用于产生用于疫苗生产的病毒的方法与流程

本申请要求2016年9月1日申请的美国临时申请号62/382,621的权益，其通过提述以其整体并入本文。

序列表的ascii文本文件的提交

下列提交的ascii文本文件的内容通过提述以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(crf)(文件名称：606772001240seqlist.txt；记录的日期：2017年8月24日，大小：2kb)。

本公开涉及用于产生用于疫苗生产的病毒(例如肠病毒c病毒)的方法。

背景

脊髓灰质炎是由人肠道病毒c(hev-c)的病毒感染引起的，人肠道病毒c包含多种病毒亚型，包括几种脊髓灰质炎病毒血清型。脊髓灰质炎病毒通常通过口腔分泌物或与感染个体的粪便物质接触在人与人之间传播。大多数感染仅导致限于消化道的无症状病毒复制。然而，在不到1％的感染中，病毒感染中枢神经系统并在脊髓前角细胞的运动神经元中复制，这导致急性弛缓性麻痹，且在某些情况下难以说话、吞咽、呼吸并死亡。仅在美国，每年都有数万人感染脊髓灰质炎，直到1955年jonassalk开发出一种灭活的脊髓灰质炎疫苗。后来albertsabin使用减毒病毒开发了一种口服脊髓灰质炎疫苗(opv)。这些导致人类几乎消灭了脊髓灰质炎；然而，2012年报道了223例麻痹性脊髓灰质炎(sutter,r.w.等人(2014)j.infect.dis.210:s434-s438)。脊髓灰质炎在尼日利亚、阿富汗和巴基斯坦仍然流行，且在中东、非洲和亚洲的不同国家都发生了零星的爆发。

人肠道病毒c属于无包膜正义rna病毒的小核糖核酸病毒科(picornaviridae)，其还包括某些鼻病毒(rhinovirus)和某些柯萨奇病毒(coxsackievirus)。hev-c组的成员包括三种脊髓灰质炎病毒血清型(s1、s2和s3；也称为pv1、pv2和pv3)和许多柯萨奇a病毒血清型(例如，cav血清型1、11、13、15、17、18、19、20、21、22和24)(brown,b.等人(2003)j.virol.77:8973-84)。虽然认为野生脊髓灰质炎病毒血清型2(wpv2)已被消灭(最后一次已知的感染发生在1999年)，wpv3感染最后一次发生于2012年，但wpv1感染仍有报告(lowther,s.a.(2013)morbidityandmortalityweeklyreport62:335-8)。

脊髓灰质炎病毒包含二十面体衣壳，每个衣壳蛋白由vp1、vp2、vp3和vp4各60个拷贝组成。病毒与特异性脊髓灰质炎病毒受体(pvr，也称为cd155)的结合导致所有三种病毒血清型的细胞感染。然而，这些血清型包含被中和抗体识别的血清型特异性免疫显性表位和一般免疫显性表位(minor,p.d.等人(1986)j.gen.virol.67:1283-91)。灭活的脊髓灰质炎疫苗包含每种血清型的福尔马林灭活的野生型菌株。sabin口服脊髓灰质炎疫苗包含三种活的减毒的脊髓灰质炎病毒血清型的混合物，但是针对每种脊髓灰质炎病毒血清型的单价疫苗也用于减少特定血清型的传播。然而，已经显示这些减毒病毒可获得神经毒力和传播力，这导致由于循环疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒(cvdpv)引起的爆发。由于这些爆发以及由于消灭不彻底而导致的野生脊髓灰质炎病毒的持续爆发，因此需要继续生产脊髓灰质炎疫苗。

工业规模的病毒疫苗生产需要大量资源和成本。为了生产潜在的疫苗，病毒疫苗通常由锚定依赖性细胞系(例如vero细胞)产生。在工业规模上，这些细胞在滚瓶上的多板系统(例如，“细胞工厂”(cellfactories)、“细胞立方体”(cellcube)等)中以静态模式培养，或者在生物反应器中悬浮的微载体(多孔或无孔)培养。多板系统体积庞大并且需要大量的处理操作，而微载体培养需要从预培养到具有复杂操作(即珠子到珠子的转移)的最终工艺的许多操作(载体的灭菌和水化等)和许多步骤。

