SFASL的AAV2介导的基因递送作为青光眼的神经保护疗法的制作方法

本发明是在美国国立卫生研究院授予的gm058724、ca090691和ey021543的政府支持下完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。

相关申请

本申请根据35u.s.c.119(e)要求2017年5月26日提交的美国临时申请序列号62/511,629并且其标题为“aav2-mediatedgenedeliveryofsfaslasaneuroprotectivetherapyinglaucoma”，以及2016年7月5日提交的美国临时申请序列号62/358,541、题为“aav2-mediatedgenedeliveryofsfaslasaneuroprotectivetherapyinglaucoma”的权益，各自的全部内容通过引用并入本文。

背景

青光眼是全世界失明的主要原因，是一种复杂的多因素疾病，其特征在于视网膜神经节细胞(rgc)的进行性丧失。升高的眼内压(iop)是青光眼发展的公认风险因素，并且仍然是唯一可修改的疾病相关参数。然而，单独降低iop并不能防止所有患者的rgc丢失，即使在iop成功降低后，rgc的破坏仍可继续。此外，在具有正常iop的患者中发生青光眼的高发生率且rgc丧失。

概述

本公开内容的方面涉及用于预防视神经变性的组合物和方法。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法可用于治疗青光眼。在一些实施方案中，本公开内容涉及fas配体(fasl)介导导致例如在青光眼中的组织损伤的细胞凋亡和炎症的发现。在一些实施方案中，本公开内容涉及发现raav介导的可溶性fas配体(sfasl)的递送防止青光眼小鼠模型中视网膜神经节细胞(rgc)和轴突的死亡。

因此，本公开内容的一个方面提供了治疗受试者的青光眼的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的重组腺相关病毒(raav)，其中raav包含(i)衣壳蛋白和(ii)工程化以表达sfasl或其片段的核酸。在一些实例中，sfasl或其片段的量有效减少青光眼疾病进展，降低受试者的眼内压，使视网膜神经胶质细胞失活，抑制tnfα活性，减少视网膜神经节细胞(rgc)死亡和/或减少轴突退化。在一些实施方案中，提供了用于预防视神经变性和/或治疗青光眼的新型组合物和方法。

另一方面，本公开内容提供了治疗fas配体依赖性炎性病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的重组腺相关病毒(raav)，其中raav包含(i)衣壳蛋白和(ii)工程化以表达sfasl或其片段的核酸。在一些实施方案中，fas配体依赖性炎性病症是青光眼或皮肤狼疮。

或者，本公开内容提供了治疗fas配体依赖性炎性病症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括检测受试者组织中膜结合的fas配体(mfasl)和/或可溶性fas配体(sfasl)的存在或不存在，并基于mfasl和/或sfasl的存在或不存在来治疗受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括通过向受试者施用有效量的重组腺相关病毒(raav)来治疗受试者，其中raav包含(i)衣壳蛋白和(ii)工程化以表达sfasl或其片段的核酸。

在另一方面，本公开内容提供了向受试者施用可溶性fasl(sfasl)或其片段的方法。在一些实施方案中，受试者具有与年龄相关的升高的眼内压。在一些实施方案中，所述方法还涉及眼内施用重组腺相关病毒(raav)，其包含经工程改造以表达sfasl或其片段的核酸。

在一些实施方案中，在本文描述的方法中待治疗的受试者是患有或怀疑患有fas配体依赖性炎性病症的患者(例如人类患者)。在一些实例中，受试者是患有或怀疑患有青光眼的人类患者。这样的人类患者可能表现出升高的眼内压(iop)，视网膜神经节细胞(rgc)和/或轴突的丧失，促凋亡基因(例如，bax、fadd、fas和fasl)的表达增加，抗凋亡基因(例如，c-flip、bcl-2和ciap-2)、活化的视网膜神经胶质细胞的表达减少，增加的tnfα活性，增加的mfasl表达和降低的sfasl表达。

在一些实施方案中，通过本文描述的方法治疗的任何受试者可以已经用另一种青光眼疗法(例如滴眼液、口服药物或手术)治疗。在一些实施方案中，本文所述的方法可以进一步包括向受试者施用另一种抗青光眼治疗。

本公开内容还提供了用于治疗受试者的青光眼的药物组合物。在一些实施方案中，此类药物组合物包含一种或多种raav和药学上可接受的载体，所述raav包含经工程改造以表达本文所述的sfasl或其片段的核酸。在一些实施方案中，还提供了raav在制备用于青光眼治疗的药物中的用途，所述raav包含经工程改造以表达sfasl或其片段的核酸。

在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从以下附图和若干实施方案的详细描述以及所附权利要求，本发明的其他特征或优点将变得显而易见。

附图简要说明

图1a-1e显示仅表达fasl膜形式的dba/2j小鼠中rgc和轴突的加速丧失。图1a显示在3、6和9个月龄时，d2-gp、d2和d2-δcs小鼠的回弹张力测定法测量iop测量值(n＝16d2-gp；n＝22d2,n＝22d2-δcs)。数据表示为平均iop±sem。图1b显示了在3和6月龄时从d2-gp、d2和d2-δcs小鼠分离的视网膜平板支架(retinalflat-mounts)的代表性共聚焦图像，用β-iii微管蛋白和rgc特异性标记染色，dapi染色为核染色，比例尺为75μm。图1c显示了β-iii微管蛋白阳性rgc的定量，表示为rgc密度/mm²视网膜。n＝10只眼睛/组。图1d显示了在3和6月龄时取自d2-gp、d2和d2-δcs的ppd视神经横截面的代表性显微照片，比例尺为100x。图1e显示了健康轴突的定量，表示为轴突密度(10⁴)/mm²。n＝10视神经/组。ns-不显著,*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。

图2a-2d显示了加速的细胞凋亡与缺乏sfasl时的rgc损失一致。在3个月龄(图2a)和6个月龄(图2c)中取自d2-gp、d2和d2-δcs小鼠的石蜡包埋的视网膜切片中的代表性tunel染色，比例尺为100μm。gcl，神经节细胞层；inl，内核层；onl，外核层；白色箭头＝gcl中的tunel阳性细胞；白色箭＝inl中的tunel阳性细胞。在3个月龄(图2b)和6个月龄(图2d)时定量gcl中的tunel阳性细胞，表示为tunel阳性细胞/视网膜切片(9个切片/视网膜)，n＝8/组。ns-不显著,***p<0.001,****p<0.0001。

图3a-3f显示了d2-gp、d2和d2-δcs动物中fas、fasl和fadd的表达。对在3和6月龄时从d2-gp、d2和d2-δcs小鼠分离的神经视网膜进行定量rt-pcr，以定量fas(图3a)、fasl(图3b)和fadd(图3c)的mrna水平。n＝6/组。自3和6个月时从d2-gp、d2和d2-δcs小鼠分离的后眼杯制备的蛋白质裂解物(20μg/样品)的代表性western印迹(图3d)。将由过表达sfasl或mfasl的l5178y-r肿瘤转染子制备的蛋白质裂解物用作阳性对照，并将从fasl-ko小鼠分离的后眼杯制备的蛋白质裂解物用作阴性对照。mfasl34和38kd条带(图3e)和sfasl26kd条带(图3f)的密度测定分析是3次独立实验的平均值(每个实验3个独立的印迹，其由每组1个后段组成)误差条表示sem+ns-不显著。n.d.-未检出,*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。

图4a-4f显示了在用aav2.sfasl处理的d2-δcs小鼠和d2小鼠的视网膜中gfap和tnfα的表达。石蜡包埋视网膜切片的代表性共聚焦显微镜图像，所述切片取自3个月龄和6个月龄的d2-gp、d2和d2-δcs小鼠，并染色gfap和dapi，白色箭＝米勒细胞中的gfap，比例尺为100μm(图4a)。对在3和6月龄时从d2-gp、d2和d2-δcs小鼠分离的神经视网膜进行定量rt-pcr，以定量gfap(图4b)和tnfα(图4c)的mrna水平。石蜡包埋视网膜切片的代表性共聚焦显微镜图像，所述切片取自10个月龄的d2-gp、d2-uninj.、d2-aav2-egfp和d2-aav2-sfasl小鼠，并染色gfap和dapi，比例尺为100μm(图4d)。对10个月龄的d2-gp、d2-uninj.、d2-aav2-egfp和d2-aav2-sfasl小鼠分离的神经视网膜进行定量rt-pcr，以定量gfap(图4e)和tnfα(图4f)的mrna水平。n＝6/组。误差条表示sem。ns-不显著,*p<0.05,**<0.01,****<0.0001。

图5a-5d显示了dba2/j小鼠中sfasl的过表达。dba/2j小鼠在2月龄时接受一次玻璃体内注射aav2.sfasl或作为对照的aav2.egfp。视网膜平板支架显示在整个视网膜中aav2.egfp的表达，比例尺为5x和100μm(图5a)。视网膜的横截面3-d重建(图5b)。gcl-神经节细胞层，inl-内核层。western印迹形成神经视网膜裂解物(5μg/样品)，显示在aav2注射后2周和2个月时26kd处sfasl的过表达，n＝3/组(图5c)。通过d2(未注射)、d2-aav2.egfp和d2-aav2.sfasl中的回弹眼压术在3、5、7和9个月龄时进行iop测量(图5d)。数据表示为平均iop±semiop(n＝10/组)。在9月龄时，d2-gp、d2(未注射)、d2-aav.egfp和d2-aav.sfasl中的色素分散和虹膜基质萎缩。*p<0.05。

图6a-6b显示玻璃体内aav2.sfasl保护dba/2j小鼠中的rgc和轴突。dba/2j小鼠在2月龄时接受一次玻璃体内注射aav2.sfasl或作为对照的aav2.egfp。在10月龄时，除了月龄匹配的d2-uninj(未注射)和d2.gp小鼠之外，还对aav2.sfasl和aav2.egfp处理的小鼠实施安乐死，并且处理视网膜和视神经以分析rgc和轴突。从d2-gp、d2未注射、d2-aav2.egfp和d2-aav2.sfasl小鼠分离的、用β-iii微管蛋白、rgc特异性标记物和dapi染色的视网膜平板支架的代表性共聚焦图像，比例尺为50μm。β-iii微管蛋白阳性rgc的定量，表示为rgc密度/mm²视网膜。n＝10只眼睛/组(图6a)。ppd视神经横截面的代表性显微照片取自d2-gp、d2未注射、d2-aav2.egfp和d2-aav2.sfasl小鼠。健康轴突的定量，表示为轴突密度(10⁴)/mm²。n＝10只眼睛/组(图6b)。比例尺为100x，ns-不显著,**p<0.01,***p<0.001****p<0.0001。

图7a-7b显示用aav2.sfasl处理的d2小鼠中促凋亡介质和抗凋亡介质的表达。对神经视网膜进行定量rt-pcr以定量促细胞凋亡介质(图7a)fas、fadd和bax以及抗凋亡介质cflip、bcl2和ciap2的mrna水平(图7b)。n＝5/组。误差条表示sem。ns-不显著,*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。

图8a-8d显示当在疾病开始之前或之后给予时，用aav2.sfasl治疗提供d2小鼠中rgc和轴突的长期保护。来自在2个月龄时(处理前)用aav2-egfp或aav2-sfasl处理(预处理)的d2小鼠(图8a)和在7月龄时(疾病开始后)用aav2-egfp或aav2-sfasl处理的d2小鼠(图8c)的在15个月龄时用βiii微管蛋白和dapi染色的视网膜全部支架的代表性共聚焦显微镜图像(比例尺为100μm)。月龄匹配的d2-gp和d2-未注射的小鼠作为对照，(比例尺为100μm)。β-iii微管蛋白阳性rgc的定量，表示为rgc密度/mm²视网膜。来自2个月龄时用aav2-egfp或aav2-sfasl处理的d2小鼠(图8b)和在7个月龄用aav2-egfp或aav2-sfasl处理的d2小鼠(图8d)的在15个月龄时用ppd染色的视神经横截面的代表性显微照片。比例尺为100x。月龄匹配的d2-gp和d2-未注射的小鼠作为对照。健康轴突的定量，表示为轴突密度(10⁴)/mm²。n＝10只眼睛/组。ns-不显著,*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。

图9a-9f显示用aav2.sfasl预处理保护c57/bl6小鼠中升高的iop的微珠诱导的小鼠模型中的rgc细胞死亡。western印迹形成神经视网膜裂解物(5ug/样品)，其显示在26kd处的sfasl的表达和在微珠或盐水注射后4周注射盐水和微珠的b6.aav2.egfp和b6.aav2.sfasl小鼠中的肌动蛋白(图9a)。通过来自用盐水或微珠处理的b6.aav2.egfp和b6.aav2.sfasl小鼠的回弹眼压测定法进行iop测量(图9b)。数据表示为平均iop±sem,(n＝10/组)。在微珠注射后28天，处理神经视网膜和视神经以定量rgc和轴突。来自视网膜平板支架的代表性共聚焦显微镜图像，在微珠或盐水注射后4周用βiii微管蛋白、rgc特异性标记物和dapi染色(图9c)。β-iii微管蛋白阳性rgc的定量，表示为rgc密度/mm²视网膜，比例尺为75μm(图9d)。在微珠或盐水注射后4周用ppd染色的视神经横截面的代表性显微照片，比例尺为100x(图9e)。健康轴突的定量，表示为轴突密度(10⁴)/mm²(图9f)。n＝5只眼睛/组。ns-不显著,*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。

详述

本发明的方面涉及某些编码蛋白质的转基因(例如，可溶性fas配体(sfasl)或其片段)，其在递送至受试者时对于治疗或预防受试者中的视网膜神经节细胞(rgc)死亡是有效的。因此，在一些实施方案中，本公开内容描述的方法和组合物可用于治疗青光眼。

