本发明涉及抗微生物组合物。本发明更具体地涉及个人护理组合物，例如用于毛发、身体和面部洗涤的组合物，其提供抗微生物功效。更具体地涉及用于毛发和头皮的清洁组合物，其包含相互作用以提供用于抗头皮屑益处的协同抗微生物功效的活性物质。
背景技术：
：本发明涉及抗微生物组合物，其可用于清洁任何身体部位，但特别适用于毛发和头皮。毛发护理组合物通常提供清洁或调理益处或两者的组合。这样的组合物通常包含一种或多种清洁表面活性剂，其通常有助于清洁毛发和/或头皮，而使得没有不期望的污垢、颗粒和脂肪物质。另外，已经通过毛发护理组合物提供了抗头皮屑益处。头皮屑是影响全球许多人的问题。该情况表现为死皮细胞团从头皮脱落。这些是白色的，并提供美学上令人不愉快的外观。促成头皮屑的一个因素是马拉色菌酵母的某些成员。为了对抗这些，已经以毛发清洁洗发剂的形式开发了抗头皮屑产品。已知的抗头皮屑洗发剂的实例包括月桂醚硫酸钠(乙氧基化阴离子表面活性剂)与抗头皮屑剂的组合。用于毛发护理的典型抗头皮屑剂是金属吡啶硫酮，例如吡啶硫酮锌(zpto)，octopirox(吡罗克酮乙醇胺(piroctoneolamine))，唑类抗微生物剂(例如，氯咪巴唑)，硫化硒及其组合。虽然通过在这样的洗发剂中使用上述活性物质在很大程度上减轻了头皮屑的问题，但是需要增强这些活性物质的功效。本发明人已经通过探索上述活性物质之一(吡啶硫酮锌)的功效可以藉此得以增强的许多可能机制以及对可能的增强剂候选物的广泛实验的组合，发现哌嗪类的某些化合物表现出这样的增强性能。本发明的协同抗微生物组合还可以配制成用于皮肤清洁的产品，例如身体和面部护理。哌嗪是非常大的化合物家族，已经报道很多不同的用途，包括作为防晒剂，并已经报道用于皮肤护理组合物。wo97/29733(neutrogena)公开了包含真菌麦角固醇生物合成抗真菌剂(优选唑或烯丙胺)和吡啶硫酮盐的组合物。a.y.leeetal:"mappingthecellularresponsetosmallmoleculesusingchemogenomicfitnesssignatures",science,vol.344,no.6180,2014年4月11日(2014-04-11),第208-211页(“科学论文”)公开关于使用酵母基因组工具在功能丧失测定中将对小分子的细胞响应绘图的研究。该论文公开了分子13，17，22和26，(其类似于本发明要求保护的化合物)靶向麦角固醇生物合成及其在膜中的功能。上述两份出版物公开了报道单独或组合在酵母中降低麦角固醇生物合成和功能的化合物。因此，没有本发明的活性物质与金属吡啶硫酮组合的报道，也没有可以组合它们以提供协同的抗微生物活性的任何指示。因此，本发明的一个目的是提供与个体组分相比表现出协同抗微生物活性的个人护理组合物。技术实现要素：根据本发明的第一方面，存在协同抗微生物组合物，其包含(i)吡啶硫酮的多价金属盐；和(ii)哌嗪化合物，其选自1-(2-氟苯甲酰基)-4-(4-苯基环己基)哌嗪，1-(3-氯苄基)-4-(4-乙基苄基)哌嗪草酸盐，1-(4-氟苯基)-4-异丁酰基哌嗪，1-异丁酰基-4-苯基哌嗪，或1-(4-乙基苄基)-4-(4-甲基环己基)哌嗪草酸盐。本发明的第二方面涉及抑制糠秕马拉色菌生长的方法，其包括将第一方面所述的组合物施用于个体的头皮的步骤。具体实施方式通过阅读以下详细描述和所附权利要求，这些和其它方面、特征和优点对于本领域普通技术人员将变得显而易见。为了避免疑问，本发明的一个方面的任何特征都可以用于本发明的任何其它方面。