一旦产生病毒，用于下游纯化的现有方案通常是繁重且资源密集的。例如，美国专利号8,753,646描述了用于脊髓灰质炎病毒纯化的方案，其包括多个过滤和超速离心步骤，最后进行基于柱的病毒纯化。每个额外步骤都需要人力、时间和资源。因此，需要使用更简化的下游纯化方案的疫苗生产技术，这将允许简单、更短的工艺，该工艺减少占地面积，人力和操作成本。

脊髓灰质炎病毒仍然流行的非洲和中东的几个地区仍然需要脊髓灰质炎疫苗。然而，这些地区在经济上处于不利地位，缺乏有效的疫苗接种计划的充足资源和/或基础设施。因此，消灭脊髓灰质炎需要更多的成本和资源有效的病毒生产方法。

简述

因此，需要开发用于肠病毒c生产的方法，例如，允许工业规模上的成本高效的病毒生产的方法。如本文所公开的，本公开的方法，除其他事项之外，使用固定床培养系统以实现增加的病毒生产，具有更高的成本效益和简化的流程。例如，本文描述的改进能够将疫苗的每剂量成本从大约5美元降低到1.25美元。在一些实施方案中，本公开的方法可以另外地或替代地包括在用病毒接种细胞期间或之前向细胞培养基中添加聚山梨醇酯。有利地，这些方法可用于(例如)肠病毒c的大规模或工业规模生产，生产的肠病毒c可用于制备疫苗和/或免疫原性组合物。

因此，本公开的某些方面提供了用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在第一细胞培养基中培养细胞；(b)在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒c病毒接种所述细胞；且(c)收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒，其中在用肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加表面活性剂。在一些实施方案中，与缺少所述表面活性剂时收获的肠病毒c病毒的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒c病毒的产量增加。在一些实施方案中，与缺少所述表面活性剂时收获的肠病毒c病毒的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒c病毒的产量增加了约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。在一些实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述表面活性剂是基于聚乙二醇的表面活性剂。本公开的其他方面提供用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在第一细胞培养基中培养细胞；(b)在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒c病毒接种所述细胞；且(c)收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒，其中在用肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加葡聚糖。在一些实施方案中，与缺少所述葡聚糖时收获的肠病毒c病毒的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒c病毒的产量增加。在一些实施方案中，与缺少所述葡聚糖时收获的肠病毒c的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒c的产量增加约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。在一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。在一些实施方案中，所述细胞在步骤(a)中在液体培养基中培养。在一些实施方案中，所述细胞是贴壁细胞，且所述细胞在步骤(a)中在微载体上培养。在一些实施方案中，所述细胞是贴壁细胞，且所述细胞在步骤(a)中在包含基质的固定床中培养。在一些实施方案中，所述细胞在步骤(a)中在生物反应器中培养。在一些实施方案中，以约0.01至约0.0009的感染复数(moi)用肠病毒c接种所述细胞。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下培养经接种的细胞，且步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖。在一些实施方案中，进一步包括，在步骤(c)之后：(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c；(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

在进一步方面中，本文提供用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒c病毒接种所述细胞，其中以约0.01至约0.0009的moi用肠病毒c病毒接种所述细胞；且(c)收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述肠病毒c是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。在一些实施方案中，在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下培养经接种的细胞，且步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph接种。在一些实施方案中，无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤(c)之后：(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

在进一步的方面中，本文提供一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒c病毒接种所述细胞，其中约100,000个细胞/cm²至约320,000个细胞/cm²被接种；且(c)收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述肠病毒c是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。在一些实施方案中，在用所述肠病毒c接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。在一些实施方案中，以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c病毒接种所述细胞。在一些实施方案中，在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下培养经接种的细胞，且步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph接种。在一些实施方案中，无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤(c)之后：(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

在进一步的方面中，本文提供用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用所述肠病毒c病毒接种所述细胞；且(c)收获由所述细胞产生的所述肠病毒c病毒，其中在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。在一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。在一些实施方案中，在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述细胞以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c接种。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在所述肠病毒c病毒感染所述细胞且所述感染的细胞产生所述肠病毒c病毒的条件下，培养所述接种的细胞，且步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph接种。在一些实施方案中，无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤(c)之后：(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

在进一步的方面中，本文提供一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用肠病毒c病毒接种所述细胞，其中所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph接种；且(c)收获由所述细胞产生的所述肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。在一些实施方案中，在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。在一些实施方案中，以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c病毒接种所述细胞。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在肠病毒c可病毒感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下培养所述接种的细胞，且步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤(c)之后：(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

