1仅仅形成二聚体，而小鼠klrg1作为单体和二聚体存在(hofmann等，2012)。
人的klrg1表达局限于t细胞和nk细胞。与辅助t细胞相比，其以更高的比例在细胞毒性t细胞和nk细胞上表达(图1，淋巴细胞子集的klrg1表达，人血流式细胞术)。具体地，图1显示klrg1在细胞毒性cd8+t细胞和nk细胞上的表达比在cd4+辅助细胞上更高。在cd8+细胞毒性t细胞群中，klrg1表达增加与抗原特异性效力增加相关(图2a和b)。具体地，图2显示t细胞上的klrg1的表达随分化增加而增加。图2a(cd8+t细胞子集的细胞毒性和细胞因子，人血基因表达)显示t细胞的细胞毒性潜力从tn→tcm→tem→temra增加。图2b(通过流式细胞术得到的人血cd8+亚群的klrg1+cd6+t细胞的百分比)显示klrg1表达从tn→tcm→tem→temra增加。当cd8+细胞毒性t细胞响应抗原分化时，从初始t细胞到中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞和效应记忆ra细胞，它们表达的klrg1的量增加。因此，klrg1使细胞具有高细胞毒性杀伤能力的特征。这种细胞毒性可能是不希望的(在自身免疫疾病和移植排斥的情况下)或希望的(在癌症或慢性感染性疾病的情况下)。
由于klrg1在人中的功能与klrg1在小鼠中的功能差别很大，小鼠的数据对于人疾病的治疗的适用性是有限的。然而，几乎完全没有公开的人疾病的klrg1的平移数据。没有公开的通过免疫组织化学对任何人患病的或健康的组织样品中klrg1表达的研究。有4项公开的包含关于通过流式细胞术对人患病的组织样品，但不是外周血单核细胞(pbmc)中klrg1表达的少量数据的研究：肝细胞癌(brunner等，2015)和肾细胞癌(attig等，2009)中的肿瘤浸润性淋巴细胞；黑色素瘤中的肿瘤浸润的淋巴结(legat等，2013)；以及类风湿性关节炎和脊柱关节病中的滑膜t细胞(melis等，2014)。约5项公开的研究包含少量关于患病的pbmc中klrg1表达的数据。
klrg1是像许多其他t细胞共抑制受体一样的共抑制受体，因此可以与ctla-4、pd-1、lag-3和tim-3相比较。而这些后面的共抑制受体已经被认为是t细胞耗竭的标志(blackburn等，2009)，其中两个(ctla-4和pd-1)通过免疫治疗成功地以癌症治疗为目标(mahoney等，2015)，klrg1尚未被认为是耗竭的标志，而是作为免疫衰老的标志(akbar和henson，2011；apetoh等，2015)。作为免疫衰老的标志，klrg1已经被视为不适宜的用于免疫治疗的靶点(akbar和henson，2011)。
作为小鼠生物学研究的结果，已经形成了很多关于ctla-4和pd-1作为用于免疫治疗的有利的靶点的科学和关注。对ctla-4敲除小鼠具有致命的自发的系统性自身免疫性的证实推动了靶向该途径以产生癌症自身免疫性的关注(tivol等，1995)。类似地，对pd-1敲除小鼠具有自发的自身免疫性的证实关注对pd-1的活性，目标是人治疗潜力(nishimura等，1999)。
相反地，小鼠的klrg1表达已经被确定为与pd-1的表达呈负相关(blackburn等，2009)。与ctla-4和pd-1敲除小鼠不同，klrg1敲除小鼠不表现出自发的自身免疫性(grundemann等，2010)。而现有的多家制药企业主导的临床开发计划大多数针对其他共抑制t细胞受体(图3，制药公司用于共抑制受体调节的药物开发计划。灰色方块显示存在公共领域计划)，在公共领域中针对klrg1的药物开发计划目前是未知的。
而且，尽管klrg1+t被表征为衰老的并且被视为不利于以癌症免疫治疗为目标，但它们可以在用其配体调节klrg1受体之后增殖(henson等，2009；henson等，2012；shi等，2014)。尽管不存在klrg1敲除小鼠的自发的自身免疫表型，但是这些小鼠确实在结核分支杆菌感染后表现出存活延长，表明在缺乏klrg1的情况下提高的免疫性(cyktor等，2013)。
免疫-肿瘤学治疗的目标是激活被抑制的cd8+细胞毒性t细胞和nk细胞。现有的fda批准的药物靶向ctla-4和pd-1。与细胞毒性t细胞(cd8+)或nk细胞相比，这些分子在t辅助细胞(cd4+)上的表达更高或类似，而krlg1在cd8+t细胞和nk细胞上的表达比cd4+t辅助细胞更高(图4a和b)。图4a(淋巴细胞子集的检查点表达，人血流式细胞术)表明淋巴细胞子集上的klrg1表达与ctla-4和pd-1相比成比例地升高。图4b(流式细胞术获得的人血cd8+亚群的细胞的百分比)显示与ctla-4或pd-1相比，klrg1在更高比例的淋巴细胞上表达，并且从tn→tcm→tem→temra升高，而pd-1和ctla-4表达从tem→temra降低。因此，本发明的一个优点是优先靶向cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。另一个优点是对cd8+细胞毒性t细胞和nk细胞的最有效(即具有最强的细胞毒性潜力)的亚群的靶向。
利用这些新的认识，对之前未分析的数据的进一步分析证明了许多肿瘤类型被表达klrg1的t细胞的普遍浸润和klrg1配体e-钙粘素在这些肿瘤样品中的表达(图5，还参见以下实施例3和4)。在许多肿瘤中，e-钙粘素的表达远高于pd-1配体pd-l1的表达。
在各个方面和实施方案中，klrg1是人或猕猴klrg1，优选为人klrg1，包括其任何功能性部分。例如，klrg1可以是人klrg1-ecd同种型1(seqidno:1)，包括其任何功能性部分。
在各个方面和实施方案中，klrg1是人klrg1-ecd同种型(seqidno:2)，包括其任何功能性部分。
在各个方面和实施方案中，klrg1是猕猴klrg1(seqidno:3)，包括其任何功能性部分。
在各个方面和实施方案中，klrg1配体是钙粘素，优选为人钙粘素，包括其任何功能性部分。
在各个方面和实施方案中，klrg1配体是人e-钙粘素(seqidno:4)，包括其任何功能性部分。
在各个方面和实施方案中，klrg1配体是人n-钙粘素(seqidno:5)，包括其任何功能性部分。
在各个方面和实施方案中，klrg1配体是人r-钙粘素(seqidno:6)，包括其任何功能性部分。
在一些实施方案中，结合剂靶向klrg1序列中涉及结合钙粘素的氨基酸。例如，在一个实施方案中，结合剂分别结合seqidno:1和seqidno:2的(157)nsfvq(162)和/或(172)qasscev(178)。
拮抗剂、结合剂
在各个方面和实施方案中，杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)拮抗剂包含(i)杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合结合剂，或(ii)抑制klrg1表达的rnai剂。在各个方面和实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物。通常，拮抗剂破坏klrg1信号传导，从而实现治疗作用(例如，通过激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞)。在各个实施方案中，拮抗剂结合人klrg1的胞外域或结合klrg1配体(例如，由此破坏klrg1信号传导)。