词语“包含”旨在表示“包括”，但不一定是“由...组成”或“由...构成”。换句话说，所列出的步骤或选项不需要是穷举性的。应注意，以下描述中给出的实施例旨在阐明本发明，而非旨在使本发明限于这些实施例本身。类似地，除非另有说明，否则所有百分比均为重量/重量百分比。除非是在工作实施例和比较实施例中，或者是在另外明确指出的情况下，否则本说明书中表示材料量或反应条件、材料物理性质和/或用途的所有数字都应理解为由词语“约”修饰。以“x至y”的形式表示的数值范围应理解为包括x和y。当针对特定特征以“x至y”的形式描述多个优选范围时，应理解还预期组合不同端点的所有范围。换句话说，在规定值的任何范围时，任何特定的上限值可以与任何特定的下限值相关联。见于本文中的本发明的公开应被认为覆盖见于彼此多项从属的权利要求中的所有实施方式，与可能发现权利要求没有多项从属或冗余无关。在公开关于本发明的特定方面(例如本发明的组合物)的特征时，这样的公开也被认为适用于本发明的任何其他方面(例如本发明的方法)，并作出必要的修正。如本文所用，“抗微生物组合物”意指包括用于局部施用于哺乳动物(尤其是人类)的皮肤、毛发和/或头皮的组合物。通常将这样的组合物施用于身体的期望局部表面从几秒到至多24小时的一段时间。当施用时间段低时，例如大约几秒至几分钟，然后用水冲洗或擦去组合物，则这样的组合物被称为清洁组合物或洗去型组合物。当组合物施用较长时间段时，例如从几分钟到至多24小时，并且经常在正常个人清洁的过程中洗掉，则这样的组合物被称为免洗型组合物。根据本发明的组合物可以是洗去型或免洗型。在这两者中，它优选是洗去型。它包括施用于人体以同样改善外观、清洁、气味控制或一般美学的任何产品。本发明的组合物可以是液体、洗剂、霜剂、泡沫、磨砂膏、凝胶或条的形式。这样的组合物的非限制性实例包括洗去型洗发剂、调理剂、沐浴露、洗手液或凝胶或条。本发明的组合物最优选为洗发剂或调理剂。它最优选用于预防或缓解头皮和/或毛发上的头皮屑的症状。本发明更具体地涉及抗微生物清洁组合物。优选的方面是抗头皮屑毛发护理组合物。它包括本发明要求保护的吡啶硫酮的多价金属盐例如吡啶硫酮锌与哌嗪化合物的协同抗真菌作用。优选的吡啶硫酮的多价金属盐是吡啶硫酮锌(zpto)，其是1-羟基-2-吡啶硫酮锌的简写。吡啶硫酮的多价金属盐由以下通式表示：在吡啶硫酮锌的情况下，m是金属阳离子锌。基于组合物的重量，吡啶硫酮锌优选以0.1至5.0％，更优选0.1至2.0％存在。zpto是颗粒材料。虽然粒度对于实现本发明的益处并不重要，但zpto的粒度优选为0.25至8微米，更优选0.5至8.0微米，进一步更优选1.0至7.5微米。zpto可商购自kolonlifescienceinc.，sinolion(usa)ltd，lonza和其他供应商。哌嗪化合物优选选自1-(2-氟苯甲酰基)-4-(4-苯基环己基)哌嗪，1-(3-氯苄基)-4-(4-乙基苄基)哌嗪草酸盐，1-(4-氟苯基)-4-异丁酰基哌嗪，1-异丁酰基-4-苯基哌嗪，或1-(4-乙基苄基)-4-(4-甲基环己基)哌嗪草酸盐，其具有下面给出的化学结构。1-(2-氟苯甲酰基)-4-(4-苯基环己基)哌嗪1-(4-乙基苄基)-4-(4-甲基环己基)哌嗪草酸盐1-(3-氯苄基)-4-(4-乙基苄基)哌嗪草酸盐1-异丁酰基-4-苯基哌嗪1-(4-氟苯基)-4-异丁酰基哌嗪在本发明中使用的哌嗪化合物已经合成地制备，并且可从chembridgecorporation，ca，usa商购获得。