治疗青光眼的方法

本公开内容提供了向受试者递送转基因(例如，编码sfasl蛋白或其片段的基因)的方法。该方法通常包括向受试者施用有效量的编码sfasl蛋白片段的分离的核酸，或包含用于表达sfasl蛋白片段的核酸的raav。

fas配体(fasl)是tnf家族的40kdaii型跨膜蛋白，最初通过其诱导fas受体阳性细胞凋亡的能力来鉴定。fasl能够表达为膜结合蛋白(mfasl)，或切割并作为可溶性蛋白(sfasl)释放。

人fasl基因编码281个氨基酸的蛋白质。在一些实施方案中，人fasl基因编码包含seqidno：6所示氨基酸序列并如genbank登录号nm_000639.2所述的蛋白质。在一些实施方案中，对应于人fasl的氨基酸残基127-281的人sfasl蛋白如seqidno：3所示。在一些实施方案中，人sfasl蛋白由seqidno：2中所示的核酸编码。

本公开内容的方面部分基于以下令人惊讶的发现：sfasl在需要其的受试者中表达时，例如通过施用病毒载体(例如raav)，防止rgc和轴突的丧失。

因此，在一些方面，本公开内容提供了编码sfasl蛋白或其片段的转基因。“sfasl蛋白片段”是指sfasl蛋白的功能性的2至154(例如，2至154之间的任何整数)氨基酸部分。在一些实施方案中，sfasl蛋白片段包含sfasl(例如，seqidno：3)的连续氨基酸部分(例如，氨基酸1至154)。在一些实施方案中，sfasl蛋白片段包含sfasl(例如，seqidno：3)的一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)间断的氨基酸部分(例如，氨基酸1至10、32至120和64至150)。

在一些实施方案中，编码本公开内容描述的sfasl或其片段的转基因预防rgc和轴突的丧失，因此可用于治疗青光眼。通常，“青光眼”是指一组损害视神经的眼部疾病。在一些实施方案中，青光眼中视神经的损伤是由眼内压力升高引起的。青光眼的实例包括但不限于开角型青光眼、闭角型青光眼、正常眼压性青光眼(ntg)、先天性青光眼、继发性青光眼、色素性青光眼、假性剥脱性青光眼、创伤性青光眼、新生血管性青光眼、虹膜角膜内皮细胞综合征(ice)和葡萄膜炎性青光眼。

在一些方面，如本公开内容所述，本公开内容提供了治疗有此需要的受试者的青光眼的方法，该方法包括向患有青光眼的受试者施用治疗有效量的分离的核酸或raav。

物质的“有效量”是足以产生所需效果的量。在一些实施方案中，有效量的分离的核酸(例如，包含编码如本文所述的sfasl蛋白或其片段的转基因的分离的核酸)是足以转染(或在raav介导的递送的背景下感染)足够数量的受试者的靶组织的靶细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是眼组织(例如，感光细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜神经节细胞、视网膜细胞等)。在一些实施方案中，有效量的分离的核酸(例如，其可以通过raav递送)可以是足以在受试者中具有治疗益处的量，例如，增加或补充感兴趣的基因或蛋白质(例如，sfasl)的表达，或改善受试者的一种或多种疾病症状(例如，青光眼的症状，例如rgc损伤)等。有效量将取决于多种因素，例如，受试者的物种、年龄、体重、健康状况和待靶向的组织，因此可以如本公开内容中其他地方所述在受试者和组织之间变化。

如本文所用，术语“治疗”是指将包含sfasl或其片段的组合物应用或施用于患有青光眼、青光眼症状或青光眼易感性的受试者，目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改良或影响病症、疾病的症状或青光眼的倾向。

减轻青光眼包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病并不一定需要治愈效果。如其中所使用的，“延迟”疾病(例如青光眼)的发展意味着推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或延后疾病的进展。这种延迟能够具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或被治疗的个体。一种“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是与不使用该方法相比时，在给定时间范围内降低发生一种或多种疾病症状的可能性和/或在给定的时间范围内减少症状程度的方法。这类比较通常基于临床研究，使用许多受试者，足以给出统计学显著结果。

疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域熟知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法察觉的进展。出于本公开内容的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，青光眼的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。

在一些实施方案中，将sfasl或其片段以足以将受试者的眼内压降低至少5％(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的受试者。在一些实施方案中，将sfasl或其片段以足以在受试者中灭活视网膜神经胶质细胞至少5％(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的受试者。在一些实施方案中，将sfasl或其片段以足以抑制受试者的tnfα活性至少5％(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的受试者。在一些实施方案中，将sfasl或其片段以足以减少受试者的视网膜神经节细胞(rgc)死亡和/或减少轴突变性至少5％(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量施用于需要治疗的受试者。

本文还提供了用于治疗fas配体依赖性炎性病症的方法和组合物。如本文所用，“fas配体依赖性炎性病症”是由fas配体依赖性炎症介导的病况或疾病。fas配体依赖性炎症可能与眼部炎症疾病有关。眼部炎性疾病的非限制性实例包括但不限于过敏性结膜炎、葡萄膜炎、巩膜炎、巩膜外层炎、视神经炎、角膜炎、眼眶假瘤、视网膜血管炎、慢性结膜炎和自身免疫诱导的慢性炎症(例如，类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)。通常，fas配体依赖性炎性病况与由mfasl引起的眼部炎症有关。不希望受任何特定理论的束缚，基于raav的sfasl递送减少了具有fas配体依赖性炎性病况的受试者的眼部炎症。

在一些实施方案中，治疗fas配体依赖性炎症病况的方法包括向有需要的受试者施用有效量的重组腺相关病毒(raav)，其中raav包含(i)衣壳蛋白和(ii)工程化以表达sfasl或其片段的核酸。

在一些实施方案中，用于治疗fas配体依赖性炎症病况的方法包括检测受试者组织中膜结合fas配体(mfasl)和/或可溶性fas配体(sfasl)的存在或不存在，并基于mfasl和/或sfasl的存在或不存在治疗受试者，其中治疗受试者包括向有需要的受试者施用有效量的重组腺相关病毒(raav)，其中raav包含(i)衣壳蛋白和(ii)经工程改造以表达sfasl或其片段的核酸。

技术人员认识到可以通过本领域已知的任何方法检测fasl蛋白(例如，fasl、mfasl或sfasl)。在一些实施方案中，使用电泳、western印迹和质谱法检测fasl蛋白。在一些实施方案中，在眼液(例如，眼内液、房水或泪液)中检测fasl蛋白。

组合疗法

本文还提供了使用本文所述的sfasl或其片段和另一种抗青光眼治疗剂(例如本文所述的那些)的组合疗法。如本文所用，术语组合疗法包括以顺序方式施用这些药剂(例如，sfasl或其片段和抗青光眼治疗剂)，即，其中每种治疗剂在不同时间施用，以及以基本上同时的方式施予这些治疗剂或至少两种药剂。

每种药剂的顺序或基本同时施用能够受任何适当途径的影响，包括但不限于raav介导的递送、口服途径、静脉内途径、肌肉内、皮下途径和通过粘膜组织的直接吸收。能够通过相同途径或通过不同途径施用药剂。例如，第一药剂(例如，sfasl或其片段)可以通过raav介导的递送施用，第二药剂(例如，抗青光眼剂)可以口服施用。

如本文所用，除非另有说明，否则术语“顺序”是指其特征在于规则的顺序或次序，例如，如果剂量方案包括施用sfasl或其片段和抗青光眼剂，则顺序剂量方案可以包括在施用抗青光眼剂之前、同时、基本上同时或之后施用sfasl或其片段，但两种药剂将以规则的顺序或次序施用。除非另有说明，否则术语“分开”是指彼此分开。除非另有说明，否则术语“同时”是指同时发生或完成，即本发明的药剂同时施用。术语“基本上同时”意味着药剂在彼此的几分钟内(例如，彼此在10分钟内)施用并且意图包括联合施用以及连续施用，但是如果施用是连续的，则其在时间上仅短期分开(例如，医生需要分开管理两种药剂的时间)。如本文所用，同时施用和基本上同时施用可互换使用。顺序施用是指在时间上分开给予本文所述的药剂。

联合治疗还能够包括进一步与其他生物活性成分(例如，不同的抗青光眼剂)和非药物疗法(例如，手术)组合的本文所述药剂(例如，sfasl或其片段和抗青光眼剂)的施用。

应当理解，sfasl或其片段与另一种抗青光眼剂(例如，通过滴眼剂递送的)的任何组合可以以任何顺序用于治疗青光眼。本文所述的组合可基于许多因素进行选择，包括但不限于减少青光眼疾病进展、降低眼内压(iop)、使视网膜神经胶质细胞失活、抑制tnfα活性、减少视网膜神经节细胞(rgc)死亡、减少轴突变性和/或减轻与青光眼相关的至少一种症状的有效性，或减轻组合中另一种药剂的副作用的有效性。例如，本文描述的组合疗法可以减少与组合的每个个体成员相关的任何副作用，例如，与抗青光眼剂相关的副作用。

在一些实施方案中，另一种抗青光眼治疗剂是滴眼剂、口服药物和/或手术疗法。滴眼剂可包含一种或多种治疗剂，例如前列腺素、β阻滞剂、α-肾上腺素能激动剂、碳酸酐酶抑制剂、缩瞳剂和胆碱能剂。在一些实施方案中，口服药物包含碳酸酐酶抑制剂。手术疗法的实例包括但不限于激光疗法、过滤手术、引流管和电烙术。

分离的核酸

在一些方面，本公开内容提供了可用于表达人sfasl或其片段的分离的核酸。“核酸”序列是指dna或rna序列。在一些实施方案中，分离本公开内容的蛋白质和核酸。如本文所用，术语“分离的”是指人工产生的。如本文关于核酸所用，术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链反应(pcr)体外扩增的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)通过裂解和凝胶分离纯化的；或(iv)通过例如化学合成合成的。分离的核酸是易于通过本领域熟知的重组dna技术操作的核酸。因此，已知其中的5'和3'限制性位点或已经公开了用于其的聚合酶链式反应(pcr)引物序列的载体中包含的核苷酸序列被认为是分离的，但是以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不被认为是分离的。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必需的。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸不是纯的，因为它可以仅包含其所在细胞中的物质的微小百分比。然而，当该术语在本文中使用是，这种核酸是分离的，因为它易于通过本领域普通技术人员已知的标准技术操作。如本文关于蛋白质或肽所用，术语“分离的”是指已从其天然环境中分离的或人工产生的蛋白质或肽(例如，通过化学合成，通过重组dna技术等)。

技术人员还将认识到，可以进行保守氨基酸取代以提供衣壳蛋白的功能等同变体或同源物。在一些方面，本公开内容包括导致保守氨基酸取代的序列改变。如本文所用，保守氨基酸取代是指不改变其中进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。变体可以根据本领域普通技术人员已知的改变多肽序列的方法制备，例如在编辑这些方法的参考文献中发现的，例如molecularcloning:alaboratorymanual,j.sambrook,等人编,第二版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989,或currentprotocolsinmolecularbiology,f.m.ausubel,等人编,johnwiley&sons,inc.,newyork。氨基酸的保守取代包括在以下组氨基酸之间进行的取代：(a)m,i,l,v；(b)f,y,w；(c)k,r,h；(d)a,g；(e)s,t；(f)q,n；和(g)e,d。因此，可以对本文公开的蛋白质和多肽的氨基酸序列进行保守氨基酸取代。

本发明的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(aav)载体(raav载体)。在一些实施方案中，如本公开内容所述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)或其变体的区域(例如，第一区域)。可以将分离的核酸(例如，重组aav载体)包装到衣壳蛋白中并施用于受试者和/或递送至选定的靶细胞。“重组aav(raav)载体”通常至少包含转基因及其调节序列和5'和3'aav反向末端重复序列(itr)。如本文其他地方所公开的，转基因可以包含编码一种或多种蛋白质(例如，人sfasl或其片段)的一个或多个区域。如本公开中其他地方所述，转基因还可以包含编码例如mirna结合位点，和/或表达控制序列(例如，多聚a尾)的区域。

通常，itr序列的长度约为145bp。优选地，基本上编码itr的整个序列用于分子中，尽管这些序列的某种程度的微小修饰是允许的。修饰这些itr序列的能力在本领域技术范围内。(参见例如教科书如sambrookdr等人，"molecularcloning.alaboratorymanual",第二版,coldspringharborlaboratory,newyork(1989)；和k.fisher等人,jvirol.,70:520532(1996))。用于本发明的这种分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选择的转基因序列和相关的调节元件位于5'和3'aavitr序列的侧翼。aavitr序列可以从任何已知的aav获得，包括目前鉴定的哺乳动物aav类型。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，raav载体)包含至少一种具有选自aav1、aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11及其变体的血清型的itr。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码aav2itr的区域(例如，第一区域)。

在一些实施方案中，分离的核酸还包含含有第二aavitr的区域(例如，第二区域，第三区域，第四区域等)。在一些实施方案中，第二aavitr具有选自aav1、aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11及其变体的血清型。在一些实施方案中，第二itr是缺乏功能性末端拆分位点(trs)的突变体itr。术语“缺乏末端拆分位点”可以指包含突变(例如，诸如非同义突变的有义突变或错义突变)的aavitr，其消除itr的末端拆分位点(trs)，或指缺乏编码功能性trs的核酸序列的截短的aavitr(例如，δtrsitr)。不希望受任何特定理论的束缚，包含缺乏功能性trs的itr的raav载体产生自身互补的raav载体，例如如mccarthy(2008)moleculartherapy16(10):1648-1656所述。

除了上文鉴定的重组aav载体的主要元件外，载体还包括常规的控制元件，其以允许其在用载体转染或用本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因的元件有效连接。如本文所用，“有效连接”的序列包括与目的基因邻接的表达控制序列和反式或远距离起作用以控制目的基因的表达控制序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna处理信号，如剪接和聚腺苷酸化(多聚a)信号；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；并且当需要时，增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以使用。