术语“抗体”以最宽泛的意义使用，并且具体地涵盖例如单一的抗klrg1或抗klrg1配体单克隆抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”是指由基本上同质的抗体群获得的抗体，例如除了可能以少量存在的可能的自然发生的突变以外，组成群的单一抗体是相同的。抗体可以是单克隆的。抗体可以是人或人源化抗体。
“抗体片段”可以包括完整抗体的一部分，优选为完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“fv”包括包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密的、非共价连接的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。在该构型中，每一可变域的三个cdr相互作用以在vh-vl二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个cdr共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，即使单个可变域(或仅包含三个对抗原具有特异性的cdr的fv的一半)也有识别和结合抗原的能力，但是比完整的结合位点的亲和力低。fab片段也包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。fab片段通过在重链ch1结构域的羧基末端添加几个残基而区别于fab'片段，所述重链ch1结构域包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab'-sh在本申请中代表其中恒定域的半胱氨酸残基(多个半胱氨酸残基)带有游离的巯基的fab'。f(ab')2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的fab'片段对而产生的。其它的抗体片段的化学偶联也是已知的。
根据免疫球蛋白重链的恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的类别。有五种主要的免疫球蛋白类别：iga、igd、ige、igg和igm，这些中的几种可以进一步分为子类别(同种型)，例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。“单链fv”或“sfv”抗体片段包含抗体的vh结构域和vl结构域，其中这些结构域以单多肽链存在。优选地，fv多肽进一步包含vh结构域和vl结构域之间的多肽接头，其使得sfv形成希望的用于抗原结合的结构。
在各个实施方案中，抗体或其抗原结合片段、或抗体模拟物包括人或人源化抗体。非人(例如，鼠)抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(cdr)的残基被来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠或兔的cdr的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架残基被对应的非人残基替代。人源化抗体也可以包含在受体抗体中、在输入的cdr或框架序列中均不存在的残基。通常，人源化抗体可以包含至少一个，通常是两个可变域的基本上全部，在所述可变域中，cdr区的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的cdr区，并且fr区的全部或基本上全部是人免疫球蛋白共有序列的fr区。用于人源化非人抗体的方法是本领域中熟知的。
例如，也可以使用本领域已知的选择和/或突变方法使结合剂成为亲和力成熟的。通常，“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个高可变区中具有一种或多种变化，导致抗体对抗原的亲和力相对于不具有这些变化(多种变化)的亲本抗体改善的抗体。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至是皮摩尔的亲和力。优选的亲和力成熟的抗体具有比由其制备成熟的抗体的起始抗体(通常为鼠、人源化的或人的)高5倍、更优选10倍、甚至更优选20或30倍的亲和力。
与特定的多肽或特定的多肽上的表位“结合”、与特定的多肽或特定的多肽上的表位“特异性结合”或对特定的多肽或特定的多肽上的表位“有特异性”的抗体是与特定的多肽或特定的多肽上的表位结合，而基本上不与任何其它多肽或多肽表位结合的抗体。因此，klrg1/配体结合剂包括根据本发明的抗klrg1/配体抗体的功能等同物。klrg1/配体结合剂可以是与klrg1(例如，人klrg1)结合或特异性结合的结合剂。在一些情况下，klrg1/配体结合剂可以与各种类似的klrg1蛋白(例如，以对一种hlrg1，如人hlrg1的最高亲和力和对其他的hlrg1，如小鼠klrg1的较低亲和力)交叉反应。klrg1/配体结合剂可以是与klrg1配体结合或特异性结合的结合剂。再者，klrg1/配体结合剂可以是与一种klrg1配体结合或特异性结合，或者在一些情况下与多于一种的klrg1配体(例如，一种或多种人钙粘素)交叉反应的结合剂。
在各个实施方案中，结合剂是阻断或拮抗结合剂。“阻断”或“拮抗”意味着药剂(例如，抗体或其结合片段/模拟物)是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的药剂。某些阻断剂或拮抗剂基本上或完全地抑制抗原的生物活性。例如，klrg1/配体结合剂可以阻断klrg1信号传导(例如，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞)。实施例21提供了一个用于确定和/或表征具有中和活性抗体的示例性方法。
在各个实施方案中，抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物包括：
a.结合klrg1的全长抗体fab部分；
b.结合e-钙粘素的全长抗体fab部分；
c.结合n-钙粘素的全长抗体fab部分；
d.结合r-钙粘素的全长抗体fab部分；
e.融合蛋白e-钙粘素/fc；
f.融合蛋白r-钙粘素/fc；
g.融合蛋白n-钙粘素/fc；
h.嵌合抗原受体；或
i.多特异性抗体。
在各个实施方案中，结合剂是嵌合抗原受体，并且所述嵌合抗原受体包含移植到t细胞上的klrg1抗体的特异性部分。
在各个实施方案中，结合剂是多特异性抗体。多特异性抗体可以包含双特异性和三特异性抗体。
在各个实施方案中，结合剂结合klrg1。
在各个实施方案中，klrg1是人klrg1的胞外域。
在各个实施方案中，结合剂结合klrg1配体。
在各个实施方案中，klrg1配体是人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素。
在各个实施方案中，结合剂在klrg1/钙粘素结合位点结合klrg1和/或钙粘素。