在进一步的方面中，本文提供一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在所述肠病毒c病毒感染所述细胞且所述感染的细胞产生所述肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用所述肠病毒c病毒接种所述细胞，其中无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或葡糖糖从所述第二培养基中去除；且(c)收获由所述细胞产生的所述肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。在一些实施方案中，在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前的约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述细胞以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c病毒接种。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，所述细胞在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在所述肠病毒c病毒感染所述细胞且所述感染的细胞产生所述肠病毒c病毒的条件下培养所述接种的细胞，且步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph接种。在一些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤(c)之后：(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

在进一步的方面中，本文提供一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；(b)在所述肠病毒c病毒感染所述细胞且所述感染的细胞产生所述肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用所述肠病毒c病毒接种所述细胞；(c)收获由所述细胞产生的所述肠病毒c病毒；(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

在任何上述实施方案的一些实施方案中，深层过滤器的孔径为约0.2μm至约3μm之间。在任何上述实施方案的一些实施方案中，在步骤(e)之前，将所述第一洗脱物的ph调整至约5.7的ph值。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1和s2。在任何上述实施方案的一些实施方案中，将所述第一洗脱物的ph调整至约5.0的ph值，且其中所述肠病毒c病毒是脊髓灰质炎病毒s3。在任何上述实施方案的一些实施方案中，使用柠檬酸盐缓冲液或磷酸缓冲液以使所述第一洗脱物结合至所述阳离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，使用包含聚山梨醇酯的缓冲液以使所述第一洗脱物结合至所述阳离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述第一洗脱物以范围为约4.5至约6.0的ph结合至所述阳离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，使所述第一洗脱物以约8ms/cm至约10ms/cm结合至所述阳离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，通过调整所述ph至约8.0洗脱所述第一结合级分。在任何上述实施方案的一些实施方案中，通过添加约0.20m至约0.030m氯化钠洗脱所述第一结合级分。在任何上述实施方案的一些实施方案中，以约20ms/cm至约25ms/cm洗脱所述第一结合级分。在任何上述实施方案的一些实施方案中，在步骤(g)之前，将所述第二洗脱物的ph调整至约8.0至约8.5的ph值。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3，且其中在步骤(g)之前，将所述第二洗脱物的ph调整至约8.0至约8.5的ph值。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自s1和s3的脊髓灰质炎病毒血清型，且在步骤(g)之前，将所述第二洗脱物的ph调整至约8.5的ph值。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是脊髓灰质炎病毒s2，且在步骤(g)之前，将所述第二洗脱物的ph调整至约8.0的ph值。在任何上述实施方案的一些实施方案中，使用磷酸盐缓冲液以使所述第二洗脱物结合至所述阴离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，使用包含聚山梨醇酯的缓冲液以使所述第二洗脱物结合至所述阴离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述第二洗脱物在范围为约7.5至约8.5的ph结合至所述阳离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述第二洗脱物以约3ms/cm结合至所述阴离子交换膜。在任何上述实施方案的一些实施方案中，通过添加约0.05m至约0.10m氯化钠洗脱所述第二结合级分。在任何上述实施方案的一些实施方案中，以约5ms/cm至约10ms/cm洗脱所述第二结合级分。在一些实施方案中，在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。在一些实施方案中，以约0.01至0.0009的moi用所述肠病毒c接种所述细胞。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被接种。在一些实施方案中，在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒可感染细胞且感染的细胞可产生肠病毒c病毒的条件下，培养所述接种的细胞，且其中步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。在一些实施方案中，所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph被接种。在一些实施方案中，无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖。