如本文所用，当核酸序列(例如，编码序列)和调节序列以使得核酸序列的表达或转录置于受调节序列的影响或控制的方式共价连接时，称其有效连接。如果希望将核酸序列翻译成功能性蛋白质，则如果5'调节序列中的启动子的诱导导致编码序列的转录以及如果两个dna序列之间的连接性质不会(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰将相应的rna转录物翻译成蛋白质的能力，则认为两个dna序列有效连接。因此，如果启动子区能够影响该dna序列的转录，使得所得的转录物可以翻译成所需的蛋白质或多肽，则启动子区域将与核酸序列有效连接。类似地，两个或更多个编码区在它们以这样的方式连接时有效连接，即它们从共同启动子的转录导致已在框内翻译的两个或更多个蛋白质的表达。在一些实施方案中，有效连接的编码序列产生融合蛋白。在一些实施方案中，有效连接的编码序列产生功能性rna(例如，mirna)。

“启动子”是指由细胞合成机制或引入的合成机制识别，启动基因特异性转录所需的dna序列。短语“有效定位的”、“在控制下的”或“在转录控制下的”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制rna聚合酶的起始和基因的表达。

对于编码蛋白质的核酸，通常在转基因序列之后和3'aavitr序列之前插入多腺苷酸化序列。可用于本公开内容的raav构建体还可含有内含子，其理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列源自sv-40，并且被称为sv-40t内含子序列。可以使用的另一种载体元件是内部核糖体进入位点(ires)。ires序列用于从单个基因转录物产生一种以上的多肽。ires序列将用于产生含有多于一条多肽链的蛋白质。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的[参见例如sambrook等人，以及其中引用的参考文献，例如，第3.183.26和16.1716.27页和ausubel等人,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,1989]。在一些实施方案中，口蹄疫病毒2a序列包含在多蛋白中；这是一种小肽(长度约为18个氨基酸)，其已被证明可介导多蛋白的裂解(ryan,md等人,embo,1994；4:928-933；mattion,nm等人,jvirology,1996年11月；p.8124-8127；furler,s等人,genetherapy,2001；8:864-873；和halpin,c等人,theplantjournal,1999；4:453-459)。先前已在包括质粒和基因治疗载体(aav和逆转录病毒)的人工系统中证明了2a序列的切割活性(ryan,md等人,embo,1994；4:928-933；mattion,nm等人,jvirology,1996年11月；p.8124-8127；furler,s等人,genetherapy,2001；8:864-873；和halpin,c等人,theplantjournal,1999；4:453-459；defelipe,p等人,genetherapy,1999；6:198-208；defelipe,p等人,humangenetherapy,2000；11:1921-1931.；和klump,h等人,genetherapy,2001；8:811-817)。

组成型启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地具有rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地具有cmv增强子)[参见，例如boshart等人,cell,41:521-530(1985)]、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1α启动子[invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子是u6启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。

诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物，环境因素例如温度或特定生理状态的存在来调节，例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。诱导型启动子和诱导型系统可从各种商业来源获得，包括但不限于invitrogen、clontech和ariad。已经描述了许多其他系统，并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(mt)启动子、地塞米松(dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统(wo98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(no等人,proc.natl.acad.sci.usa,93:3346-3351(1996))、四环素-可抑制系统(gossen等人,proc.natl.acad.sci.usa,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(gossen等人,science,268:1766-1769(1995)，还参见harvey等人,curr.opin.chem.biol.,2:512-518(1998))、ru486诱导系统(wang等人,nat.biotech.,15:239-243(1997)和wang等人,genether.,4:432-441(1997))和雷帕霉素诱导系统(magari等人,j.clin.invest.,100:2865-2872(1997))。在本文中可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态调节的启动子，例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中。

在另一个实施方案中，将使用用于转基因的天然启动子。当希望转基因的表达应该模拟天然表达时，天然启动子可能是优选的。当转基因的表达必须在时间上或发育上，或以组织特异性方式，或响应特定转录刺激而被调控时，可以使用天然启动子。在另一个实施方案中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件、多腺苷酸化位点或kozak共有序列也可用于模拟天然表达。

在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合组织特异性转录因子，其以组织特异性方式诱导转录。此类组织特异性调节序列(例如，启动子、增强子等)是本领域熟知的。在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子。眼特异性启动子的实例包括但不限于视网膜劈裂素启动子、k12启动子、视紫红质启动子、视杆特异性启动子、视锥特异性启动子、视紫红质激酶启动子，grk1启动子、光感受器间维甲酸结合蛋白近端(irbp)启动子和视蛋白启动子(例如，红色视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子等)。

重组腺相关病毒(raav)

在一些方面，本公开内容提供了分离的aav。如本文关于aav所用，术语“分离的”是指人工产生或获得的aav。可以使用重组方法产生分离的aav。此类aav在本文中称为“重组aav”。重组aav(raav)优选具有组织特异性靶向能力，使得raav的转基因将特异性递送至一种或多种预定组织。aav衣壳是确定这些组织特异性靶向能力的重要因素。因此，可以选择具有适合于被靶向组织的衣壳的raav。

获得具有所需衣壳蛋白的重组aav的方法是本领域熟知的。(参见，例如，us2003/0138772)，其内容通过引用整体并入本文)。通常，该方法包括培养宿主细胞，其含有编码aav衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；包含aav反向末端重复序列(itr)和转基因的重组aav载体；和足够的辅助功能，以允许将重组aav载体包装到aav衣壳蛋白中。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由aav的cap基因编码的结构蛋白。aav包含三种衣壳蛋白，病毒粒子蛋白1至3(命名为vp1、vp2和vp3)，所有这些都通过可变剪接从单个cap基因转录。在一些实施方案中，vp1、vp2和vp3的分子量分别为约87kda、约72kda和约62kda。在一些实施方案中，翻译后，衣壳蛋白在病毒基因组周围形成球形60聚体蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组，递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。

在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有选自aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav8、aavrh8、aav9和aav10的aav血清型。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白是源自非人灵长类动物的血清型，例如aavrh8血清型。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有对受试者眼睛具有趋向性的血清型，例如aav(例如，aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aavrh.8、aavrh.10、aavrh.39和aavrh.43)，其比其他载体更有效地转导受试者的眼细胞。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有aav8血清型或aav5血清型。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白包含seqidno：1中所示的序列。

在宿主细胞中培养以将raav载体包装在aav衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，重组aav载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，所述宿主细胞使用本领域技术人员已知的方法经工程改造以含有一种或多种所需组分。最合适的是，这种稳定的宿主细胞含有在诱导型启动子控制下的所需组分。但是，所需的组分可能处于组成型启动子的控制之下。在适合与转基因一起使用的调节元件的讨论中，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的实例。在另一个替代方案中，选定的稳定宿主细胞可以含有在组成型启动子控制下的选定组分和在一种或多种诱导型启动子控制下的其他选定组分。例如，可以产生稳定的宿主细胞，其衍生自293细胞(其含有在组成型启动子的控制下的e1辅助功能)，但其含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白。本领域技术人员可以产生其他稳定的宿主细胞。

在一些实施方案中，本公开内容涉及含有核酸的宿主细胞，所述核酸包含编码蛋白质(例如，sfasl蛋白质或其片段)的编码序列。在一些实施方案中，本公开内容涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物还包含冷冻保存剂。

可以使用任何合适的遗传元件(载体)将产生本公开内容的raav所需的重组aav载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。所选择的遗传元件可以通过任何合适的方法包括本文所述的那些进行递送。用于构建本公开内容的任何实施方案的方法是核酸操作领域技术人员已知的，并包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborpress,coldspringharbor,n.y.。类似地，产生raav病毒体的方法是众所周知的，并且合适方法的选择不是对本公开内容的限制。参见，例如，k.fisher等人,j.virol.,70:520-532(1993)和美国专利号5,478,745。

在一些实施方案中，可以使用三重转染方法产生重组aav(在美国专利号6,001,650中详细描述)。通常，通过用重组aav载体(包含转基因)转染宿主细胞以包装成aav颗粒、aav辅助功能载体和辅助功能载体来产生重组aav。aav辅助功能载体编码“aav辅助功能”序列(即rep和cap)，其反式起作用以进行有效的aav复制和衣壳化。优选地，aav辅助功能载体支持有效的aav载体产生，而不产生任何可检测的野生型aav病毒粒子(即含有功能性rep和cap基因的aav病毒粒子)。适用于本公开内容的载体的非限制性实例包括描述于美国专利号6,001,650中的phlp19和描述于美国专利号6,156,303中的prep6cap6载体，其全部内容通过引用并入本文。辅助功能载体编码非aav衍生的病毒和/或aav依赖于其复制(即“辅助功能”)的细胞功能的核苷酸序列。辅助功能包括aav复制所需的那些功能，包括但不限于参与aav基因转录激活、阶段特异性aavmrna剪接、aavdna复制、cap表达产物的合成和aav衣壳组装的那些部分。基于病毒的辅助功能可以衍生自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型)和痘苗病毒。

在一些方面，本公开内容提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞对外源dna的摄取，当外源dna被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术通常是本领域已知的。参见，例如，graham等人.(1973)virology,52:456,sambrook等人.(1989)molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratories,newyork,davis等人.(1986)basicmethodsinmolecularbiology,elsevier,和chu等人.(1981)gene13:197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸(例如核苷酸整合载体和其他核酸分子)引入合适的宿主细胞中。

“宿主细胞”是指任何含有或能够携带感兴趣物质的细胞。宿主细胞通常是哺乳动物细胞。宿主细胞可以用作aav辅助构建体、aav小基因质粒、辅助功能载体或与重组aav的产生相关的其他转移dna的接受者。该术语包括已经被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”可以指已经用外源dna序列转染的细胞。应当理解，由于天然的、偶然的或有意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学上或在基因组或总dna互补物(complement)中可能不一定与原始亲本完全相同。

如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域进一步已知，在这种克隆群体的储存或转移期间，核染色中可发生自发或诱导的变化。因此，来自所提及的细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所指的细胞系包括这些变体。

如本文所用，术语“重组细胞”是指已经引入了外源dna区段(例如导致生物活性多肽转录或产生生物活性核酸如rna的dna区段)的细胞。

如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，当与适当的控制元件结合时能够复制并且它能够在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。在一些实施方案中，预期有用载体是其中待转录的核酸区段位于启动子的转录控制下的那些载体。“启动子”是指由启动基因特异性转录所需的细胞合成机制或引入的合成机制识别的dna序列。短语“可操作地定位”、“在控制下”或“在转录控制下”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制rna聚合酶的起始和基因的表达。术语“表达载体或构建体”意指含有核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如，以从转录的基因产生生物活性多肽产物或功能性rna(例如，指导rna)。用于将重组载体包装在所需aav衣壳中以产生本公开的raav的前述方法不意味着限制，并且其他合适的方法对于技术人员是显而易见的。

raav介导的sfasl转基因向眼睛的递送

本文提供了将转基因递送至受试者的眼部(例如，光细胞受体例如视杆细胞或视锥细胞、视网膜细胞等)组织的方法。该方法通常包括向受试者施用有效量的raav，其包含用于在受试者中表达转基因(例如，sfasl蛋白或其片段)的核酸。“有效量”的raav是足以感染受试者中足够数量的靶组织细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是眼(例如，光感受器、视网膜等)组织。有效量的raav可以是足以在受试者中具有治疗益处的量，例如，在受试者中改善一种或多种疾病症状，例如青光眼的症状。青光眼症状的实例包括但不限于外周和/或中央视力中的盲点、隧道视力、严重头痛、眼痛、恶心和呕吐、视力模糊、灯光周围的晕圈和眼睛发红。有效量将取决于多种因素，例如，受试者的物种、年龄、体重、健康状况和待靶向的组织，因此可以在受试者和组织之间变化。

有效量也可取决于所用的raav。本发明部分基于以下认识：包含衣壳蛋白的某些raav介导眼(例如，光感受器、视网膜等)细胞的有效转导。在一些实施方案中，本文提供的方法中使用的raav包含选自下组的aav血清型衣壳蛋白：aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aavrh.8、aavrh.10、aavrh.39和aavrh.43。在一些实施方案中，raav包含aav2血清型的衣壳蛋白(seqidno：1)。在一些实施方案中，衣壳蛋白包含与seqidno：1具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，衣壳蛋白是aav2衣壳蛋白。

在某些实施方案中，raav的有效量是10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个基因组拷贝/kg。在某些实施方案中，raav的有效量是10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴或10¹⁵个基因组拷贝/个受试者。

有效量也可取决于施用模式。例如，在一些情况下，通过基质内施用或皮下注射靶向眼(例如，光感受器、视网膜等)组织可能需要不同于通过另一种方法(例如，全身给药，局部给药)靶向眼睛(例如，光感受器、视网膜等)组织(例如，更高或更低)的剂量。在一些实施方案中，具有某些血清型的raav(例如，aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aavrh.8、aavrh.10、aavrh.39和aavrh.43)的基质内注射(is)介导有效转导眼(例如，角膜、光感受器、视网膜等)细胞。因此，在一些实施方案中，注射是基质内注射(is)。在一些实施方案中，施用是通过注射，任选地视网膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射是局部施用(例如，局部施用于眼睛)。在一些情况下，施用多剂量的raav。

在一些实施方案中，本文所述的raav对眼(例如，光感受器、视网膜等)细胞的有效转导可用于治疗患有青光眼(例如，开角型青光眼)的受试者。因此，本文还提供了用于治疗青光眼的方法和组合物。在一些方面，本公开内容提供了治疗青光眼(例如，开角型青光眼)的方法，该方法包括：向患有或怀疑患有青光眼的受试者施用有效量的raav，其中所述raav包含(i)衣壳蛋白，其具有选自aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aavrh.8、aavrh.10、aavrh.39和aavrh.43的血清型，和(ii)核酸，其包含与转基因(例如，如本公开内容所述的编码sfasl蛋白或其片段的转基因)可操作地连接的启动子。