在各个实施方案中，结合剂不是现有技术的抗体。已知的抗klrg1抗体包括：克隆13f12f2(ebioscience)，其为与胞外域结合并且已经在流式细胞术中证实了对人细胞的反应性的小鼠抗人klrg1抗体；克隆14c2a07(biolegend)和sa231a2(biolegend)，其被报道为抗人klrg1抗体；和克隆2f1，其为仓鼠抗小鼠klrg1抗体，其被一些销售商(例如，biolegend)报道为对人有反应性，而其他销售商(例如，abcam)仅报道了对小鼠的反应性。这些抗体的测试没有证实对人klrg1的反应性。据称克隆13a2(ebioscience)结合与克隆13f12f2类似的表位。克隆rea261(miltenyibiotec)也被报道结合人klrg1(结合未被验证)。销售商描述了已知的抗e-钙粘素抗体，包括以下实例：克隆67a4、克隆mb2和克隆hecd1(均由abcam销售)；ebioscience销售的decma1；和bdbiosciences销售的克隆36/e-钙粘素。在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与klrg1结合并且不是克隆13f12f2、14c2a07、sa231a2、2f1、13a2或rea261(或其它先前描述的抗klrg1抗体)的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂可以通过向受试者提供编码结合剂的mrna给予。这种mrna方法正在由modernatherapeutics等开发。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括阻断klrg1-配体结合或与klrg1-配体结合竞争的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与人和猕猴klrg1的胞外域，或人和猕猴klrg1配体交叉反应的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与(i)klrg1的胞外域的表位，或(ii)klrg1配体的表位结合的结合剂，其中所述表位在人和猕猴中至少90％相同。在一个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与克隆13f12f2、14c2a07、sa231a2、2f1、13a2或rea261中任一个相同的表位结合的结合剂。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括与klrg1结合并且不是小鼠抗体的结合剂。
在各个实施方案中，拮抗剂中和klrg1/e-钙粘素结合。
在各个实施方案中，本发明提供了杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，所述结合剂中和klrg1/钙粘素(例如，e-钙粘素)的结合并且破坏klrg1信号传导，从而激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。
在各个实施方案中，拮抗剂或结合剂与克隆13f12f2、14c2a07、sa231a2、2f1、13a2或rea261中的至少一种交叉竞争。
在各个实施方案中，结合剂是人或人源化单克隆抗体，或其结合片段。
在各个实施方案中，klrg1拮抗剂包括rnai剂。rnai剂可以尤其是sirna或mrna。
像抗体(及其等同物)一样，可以应用于本发明的rnai剂是本领域中已知的。简言之，rna干扰(rnai)是其中rna分子通常通过使特定mrna分子破坏而抑制基因表达的生物过程。现在已知rnai为精确的、有效的、稳定的并且比用于基因抑制的反义技术更好。两类小核糖核酸(rna)分子–微小核糖核酸(mirna)和小干扰rna(sirna)–是rna干扰的核心。rna是基因的直接产物，并且这些小rna可以与其它特异性信使rna(mrna)分子结合，或者例如通过避免mrna产生蛋白提高或降低它们的活性。但是，本发明不必然局限于sirna和mrna。
检查点调节剂治疗
在各个实施方案中，所述方法还包括给予受试者有效量的检查点调节剂治疗。本文使用的术语“检查点调节剂治疗”包括通过调节免疫系统功能而具有疗效(例如，用于治疗癌症)的药剂。免疫检查点可以是刺激性的或抑制性的。检查点治疗可以阻断抑制性检查点(例如，当被癌症利用以逃避免疫系统)，恢复免疫系统功能。被批准的和市售的检查点调节剂治疗的实例包括派姆单抗(pembrolizumab，
检查点调节剂治疗和klrg1/配体结合剂可以基本上同时(例如，同时地、在同一天内、在相同的治疗过程中)或在检查点调节剂治疗和klrg1/配体结合剂有利地组合以实现理想的效果(例如，有效的治疗、协同作用)的时间段内给予受试者。一些检查点调节剂可以诱导抵消调节剂的效力的klrg1表达；与klrg1组合将恢复它们的效力。在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂和检查点调节剂治疗具有协同作用。协同作用可以定义为具有大于加和(或另外预期的)作用的组合，其可以通过本领域已知的各种方法测定。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是派姆单抗(
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是纳武单抗
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是易普利单抗
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是pf-05082566(pfizer；抗4-1bb激动剂)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是实体瘤或黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是乌瑞鲁单抗(urelumab，bms；抗4-1bb激动剂)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是实体瘤、头颈癌或黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是阿特珠单抗(atezolizumab，roche；抗pd-l1)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是实体瘤、局部晚期或转移性尿路上皮癌或肺癌(例如，非小细胞肺癌)或膀胱癌。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是度伐单抗(durvalumab，medimmune；抗pd-l1)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是实体瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌)或黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是曲美木单抗(tremilimumab，astra-zeneca；抗ctla-4)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是实体瘤、非小细胞肺癌(例如，nsclc)、鳞状细胞癌(例如，头颈部的鳞状细胞癌)、黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)、膀胱癌、胰腺癌、胃癌或肝癌(例如，hcc)。