基于组合物的总重量，哌嗪化合物优选以0.1至10％，更优选0.1至5％，还更优选0.2至3.0％存在。根据本发明的一个优选方面，哌嗪化合物是1-(2-氟苯甲酰基)-4-(4-苯基环己基)哌嗪或1-(3-氯苄基)-4-(4-乙基苄基)哌嗪草酸盐。不希望受理论束缚，本发明人相信哌嗪化合物通过扰乱微生物膜完整性，增强了zpto的抗微生物功效。本发明人已经发现对麦角固醇具有相同酵母化学基因组响应的化合物如酮康唑与吡啶硫酮锌的组合不一定表现出协同功效。例如，本发明人已经测试各种其他化合物(如下具有与科学论文的表2中记录的相同的功能)与吡啶硫酮锌组合。1-乙酰基-4-(2,3-二甲基苯基)哌嗪5-氯-2-(4-异丁酰基-1-哌嗪基)苯胺1-丁酰基-4-(4-氟苯基)哌嗪4-(1-苯甲酰基-4-哌啶基)吡啶6-溴-3-氯-n-(1-甲基-4-哌啶基)-1-苯并噻吩-2-甲酰胺3,6-二氯-n-(1-甲基-4-哌啶基)-1-苯并噻吩-2-甲酰胺以上化合物均未显示与吡啶硫酮锌具有抗马拉色菌的功效的协同作用。因此，简单地用其他麦角固醇抑制剂替换酮康唑不一定转化为协同的抗马拉色菌的功效。本发明人因此证实在本发明中要求保护的哌嗪化合物与吡啶硫酮锌的组合是协同的，而对wo97/29733中公开作为唑化合物的替代的许多其他化合物没有看到这种行为。本发明的组合物优选包含化妆品可接受的载体。根据一个方面，化妆品可接受的载体包含水。根据另一个优选的方面，载体另外包含表面活性剂。根据本发明的另一个优选方面，组合物是洗发剂或毛发调理剂。洗发剂根据本发明特别优选的方面，组合物是洗发剂。本发明的组合物尤其是洗发剂用阴离子表面活性剂例如烷基硫酸盐和/或乙氧基化烷基硫酸盐表面活性剂配制。这些阴离子表面活性剂的含量优选为组合物的1-20重量％，优选2-16重量％，进一步更优选3-16重量％。优选的烷基硫酸盐是c8-18烷基硫酸盐，更优选c12-18烷基硫酸盐，优选是具有增溶阳离子如钠、钾、铵或取代铵的盐的形式。优选的烷基醚硫酸盐是具有下式的那些：ro(ch2ch2o)nso3m；其中r是具有8-18(优选12-18)个碳原子的烷基或烯基；n是平均值大于至少0.5，优选1至3，更优选2至3的数字；并且m是增溶阳离子，如钠，钾，铵或取代铵。一个实例是月桂醚硫酸钠(sles)。平均乙氧基化度为0.5-3，优选1-3的sles是特别优选的。根据本发明的洗发剂组合物可包含一种或多种另外的阴离子清洁表面活性剂，其是化妆品可接受的并且适合局部施用于毛发。另外的合适的阴离子清洁表面活性剂的实例是烷芳基磺酸盐，烷基琥珀酸盐，烷基磺基琥珀酸盐，烷基醚磺基琥珀酸盐，n-烷基肌氨酸盐，烷基磷酸盐，烷基醚磷酸盐和烷基醚羧酸及其盐，尤其是它们的钠，镁，铵和单、二和三乙醇胺盐。烷基和酰基通常含有8-18个，优选10-16个碳原子，并且可以是不饱和的。烷基醚磺基琥珀酸盐，烷基醚磷酸盐和烷基醚羧酸及其盐每分子可含有1-20个环氧乙烷或环氧丙烷单元。用于本发明组合物的典型阴离子清洁表面活性剂包括油基琥珀酸钠，月桂基磺基琥珀酸铵，月桂醚磺基琥珀酸钠，十二烷基苯磺酸钠，十二烷基苯磺酸三乙醇胺，月桂醚羧酸和n-月桂基肌氨酸钠。合适的优选的另外的阴离子清洁表面活性剂是月桂醚磺基琥珀酸钠(n)eo，(其中n为1-3)，月桂醚羧酸(n)eo(其中n为10-20)。任何前述阴离子清洁表面活性剂的混合物也可以是合适的。本发明的组合物优选另外包含两性表面活性剂，优选甜菜碱表面活性剂，优选烷基酰胺丙基甜菜碱表面活性剂，例如椰油酰胺丙基甜菜碱。