在一些实施方案中，如本公开内容所述的raav(或分离的核酸)的施用导致视网膜神经元的转导。视网膜神经元的实例包括但不限于双极细胞、神经节细胞、水平细胞、视网膜无长突细胞、视杆细胞和视锥细胞。

在一些实施方案中，如本公开内容所述的raav(或分离的核酸)的施用导致视网膜神经节细胞(rgc)的转导。rgc的实例包括但不限于w-神经节细胞、x-神经节细胞、y-神经节细胞、侏儒细胞、伞状(parasol)细胞、双纹理(bistratified)细胞、光敏神经节细胞和投射到上丘用于眼部运动的其他神经节细胞。

视网膜神经节细胞在大小、连接和对视觉刺激的反应方面存在显著差异，但它们都具有延伸到大脑中的长轴突的定义特性。这些轴突形成视神经、视交叉和视神经束。在一些实施方案中，如本公开内容所述的raav(或分离的核酸)的施用防止rgc、轴突或其组合的死亡。

可以根据本领域已知的任何适当方法将组合物中的raav递送至受试者。优选悬浮在生理学上相容的载体中(即在组合物中)的raav可以施用于受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人灵长类动物(如猕猴)。在一些实施方案中，宿主动物不包括人。

将raav递送至哺乳动物受试者可以通过例如眼内注射或局部施用(例如滴眼剂)。在一些实施方案中，眼内注射是基质内注射、结膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射不是局部施用。也可以使用施用方法的组合(例如，局部施用和基质内施用)。

本公开内容的组合物可以单独包含raav，或者与一种或多种其他病毒(例如，具有一种或多种不同转基因的第二种raav编码)组合。在一些实施方案中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的raav，每种raav具有一种或多种不同的转基因。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。考虑到raav所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以用各种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其他示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载体的选择不是对本公开的限制。

任选地，除了raav和载体之外，本公开内容的组合物还可以含有其他药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

以足够的量施用raav以转染所需组织(例如，眼组织，例如光感受器、视网膜等组织)的细胞，并提供足够水平的基因转移和表达，而没有过度的不利影响。药学上可接受的施用途径的实例包括但不限于直接递送至所选器官(例如，视网膜下递送至眼睛)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、瘤内和其他肠胃外的施用途径。如果需要，可以组合施用途径。

实现特定“治疗效果”所需的raav病毒粒子的剂量，例如基因组拷贝/每千克体重(gc/kg)中的剂量单位，将基于若干因素而变化，包括但不限于：raav病毒粒子施用途径，达到治疗效果所需的基因或rna表达水平，所治疗的特定疾病或病症，以及基因或rna产物的稳定性。基于上述因素以及其他因素，本领域技术人员可以容易地确定raav病毒体剂量范围以治疗患有特定疾病或病症的患者。

有效量的raav是足以靶向感染动物、靶向期望组织的量。有效量主要取决于诸如物种、年龄、体重、受试者健康和待靶向组织等因素，因此可在动物和组织之间变化。例如，有效量的raav通常在约1ml至约100ml的溶液含有约10⁹至10¹⁶个基因组拷贝的范围内。在一些情况下，约10¹¹至10¹³个raav基因组拷贝的剂量是合适的。在某些实施方案中，10⁹个raav基因组拷贝对靶向眼组织(例如，角膜组织)是有效的。在一些实施方案中，当施用于受试者的眼睛时，比10⁹个raav基因组拷贝更浓缩的剂量是有毒的。在一些实施方案中，通过多剂量的raav产生有效量。

在一些实施方案中，将raav的剂量以每个日历日(例如，24小时)施用于受试者不超过一次。在一些实施方案中，将raav的剂量以每2、3、4、5、6或7个日历日施用于受试者不超过一次。在一些实施方案中，将raav的剂量以每个日历周(例如，7个日历日)施用于受试者不超过一次。在一些实施方案中，将raav的剂量以不超过每两周一次的方式(例如，在两个日历周期间一次)施用于受试者。在一些实施方案中，将raav的剂量以每个日历月施用于受试者不超过一次(例如，在30个日历日中一次)。在一些实施方案中，将raav的剂量以每6个日历月施用于受试者不超过一次。在一些实施方案中，将raav的剂量以每个日历年(例如，365个日历日或在闰年的情况下366天)施用于受试者不超过一次。在一些实施方案中，将raav的剂量以每2个日历年(例如，730个日历日或在闰年的情况下731天)施用于受试者不超过一次。在一些实施方案中，将raav的剂量以每3个日历年(例如，1095个日历日或在闰年的情况下1096天)施用于受试者不超过一次。

在一些实施方案中，配制raav组合物以减少组合物中aav颗粒的聚集，特别是在存在高raav浓度的情况下(例如，约10¹³gc/ml或更高)。用适当的减少聚集的方法，包括例如添加表面活性剂、ph调节、盐浓度调节等。(参见，例如，wrightfr等人,moleculartherapy(2005)12,171–178，其内容通过引用并入本文。)

药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制对于本领域技术人员来说是公知的，在开发合适的剂量和治疗方案以在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物时。通常，这些制剂可含有至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以变化，并且可以方便地在总配方重量或体积的约1或2％至约70％或80％或更多之间变化。当然，可以制备每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量，使得以任何给定单位剂量的化合物获得合适的剂量。制备此类药物制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑因素等因素，并且因此，各种剂量和治疗方案可能是可取的。

在一些实施方案中，将本文公开的适当配制的药物组合物中的raav直接递送至靶组织，例如直接递送至眼组织(例如，光感受器、视网膜等组织)。然而，在某些情况下，可能需要单独或另外通过另一种途径递送基于raav的治疗构建体，例如皮下、胰腺内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌肉内、鞘内或口服、腹膜内或通过吸入。在一些实施方案中，如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自通过引用整体并入本文)中所述的施用模式可以用于递送raav。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过玻璃体内注射或视网膜下注射。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。在许多情况下，该形式是无菌的并且是到易于注射程度的流体。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体能够是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，能够实现可注射组合物的延长吸收。

对于可注射水溶液的给药，例如，如果需要，可以适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用合适的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗nacl溶液中，并且将其添加到1000ml的皮下注射液中或者在建议的输注部位注射(参见例如，"remington'spharmaceuticalsciences"第15版，第1035-1038页和1570-1580)。取决于宿主的状况，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体宿主的适当剂量。

通过将所需量的活性raav掺入适当的溶剂中，根据需要与本文列举的各种其他成分一起制备无菌可注射溶液，然后过滤灭菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

本文公开的raav组合物还可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)并且与无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。

如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬浮液、胶体等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。补充的活性成分也能够掺入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当给予宿主时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。

递送载体如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，可以配制递送转基因的raav载体以用于包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中的递送。

此类制剂可优选用于引入本文公开的核酸或raav构建体的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用通常是本领域技术人员已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制备物作为潜在药物载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。

脂质体已经成功地与许多细胞类型一起使用，这些细胞类型通常对其他程序的转染具有抗性。此外，脂质体没有dna长度限制，这是典型的基于病毒的递送系统。脂质体已被有效地用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了几项成功的临床试验，这些试验检验了脂质体介导的药物递送的有效性。

脂质体由磷脂形成，磷脂分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(mlv))。mlv通常具有25nm至4μm的直径。mlv的超声处理导致形成直径在200至的小单层囊泡(suv)，其在核中含有水溶液。

或者，可以使用raav的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常能够以稳定且可重复的方式捕获物质。为了避免由细胞内聚合物过载引起的副作用，应该使用能够在体内降解的聚合物设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。

试剂盒和相关组合物

在一些实施方案中，本文所述的药剂可以组装成药物的或诊断的或研究试剂盒，以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的用途。试剂盒可包括容纳本公开内容的组分和使用说明的一个或多个容器。具体地，此类试剂盒可包括本文所述的一种或多种试剂，以及描述预期应用和这些试剂的正确使用的说明书。在某些实施方案中，试剂盒中的药剂可以是适合于特定应用和施用该药剂的方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可包含用于进行各种实验的适当浓度或量的组分。

在一些实施方案中，本公开内容涉及用于产生raav的试剂盒，所述试剂盒包含容纳分离的核酸的容器，所述分离的核酸包含编码sfasl蛋白或其片段的转基因，所述转基因具有seqidno：3所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含容纳编码aav衣壳蛋白例如aav2衣壳蛋白(例如，seqidno：1)的分离的核酸的容器。

试剂盒可以设计成便于研究人员使用本文所述的方法，并且能够采用多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如，在溶液中)或以固体形式(例如干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的或可加工的(例如，以活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如，水或细胞培养基)，其在试剂盒中可能提供或可能不提供。如本文所使用的，“说明书”能够定义说明和/或倡议的组分，并且通常涉及与本公开的包装相关联或与之相关的书面说明。说明书还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明书，使得用户将清楚地认识到说明书与该试剂盒相关联，例如，视听(例如，录像带、dvd等)、因特网和/或基于网络的通讯等。书面说明书可以是由管理药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明书也可以反映制造、使用或销售用于动物管理的机构的批准。

试剂盒可以在一个或多个容器中包含本文所述的任何一种或多种组分。作为实例，在一个实施方案中，试剂盒可包括用于混合试剂盒的一种或多种组分和/或分离和混合样品并施用于受试者的说明书。该试剂盒可包括容纳本文所述的药剂的容器。药剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。药剂可以无菌制备、包装在注射器中并冷藏运输。或者，它可以容纳在小瓶或其他容器中用于储存。第二容器可以具有无菌制备的其他药剂。或者，试剂盒可包括预混合的活性剂，并在注射器、小瓶、管或其他容器中运输。

通过以下实施例更详细地描述本发明的示例性实施方案。这些实施方案是本发明的示例，本领域技术人员将认识到，本发明不限于示例性实施方案。

实施例

实施例1：高水平的mfasl与fas介导的凋亡和非凋亡炎症途径的激活一致

材料与方法

动物

所有动物实验均由schepens眼科研究所的动物护理和使用指导委员会批准，并且在视觉和眼科研究协会(rockville，md)的指导下进行。购买dba/2j-gpnmb⁺/sjj小鼠(d2-gp)。通过将δcs建立者小鼠与购自jacksonlaboratories的dba/2j小鼠杂交10代来产生表达δcs突变的dba/2j小鼠。在10代之后，将δcs突变杂合的d2.δcs小鼠杂交以产生对于δcs突变(d2.δcs)小鼠和wt同窝小鼠(d2)纯合的d2.δcs。在schepens眼科研究所的aaalac批准的动物设施中，将所有三种基因型(d2、d2.δcs和d2.gp)圈养并保持在循环光(12l-30lux:12d)条件下。

iop测量

用回弹tonolab眼压计(colonialmedicalsupply,espoo,芬兰)测量iop。将小鼠用100％氧气中的3％异氟烷麻醉(诱导)，然后用100％氧气中的1.5％异氟烷(维持)麻醉，用精密蒸发器递送。在动物失去脚趾反射或尾部捏反应后2至3分钟内开始iop测量。将麻醉的小鼠置于平台上，并将压力传感器的尖端放置在离中央角膜约1/8英寸处。消除最高值和最低值后，在6次测量后自动显示平均iop。该机器产生的平均值被认为是一个读数，并且每只眼睛获得六个读数。对于d2.gp、d2和d2.δcs小鼠，每月测量一次iop。对于微珠研究，在微珠注射前一天获得基线iop，然后在微珠注射后每三天测量iop。由于iop在一天中的变化，所有iop均在一天的同一时间(10:00至12:00之间)进行。

视网膜神经节细胞的定量

分离神经视网膜并在室温下在4％多聚甲醛中固定2小时。将视网膜平板支架(flatmount)与针对rgc特异性标记物和β-iii-微管蛋白的一抗(millipore，billerica，ma)在4℃孵育过夜。alexafluor594-缀合的二抗(invitrogen)用作二抗。细胞核用dapi复染。使用60x油浸，拍摄十六个非重叠图像，其中每个象限内有四五个图像。计数用β-iii-微管蛋白抗体阳性标记的神经节细胞层中的所有细胞。使用imagej软件测量视网膜面积，并计算rgc密度/mm²视网膜。

视神经轴突的定量

为了定量轴突，将视神经解剖并固定在karnovsky试剂(50％在磷酸盐缓冲液中)过夜。在球体后方1.0mm处取出神经的半薄横截面，并在karnovsky溶液(50％溶于磷酸盐缓冲液中)固定过夜。制备超薄(60-90nm)视神经横截面并用1％对苯二胺(ppd)染色以通过光学显微镜评估。以100x放大率拍摄10个非重叠显微照片，覆盖视神经横截面的整个区域。用imagej软件确定每个视神经横截面的总面积，并且该值用于估计每个视神经横截面的总轴突密度。

tunel染色

通过tunel染色评估凋亡细胞。取出眼睛，用10％福尔马林固定。处理眼睛并将安装在载玻片上的20μm石蜡切片用于染色。根据制造商的方案(insitucelldeathdetectionkit；rocheappliedscience,mannheim，德国,11684795910)，在染色tunel之前对切片进行去石蜡化。使用具有dapi的vectarshield封固剂(vectorlaboratories，h-1200)封固切片。洗涤切片，盖上盖子并通过共聚焦激光扫描显微镜(leicamicrosystems并使用sp6软件处理)检查。

定量rt-pcr

在安乐死麻醉的时间点，用10ml1xpbs通过左心室灌注小鼠。灌注后，根据制造商的方案，使用qiagenrneasymini试剂盒(目录号74104)将眼摘出并从神经视网膜中分离rna。用dnase(目录号am222，invitrogen)处理rna以确保没有基因组dna的污染。根据制造商的方案，使用来自bio-rad的iscriptcdna合成试剂盒(目录号170-8890)，使用500ngrna制备cdna。用rnaseh(18021-014，invitrogen)处理cdna以确保不存在单链rna。使用来自invitrogen的预混合物(目录号4472903)，使用制造商的方案，以10μl总体积重复进行定量实时pcr。使用下式对管家基因β-肌动蛋白的相对表达进行定量：相对表达＝10,000x1/2^(平均基因ct-平均β-肌动蛋白ct)。所用的所有引物列于表1中。