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是bms986016(bms；抗lag-3)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是实体瘤或黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗是mgb453(novartis；抗tim-3)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是实体瘤或黑色素瘤(例如，转移性黑色素瘤)。
虽然有前面的说明性实例，但本领域技术人员将认识到klrg1/配体结合剂可以与其它检查点调节剂治疗组合和/或用于不同的适应症。
癌症疫苗治疗
在各个实施方案中，所述方法还包括给予受试者有效量的癌症疫苗治疗。本文使用的术语“癌症疫苗治疗”包括刺激免疫系统应答用于治疗癌症的药剂。术语“癌症疫苗治疗”不包括针对可能后来引发癌症的病原体的疫苗(例如，预防肝炎但不预防其中肝炎感染是病因因素的随后的肝癌的肝炎疫苗)。批准的和市售的癌症疫苗治疗的实例包括用于前列腺癌的sipuleucel-t
癌症疫苗治疗和klrg1/配体结合剂可以基本上同时(例如，同时地、在同一天内、在相同的治疗过程期间)或在癌症疫苗治疗和klrg1/配体结合剂有利地组合以实现期望的作用(例如，有效的治疗、协同作用)的时间段内给予受试者。在一些实施方案中，抗klrg1治疗实现了对疫苗更有效的t细胞应答。在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂和癌症疫苗治疗具有协同作用。协同作用可以定义为具有大于加和(或另外期望的)作用的组合，其可以通过本领域已知的各种方法测定。
在各个实施方案中，癌症疫苗治疗是sipuleucel-t
在各个实施方案中，癌症疫苗治疗是ino-3112(inovio)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是人乳头状瘤病毒(hpv)促成的癌症(例如，头颈部癌症)。
在各个实施方案中，癌症疫苗治疗是ino-5150(inovio)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是前列腺癌。
在各个实施方案中，癌症疫苗治疗是tpiv200(tapimmune)。不受限制，在这样的实施方案中，癌症可以是卵巢癌。
尽管有前面的说明性实例，但本领域技术人员将认识到klrg1/配体结合剂可以与其它癌症疫苗治疗组合和/或用于不同的适应症。
其它活性药物成分
在各个实施方案中，本发明可以使用klrg1/配体结合剂和一种或多种另外的活性药物成分(api)的组合。因此，本发明可以提高klrg1/配体结合剂的效力和/或降低来自其的不希望的副作用。
在各个实施方案中，所述方法还包括给予受试者有效量的癌症化疗。
在各个实施方案中，检查点调节剂治疗包括抗pd-1、抗pd-l1或抗ctla-4治疗。
在各个实施方案中，受试者先前的癌症治疗失败或不响应先前的癌症治疗。
在各个实施方案中，受试者的klrg1表达升高。klrg1表达升高可以包括cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞上的klrg1表达升高。在各个实施方案中，所述方法还可以包括测试受试者的klrg1表达升高(例如，在开始之前和/或在治疗期间)。
在各个实施方案中，受试者的钙粘素表达升高(例如，e-钙粘素)。钙粘素表达升高可以包括癌细胞上的钙粘素表达升高。在各个实施方案中，所述方法还可以包括测试受试者的钙粘素表达升高(例如，在开始之前和/或在治疗期间)。
在一些实施方案中，api可以是多核苷酸(包括寡核苷酸)、蛋白或小分子。
在一个实施方案中，api是多核苷酸。多核苷酸可以是基因组dna片段、cdna、mrna、ssrna、dsrna、微小rna、sirna、shrna、sdrna、dsirna、lna，以及反义dna或rna。
供选择地，api可以是小分子药物。优选地，分子的分子量为约1500g/mol至约50g/mol。
api包括例如以下中的两种或更多种：抗癌剂、抗生素药剂、抗病毒剂、抗真菌剂或止痛剂。
示例性抗癌剂可以包括但不限于阿西维辛、阿柔比星、阿考达唑、阿美蒽醌、氨鲁米特、氨茴霉素、天冬酰胺酶、阿扎胞苷、阿扎替派、比生群、博来霉素、白消安、放线菌素、卡鲁睾酮、卡醋胺、卡铂、卡非佐米、卡莫司汀、卡柔比星、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、阿糖孢苷、达卡巴嗪、放线菌素d、柔红霉素、地扎胍宁、亚丝醌、多西他赛、阿霉素、依匹哌啶、埃罗替尼、依托泊苷、艾托卜宁(etoprine)、氟尿苷、氟达拉滨、氟脲嘧啶、fluorocitabine、羟基脲、异丙铂、醋酸亮丙瑞林、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、巯嘌呤、甲氨喋呤、氯苯氨啶(metoprine)、mitocromin、米托洁林、丝裂霉素、米托司培、米托蒽醌、霉酚酸、诺考达唑、诺加霉素、奥昔舒仑、紫杉醇、培利霉素、戊氮芥、甲基丝裂霉素、泼尼氮芥、盐酸丙卡巴肼、嘌呤霉素、吡唑呋喃菌素、利波腺苷、司莫司汀、司帕霉素、锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、链脲菌素、他利霉素、替加氟、替尼泊苷、替罗昔隆、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、噻唑呋林(tiazofurin)、磷酸曲西瑞宾(triciribinephosphate)、曲他胺、三甲曲沙、乌拉莫司汀、尿烷亚胺、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春匹定、长春罗定、长春利定、净司他丁和佐柔比星。