在一个优选的实施方式中，组合物包含0.1至10重量％，优选0.5至8重量％，更优选1至5重量％的甜菜碱表面活性剂。为了增强来自本发明组合物(特别是洗发剂)的活性物质的沉积，阳离子聚合物通常包含在其中。在本发明中，优选组合物另外包含0.01至2.0％的阳离子聚合物。阳离子聚合物优选为瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵。瓜尔胶聚合物主要含有半乳甘露聚糖聚合物链。取决于有多少瓜尔胶被水解和阳离子化，该聚合物可以以各种分子量和阳离子取代度获得。阳离子聚合物优选以组合物的0.04-0.5重量％，更优选0.08-0.25重量％存在。组合物的ph优选等于或高于4.0，更优选为5.0至7.0。根据本发明的组合物，特别是用于抗头皮屑洗发剂，优选另外包含锌化合物。据信组合物中另外的锌化合物的存在改善吡啶硫酮的金属盐的抗头皮屑功效。合适的锌化合物是氧化锌，柠檬酸锌，丙二酸锌，碳酸锌或其组合。锌化合物优选以组合物的0.1至3重量％，更优选0.1至1.5重量％存在。根据本发明的洗发剂组合物优选另外包含康唑类杀真菌剂。优选地，康唑类杀真菌剂选自酮康唑、氯咪巴唑或其混合物。唑类杀真菌剂优选以组合物的0.01-2重量％，更优选0.025-0.75重量％包含。据信康唑类杀真菌剂的存在改善吡啶硫酮锌的沉积。组合物优选另外包含维生素b3化合物。优选的维生素b3化合物是烟酰胺。烟酰胺具有如下给出的结构已知烟酰胺用于从角质形成细胞分泌amp。如此分泌的amp提供改善身体外表面(例如头皮上)的免疫力。因此，在本发明的组合物中使用烟酰胺，预期不仅通过本发明组合物的抗真菌活性，而且通过使用烟酰胺提供头皮自身对细菌的保护屏障加强，而增强抗头皮屑功效。预期该组合可以提供进一步的持久保护，例如长达24小时的对抗细菌的保护。烟酰胺优选以组合物的0.1至5重量％，更优选0.5至5重量％，进一步更优选0.5至3重量％，最优选1.0至3.0重量％存在。悬浮剂优选地，本发明的组合物还包含悬浮剂。合适的悬浮剂选自聚丙烯酸，丙烯酸的交联聚合物，丙烯酸与疏水单体的共聚物，含羧酸单体和丙烯酸酯的共聚物，丙烯酸和丙烯酸酯的交联共聚物，杂多糖胶和结晶长链酰基衍生物。长链酰基衍生物理想地选自乙二醇硬脂酸酯，具有16-22个碳原子的脂肪酸的烷醇酰胺，及其混合物。乙二醇二硬脂酸酯和聚乙二醇3二硬脂酸酯是优选的长链酰基衍生物，因为它们赋予组合物珠光。聚丙烯酸可作为carbopol420，carbopol488或carbopol493商购。也可以使用与多官能剂交联的丙烯酸聚合物；它们可作为carbopol910，carbopol934，carbopol941和carbopol980商购。含羧酸单体和丙烯酸酯的合适共聚物的实例是carbopol1342。所有carbopol(商标)材料均可从goodrich获得。丙烯酸和丙烯酸酯的合适交联聚合物是pemulentr1或pemulentr2。合适的杂多糖胶是黄原胶，例如可作为kelzanmu获得的。可以使用任何上述悬浮剂的混合物。优选的是丙烯酸和结晶长链酰基衍生物的交联聚合物的混合物。如果包含，悬浮剂将通常基于组合物的总重量按悬浮剂的总重量计以0.1-10％，优选0.5-6％，更优选0.5-4％的含量存在于本发明的洗发剂组合物中。本发明的组合物可含有其他成分以增强性能和/或消费者可接受性。这样的成分包括香味剂，染料和颜料，ph调节剂，珠光剂或遮光剂，粘度调节剂，防腐剂和天然毛发营养素，例如植物性治疗药物(botanicals)，水果提取物，糖衍生物和氨基酸。