表1.用于实时pcr的rna引物列表。

western印迹分析

为了评估d2、d2.gp和d2.δcs小鼠的后段中的总fasl表达，从后眼杯(神经视网膜、脉络膜和巩膜)制备蛋白质裂解物(20μg/样品)。为了评估在aav2处理的眼睛的神经视网膜中sfasl的过度表达，仅从神经视网膜制备蛋白质裂解物(5ug/样品)。在12％tris-甘氨酸凝胶(invitrogen，carlsbadca)上分离蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜(invitrogen，carlsbadca)上。使用多克隆兔抗fas配体抗体，然后使用irdye二抗(li-corbiotechnology，lincolnne)探测膜的fas配体。小鼠β肌动蛋白用于评估相等的上样。使用li-corodyssey成像系统(li-corbiotechnology，lincolnne)显影每个印迹。使用imagestudio软件进行密度测定。将过表达sfasl或mfasl的l5178y-r肿瘤转染子用作阳性对照，并将从fasl-ko小鼠制备的后眼杯制备的蛋白质裂解物用作阴性对照。

统计学

所有数据均以平均值±sem表示。graphpadprism6(lajolla,ca,usa)。为了比较，双向anova、单向anova和tukey多重比较检验用于d2-aav2.egfp和d2-aav2.sfasl，且sidak多重比较检验用于微珠诱导的iop升高模型。p值小于0.05被认为是显著的。

结果

d2.δcs小鼠中的加速青光眼

由于gpnmb和tyrp1基因的突变分别触发虹膜基质萎缩和色素分散，dba/2j(d2)小鼠自发地发展与月龄相关的升高的眼内压(iop)。结果，约6-8个月龄的d2小鼠的iop升高，随后rgc和神经纤维丧失。已经证明，仅表达膜形式的fasl(d2.δcs)的dba/2j小鼠在5月龄时显示出神经纤维层的显著变薄，而这在表达wtfasl的d2小鼠中未见。神经纤维层的早期变薄表明青光眼的发展加速。

为了证明d2.δcs小鼠中青光眼的加速发展，将年轻和年老d2.δcs小鼠的疾病进展与表达wtfasl(阳性对照)的d2同窝小鼠和表达正常gpnmb基因的dba/2j同基因小鼠(d2-gp)(阴性对照)进行比较，d2-gp小鼠由于tyrp1突变而发展非常轻微形式的虹膜疾病，但不产生升高的眼内压(iop)或青光眼。在3、6和9个月龄时使用回弹张力测量法测量iop(图1a)。与阴性对照d2.gp小鼠相比，d2和d2.δcs小鼠在6月龄时显示升高的iop。然而，任何月龄的d2和d2.δcs之间的iop没有显著差异，表明δcs突变不影响iop。

为了确定在d2.δcs小鼠中rgc和/或轴突的丧失是否加速，在3和6月龄时对小鼠组进行安乐死，并且用rgc特异性标记物βiii微管蛋白染色视网膜平板支架以评估rgc密度，且视神经切片用对苯二胺(ppd)染色以评估轴突密度。d2小鼠中rgc和轴突的丧失与月龄相关，并且仅在>8个月大的小鼠中发展。因此，与d2.gp小鼠相比，在3和6个月龄时，d2显示没有显著的rgc损失(图1b-1c)或轴突(图1d-1e)。相反，d2.δcs小鼠在6个月龄时发生rgc(图1b-1c)和轴突(图1d-1e)的早期丧失，表明d2.δcs小鼠中不可切割的fasl的表达导致青光眼的加速发展。

为了证明在d2.δcs小鼠中rgc的加速死亡是由于细胞凋亡，对来自d2、d2.δcs和d2.gp小鼠在3和6月龄时的视网膜切片进行tunel染色。与d2和d2.gp小鼠相比，在3个月龄(图2a-2b)和6个月龄(图2c-2d)的d2.δcs的rgc层中检测到tunel+细胞。此外，在6月龄时，在d2.δcs小鼠中检测到的tunel阳性细胞不再局限于rgc层(图2c)。总之，这些结果表明d2.δcs小鼠通过细胞凋亡和轴突丧失显示rgc的早期死亡，导致青光眼的加速发展。

在d2.δcs小鼠中fas、fasl和fadd的表达

为了确定iop升高对d2和d2.δcs小鼠中fas诱导的凋亡途径组分的影响，通过定量rt-pcr分析视网膜中fas、fasl和fadd的mrna水平，并使用western印迹确定mfasl和sfasl的相对表达。

在d2、d2.δcs或d2.gp小鼠中，在3或6个月龄时fasmrna表达没有显著差异(图3a)。相比之下，6个月大的d2.δcs小鼠显示fasl和fadd的mrna的显著增加，fasl和fadd是fas诱导的细胞凋亡的外在途径的介质(图3b-3c)。因为在6个月龄的d2.δcs小鼠中检测到sfasl表达时检测到mfasl表达(图3d-3f)，所以fasl的增加是由于mfasl的表达增加。fasl的不可检测的表达与d2.δcs小鼠中fasl切割位点的敲入突变一致，所述敲入突变阻止视网膜中sfasl的表达。此外，该实验显示在具有fasl的wt等位基因(d2.gp和d2小鼠)的小鼠中，sfasl是视网膜中表达的fasl的主要形式，表明在眼睛中，在稳态条件下，大多数fasl被切割成可溶形式。

总之，这些数据表明在6个月时在d2-δcs小鼠中观察到的rgc的加速丧失与mfasl的表达增加和fas诱导的细胞凋亡的外在途径的介质的诱导一致。

在d2-δcs小鼠中的米勒细胞活化

跨越所有视网膜层的米勒细胞构成视网膜的主要神经胶质细胞并为视网膜神经元提供支持。在正常视网膜中，胶质纤维酸性蛋白(gfap)通过星形胶质细胞和米勒细胞的末端足在神经纤维层中表达。然而，在青光眼中，由于反应性神经胶质增生，米勒细胞中的gfap表达显著增加，并且被认为是神经炎症的指标。

为了确定d2.δcs小鼠中青光眼的加速发展是否与促炎性米勒细胞的早期活化一致，在d2、d2.δcs和d2.gp小鼠中在3和6月龄时通过进行rt-pcr和使用抗gfap抗体的免疫组织化学染色测量视网膜中的gfap表达。在3个月龄时，所有三组小鼠的gfap表达仅限于神经纤维层中的星形胶质细胞和米勒细胞末端足，并且d2、d2.δcs和d2.gp小鼠之间的gfap表达没有显著差异(图4a-4b)。然而，与d2和d2.gp小鼠相比，到6个月龄时，d2.δcs小鼠中gfap的表达不再局限于神经纤维层中的星形胶质细胞和研磨末端足，而是延伸到视网膜米勒细胞的整个长度，这与gfapmrna水平显著增加同时发生(图4a-4b)。与d2和d2.gp小鼠相比，gfap的增加与d2.δcs小鼠中tnfαmrna水平的显著增加一致(图4c)。tnfα由青光眼中活化的神经胶质细胞产生，并与神经胶质激活、炎症和rgc死亡的介导有关。这些数据表明，表达高水平mfasl的d2.δcs小鼠中rgc的加速丧失不仅与诱导rgc凋亡有关，而且与神经胶质激活和tnfα诱导一致。因此，d2.δcs小鼠中高水平的mfasl与fas介导的凋亡和非凋亡炎症途径的激活一致。

实施例2：sfasl的递送在青光眼小鼠模型中提供治疗效果

材料与方法

病毒载体的构建

制备腺相关载体scaav2-cb6-pi-egfp和scaav2-cb6-pi-sfaslecto。scaav2-cb6-pi-sfaslecto载体具有seqidno：5所示的核酸序列。通过从pcdna3-sfasl-ecto加5'mgcsf中分离对应于sfasl外5'gcsf的完整cdna序列的582bp片段来制备种子质粒paavsccb6pisfaslecto。将582bp片段连接(t4连接酶neb#m0202)至bamhi、hindiii双消化的和antartic磷酸酶处理的paavsc-cb6-pi质粒。将等分试样的连接混合物转染到大肠杆菌感受态细胞上，并接种到lb-agar加50μg/ml羧苄青霉素上。挑取菌落并在lb-羧苄青霉素培养基上生长，并通过限制酶检测质粒小量制备物并测序。从1升细菌培养物制备大规模质粒，并使用zrplamidgigaprep试剂盒(#d4056，zymoresearch，irvineca)分离。

玻璃体内注射

就在角膜缘平行结膜血管后面进行玻璃体内注射。小鼠接受含有aav2cb6.sfasl(3x10⁹pfu/ml)或aav2cb6.egfp(3x10⁹pfu/ml)的双眼的1μl玻璃体内注射，并使用无菌生理盐水作为载体对照。

结果

使用aav2玻璃体内递送sfasl

如本文所示，膜结合形式的fasl负责诱导细胞凋亡和促炎细胞因子的产生。因此，d2.δcs小鼠中青光眼的恶化发展很容易通过未切割的mfasl的表达增加来解释。然而，sfasl已被证明可作为mfasl拮抗剂并实际阻断fasl诱导的炎症。

为了确定sfasl是否也能阻断mfasl在青光眼中的作用，使用腺相关病毒血清型2(aav2)载体通过单次玻璃体内注射将sfasl递送至d2小鼠的rgc。已经证明，在小鼠中玻璃体内施用aav2载体主要导致长寿命rgc和内核层细胞的转导。结果，使用aav2的基因递送可以提供长期持久表达。

为了评估哪种视网膜细胞被aav2转导，将仅表达egfp的aav2载体(aav.egfp)玻璃体内注射到两个月龄的d2小鼠中。共聚焦显微镜用于评估注射后2周视网膜全部支架中的egfp表达，并显示整个视网膜中均匀的egfp分布(图5a)。视网膜的横截面重建显示整个神经节细胞层和内核层中的强egfp表达(图5b)。d2小鼠接受类似的aav2.sfasl注射，并且神经视网膜中sfasl的western印迹分析显示，与用aav2.egfp或未注射的对照小鼠治疗的d2小鼠相比，早在注射后2周sfasl表达显著增加(图5c)。此外，在单次注射后，在整个研究期间(8个月)，视网膜中sfasl的增加维持在一致水平。iop的每月监测显示在d2未注射的对照小鼠和接受aav2.egfp或aav2.sfasl处理的d2小鼠之间的任何月龄的iop水平没有显著差异(图5d)。此外，在9个月龄时拍摄的代表性裂隙灯图像显示，在d2未注射的对照小鼠和接受aav2.egfp或aav2.sfasl处理的d2小鼠之间，虹膜色素分散或虹膜萎缩的严重性没有差异(图5d)。

总之，这些结果表明，单次玻璃体内注射aav2.sfasl进入d2小鼠可在内部视网膜内长期稳定表达高水平的sfasl，这对虹膜色素分散、虹膜萎缩和iop升高的发展没有影响。

玻璃体内递送aav2.sfasl可防止d2小鼠中rgc和轴突的丧失

为了确定sfasl的过表达是否阻止d2小鼠中rgc和轴突的丧失，小鼠在2个月龄时接受玻璃体内注射aav2.sfasl，并在8个月后在10个月时实施安乐死。在用βiii微管蛋白染色的视网膜全部支架中测量rgc密度，并在视神经切片中测量轴突密度。与d2.gp阴性对照小鼠相比，发生青光眼的d2-未注射的小鼠和d2aav2.egfp小鼠的rgc和轴突密度均显著降低(图6a-6b)。相比之下，与不发生青光眼的d2.gp对照小鼠相比，用aav2.sfasl处理的d2小鼠在rgc或轴突密度方面没有显示出显著的损失(图6a)。这些数据表明，即使在iop升高的情况下，视网膜中sfasl的过表达也阻止了d2小鼠中青光眼的发展和rgc和轴突的丧失。

sfasl阻止d2小鼠中促炎性米勒细胞的活化

如本文所示，青光眼中rgc的丧失与表达gfap的促炎性米勒细胞的活化和tnfα的诱导一致。为了确定aav2.sfasl处理的d2小鼠中是否缺乏青光眼，同时减少米勒细胞活化，通过免疫组织化学染色确定米勒细胞中的gfap表达，并使用rt-pcr测量10个月龄的d2未处理、d2.aav2.egfp、d2.aav2.sfasl和d2.gp小鼠神经视网膜中的gfap和tnfαmrna表达。

如本文所示，发生青光眼的d2-未处理的和d2.aav2.egfp小鼠显示活化的促炎性米勒细胞，其表达高水平的gfap，如共聚焦图像中所见(图4d)，且rt-pcr显示gfap和tnfαmrna表达显著增加(图4e-4f)。相反，在不发生青光眼的d2.aav2.sfasl小鼠中，米勒细胞表达显著更少的gfap和tnfαmrna水平，其与在d2.gp正常对照小鼠中观察到的相当(图4d-4f)。这些数据表明，在d2.aav2.sfasl小鼠中，sfasl介导的rgc和轴突保护与防止促炎性米勒细胞的活化一致。

sfasl阻止d2小鼠中凋亡基因的上调和促存活基因的下调

在青光眼中，细胞凋亡的外在和内在途径已被鉴定为rgc凋亡的介质。为了确定用sfasl治疗是否抑制细胞凋亡的外在途径和内在途径的激活，对来自10个月龄的d2、d2.gp、d2-aav2.egfp和d2-aav2.sfasl小鼠的视网膜组织进行qrt-pcr以评估外在和内在途径中凋亡基因和促存活基因的表达。在10个月龄时，促凋亡介质fas、fadd和bax在d2和d2-aav2.egfp小鼠中升高(图7a)。然而，用aav2.sfasl处理阻止了这些基因的上调，并且d2-aav2.sfasl小鼠中的fas、fadd和bax的mrna水平等于在d2.gp对照小鼠中检测到的水平(图7a)。类似地，在d2和d2aav2.egfp小鼠中，促存活基因cflip、bcl2和ciap-2(图7b)的水平下调，并且用aav2.sfasl处理阻止了这些基因和mrna的下调并且d2-aav2.sfasl小鼠中cflip、bcl2和ciap2的水平等于d2.gp对照小鼠中检测到的水平。这些结果表明，即使在iop升高的情况下，sfasl的存在也阻断了fasl介导的促存活基因的下调和fasl介导的凋亡基因的上调。