示例性的抗生素药剂可以包括但不限于氨基糖苷；阿米卡星；庆大霉素；卡那霉素；新霉素；奈替米星；链霉素(steptomycin)；妥布霉素；安沙霉素类；格尔德霉素；除莠霉素；碳头孢烯；氯碳头孢；碳青霉烯(carbacepenem)；厄他培南；多利培南；亚胺培南/西司他丁；美罗培南；头孢菌素；头孢羟氨苄；头孢唑啉；头孢噻吩(cefalotin)或头孢噻吩(cefalothin)；头孢氨苄；头孢克洛；头孢孟多；头孢西丁；头孢丙烯；头孢呋辛；头孢克肟；头孢地尼；头孢妥仑；头孢哌酮；头孢噻肟；头孢泊肟；头孢他啶；头孢布烯；头孢唑肟；头孢曲松；头孢吡肟；头孢比普；糖肽；替考拉宁；万古霉素；大环内酯类；阿奇霉素；克拉霉素；地红霉素；红霉素(erythromicin)；罗红霉素；三乙酰竹桃霉素；泰利霉素；壮观霉素；单胺菌素；氨曲南；青霉素类；阿莫西林；氨苄西林；阿洛西林；羧苄青霉素；氯唑西林；双氯西林；氟氯西林；美洛西林；甲氧西林；乙氧萘青霉素；苯唑西林；青霉素，哌拉西林，替卡西林；杆菌肽；粘菌素；多粘菌素b；喹诺酮；环丙沙星；依诺沙星；加替沙星；左氧氟沙星；洛美沙星；莫西沙星；诺氟沙星；氧氟沙星；曲伐沙星；磺酰胺；磺胺米隆；百浪多息(旧称)；磺胺醋酰；磺胺甲二唑；磺胺(sufanilimide)(旧称)；柳氮磺胺吡啶；磺胺异噁唑；甲氧苄啶；甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(复方新诺明)(tmp-smx)；四环素；地美环素；强力霉素；米诺环素；土霉素；四环素；胂凡纳明；氯霉素；克林霉素；林可霉素；乙胺丁醇；磷霉素；夫西地酸；呋喃唑酮；异烟肼；利奈唑胺；甲硝唑；莫匹罗星；呋喃妥因(nitrofuantoin)；平板霉素；多粘菌素，吡嗪酰胺(purazinamide)；奎奴普丁/达福普汀；利福平(rifampin)或利福平(rifampicin)；和替硝唑。
在具体的实施方案中，抗癌剂选自柔红霉素、阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、卡铂、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、异丙铂、醋酸亮丙瑞林、卡非佐米和甲氨蝶呤。
示例性抗病毒剂可以包括但不限于缩氨基硫脲；美替沙腙；核苷和/或核苷酸；阿昔洛韦；碘苷；阿糖腺苷；利巴韦林；更昔洛韦；泛昔洛韦；伐昔洛韦；西多福韦；喷昔洛韦；缬更昔洛韦；溴夫定；利巴韦林，环胺类；金刚乙胺；曲金刚胺；膦酸衍生物；膦甲酸盐；膦乙酸盐；蛋白酶抑制剂；沙奎那韦；茚地那韦；利托那韦；奈非那韦；安普那韦；洛匹那韦；夫沙那韦；阿扎那韦；替拉那韦；核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂；齐多夫定；去羟肌苷；扎西他滨；司他夫定；拉米夫定；阿巴卡韦；替诺福韦二吡呋酯；阿德福韦酯；恩曲他滨；恩替卡韦；非核苷转录酶抑制剂；奈韦拉平；地拉韦啶；依法韦伦；神经氨酸酶抑制剂；扎那米韦；奥司他韦；吗啉胍；异丙肌苷；普拉康纳利(pleconaril)；和恩夫韦地。
示例性抗真菌剂可以包括但不限于烯丙胺；特比萘芬；抗代谢物；氟胞嘧啶；唑；氟康唑；伊曲康唑；酮康唑；雷夫康唑(ravuconazole)；泊沙康唑；伏立康唑；葡聚糖合成抑制剂；卡泊芬净；米卡芬净；阿尼芬净；多烯类；两性霉素b；两性霉素b胶体分散体(abcd)；和灰黄霉素。
示例性止痛剂可以包括但不限于阿片衍生物、可待因、哌替啶、美沙酮和吗啡。
药物组合物
在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂被制备成药物组合物，例如用作药物的药物组合物。在各个实施方案中，药物组合物用作癌症治疗剂。在各个实施方案中，药物组合物可以包含一种或多种抗生素、抗病毒剂、抗糖尿病药、抗高血压药、抗真菌剂或止痛剂。
本领域技术人员可以根据已知的方法将klrg1/配体结合剂配制成药物组合物。
药物组合物可以包含载体。本文使用的“载体”可以包括药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其对以所使用的剂量和浓度暴露于其的细胞和受试者是无毒的(或相对无毒的)。生理上可接受的载体通常是ph缓冲水溶液。生理上可接受的载体的实例包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐的平衡离子，如钠离子；和/或非离子表面活性剂，如tweentm、聚乙二醇(peg)和pluronicstm。
在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂包含在可注射制剂中，例如皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射制剂。可注射的制剂可以是水溶液，例如生理上相容的缓冲液，如hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中的水溶液。可注射的制剂可以包含配制剂(formulatoryagent)，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。供选择地，klrg1/配体结合剂可以是干燥的或粉状形式的，用于在使用前用适合的载体，例如无菌无热原的水构成。
治疗和给予、癌症
本发明提供了包括向有其需要的受试者给予根据本文公开的任一方面或实施方案的klrg1/配体结合剂，或根据本文公开的任一方面或实施方案的药物组合物的方法。在各个实施方案中，受试者为人。在各个实施方案中，根据本发明的方法在体内(例如，与离体相反的)实施。本文使用的“治疗”可以指治疗性处理和预防性和防范性措施，其中目的是避免或减缓(减轻)被靶向的病理病症或障碍。需要治疗的人可以包括已经患有障碍的人、倾向于患上障碍的人或要预防障碍的人。
在各个方面和实施方案中，本发明提供了治疗受试者的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，从而破坏klrg1信号传导并且激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞。
本发明提供了治疗癌症的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂。
“给予”和“治疗”当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时可以包括使外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体接触。“给予”和“治疗”包括体内的，以及在一些实施方案中体外的或离体的治疗。
“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指从内部或从外部给予具有一种或多种疾病症状或疑似患有疾病的受试者或患者治疗剂，如包含本发明的任一结合剂的组合物，所述药剂对所述受试者或患者具有治疗活性。通常，药剂以有效量给予，无论通过诱导这样的症状(多种症状)的消退或是抑制这样的症状(多种症状)的进展达到任何临床上可测定的程度，以缓解被治疗的受试者或群体的一种或多种疾病症状。有效缓解任何特定疾病症状的治疗剂的量可以根据如患者的疾病状态、年龄和体重，和药物在受试者中引发希望的应答的能力的因素变化。疾病症状是否已经被缓解可以通过医师或其他有技能的保健提供者使用的任何常用的临床测量来评价，所述临床测量用以评价该症状的严重性或进展状态。
因此，在各个实施方案中，术语“有效量”是使得特定的所述目的实现的klrg1/配体结合剂的浓度或量。klrg1/配体结合剂的“有效量”可以根据经验确定。而且，“治疗有效量”是有效地用于实现所述治疗作用的klrg1/配体结合剂的浓度或量。该量也可以根据经验确定。