在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述细胞是vero细胞。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述vero细胞系选自下组：whovero10-87、atccccl-81、vero76(atcc登记号crl-1587)和veroc1008(atcc登记号crl-1586)。在任何上述实施方案的一些实施方案中，在步骤(a)中约4,000个细胞/cm²和约16,000个细胞/cm²被培养。在任何上述实施方案的一些实施方案中，在步骤(a)中约5,000个细胞/cm²被培养。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基是不同的。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述方法进一步包括，在步骤(a)和步骤(b)之间，去除所述第一细胞培养基，且用所述第二培养基冲洗所述细胞。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述第二细胞培养基是无血清培养基。在任何上述实施方案的一些实施方案中，步骤(a)期间的所述第一细胞培养基中的乳酸浓度不超过约25mm。在任何上述实施方案的一些实施方案中，步骤(b)期间的所述第二细胞培养基中的乳酸浓度不超过约15mm。在任何上述实施方案的一些实施方案中，步骤(a)期间的所述第一细胞培养基中氧密度(do)保持在约50％以上。在任何上述实施方案的一些实施方案中，步骤(b)期间的所述第二细胞培养基中氧密度(do)保持在约50％以上。在任何上述实施方案的一些实施方案中，步骤(a)期间的所述第一细胞培养基中氧密度(do)保持在约60％以上。在任何上述实施方案的一些实施方案中，步骤(b)期间的所述第二细胞培养基中氧密度(do)保持在约60％以上。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述固定床的床高度为约2cm。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述固定床的床高度为约10cm。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述基质是纤维基质。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述纤维基质是碳基质。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述纤维基质的孔隙率为约60％至99％。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述孔隙率为约80％至约90％。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述纤维基质的细胞可及的表面积为约150cm²/cm³至约1000cm²/cm³。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述纤维基质的细胞可及的表面积为约10cm²/cm³至约150cm²/cm³。在一些实施方案中，所述纤维基质的细胞可及的表面积为约120cm²/cm³。在任何上述实施方案的一些实施方案中，至少5.0x10⁷tcid50/ml的所述肠病毒c病毒在步骤(d)中收获。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述方法进一步包括用β-丙内酯(bpl)、福尔马林或二乙烯亚胺(bei)中的一种或多种使所述肠病毒c病毒灭活。在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒株：lsc、2ab；p712、ch、2ab；leon、12a1b；及其任何组合。

在进一步方面中，本文提供通过任何上述实施方案的方法产生的肠病毒c。在一些实施方案中，所述病毒包含一种或多种抗原。在一些实施方案中，所述病毒已经由β-丙内酯(bpl)、福尔马林或二乙烯亚胺(bei)中的一种或多种灭活。

在进一步的方面中，本文提供包含任何上述实施方案的病毒的组合物。在进一步方面中，本文提供包含任何上述实施方案的病毒的免疫原性组合物。在进一步方面中，本文提供包含任何上述实施方案的病毒的疫苗。

应理解，本文所述的各种实施方案的一个、一些或所有性质可以组合以形成本发明的其他实施方案。本领域技术人员将容易想到本发明的这些和其他方面。通过下面的详细描述进一步描述本发明的这些和其他实施方案。

附图简述

该专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由主管局提供。

图1显示了根据一些实施方案使用固定床生物反应器进行病毒生产的上游处理步骤的示例性方案。wvs：工作病毒种子。

图2a和2b显示感染时细胞密度(cdi)对细胞生产力的影响，如脊髓灰质炎病毒d-抗原生产所反映的。生产力以两种方式作图：“体积”生产力(du/ml；图2a)和“每细胞”生产力(du/10⁶个细胞；图2b)。

图3显示病毒感染复数(moi)随时间对细胞生产力的影响，如体积脊髓灰质炎病毒d-抗原生产(du/ml)所反映的。

图4显示icellis(菱形)中与方瓶(cs对照，正方形)中的细胞生长对病毒稳定性的影响的比较。

图5a-5c显示icellis中ph和溶氧(do)调节对细胞生产力的影响(图5a)，以及在调节(“对照”)和不调节(“未调节”)情况下，ph(图5b)和do(图5c)水平随时间的变化。

图6显示icellis中细胞外(正方形)和细胞内(菱形)d-抗原随时间的体积生产量。

图7a比较了微载体(如cytodex^tm)中生长的细胞的与icellis中生长的两批(“nano1”和“nano2”)的每细胞生产力、葡萄糖短缺和感染时乳酸脱氢酶(ldh)活性。图7b比较了如本文所述的微载体(如cytodex^tm)上生长的细胞的、如文献中所述的微载体(“lit.cytodex^tm”)上生长的细胞的和icellis(“icellis中cytodex^tm复制-粘贴”和“最佳操作”)中生长的两批的每细胞生产力。图7c和7d比较了如本文所述的微载体上生长的细胞的或如文献中所述的微载体(图7c中的“cytodex^tmt”和“cytodex^tmlit”)上生长的细胞的每细胞生产力与icellis中生长的两批(图7d中的“h”和“p”)的每细胞生产力。图7e和7f显示感染阶段时细胞培养基中起始葡萄糖浓度对细胞生产力(d-抗原/cm²)的作用。图7g显示在感染前葡萄糖短缺随时间对体积细胞生产力(d-抗原/ml)的作用。图7h显示在感染时添加额外的葡萄糖随时间对体积细胞生产力(d-抗原/ml)的作用。