本发明的组合物优选是水基的。它优选包含大量水，优选组合物的70-95重量％。毛发调理剂当调理益处待通过本发明的组合物递送时，组合物被称为毛发调理剂。通常，毛发护理组合物中使用的最流行的调理剂是水不溶性油性材料，例如矿物油，天然存在的油，例如甘油三酯和硅酮聚合物。调理益处是通过沉积在毛发上，导致形成膜，使得毛发在潮湿时更容易梳理并且在干燥时更易于管理的油性材料而实现。特别有用的调理剂是硅酮化合物，优选非挥发性硅酮化合物。有利地，本文的组合物可包含一种或多种硅酮。硅酮是以分散或悬浮的颗粒形式存在的调理剂。它们旨在沉积在毛发上，在用水冲洗毛发后留下。合适的硅油可包括聚烷基硅氧烷，聚芳基硅氧烷，聚烷基芳基硅氧烷，聚醚硅氧烷共聚物及其混合物。氨基硅酮通常与洗发剂组合物一起配制。氨基硅酮是含有至少一个伯胺、仲胺、叔胺或季铵基团的硅酮。也可以使用高分子量硅酮胶。另一种有用的类型是交联硅酮弹性体，例如二甲聚硅氧烷/乙烯基/二甲聚硅氧烷交联聚合物(例如dowcorning9040和9041)。存在时，组合物中硅酮的量可以为毛发护理组合物的约0.1至约10重量％，优选约0.1至约8重量％，更优选约0.3至约5重量％。组合物的ph优选等于或高于4.0，更优选为5.0至7.0。毛发调理组合物经常包含选自阳离子表面活性剂的调理表面活性剂，单独使用或混合使用。用于根据本发明的调理剂组合物的合适的阳离子表面活性剂包括鲸蜡基三甲基氯化铵，山嵛基三甲基氯化铵，鲸蜡基氯化吡啶，四甲基氯化铵，四乙基氯化铵，辛基三甲基氯化铵，十二烷基三甲基氯化铵，十六烷基三甲基氯化铵，辛基二甲基苄基氯化铵，癸基二甲基苄基氯化铵，硬脂基二甲基苄基氯化铵，双十二烷基二甲基氯化铵，双十八烷基二甲基氯化铵，牛油三甲基氯化铵，二氢化牛油二甲基氯化铵(例如，来自akzonobel的arquad2ht/75)，椰油三甲基氯化铵，peg-2-油基氯化铵及其相应的氢氧化物。另外的合适的阳离子表面活性剂包括具有ctfa名称quaternium-5，quaternium-31和quaternium-18的那些材料。任何前述材料的混合物也可以是合适的。用于根据本发明的调理剂的特别有用的阳离子表面活性剂是鲸蜡基三甲基氯化铵，可商购获得，例如作为genaminctac，来自hoechstcelanese。用于根据本发明的调理剂的另一种特别有用的阳离子表面活性剂是山嵛基三甲基氯化铵，可商购获得，例如作为genaminkdmp，来自clariant。又一种优选的阳离子表面活性剂是硬脂酰胺丙基二甲胺。用于组合物的最优选的阳离子表面活性剂是硬脂酰胺丙基二甲胺，山嵛基三甲基氯化铵或硬脂基三甲基氯化铵。在本发明的调理剂中，阳离子表面活性剂的水平通常为组合物的0.1至5重量％，优选0.5至2.5重量％。本发明的毛发调理组合物优选还可另外包含脂肪醇。据信脂肪醇和阳离子表面活性剂在调理组合物中的组合使用是特别有利的，因为这导致形成其中分散有阳离子表面活性剂的层状相。代表性的脂肪醇包含8至22个碳原子，更优选16至22个。脂肪醇通常是含有直链烷基的化合物。合适的脂肪醇的实例包括鲸蜡醇，硬脂醇及其混合物。这些材料的使用也是有利的，因为它们对本发明的组合物的整体调理性质做出贡献。本发明的调理剂中的脂肪醇的水平按组合物重量计将通常为0.01至10％，优选0.1至8％，更优选0.2至7％，最优选0.3至6％。阳离子表面活性剂与脂肪醇的重量比适合地是1:1至1:10，优选1:1.5至1:8，最佳为1:2至1:5。