本发明提供了治疗黑色素瘤的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物。
本发明提供了治疗肺癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物。
本发明提供了治疗胰腺癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物。
本发明提供了治疗胶质瘤的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物。
本发明提供了治疗乳腺癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物。
本发明提供了治疗卵巢癌的方法，其包括给予有其需要的受试者有效量的杀伤细胞凝集素样受体g1(klrg1)/配体结合剂，其中所述结合剂是结合人klrg1的胞外域和/或人e-钙粘素、n-钙粘素或r-钙粘素，从而破坏klrg1信号传导并激活cd8+细胞毒性t细胞和/或nk细胞的抗体或其抗原结合片段，或抗体模拟物。
更普遍地，本发明提供了用于治疗癌细胞和/或组织，包括受试者的癌症细胞和/或组织的方法。癌症可以由导致器官衰竭的细胞和组织的异常生长所形成的恶性肿瘤引起。
在各个实施方案中，受试者患有上皮癌。
在各个实施方案中，受试者患有癌。
实体瘤可以是除血液、骨髓或淋巴细胞之外的身体组织细胞的异常生长所形成的赘生物(细胞的新生长)或损伤(解剖结构的损害或生理功能的紊乱)。实体瘤由起源于不同组织类型，如黑色素瘤、肺、胰腺、胶质瘤、乳腺或卵巢，并且最初在其细胞来源的器官中生长的细胞的异常团块组成。然而，这样的癌症可以通过疾病晚期的转移性肿瘤生长扩散至其它器官。
被治疗的受试者可以已经被诊断为患有癌症。受试者可以患有局部晚期的、不可切除的或转移性癌症和/或可以是先前的一线治疗失败的。
在各个实施方案中，受试者患有葡萄膜黑色素瘤、子宫癌、子宫癌肉瘤、甲状腺癌、胸腺瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、直肠腺癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、胰腺癌、卵巢囊腺癌、间皮瘤、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝脏肝细胞癌、肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、弥漫型b大细胞淋巴瘤、结肠腺癌、胆管癌、宫颈癌和/或子宫颈内癌、乳腺浸润性癌、脑低级别胶质瘤、膀胱癌或急性髓性白血病。
在各个实施方案中，受试者患有黑色素瘤。
在各个实施方案中，受试者患有肺癌。
在各个实施方案中，受试者患有胰腺癌。
在各个实施方案中，受试者患有胶质瘤
在各个实施方案中，受试者患有乳腺癌。
在各个实施方案中，受试者患有卵巢癌。
在各个实施方案中，klrg1/配体结合剂可以通过向受试者提供编码结合剂的mrna给予。
在各个实施方案中，治疗可以延长受试者的生存。在各个实施方案中，治疗可以避免或减少癌症的进展和/或转移。
以下实施例是说明性的，并非限制性的。在审阅该公开内容后，技术的许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。因此，技术的范围不应参考实施例决定，而是应当参考所附权利要求以及其全部等同方案的范围来确定。
实施例
实施例1：klrg1的抗体
通过用纯化的重组蛋白抗原：人klrg1-ecd同种型1(seqidno:1)、人klrg1-ecd同种型2(seqidno:2)和猕猴klrg1(seqidno:3)免疫小鼠产生结合klrg1的抗体。每两周免疫小鼠并且在第二次和第四次免疫后收集血清用于测试。
图6a显示在免疫的小鼠中对猕猴klrg1的特异性血清应答。图6b显示在免疫的小鼠中对人klrg1的特异性血清应答。通过elisa测定抗klrg1抗体活性。显示通过在小鼠中产生识别人和猕猴klrg1的抗体介导应答。
图7显示从免疫的小鼠分离的9个杂交瘤克隆的剂量依赖性结合曲线。通过首先在免疫吸附96孔板上固定人klrg1(seqidno:2)，接着暴露于剂量依赖性滴度的抗体来进行elisa。通过抗小鼠hrp缀合的检测使结合的抗体可视化。因此，图7显示从免疫的小鼠的脾脏分离的脾细胞能够产生识别klrg1的抗体。
实施例2:klrg1在cd8+和nk细胞中的基因表达比在cd4+t细胞中高，其与cd8+t细胞的细胞毒性潜力相关，并且高于检查点共抑制受体ctla-4和pd-1的基因表达
基因表达数据集的分析证明与cd4+t辅助细胞(相对倍数1.0)相比，cd8+(相对倍数4.0)细胞的klrg1表达更高(图8，人血cd8+t细胞的klrg1基因表达)。响应抗原暴露，cd8+细胞毒性t细胞从初始细胞分化成效力提高的效应细胞，特征在于中枢记忆(tcm)细胞、效应记忆(tem)细胞和效应(temra)细胞。如细胞毒性分子颗粒酶和细胞因子的基因表达所反映的，这些分化子集中的cd8+t细胞的细胞毒性潜力与klrg1的表达高度相关，但与其它检查点抑制剂靶点共抑制受体pd-1和ctla-4不相关(参见图9a，cd8+t细胞子集的细胞毒性和细胞因子、人血基因表达，图9b，cd8+t细胞子集的检查点表达、人血基因表达)。
实施例3：人癌症中klrg1的表达增加
将来自geneexpressionomnibus(geo)和europeanbioinformaticsinstitute(ebi)的微阵列数据汇编、归一化并分析倍数差异和显著性水平。使用的数据集为：e-tabm-40、gse49954、gse26495、gse14926、gse72642、gse58173、gse65010、gse11507；tcga数据(http://cancergenome.nih.gov/)和gtex数据(http://www.gtexportal.org/)。
如通过rnaseq表达所检测的，很多种癌症中的肿瘤浸润淋巴细胞表达klrg1。图5显示与许多癌症类型的肿瘤样品(9755个样品和32种癌症类型)中的pd-1及其配体pd-l1的表达相比，klrg1及其配体e-钙粘素的表达。从左向右列出的癌症类型为葡萄膜黑色素瘤、子宫癌、子宫癌肉瘤、甲状腺癌、胸腺瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、黑色素瘤、肉瘤、直肠腺癌、前列腺癌、嗜铬细胞瘤、胰腺癌、卵巢囊腺癌、间皮瘤、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肝脏肝细胞癌、肾乳头状细胞癌、肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、弥漫型b大细胞淋巴瘤、结肠腺癌、胆管癌、宫颈癌和/或子宫颈内癌、乳腺浸润性癌、脑低级别胶质瘤、膀胱癌和急性髓性白血病。不希望受任何特定理论的约束，这些癌症是用于本发明的特别有希望的靶点，因为已知它们是免疫原性的(例如，黑色素瘤、肺癌、结肠癌、头颈部癌症)。它们的e-钙粘素表达较高表明它们的被klrg1+t细胞和nk细胞免疫攻击的潜在活跃侵袭。因此，这样的癌症是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例4：人癌症中e-钙粘素的表达增加