实施例3:当在证明rgc损伤后施用时，sfasl治疗提供治疗效果

本文提供的数据表明，与未处理的和aav2.egfp对照组相比，用aav2.sfasl处理d2小鼠为rgc及其轴突提供了显著的保护(图6a-6b)。然而，这些小鼠仅追踪到10个月龄。

为了证明aav2.sfasl治疗提供长期保护并且不仅仅延迟rgc和轴突的死亡，对小鼠组进行了长达15个月龄的追踪。rgc和轴突的定量揭示，即使在15个月龄时，当比较未注射d2的小鼠和aav2.egfp小鼠时，aav2.sfasl处理的d2小鼠继续显示对rgc和轴突的显著保护(图8a-8b)。这些数据表明，即使在iop升高的情况下，用aav2.sfasl治疗前青光眼d2小鼠也能够完全和持续地保护rgc和轴突。

然而，更具临床相关性的问题是，在检测到rgc损伤后给予aav2.sfasl治疗是否能够提供显著的保护。已经报道了早在6个月龄的d2小鼠中rgc凋亡的证据，这与本文报道的tunel染色一致(图2a-2d)。因此，用aav2.sfasl或作为阴性对照的aav2.egfp处理7个月龄的d2小鼠，并追踪小鼠至15个月龄。与未处理和aav2.egfp对照组相比，15个月龄时rgc和轴突的定量揭示了rgc和轴突的显著保留(图8c-8d)。

这些数据表明，神经视网膜中sfasl的过表达为d2小鼠的rgc和轴突提供了显著和长期的保护，即使在证明rgc损伤后施用也是如此。

实施例4：sfasl治疗在青光眼小鼠模型中提供治疗效果

材料与方法

升高的iop的诱导

通过腹膜内注射氯胺酮(100mg/kg；ketaset；fortdodgeanimalhealth,fortdodge,ia)和甲苯噻嗪(9mg/kg；tranquived；vedco,inc.,st.joseph,mo)的混合物并补充局部应用丙美卡因(0.5％；bausch&lomb,tampa,fl)麻醉小鼠。通过在手术显微镜下将聚苯乙烯微珠(fluospheres；invitrogen,carlsbad,ca；15μm直径)注射到每只动物的右眼前房，单侧诱导iop升高。简而言之，在无菌生理盐水中制备浓度为5.0×10⁶个珠/ml的微珠。使用锋利的玻璃微量移液管(worldprecisioninstrumentsinc.,sarasota,fl)在中心附近轻轻刺穿右角膜。将小体积(2μl)的微珠通过该预制孔注入前房，然后通过连接有hamilton注射器的微量移液管注入气泡。任何出现炎症迹象的小鼠(角膜混浊、水肿角膜等)都被排除在研究之外。

结果

为了确定sfasl的神经保护作用是否对于青光眼dba/2j模型是独特的，研究了sfasl在微珠诱导的iop升高的小鼠模型中防止rgc丧失的能力。c57bl/6小鼠接受玻璃体内注射aav2.egfp或aav2.sfasl，然后前室注射微珠或盐水作为阴性对照。

在aav2注射后三周，western印迹分析证实与aav2.egfp小鼠相比，aav2.sfasl小鼠的神经视网膜中sfasl的过表达(图9a)。与盐水对照相比，aav2.egfp和aav2.sfasl小鼠的单个前房注射15μm聚苯乙烯微珠导致iop升高长达21天(图9b)。iop在微珠注射后第11天达到峰值，并且在aav2.sfasl或aav2.egfp处理的小鼠之间微珠诱导的升高的iop的时间过程或量级没有显著差异。微珠注射后4周的rgc密度的定量显示，与注射盐水的对照相比，注射微珠的aav2.egfp处理的小鼠的rgc密度显著降低(图9c-9d)。然而，用aav2.sfasl处理保护了rgc并且微珠注射的aav2.sfasl小鼠中的rgc密度等于注射盐水的对照中的rgc密度(图9c-9d)。在视神经中观察到类似的结果，其中与aav2.egfp处理的对照组相比，aav2.sfasl处理提供轴突的完全保护(图9e-9f)。

这些结果表明，aav2.sfasl在慢性dba/2j和急性微珠诱导的iop升高模型中提供完全的神经保护作用。

序列

seqidno:1–aav2型衣壳蛋白质序列

maadgylpdwledtlsegirqwwklkpgppppkpaerhkddsrglvlpgykylgpfngldkgepvneadaaalehdkaydrqldsgdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrvleplglveepvktapgkkrpvehspvepdsssgtgkagqqparkrlnfgqtgdadsvpdpqplgqppaapsglgtntmatgsgapmadnnegadgvgnssgnwhcdstwmgdrvittstrtwalptynnhlykqissqsgasndnhyfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtqndgtttiannltstvqvftdseyqlpyvlgsahqgclppfpadvfmvpqygyltlnngsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnftfsytfedvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtntpsgtttqsrlqfsqagasdirdqsrnwlpgpcyrqqrvsktsadnnnseyswtgatkyhlngrdslvnpgpamashkddeekffpqsgvlifgkqgsektnvdiekvmitdeeeirttnpvateqygsvstnlqrgnrqaatadvntqgvlpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdghfhpsplmggfglkhpppqilikntpvpanpsttfsaakfasfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnynksvnvdftvdtngvyseprpigtryltrnl

seqidno:2-人可溶性fas配体(登录号：nm_000639.2；核酸残基576-1040)dna序列

gagaagcaaataggccaccccagtccaccccctgaaaaaaaggagctgaggaaagtggcccatttaacaggcaagtccaactcaaggtccatgcctctggaatgggaagacacctatggaattgtcctgctttctggagtgaagtataagaagggtggccttgtgatcaatgaaactgggctgtactttgtatattccaaagtatacttccggggtcaatcttgcaacaacctgcccctgagccacaaggtctacatgaggaactctaagtatccccaggatctggtgatgatggaggggaagatgatgagctactgcactactgggcagatgtgggcccgcagcagctacctgggggcagtgttcaatcttaccagtgctgatcatttatatgtcaacgtatctgagctctctctggtcaattttgaggaatctcagacgtttttcggcttatataagctctaa

seqidno:3-人可溶性fas配体(登录号：p48023.1；氨基酸128-281)蛋白质序列

ekqighpspppekkelrkvahltgksnsrsmplewedtygivllsgvkykkgglvinetglyfvyskvyfrgqscnnlplshkvymrnskypqdlvmmegkmmsycttgqmwarssylgavfnltsadhlyvnvselslvnfeesqtffglykl

seqidno:4–猴病毒40(sv40)启动子dna序列

tctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagcgggatcagccaccgcggtggcggccctagagtcgatcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatcc

seqidno:5–paavsc-cb6-pi-sfaslecto载体序列

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggacgcgcgagcgagcgagtgactccggcgggcccgtttcgggcccgcagcccgctggaaaccagcgggccggagtcactcgctcgctcgcgcgtctctccgagtgtagccatgctctaggaagatcaattcggtacaattcacgcgtcgacattgattattgactctggtcgttacataacttacggtaaatggcccgccctcacatcggtacgagatccttctagttaagccatgttaagtgcgcagctgtaactaataactgagaccagcaatgtattgaatgccatttaccgggcggtggctgaccgcccaacgaccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtaccgactggcgggttgctggggcgggtaactgcagttattactgcatacaagggtatcattgcggttatccctgaaaggtaactgcagttacccacctatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattataaatgccatttgacgggtgaaccgtcatgtagttcacatagtatacggttcatgcgggggataactgcagttactgccatttaccgggcggaccgtaattgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctactcgaggccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccaccccacgggtcatgtactggaataccctgaaaggatgaaccgtcatgtagatgagctccggtgcaagacgaagtgagaggggtagaggggggggaggggtggggcaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgagggttaaaacataaataaataaaaaattaataaaacacgtcgctacccccgccccccccccccccccccccgcgcgcggtccgccccgccccgccccgctccggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctaccgccccgccccgctccgcctctccacgccgccgtcggttagtctcgccgcgcgaggctttcaaaggaaaataccgctccgccgccgccgccgccgggattaaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagcgggatcagccaccgcggtggcggccctagagtcgatcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaaatttttcgcttcgcgcgccgcccgccctcgccctagtcggtggcgccaccgccgggatctcagctagctccttgactttttggtctttcaattgaccattgtttagtctttttgtcttttatttcaggtccccggatccatggctcaactttctgcccagaggcgcatgaagctaatggccctgcagctgctgctgtggccaaatcagaaaaacagaaaataaagtccaggggcctaggtaccgagttgaaagacgggtctccgcgtacttcgattaccgggacgtcgacgacgacaccgaaagtgcactatggtcaggacgagaggccgttcccctggtcactgtcagcgctctggaattcgaaaagcaaatagccaaccccagtacaccctctgaaaatttcacgtgataccagtcctgctctccggcaaggggaccagtgacagtcgcgagaccttaagcttttcgtttatcggttggggtcatgtgggagacttttaaaagagccgaggagtgtggcccatttaacagggaacccccactcaaggtccatccctctggaatgggaagacacatatggaaccgctctgatctctggattttctcggctcctcacaccgggtaaattgtcccttgggggtgagttccaggtagggagaccttacccttctgtgtataccttggcgagactagagacctgtgaagtataagaaaggtggccttgtgatcaacgaaactgggttgtacttcgtgtattccaaagtatacttccggggtcagtcctgcaacaaccagcccccacttcatattctttccaccggaacactagttgctttgacccaacatgaagcacataaggtttcatatgaaggccccagtcaggacgttgttggtcggggtaaaccacaaggtctatatgaggaactctaagtatcctgaggatctggtgctaatggaggagaagaggttgaactactgcactactggacagatatgggcatttggtgttccagatatactccttgagattcataggactcctagaccacgattacctcctcttctccaacttgatgacgtgatgacctgtctatacccgccacagcagctacctgggggcagtattcaatcttaccagtgctgaccatttatatgtcaacatatctcaactctctctgatcaattttgaggaatctaagggtgtcgtcgatggacccccgtcataagttagaatggtcacgactggtaaatatacagttgtatagagttgagagagactagttaaaactccttagattcacctttttcggcttatataagcttatcgataccgtcgactagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctggaaaaagccgaatatattcgaatagctatggcagctgatctcgagcgactagtcggagctgacacggaagatcaacggtcggtagacaacaaacggggtcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctaagggggcacggaaggaactgggaccttccacggtgagggtgacaggaaaggattattttactcctttaacgtagcgtaacagactcatccacagtaagatttctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaattaggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaaccaagaccccccaccccaccccgtcctgtcgttccccctcctaacccttctgttaatccatctattcatcgtaccgcccaattagtaattgatgttccttggcctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggccggatcactacctcaaccggtgagggagagacgcgcgagcgagcgagtgactccggcccgctggtttccagcgggctgcgggcccgaaacgggcccgccggtcagtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcagtcactcgctcgctcgcgcgtcggaattaattggattaagtgaccggcagcaaaatgttgcagcactgacccttttgggaccgcaatgggttgaattaggccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacggaacgtcgtgtagggggaaagcggtcgaccgcattatcgcttctccgggcgtggctagcgggaagggttgtcaacgcgtcggacttaccgcttaccctcgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcgcgcgggacatcgccgcgtaattcgcgccgcccacaccaccaatgcgcgtcgcactggcgatgtgaacggtcgcgggatcgcgggcgaggaaagcgaaagttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccaagggaaggaaagagcggtgcaagcggccgaaaggggcagttcgagatttagcccccgagggaaatcccaaggctaaatcacgaaatgccgtggagctggccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggggttttttgaactaatcccactaccaagtgcatcacccggtagcgggactatctgccaaaaagcgggaaactgcaacctcaggtgcaagaaattatcaccactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagtgagaacaaggtttgaccttgttgtgagttgggatagagccagataagaaaactaaatattccctaaaacggctaaagccggataaccaattttttactcctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttgactaaattgtttttaaattgcgcttaaaattgttttataattgcgaatgttaaatccaccgtgaaaagcccctttacacgcgccttggggataaacaaaatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacattaaaaagatttatgtaagtttatacataggcgagtactctgttattgggactatttacgaagttattataactttttccttctcatactcataagttgtattccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttggaaggcacagcgggaataagggaaaaaacgccgtaaaacggaaggacaaaaacgagtgggtctttgcgaccactttcattttctacgacttctagtcaaccgtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagtcacgtgctcacccaatgtagcttgacctagagttgtcgccattctaggaactctcaaaagcggggcttcttgcaaaaggttactactcgtgaaaatttcatctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccaagacgatacaccgcgccataatagggcataactgcggcccgttctcgttgagccagcggcgtatgtgataagagtcttactgaaccaactcatgagtggtgtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacagtgtcttttcgtagaatgcctaccgtactgtcattctcttaatacgtcacgacggtattggtactcactattgtgacgccggttgaatgaagactgttcgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccgctagcctcctggcttcctcgattggcgaaaaaacgtgttgtaccccctagtacattgagcggaactagcaacccttggcctcgacttacttcggtatggaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattatttgctgctcgcactgtggtgctacggacatcgttaccgttgttgcaacgcgtttgataattgaccgcttgatgaatgagatcgaagggccgttgttaatatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgtatctgacctacctccgcctatttcaacgtcctggtgaagacgcgagccgggaaggccgaccgaccaaataacgactatttagacctcggccactcgcacggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaaccagagcgccatagtaacgtcgtgaccccggtctaccattcgggagggcatagcatcaatagatgtgctgcccctcagtccgttgatacctacttgcttttagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcattttatctgtctagcgactctatccacggagtgactaattcgtaaccattgacagtctggttcaaatgagtatatatgaaatctaactaaattttgaagtaaaataatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaattaaattttcctagatccacttctaggaaaaactattagagtactggttttagggaattgcactcaaaagcaaggtgactcgcagtctggggcatctttagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcatctagtttcctagaagaactctaggaaaaaaagacgcgcattagacgacgaacgtttgtttttttggtggcgatggtcgccaccaaacaaacggcctagtagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagtctcgatggttgagaaaaaggcttccattgaccgaagtcgtctcgcgtctatggtttatgacaagaagatcacatcggcatcaatccggtggtgaagttcaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacttgagacatcgtggcggatgtatggagcgagacgattaggacaatggtcaccgacgacggtcaccgctattcagcacagaatggcccaacctgagttctggatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacactatcaatggcctattccgcgtcgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgggtcgaacctcgcttgctggatgtggcttgactctatggatgtgcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttcgcactcgatactctttcgcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccataggccattcgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcgaaccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcccaaagcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcggataggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataacctttttgcggtcgttgcgccggaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaataggggactaagacacctattccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcggcataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtcgctcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgcgaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgatttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattacgtcgaccgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattacacttcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaatgtgaaatacgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgtcctttgtcctatgaccatgattacgccagatttaattaaggccttaattagggatactggtactaatgcggtctaaattaattccggaattaatcc