图8a-8c显示由于添加聚山梨醇酯(吐温-80)导致的病毒产量增加。

图9a和9b显示了根据一些实施方案使用固定床生物反应器进行病毒生产的下游处理步骤的示例性方案。本文所述的改进的下游工艺和现有工艺之间的比较在图9a中显示。下游纯化和灭活的详细流程图在图9b中显示。

图10提供用于评估修改特定的下游处理参数的作用的三组实验条件(实验d、8和c)的总结。

图11a-11e显示使用sds-page银染来纯化由图10中所示的实验条件产生的脊髓灰质炎病毒。显示了来自实验8(图11a)的s2病毒的纯化、来自实验d的s2病毒的纯化(图11b)、由实验d纯化的s2病毒(图11c中的泳道1)与使用现有方法纯化的s2病毒(图11c中的泳道2)的比较、来自实验d的s3病毒的纯化(图11d)、由实验d纯化的s3病毒(图11e中的泳道1)与使用现有方法纯化的s3病毒(图11e中的泳道2)的比较。如所指示的，每个泳道代表着特定纯化步骤的产物。ft：穿透液。

图12a和12b显示使用阴离子交换膜的缓冲液组分和ph的各种组合对d-抗原(du)洗脱的影响。显示了5倍稀释(图12a)和3倍稀释(图12b)。如图所示的具有(+)和不具有(-)聚山梨醇酯(“吐温”)的条件。

图13a和13b显示使用阳离子交换膜的缓冲液组分和ph的各种组合对d-抗原(du)洗脱的影响。显示了5倍稀释(图13a)和3倍稀释(图13b)。使用(+)和不使用(-)聚山梨醇酯(“吐温”)的条件如图所示。

图14a-14d显示使用阳离子/阴离子交换膜和用柠檬酸盐(菱形)、tris(正方形)和磷酸盐(三角形)缓冲液洗脱的随ph变化的结合效率。图14a：不使用聚山梨醇酯的阴离子交换。图14b：使用聚山梨醇酯的阴离子交换。图14c：不使用聚山梨醇酯的阳离子交换。图14d：使用聚山梨醇酯的阳离子交换。所有条件使用5倍稀释系数。图14e-14h显示规模的病毒阴离子交换色谱洗脱。图14e和14g显示使用4倍稀释系数和分别具有和不具有聚山梨醇酯trisph8.0缓冲液而获得的洗脱曲线。图14f显示图14e中所示的实验的各级分的病毒产率。图14h显示使用sds-page银染的图14g中所示的实验的各级分的纯度。图14i-14l显示规模的病毒的阳离子交换色谱洗脱。图14i和14k显示使用4倍稀释系数和分别具有和不具有聚山梨醇酯的柠檬酸ph5.5缓冲液而获得的洗脱曲线。图14j显示图14i中所示的实验的各级分的病毒产率。图14l显示使用sds-page银染的图14k中所示的实验的各级分的纯度。

图15a-15c显示测试阳离子和阴离子交换条件对回收率的影响的实验设置。图15a：测试的阳离子交换条件。图15b：测试的阴离子交换条件。图15c：每个条件对步骤和总体回收率的影响。0.05％-80存在于所有缓冲液中。

图16a和16b显示测试增加缓冲液浓度和降低阳离子交换洗脱ph和阴离子交换装载ph的影响的实验设置。图16a：测试的条件。图16b：增加缓冲液浓度和降低阳离子交换洗脱ph和阴离子交换装载ph对回收率的结果(dsp1.0的结果在上面两行中给出，dsp1.1的结果在下面两行中给出)。

图17a显示稀释强度对回收率(以总d-抗原占总装载的百分比为单位测定)的影响。描述了洗脱液以及穿透液和洗柱液(“ft+洗柱”)中的回收率。请注意，即使在无稀释条件下，在穿透液中也无du回收。图17b显示穿透液中s2脊髓灰质炎病毒的百分比随用于阳离子交换膜装载的稀释系数的变化。

图18a和18b显示改变洗脱缓冲液对阴离子交换洗脱曲线的影响。描绘了使用基于ph的用ph8.0磷酸盐缓冲液(图18a)洗脱和使用基于盐的用nacl的ph8.0磷酸盐缓冲液的洗脱(图18b)获得的洗脱曲线。