对通过biogps门户网站获得的国家癌症研究院(nationalcanceinstitute)的nci-60u133a微阵列数据集的分析证明e-钙粘素在多种癌细胞系中过表达(图10显示的微阵列数据分析)。在对thecancergenomeatlas(tcga)rnaseq数据的分析中，肿瘤活组织检查样品中的e-钙粘素的表达一致地比pd-1配体pd-l1的表达高(图5)。因此，肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤和卵巢癌是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例5：结合人klrg1的抗体的产生
与klrg1的细胞外部分结合并且中和其配体e-钙粘素/n-钙粘素/p-钙粘素或与其配体e-钙粘素/n-钙粘素/p-钙粘素竞争的抗体可以通过几种包括但不限于以下的技术产生：小鼠杂交瘤技术、噬菌体展示、酵母展示、retrocyte展示、人源化小鼠技术、核糖体展示。其他的和另外的方法是本领域已知的并且可以就本发明的应用来开发。
例如，小鼠杂交瘤技术可以用于产生与klrg1结合并中和e-钙粘素的结合(或耗尽表达klrg1的细胞)的抗体。可以使用常用于产生抗体的小鼠品系，例如balb/c或sjl品系。可以以2周的间隔用抗原反复注射多只小鼠以产生免疫应答。几种形式的抗原可以单独注射或组合注射，并且添加已知的增强宿主对外来抗原的免疫应答的佐剂，如klh(钥孔戚血蓝蛋白)。抗原可以是纯化的重组klrg1、编码klrg1的cdna、在其表面上表达klrg1的细胞或源自klrg1的序列的肽的形式。
每次给予小鼠抗原后，可以通过elisa滴度监测针对klrg1的免疫应答。可以通过首先在适合的elisa微量滴定板上固定重组klrg1进行elisa。12小时孵育后，可以用磷酸盐水清洗板并用1％bsa的磷酸缓冲盐水溶液封闭。源自免疫的小鼠的血清可以在磷酸缓冲盐水中连续稀释，使之与微量滴定板中的表面结合的抗原相互作用。可以洗去过量的血清并可以使用标准技术，如加入与hrp缀合的抗小鼠抗体使结合量可视化。可以用抗原强化免疫小鼠直到可以在从小鼠取出脾脏时可以在其血清中检测到足够高水平的信号。可以将源自免疫的小鼠的脾细胞与使用本领域中使用的标准方案获得的黑色素瘤(sp2/0)融合。得到的杂交瘤可以表达和分泌抗体，所述抗体可以使用elisa检测与重组klrg1的结合或可以使用facs检测与细胞表达的klrg1的结合。产生具有理想结合特性的抗体的杂交瘤细胞系可以是亚克隆的和测序的抗体的可变区。使用这些小鼠可变区和人恒定区的重组抗体可以通过标准技术产生，并且可以以功能分析(例如，针对结合、中和活性)来评价。
实施例6：用于确定中和人klrg1与e-钙粘素的结合的抗体的分析
klrg1以相对低的亲和力与e-钙粘素结合(测定的kd在200μm的数量级)。由于这样的低结合亲和力，可以使用动态结合分析，例如实施例21中所述的，测定抗体与klrg1结合以与e-钙粘素相互作用竞争的能力。分析可以使用如octet(fortebio,inc.)所测定的动态结合参数，以确定与klrg1相互作用的抗体是否阻止了钙粘素的结合。分析可以通过直接吸附或通过使用亲和标签，如抗his或抗flag将重组klrg1胞外域固定至八隅体(octect)生物传感器。负载的传感器然后可以暴露于包含感兴趣的抗体的溶液，如果仪器还测定到结合，被考察的抗体可以被认为是“结合剂”并且被保留用于进一步研究和开发。否则，抗体可以被认为是“非结合剂”并且被丢弃。
实施例7：抗klrg1中和抗体可以导致离体的人cd8+和nk细胞增殖增加
可以用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记从人pbmc分离的cd8+t细胞和nk细胞，并用板包被的抗cd3(okt3克隆)和辐照的apc刺激。可以在第3天和第6天通过facs测定响应存在的抗klrg1抗体的增殖，所述facs采用csfe染色稀释液监测t细胞和nk细胞的比例。在各个实施方案中，抗klrg1处理的细胞可以以比对照igg处理的细胞更快的速率增殖。
实施例8：抗klrg1中和抗体可以与其它检查点抑制剂，如抗pd-1和抗pd-l1协同作用，导致离体的人cd8+和nk细胞增殖
可以用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(cfse)标记从人pbmc分离的cd8+t细胞和nk细胞，并用板包被的抗cd3(okt3克隆)和辐照的apc刺激。可以在第3天和第6天通过facs测定响应存在的抗pd1抗体或抗pdl1的增殖，所述facs通过csfe染色稀释液监测t细胞和nk细胞的增殖。然后可以进行采用抗klrg1抗体的第二次处理以测定t细胞的进一步扩增。可以在第3天和第6天通过facs测定响应抗klrg1抗体或对照的增殖，所述facs通过csfe染色稀释液监测t细胞和nk细胞的增殖。在各个实施方案中，pd-1/pd-l1阻断后的抗klrg1处理可以导致增殖与单独的抗pd-1或抗pd-l1处理相比进一步增强。
实施例9：抗klrg1中和抗体可以与其它检查点抑制剂，如抗pd-1和抗pd-l1抗体协同作用，导致离体的人cd8+和nk细胞的细胞因子分泌增加
可以从人pbmc分离cd8+t细胞和nk细胞，用板包被的抗cd3(okt3克隆)和辐照的抗原呈递细胞(apc)刺激，并在其它检查点抑制剂，如抗pd1或抗pd-l1或igg对照抗体的存在下用抗klrg1抗体处理。可以在刺激后3天和6天通过elisa或类似的技术测定培养基中促炎症细胞因子，如il2和ifn-γ的分泌。在各个实施方案中，采用抗klrg1与抗pd-1或抗pd-l1的组合的处理可以导致促炎症细胞因子的分泌与用任一种抗体单独处理的细胞相比增加。
实施例10：黑色素瘤
图11显示与来自gtex数据(genotype-tissueexpression,http://www.gtexportal.org/)的正常皮肤组织相比，黑色素瘤tcgarnaseq数据中e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。黑色素瘤中e-钙粘素的表达高(倍数变化0.77)，并且高于pd-l1的表达(倍数变化0.45)。因此，黑色素瘤是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例11：肺癌
图12显示与来自gtex数据的正常肺组织相比，肺癌tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。肺癌中e-钙粘素的表达高(倍数变化0.31)，并且高于pd-l1的表达(倍数变化-0.57)。因此，肺癌是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例12：胰腺癌
图13显示与来自gtex数据的正常胰腺组织相比，胰腺癌tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。胰腺癌中e-钙粘素的表达高(倍数变化1.10)，并且高于pd-l1的表达(倍数变化0.01)。因此，前列腺癌是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例13：胶质瘤