seqidno:6-人fas配体(登录号：p48023.1；氨基酸1-281)蛋白质序列

mqqpfnypypqiywvdssasspwappgtvlpcptsvprrpgqrrppppppppplpppppppplpplplpplkkrgnhstglcllvmffmvlvalvglglgmfqlfhlqkelaelrestsqmhtasslekqighpspppekkelrkvahltgksnsrsmplewedtygivllsgvkykkgglvinetglyfvyskvyfrgqscnnlplshkvymrnskypqdlvmmegkmmsycttgqmwarssylgavfnltsadhlyvnvselslvnfeesqtffglykl

seqidno:7-人fas配体(登录号：nm_000639.2；核酸残基195-1040)dna序列

atgcagcagcccttcaattacccatatccccagatctactgggtggacagcagtgccagctctccctgggcccctccaggcacagttcttccctgtccaacctctgtgcccagaaggcctggtcaaaggaggccaccaccaccaccgccaccgccaccactaccacctccgccgccgccgccaccactgcctccactaccgctgccacccctgaagaagagagggaaccacagcacaggcctgtgtctccttgtgatgtttttcatggttctggttgccttggtaggattgggcctggggatgtttcagctcttccacctacagaaggagctggcagaactccgagagtctaccagccagatgcacacagcatcatctttggagaagcaaataggccaccccagtccaccccctgaaaaaaaggagctgaggaaagtggcccatttaacaggcaagtccaactcaaggtccatgcctctggaatgggaagacacctatggaattgtcctgctttctggagtgaagtataagaagggtggccttgtgatcaatgaaactgggctgtactttgtatattccaaagtatacttccggggtcaatcttgcaacaacctgcccctgagccacaaggtctacatgaggaactctaagtatccccaggatctggtgatgatggaggggaagatgatgagctactgcactactgggcagatgtgggcccgcagcagctacctgggggcagtgttcaatcttaccagtgctgatcatttatatgtcaacgtatctgagctctctctggtcaattttgaggaatctcagacgtttttcggcttatataagctctaa

其他实施方案

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等效或类似特征的示例。根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开内容的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开内容进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求书的范围内。

等价物和范围

本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的本公开内容的具体实施方案的许多等价物。本公开内容的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述的。

在权利要求书中，诸如“一”、“一个”和“所述”的冠词可以表示一个或多于一个，除非相反地指出或以其他方式从上下文中显而易见。如果组中的一个、多于一个或所有组成员在给定产品或过程中存在、在其中使用或以其他方式相关，则认为包括组中一个或多个成员之间的“或”的声明或描述是满足的，除非相反地指出或以其他方式从上下文中显而易见。本公开内容包括这样的实施方案，其中该组的恰好一个成员存在于给定产品或过程中存在、在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关。本公开内容包括其中多于一个或所有组成员存在、在其中使用或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。

此外，本公开内容涵盖所有变型、组合和置换，其中来自所列权利要求中的一个或多个的一个或多个限制、要素、从句和描述性术语被引入到另一个权利要求中。例如，可以修改依赖于另一个权利要求的任何权利要求以包括在依赖于相同基本权利要求的任何其他权利要求中找到的一个或多个限制。在元素被呈现为列表的情况下，例如，以马库什组的形式，这些元素的每个子组也被公开，并且可以从组中移除任何元素。应该理解的是，通常，在本公开内容或本公开内容的方面被称为包括特定元素和/或特征的情况下，本公开内容的某些实施方案或本公开内容的方面包括、或基本上由这些元素和/或特征组成。出于简化的目的，这些实施方案未在本文中具体阐述。还应注意，术语“包含”和“含有”旨在是开放的并且允许包含额外的元素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指出或从本领域普通技术人员的上下文和理解中显而易见，否则表示为范围的值可以假设在本公开内容的不同实施方案中的所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另有明确规定，否则该范围下限单位的十分之一。

本申请涉及各种已发布的专利，已公布的专利申请，期刊文章和其他出版物，所有的这些通过引用并入本文。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则应以本说明书为准。另外，落入现有技术内的本公开内容的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为这些实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在此未明确阐述排除，也可以排除它们。无论是否与现有技术的存在相关，本公开内容的任何特定实施方案可以出于任何原因被排除在任何权利要求之外。

本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验确定本文所述的具体实施方案的许多等价物。本文描述的本发明实施方案的范围不旨在限于以上说明书，而是在所附权利要求书中阐述。本领域普通技术人员将理解，在不脱离如所附权利要求书所限定的本公开内容的精神或范围的情况下，可以对本说明书进行各种改变和修改。

序列表

<110>马萨诸塞大学

马萨诸塞眼科耳科诊所

<120>sfasl的aav2介导的基因递送作为青光眼的神经保护疗法

<130>u0120.70085wo00

<140>尚未制定

<141>当前一并

<150>us62/511,629

<151>2017-05-26

<150>us62/358,541

<151>2016-07-05

<160>29

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>735

<212>prt

<213>腺相关病毒（adeno-associatedvirus）2

<400>1

metalaalaaspglytyrleuproasptrpleugluaspthrleuser

151015

gluglyileargglntrptrplysleulysproglypropropropro

202530

lysproalagluarghislysaspaspserargglyleuvalleupro

354045

glytyrlystyrleuglypropheasnglyleuasplysglyglupro

505560

valasnglualaaspalaalaalaleugluhisasplysalatyrasp

65707580

argglnleuaspserglyaspasnprotyrleulystyrasnhisala

859095

aspalaglupheglngluargleulysgluaspthrserpheglygly

100105110

asnleuglyargalavalpheglnalalyslysargvalleuglupro

115120125

leuglyleuvalglugluprovallysthralaproglylyslysarg

130135140

provalgluhisserprovalgluproaspserserserglythrgly

145150155160

lysalaglyglnglnproalaarglysargleuasnpheglyglnthr

165170175

glyaspalaaspservalproaspproglnproleuglyglnpropro

180185190

alaalaproserglyleuglythrasnthrmetalathrglysergly

195200205

alaprometalaaspasnasngluglyalaaspglyvalglyasnser

210215220

serglyasntrphiscysaspserthrtrpmetglyaspargvalile

225230235240

thrthrserthrargthrtrpalaleuprothrtyrasnasnhisleu

245250255

tyrlysglnileserserglnserglyalaserasnaspasnhistyr

260265270

pheglytyrserthrprotrpglytyrpheasppheasnargphehis

275280285

cyshispheserproargasptrpglnargleuileasnasnasntrp

290295300

glypheargprolysargleuasnphelysleupheasnileglnval

305310315320

lysgluvalthrglnasnaspglythrthrthrilealaasnasnleu

325330335

thrserthrvalglnvalphethraspserglutyrglnleuprotyr

340345350

valleuglyseralahisglnglycysleupropropheproalaasp

355360365

valphemetvalproglntyrglytyrleuthrleuasnasnglyser

370375380

glnalavalglyargserserphetyrcysleuglutyrpheproser

385390395400

glnmetleuargthrglyasnasnphethrphesertyrthrpheglu

405410415

aspvalprophehissersertyralahisserglnserleuasparg

420425430

leumetasnproleuileaspglntyrleutyrtyrleuserargthr

435440445

asnthrproserglythrthrthrglnserargleuglnphesergln

450455460

alaglyalaseraspileargaspglnserargasntrpleuprogly

465470475480

procystyrargglnglnargvalserlysthrseralaaspasnasn

485490495

asnserglutyrsertrpthrglyalathrlystyrhisleuasngly

500505510

argaspserleuvalasnproglyproalametalaserhislysasp

515520525

aspgluglulysphepheproglnserglyvalleuilepheglylys

530535540

glnglyserglulysthrasnvalaspileglulysvalmetilethr

545550555560

aspgluglugluileargthrthrasnprovalalathrgluglntyr

565570575

glyservalserthrasnleuglnargglyasnargglnalaalathr

580585590

alaaspvalasnthrglnglyvalleuproglymetvaltrpglnasp

595600605

argaspvaltyrleuglnglyproiletrpalalysileprohisthr

610615620

aspglyhisphehisproserproleumetglyglypheglyleulys

625630635640

hisproproproglnileleuilelysasnthrprovalproalaasn

645650655

proserthrthrpheseralaalalysphealaserpheilethrgln

660665670

tyrserthrglyglnvalservalgluileglutrpgluleuglnlys

675680685

gluasnserlysargtrpasnprogluileglntyrthrserasntyr

690695700

asnlysservalasnvalaspphethrvalaspthrasnglyvaltyr

705710715720

sergluproargproileglythrargtyrleuthrargasnleu

725730735

<210>2

<211>465

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<400>2

gagaagcaaataggccaccccagtccaccccctgaaaaaaaggagctgaggaaagtggcc60

catttaacaggcaagtccaactcaaggtccatgcctctggaatgggaagacacctatgga120

attgtcctgctttctggagtgaagtataagaagggtggccttgtgatcaatgaaactggg180

ctgtactttgtatattccaaagtatacttccggggtcaatcttgcaacaacctgcccctg240

agccacaaggtctacatgaggaactctaagtatccccaggatctggtgatgatggagggg300

aagatgatgagctactgcactactgggcagatgtgggcccgcagcagctacctgggggca360

gtgttcaatcttaccagtgctgatcatttatatgtcaacgtatctgagctctctctggtc420

aattttgaggaatctcagacgtttttcggcttatataagctctaa465

<210>3

<211>154

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>3

glulysglnileglyhisproserproproproglulyslysgluleu

151015

arglysvalalahisleuthrglylysserasnserargsermetpro

202530

leuglutrpgluaspthrtyrglyilevalleuleuserglyvallys

354045

tyrlyslysglyglyleuvalileasngluthrglyleutyrpheval

505560

tyrserlysvaltyrpheargglyglnsercysasnasnleuproleu

65707580

serhislysvaltyrmetargasnserlystyrproglnaspleuval

859095

metmetgluglylysmetmetsertyrcysthrthrglyglnmettrp

100105110

alaargsersertyrleuglyalavalpheasnleuthrseralaasp

115120125

hisleutyrvalasnvalsergluleuserleuvalasnphegluglu

130135140

serglnthrphepheglyleutyrlysleu

145150

<210>4

<211>359

<212>dna

<213>猴病毒（simianvirus）40

<400>4

tctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcag60

cgatgggggcggggggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgag120

gggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccga180

aagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcgg240

cgggcgggagcgggatcagccaccgcggtggcggccctagagtcgatcgaggaactgaaa300

aaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatcc359

<210>5

<211>9276

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>5

ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt60

ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggacgcgcgagcgagcgagtg120

actccggcgggcccgtttcgggcccgcagcccgctggaaaccagcgggccggagtcactc180

gctcgctcgcgcgtctctccgagtgtagccatgctctaggaagatcaattcggtacaatt240

cacgcgtcgacattgattattgactctggtcgttacataacttacggtaaatggcccgcc300

ctcacatcggtacgagatccttctagttaagccatgttaagtgcgcagctgtaactaata360

actgagaccagcaatgtattgaatgccatttaccgggcggtggctgaccgcccaacgacc420

ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcca480

ttgacgtcaatgggtggagtaccgactggcgggttgctggggcgggtaactgcagttatt540

actgcatacaagggtatcattgcggttatccctgaaaggtaactgcagttacccacctat600

ttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccct660

attgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattataaatgccatttgacgggtgaa720

ccgtcatgtagttcacatagtatacggttcatgcgggggataactgcagttactgccatt780

taccgggcggaccgtaattgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta840

catctactcgaggccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccaccccac900

gggtcatgtactggaataccctgaaaggatgaaccgtcatgtagatgagctccggtgcaa960

gacgaagtgagaggggtagaggggggggaggggtggggcaattttgtatttatttatttt1020

ttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggggggcgcgcgccaggcg1080

gggcggggcggggcgagggttaaaacataaataaataaaaaattaataaaacacgtcgct1140

acccccgccccccccccccccccccccgcgcgcggtccgccccgccccgccccgctccgg1200

cggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaag1260

tttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctaccgccccgccccgctccgcctc1320

tccacgccgccgtcggttagtctcgccgcgcgaggctttcaaaggaaaataccgctccgc1380

cgccgccgccgccgggattaaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagcgggatcagccac1440

cgcggtggcggccctagagtcgatcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaaat1500

ttttcgcttcgcgcgccgcccgccctcgccctagtcggtggcgccaccgccgggatctca1560

gctagctccttgactttttggtctttcaattgaccattgtttagtctttttgtcttttat1620

ttcaggtccccggatccatggctcaactttctgcccagaggcgcatgaagctaatggccc1680

tgcagctgctgctgtggccaaatcagaaaaacagaaaataaagtccaggggcctaggtac1740

cgagttgaaagacgggtctccgcgtacttcgattaccgggacgtcgacgacgacaccgaa1800

agtgcactatggtcaggacgagaggccgttcccctggtcactgtcagcgctctggaattc1860

gaaaagcaaatagccaaccccagtacaccctctgaaaatttcacgtgataccagtcctgc1920

tctccggcaaggggaccagtgacagtcgcgagaccttaagcttttcgtttatcggttggg1980

gtcatgtgggagacttttaaaagagccgaggagtgtggcccatttaacagggaaccccca2040

ctcaaggtccatccctctggaatgggaagacacatatggaaccgctctgatctctggatt2100

ttctcggctcctcacaccgggtaaattgtcccttgggggtgagttccaggtagggagacc2160

ttacccttctgtgtataccttggcgagactagagacctgtgaagtataagaaaggtggcc2220

ttgtgatcaacgaaactgggttgtacttcgtgtattccaaagtatacttccggggtcagt2280

cctgcaacaaccagcccccacttcatattctttccaccggaacactagttgctttgaccc2340

aacatgaagcacataaggtttcatatgaaggccccagtcaggacgttgttggtcggggta2400

aaccacaaggtctatatgaggaactctaagtatcctgaggatctggtgctaatggaggag2460

aagaggttgaactactgcactactggacagatatgggcatttggtgttccagatatactc2520

cttgagattcataggactcctagaccacgattacctcctcttctccaacttgatgacgtg2580

atgacctgtctatacccgccacagcagctacctgggggcagtattcaatcttaccagtgc2640

tgaccatttatatgtcaacatatctcaactctctctgatcaattttgaggaatctaaggg2700

tgtcgtcgatggacccccgtcataagttagaatggtcacgactggtaaatatacagttgt2760

atagagttgagagagactagttaaaactccttagattcacctttttcggcttatataagc2820

ttatcgataccgtcgactagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccag2880

ccatctgttgtttgcccctggaaaaagccgaatatattcgaatagctatggcagctgatc2940

tcgagcgactagtcggagctgacacggaagatcaacggtcggtagacaacaaacggggtc3000

ccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatga3060

ggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctaagggggcacggaaggaactggg3120

accttccacggtgagggtgacaggaaaggattattttactcctttaacgtagcgtaacag3180

actcatccacagtaagatttctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt3240

gggaagacaattaggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaaccaa3300

gaccccccaccccaccccgtcctgtcgttccccctcctaacccttctgttaatccatcta3360

ttcatcgtaccgcccaattagtaattgatgttccttggcctagtgatggagttggccact3420

ccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccg3480

ggctttgcccgggcggccggatcactacctcaaccggtgagggagagacgcgcgagcgag3540

cgagtgactccggcccgctggtttccagcgggctgcgggcccgaaacgggcccgccggtc3600

agtgagcgagcgagcgcgcagccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacg3660

tcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcagtcactcgctcgctcgcgcgt3720

cggaattaattggattaagtgaccggcagcaaaatgttgcagcactgacccttttgggac3780

cgcaatgggttgaattaggccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcg3840

aagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacg3900

gaacgtcgtgtagggggaaagcggtcgaccgcattatcgcttctccgggcgtggctagcg3960

ggaagggttgtcaacgcgtcggacttaccgcttaccctcgcgccctgtagcggcgcatta4020

agcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcg4080

cccgctcctttcgctttcgcgcgggacatcgccgcgtaattcgcgccgcccacaccacca4140

atgcgcgtcgcactggcgatgtgaacggtcgcgggatcgcgggcgaggaaagcgaaagtt4200

cccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccc4260

tttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccaagggaaggaaagagcggtgca4320

agcggccgaaaggggcagttcgagatttagcccccgagggaaatcccaaggctaaatcac4380

gaaatgccgtggagctggccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccat4440

cgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtgggg4500

ttttttgaactaatcccactaccaagtgcatcacccggtagcgggactatctgccaaaaa4560

gcgggaaactgcaacctcaggtgcaagaaattatcaccactcttgttccaaactggaaca4620

acactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcc4680

tattggttaaaaaatgagtgagaacaaggtttgaccttgttgtgagttgggatagagcca4740

gataagaaaactaaatattccctaaaacggctaaagccggataaccaattttttactcct4800

gatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggc4860

acttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttgactaaattgtttttaaattgc4920

gcttaaaattgttttataattgcgaatgttaaatccaccgtgaaaagcccctttacacgc4980

gccttggggataaacaaaatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagaca5040

ataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatta5100

aaaagatttatgtaagtttatacataggcgagtactctgttattgggactatttacgaag5160

ttattataactttttccttctcatactcataagttgtattccgtgtcgcccttattccct5220

tttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaag5280

atgctgaagatcagttggaaggcacagcgggaataagggaaaaaacgccgtaaaacggaa5340

ggacaaaaacgagtgggtctttgcgaccactttcattttctacgacttctagtcaaccgt5400

gcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgc5460

cccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagtcacgtgctcacccaatgtagct5520

tgacctagagttgtcgccattctaggaactctcaaaagcggggcttcttgcaaaaggtta5580

ctactcgtgaaaatttcatctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggca5640

agagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccaag5700

acgatacaccgcgccataatagggcataactgcggcccgttctcgttgagccagcggcgt5760

atgtgataagagtcttactgaaccaactcatgagtggtgtcacagaaaagcatcttacgg5820

atggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcgg5880

ccaacttacttctgacaacagtgtcttttcgtagaatgcctaccgtactgtcattctctt5940

aatacgtcacgacggtattggtactcactattgtgacgccggttgaatgaagactgttcg6000

atcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgc6060

cttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccgctagcctcctggcttcctcga6120

ttggcgaaaaaacgtgttgtaccccctagtacattgagcggaactagcaacccttggcct6180

cgacttacttcggtatggaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaac6240

aacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattatt6300

tgctgctcgcactgtggtgctacggacatcgttaccgttgttgcaacgcgtttgataatt6360

gaccgcttgatgaatgagatcgaagggccgttgttaatatagactggatggaggcggata6420

aagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaat6480

ctggagccggtgagcgtgtatctgacctacctccgcctatttcaacgtcctggtgaagac6540

gcgagccgggaaggccgaccgaccaaataacgactatttagacctcggccactcgcacgg6600

tctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatc6660

tacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaaccagagcgccatagtaacgtcg6720

tgaccccggtctaccattcgggagggcatagcatcaatagatgtgctgcccctcagtccg6780

ttgatacctacttgcttttagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattg6840

gtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcattttat6900

ctgtctagcgactctatccacggagtgactaattcgtaaccattgacagtctggttcaaa6960

tgagtatatatgaaatctaactaaattttgaagtaaaataatttaaaaggatctaggtga7020

agatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgag7080

cgtcagaccccgtagaaaattaaattttcctagatccacttctaggaaaaactattagag7140

tactggttttagggaattgcactcaaaagcaaggtgactcgcagtctggggcatctttag7200

atcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaa7260

aaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcatctagtttcctagaagaactct7320

aggaaaaaaagacgcgcattagacgacgaacgtttgtttttttggtggcgatggtcgcca7380

ccaaacaaacggcctagtagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcag7440

agcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagtc7500

tcgatggttgagaaaaaggcttccattgaccgaagtcgtctcgcgtctatggtttatgac7560

aagaagatcacatcggcatcaatccggtggtgaagttcaactctgtagcaccgcctacat7620

acctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtctta7680

ccgggttggactcaagacttgagacatcgtggcggatgtatggagcgagacgattaggac7740

aatggtcaccgacgacggtcaccgctattcagcacagaatggcccaacctgagttctgga7800

tagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagc7860

ttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacactatcaatggcctattccgcgt7920

cgccagcccgacttgccccccaagcacgtgtgtcgggtcgaacctcgcttgctggatgtg7980

gcttgactctatggatgtgcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa8040

ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttcg8100

cactcgatactctttcgcggtgcgaagggcttccctctttccgcctgtccataggccatt8160

cgccgtcccagccttgtcctctcgcgtgctccctcgaaccagggggaaacgcctggtatc8220

tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgt8280

caggggggcggagcctatggtccccctttgcggaccatagaaatatcaggacagcccaaa8340

gcggtggagactgaactcgcagctaaaaacactacgagcagtccccccgcctcggatagg8400

aaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcac8460

atgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataacctttttgcggtcgttgcgccg8520

gaaaaatgccaaggaccggaaaacgaccggaaaacgagtgtacaagaaaggacgcaatag8580

gggactaagacacctattccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcag8640

ccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcgg8700

cataatggcggaaactcactcgactatggcgagcggcgtcggcttgctggctcgcgtcgc8760

tcagtcactcgctccttcgccttctcgcgggttatgcgaaaccgcctctccccgcgcgtt8820

ggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagc8880

gcaacgcaattaatgtgatttggcggagaggggcgcgcaaccggctaagtaattacgtcg8940

accgtgctgtccaaagggctgacctttcgcccgtcactcgcgttgcgttaattacacttc9000

attaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtga9060

gcggataacaatttcacacaggaaacagcaatcgagtgagtaatccgtggggtccgaaat9120

gtgaaatacgaaggccgagcatacaacacaccttaacactcgcctattgttaaagtgtgt9180

cctttgtcctatgaccatgattacgccagatttaattaaggccttaattagggatactgg9240

tactaatgcggtctaaattaattccggaattaatcc9276

<210>6

<211>281

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>6

metglnglnpropheasntyrprotyrproglniletyrtrpvalasp

151015

serseralaserserprotrpalaproproglythrvalleuprocys

202530

prothrservalproargargproglyglnargargpropropropro

354045

proproproproproleuproproproproproproproproleupro

505560

proleuproleuproproleulyslysargglyasnhisserthrgly

65707580

leucysleuleuvalmetphephemetvalleuvalalaleuvalgly

859095

leuglyleuglymetpheglnleuphehisleuglnlysgluleuala

100105110

gluleuarggluserthrserglnmethisthralaserserleuglu

115120125

lysglnileglyhisproserproproproglulyslysgluleuarg

130135140

lysvalalahisleuthrglylysserasnserargsermetproleu

145150155160

glutrpgluaspthrtyrglyilevalleuleuserglyvallystyr

165170175

lyslysglyglyleuvalileasngluthrglyleutyrphevaltyr

180185190

serlysvaltyrpheargglyglnsercysasnasnleuproleuser

195200205

hislysvaltyrmetargasnserlystyrproglnaspleuvalmet

210215220

metgluglylysmetmetsertyrcysthrthrglyglnmettrpala

225230235240

argsersertyrleuglyalavalpheasnleuthrseralaasphis

245250255

leutyrvalasnvalsergluleuserleuvalasnpheglugluser

260265270

glnthrphepheglyleutyrlysleu

275280

<210>7

<211>846

<212>dna

<213>智人（homosapiens）

<400>7

atgcagcagcccttcaattacccatatccccagatctactgggtggacagcagtgccagc60

tctccctgggcccctccaggcacagttcttccctgtccaacctctgtgcccagaaggcct120

ggtcaaaggaggccaccaccaccaccgccaccgccaccactaccacctccgccgccgccg180

ccaccactgcctccactaccgctgccacccctgaagaagagagggaaccacagcacaggc240

ctgtgtctccttgtgatgtttttcatggttctggttgccttggtaggattgggcctgggg300

atgtttcagctcttccacctacagaaggagctggcagaactccgagagtctaccagccag360

atgcacacagcatcatctttggagaagcaaataggccaccccagtccaccccctgaaaaa420

aaggagctgaggaaagtggcccatttaacaggcaagtccaactcaaggtccatgcctctg480

gaatgggaagacacctatggaattgtcctgctttctggagtgaagtataagaagggtggc540

cttgtgatcaatgaaactgggctgtactttgtatattccaaagtatacttccggggtcaa600

tcttgcaacaacctgcccctgagccacaaggtctacatgaggaactctaagtatccccag660

gatctggtgatgatggaggggaagatgatgagctactgcactactgggcagatgtgggcc720

cgcagcagctacctgggggcagtgttcaatcttaccagtgctgatcatttatatgtcaac780

gtatctgagctctctctggtcaattttgaggaatctcagacgtttttcggcttatataag840

ctctaa846

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>8

gggacagtgacctggactgt20

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>9

ctccctttgcagaactcagg20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>10

tgttaccaactgggacgaca20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>11

cttttcacggttggccttag20

<210>12

<211>19

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>12

ttctgatatagggtcctgc19

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>13

tcaccagatccaagaaactc20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>14

caagctgagtgtaactgaag20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>15

ttaaaaggcatcagcaagag20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>16

ggcgctcaatgctggcttca20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>17

tctgcctccagcctcaggtt20

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>18

agggtttcatccaggatcgagcag24

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>19

atcttccagatggtgagcgag21

<210>20

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>20

ttgtggccttctttgagttcggtg24

<210>21

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>21

ggtgccggttcaggtactcagtca24

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>22

gaagttcccggtttcctctc20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>23

gagggcaggatctctcagtg20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>24

tgtcagccaagttcaagctg20

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>25

atcttccgaactttctccaggg22

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>26

tgggtagacagcagtgccac20

<210>27

<211>19

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>27

gcccacaagatggacaggg19

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>28

gtcctgcctctggtgcttgctg22

<210>29

<211>17

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<221>

<222>

<223>合成多核苷酸

<400>29

caggttggcatggttga17