皮肤清洁本发明的组合物可用于皮肤护理例如身体或面部洗涤。抗微生物组合物可进一步包含表面活性剂。优选的表面活性剂是非离子表面活性剂，例如c8-c22，优选c8-c16脂肪醇乙氧基化物，当产物为液体形式时，其包含1-8个环氧乙烷基团。表面活性剂优选选自伯烷基硫酸盐，仲烷基磺酸盐，烷基苯磺酸盐或乙氧基化烷基硫酸盐。组合物可进一步包含阴离子表面活性剂，例如烷基醚硫酸盐，优选具有1至3个环氧乙烷基团的那些，来自天然或合成来源和/或磺酸。特别优选的是月桂醚硫酸钠。烷基多葡糖苷也可以存在于组合物中，优选碳链长度在c6和c16之间的那些。因此，在高度优选的方面，抗微生物组合物包含选自阴离子表面活性剂，脂肪酸酰胺，烷基硫酸盐，直链烷基苯磺酸盐及其组合的表面活性剂。当存在表面活性剂时，抗微生物组合物优选包含按组合物的重量计1至90％的表面活性剂当使用表面活性剂时，特别优选的表面活性剂是皂。皂是适用于本发明的抗微生物组合物的个人洗涤应用的表面活性剂。皂优选为c8-c24皂，更优选c10-c20皂，最优选c12-c18皂。皂的阳离子可以是碱金属，碱土金属或铵。优选地，皂的阳离子选自钠，钾或铵。更优选地，皂的阳离子是钠或钾。典型的脂肪酸混合物由按皂的重量计5至30％的椰子脂肪酸和70至95％的脂肪酸组成。衍生自其他合适的油/脂肪如花生，大豆，牛油，棕榈，棕榈仁等的脂肪酸也可以以其他期望比例使用。当存在时，本发明的皂优选以按组合物的重量计1-90％，优选10-85％，更优选25-75％的量存在。优选的组合物可包含其他已知成分，例如香料，颜料，防腐剂，润肤剂，防晒剂，乳化剂，胶凝剂和增稠剂。这些成分的选择在很大程度上取决于组合物的形式。水是优选的载体。当存在水时，其优选按组合物的重量计以至少1％，更优选至少2％，进一步更优选至少5％存在。当水是载体时，优选的液体组合物包含10至99.8重量％的水。液体抗微生物组合物可用作皮肤消毒液，用于皮肤清洁，特别是用于洗手或洗脸。当水是载体时，优选的固体组合物包含5至30重量％的水。固体抗微生物组合物优选为成型固体的形式，更优选为棒的形式。固体抗微生物组合物特别可用于皮肤清洁，特别是用于洗手或洗脸。根据另一方面，无机颗粒材料也是合适的载体。当无机颗粒材料是载体时，抗微生物组合物是固体形式。优选地，无机颗粒材料是滑石。当无机颗粒材料是滑石时，固体抗微生物组合物特别可用作施用于面部或身体的爽身粉。根据另一方面，溶剂是优选的载体。尽管可以使用任何溶剂，但醇是优选的溶剂。短链醇，特别是乙醇和丙醇，特别优选作为抗微生物擦拭物或抗微生物洗手液组合物的载体。在本发明的另一个方面，本发明的组合物适用于个人卫生的擦拭物。本发明还涉及抑制糠秕马拉色菌生长的方法，其包括将第一方面的组合物施用于个体的头皮的步骤。替代地并且优选地，在上述步骤之后用水冲洗表面。冲洗步骤通常在将组合物施用于皮肤或毛发/头皮后1至5分钟内进行。根据一个方面，本发明提供非治疗益处。当在糠秕马拉色菌细胞上吡啶硫酮的多价金属盐与哌嗪化合物的摩尔比在1:80至1:5000的范围内时，该方法更有效。现将参考以下非限制性实施例说明本发明。实施例使用σfic测定法测定zpto和哌嗪化合物之间的协同相互作用。下面给出该方法的简要描述。方法：针对糠秕马拉色菌的σfic法测定微生物制备：将维持在md琼脂平板(溶液a)上的糠秕马拉色菌(cbs1878)培养到20ml的生长培养基pityrosporumbroth(pb，溶液b)中。