图14显示与来自gtex数据的正常脑组织相比，胶质瘤tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。胶质瘤中e-钙粘素的表达高(倍数变化0.80)，并且高于pd-l1的表达(倍数变化-0.19)。因此，脑癌(例如，胶质瘤)是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例14：乳腺癌
图15显示与来自gtex数据的正常乳腺组织相比，乳腺癌tcgarnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。乳腺癌中e-钙粘素的表达高(倍数变化0.84)，并且高于pd-l1的表达(倍数变化0.01)。因此，乳腺癌是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例15：卵巢癌
图16显示与来自gtex数据的正常卵巢组织相比，tcga卵巢癌rnaseq数据中的e-钙粘素和pd-l1的倍数变化。卵巢癌中e-钙粘素的表达高(倍数变化1.41)，并且高于pd-l1的表达(倍数变化0.08)。因此，卵巢癌是根据本发明的治疗的特别有吸引力的靶点。
实施例16：黑色素瘤
在黑色素瘤患者活组织检查中，相当大比例的cd8+t细胞表达klrg1(rna-seq数据geo数据库，登录号gse72056)。具体地，表达klrg1的cd8+t细胞的平均百分比(基于17名患者的黑色素瘤活组织检查样品)为44％，表达pd-1的为47％(图17a，黑色素瘤患者样品的klrg1和pd-1cd8+表达)，比例类似并且无明显差别。相当多数量的pd-1阴性cd8+t细胞是klrg1+，使得靶向klrg1可以影响采用现有药物，如纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)靶向pd-1不受影响的细胞群。具体地，基于17名患者黑色素瘤活组织检查样品，平均46％(范围为20％至78％)的pd-1阴性cd8+t细胞表达klrg1(图17b，pd-1阴性cd8+t细胞中的klrg1表达，图17c，黑色素瘤患者样品的klrg1+pd-1阴性cd8+细胞)。在许多这些klrg1+pd-1阴性cd8+细胞中klrg1的表达水平高(高达每百万个碱基6-8个转录物)(图17d，来自17名患者黑色素瘤活组织检查样品的pd-1阴性cd8+t细胞中的klrg1表达)。此外，通过恶性黑色素瘤细胞，对这个单细胞数据集进行相关配体的表达的分析，证明在相当大比例的黑色素瘤恶性细胞中表达klrg1的配体，e-钙粘素(基于14名患者的平均值为76％)，而且比例比pd-1配体pd-l1大得多(平均值为11％)(图18a-d)。因此，黑色素瘤是根据本发明的治疗特别有吸引力的靶点。
实施例17：癌症组织和正常匹配组织的e-钙粘素和pd-l1的相对表达的对比的概述
图19显示癌症组织和正常匹配组织的e-钙粘素和pd-l1的相对表达的对比的概述。这些数据反映了图11-16中的数据，此处呈现在单幅图中用于对比。
实施例18：rnai对klrg1基因表达的下调
可以分离并用rnai处理人外周血单核细胞(“pbmc”)，所述rnai被设计成通过靶向编码mrna特异性下调klrg1基因的表达。可以应用熟知的技术(例如brown等(2002)rnainterferenceinmammaliancellculture:design,execution,andanalysisofthesirnaeffect.ambiontechnotes9(1):3-5中所述的)设计rnai构建体。由用于感兴趣的靶点的mrna(例如，klrg1mrnaseqidno:7)开始，选择对应于20个碱基对的序列，构成构建体的“有义”区。rnai构建体一般包括5’端“有义”序列，接着是“环”区域和与有义序列互补的“反义”序列。可以合成构建体并将其克隆到递送逆转录病毒载体中。从健康志愿者分离的pbmc可以被携带rnai编码载体的病毒颗粒感染，可以通过采用抗cd3抗体(okt3)刺激检测它们的增殖能力。用这种rnai处理的pbmc可以表现出比未处理的pbmc更高水平的增殖。
实施例18：黑色素瘤
来自3名患者的人黑色素瘤活组织检查的免疫组织化学证明大量klrg1+细胞浸润肿瘤(a-c)，但在正常皮肤中不存在klrg1+细胞(d)(图20)。klrg1+细胞在肿瘤组织中的存在使得黑色素瘤成为根据本发明的治疗的非常有吸引力的靶点。
实施例19：肾细胞癌
来自4名患者的人肾细胞癌活组织检查的免疫组织化学证明大量klrg1+细胞浸润肿瘤(图21)。klrg1+细胞在肿瘤组织中的存在使得肾细胞癌成为根据本发明的治疗的非常有吸引力的靶点。
实施例20：非小细胞肺癌
来自4名患者的人非小细胞肺癌活组织检查的免疫组织化学证明大量klrg1+细胞浸润肿瘤(图22)。klrg1+细胞在肿瘤组织中的存在使得非小细胞肺癌成为根据本发明的治疗的非常有吸引力的靶点。
实施例21：重组人e-钙粘素与人klrg1的结合，以及利用中和活性检测抗体。
开发了基于elisa的klrg1/e-钙粘素竞争分析以测定klrg1/e-钙粘素结合以及klrg1/e-钙粘素结合的中和。
e-钙粘素/klrg1结合
继实施例6，h(人)klrg1与h(人)e-钙粘素的结合可以通过elisa检测。elisa检测e-钙粘素与板包被的klrg1的结合，并且确定中和抗体具有以剂量依赖性方式减少e-钙粘素与klrg1的结合的作用。
图23呈现可溶的he-钙粘素与板包被的hklrg1结合的结果。根据该曲线，ec50和ec80分别计算为25和100nm。在具有以下组成的缓冲液中观察到最佳的klrg1/e-钙粘素相互作用：1xpbs、1％bsa、2％奶粉、0.05％tween。
抗klrg1嵌合抗体
三种鼠抗klrg1抗体，其中一种为商购的，用于产生小鼠-人嵌合抗体(标记的hyb01、hyb0和hyb03)。对三种嵌合抗体的中和活性和hklrg1结合进行比较。
he-钙粘素/hklrg1结合的中和
图24呈现三种小鼠-人嵌合抗体中和he-钙粘素/hklrg1结合的结果。可溶的e-钙粘素的浓度固定在ec80值为100nm，而嵌合抗体的浓度变化。嵌合抗体hyb03显示剂量依赖性中和(ic50为1.1nm)。嵌合抗体hyb01和hyb02未显示有效的剂量依赖性中和(ic50na)。
嵌合抗体/hklrg1结合
图25呈现三种小鼠-人嵌合抗体与板包被的klrg1以剂量依赖性方式的结合的结果，如通过elisa确定的。hyb01的ec50为0.6nm，hyb02的ec50为0.18nm，并且hyb03的ec50为0.28nm。
总结
尽管所有三种被测试的小鼠-人嵌合抗体(hyb01、hyb02和hyb03)以剂量依赖性方式结合hklrg1，但是仅一种(hyb03)还表现出剂量依赖性中和。因此，中和分析能够将中和抗体与仅结合klrg1的抗体区分开。
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