溶液a制备改良dixon琼脂(md)(确保彻底搅拌，包括在高压灭菌后)溶液b制备pityrosporumbroth(pb)然后将它们在32℃下伴随振摇温育48小时。然后，将1ml第一肉汤培养物转移到9ml的新鲜pb并在32℃下伴随振摇温育48小时。最终培养物应含有2至6×106个细胞/ml。这通过使用pb稀释至5×105细胞/ml来实现。体外易感性试验将吡啶硫酮锌连续稀释(2倍)以制备成在生长培养基中为2-125ppm的范围。将哌嗪化合物连续稀释(2倍)以制备成在生长培养基中为10-10,000ppm的范围。通过将20μl吡啶硫酮锌溶液与20μl测试化合物混合，在96孔板中制备zpto和测试化合物的二元组合。将每个孔中的溶液进一步与160μlpb和20μl糠秕马拉色菌混合。测试板中的最终细胞密度约为5×104个细胞/ml，96孔板的每个孔中活性物质的最终浓度如下所示。zpto浓度(ppm)：12.5，6.3，3.1，1.6，0.8，0.4，0.2和0。哌嗪化合物浓度(ppm)：1000，500，250，125，62.5，31.3，15.6，7.8，3.9，2.0，1.0和0。将板在32℃下温育一天。然后将20μl阿拉玛蓝(alamarblue，0.01％)添加到每个孔中，进一步孵育一天以观察颜色变化。红色表示微生物生长，不变的蓝色表示没有生长。此外，还证实单独的测试化合物在没有添加微生物的对照混合物下不导致阿拉玛蓝颜色变化。计算：(1)最低抑制浓度(mic)：mic被定义为提供完全微生物生长抑制的活性物质的绝对最低浓度，如在测试条件下的阿拉玛蓝的蓝色所指示的。例如，对于吡啶硫酮锌，mic测定为1.6-3.2ppm。1-(2-氟苯甲酰基)-4-(4-苯基环己基)哌嗪的mic测定为100ppm。1-(3-氯苄基)-4-(4-乙基苄基)哌嗪草酸盐，1-(4-氟苯基)-4-异丁酰基哌嗪和1-异丁酰基-4-苯基哌嗪测定为高于1000ppm。1-(4-乙基苄基)-4-(4-甲基环己基)哌嗪草酸盐的mic测定为125ppm。(2)分级抑制浓度(fic)：使用分级浓度(fc)和分级抑制浓度(fic)的概念，已经广泛考察孤立物和混合物中抑制性抗微生物剂的不同行为。参数可以定义如下：(3)协同性和加和性：抗微生物剂之间的相互作用可以是加和的，协同的或拮抗的，这取决于组合的功效是否等于，大于或小于单独测试时对个体组分的相同总浓度所获得的。这些关系可以通过将混合物中存在的所有组分的分级mic值相加得到“分级抑制指数”来数学地表达。在学术或专利文献中没有一致的方法定义区分协同性与加和性或拮抗性的精确限定的σfic值。在这项研究中，我们采用了自由的方法将σfic<0.9的任何二元混合物定义为显示协同行为的证据。σfic＝fic(组分1)+fic(组分2)σfic＝1对应于加和性杀菌活性σfic>1对应于拮抗性杀菌活性σfic<0.9对应于协同性杀菌活性(4)结果：基于进行实验的zpto(0至12.5ppm)和哌嗪化合物(0至1000ppm)的浓度范围，组合的σfic如下给出。实施例组合σfic1zpto+1-(2-氟苯甲酰基)-4-(4-苯基环己基)哌嗪0.252zpto+1-(3-氯苄基)-4-(4-乙基苄基)哌嗪草酸盐0.633zpto+1-(4-氟苯基)-4-异丁酰基哌嗪0.754zpto+1-异丁酰基-4-苯基哌嗪0.755zpto+1-(4-乙基苄基)-4-(4-甲基环己基)哌嗪草酸盐0.75上表中的数据表明，哌嗪化合物两者与zpto组合表现出协同性抗微生物活性。当前第1页12