图19提供了用于扩大病毒生产的示例性下游处理流程的示意图。

图20a和20b显示根据一些实施方案概述的两个完整生产过程的图示。

图21a提供使用500/66m²系统进行病毒生产的完整过程流程图。图21b显示使用500/66m²系统进行上游工艺步骤的优化参数。

图22显示完整的25l规模生产工艺的结果。

图23a显示完整25l规模生产工艺的下游处理步骤。图23b-23d显示在两种不同电导率下从阳离子交换色谱中洗脱病毒。图23e-23g显示完整25l规模生产工艺的阴离子交换色谱的洗脱曲线。图23h显示了用于纯化s2病毒的下游工艺参数。图23i显示下游工艺的每个步骤的体积；d-抗原滴度；总量和回收率；总蛋白质；和蛋白质/d-抗原比率。

图24a-24c显示500/66m²和nano系统中病毒生产的上游工艺参数的差异及其对总生产力(du)的影响。

图25a总结了用于病毒收获和纯化的上游处理步骤。图25b总结了用于病毒收获和纯化的下游处理步骤。

图26a显示装载病毒株s1至阳离子交换膜上的ph。图26b和26c显示从阳离子交换膜nacl洗脱病毒株s1。

图27a显示装载病毒株s1至阴离子交换膜上的ph。图27b显示从阴离子交换膜nacl洗脱病毒株s1。

图28a显示装载病毒株s3至阳离子交换膜上的ph。图28b和28c显示从阳离子交换膜nacl洗脱病毒株s3。

图29a显示装载病毒株s3至阴离子交换膜上的ph。图29b显示从阴离子交换膜nacl洗脱病毒株s3。

图30a和30b分别显示根据一些实施方案使用nacl(图30a)和ph(图30b)洗脱的下游工艺步骤。

图31a和31b分别显示根据一些实施方案使用nacl(图31a)和ph(图31b)洗脱的完整工艺操作的每个工艺步骤中的病毒回收率。病毒株s2用于这些实验。

图32显示使用病毒株s2的工艺操作从阴离子交换膜的nacl洗脱获得的色谱图。特定级分及其相应的体积如图所示。

图33a和33b显示了在各种工艺步骤之后从使用病毒株s2的工艺试验获得的vp1、vp2和vp3。图33a显示nacl洗脱的结果，图33b显示ph洗脱的结果。

详述

通用技术

本领域技术人员通常很好地理解本文描述或提述的技术和方法，且通常使用常规方法学采用这些技术和方法，例如，sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual3dedition(2001)coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.；currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,等eds.,(2003))；methodsinenzymology(academicpress,inc.):pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hames和g.r.tayloreds.(1995)),harlow和lane,eds.(1988)antibodies,alaboratorymanual,和animalcellculture(r.i.freshney,ed.(1987))系列；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait,ed.,1984)；methodsinmolecularbiology,humanapress；cellbiology:alaboratorynotebook(j.e.cellis,ed.,1998)academicpress；animalcellculture(r.i.freshney),ed.,1987)；introductiontocellandtissueculture(j.p.mather和p.e.roberts,1998)plenumpress；cellandtissueculture:laboratoryprocedures(a.doyle,j.b.griffiths,andd.g.newell,eds.,1993-8)j.wiley和sons；handbookofexperimentalimmunology(d.m.weir和c.c.blackwell,eds.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.m.miller和m.p.calos,eds.,1987)；pcr:thepolymerasechainreaction,(mullis等,eds.,1994)；currentprotocolsinimmunology(j.e.coligan等,eds.,1991)；shortprotocolsinmolecularbiology(wiley和sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway和p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:apracticalapproach(d.catty.,ed.,irlpress,1988-1989)；monoclonalantibodies:apracticalapproach(p.shepherd和c.dean,eds.,oxforduniversitypress,2000)；usingantibodies:alaboratorymanual(e.harlow和d.lane(coldspringharborlaboratorypress,1999)；theantibodies(m.zanetti和j.d.capra,eds.,harwoodacademicpublishers,1995)；和cancer:principlesandpracticeofoncology(v.t.devitaetal.,eds.,j.b.lippincottcompany,1993)中描述的广泛使用的方法。

细胞培养

本发明的某些方面涉及用于产生肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的方法。产生肠病毒c病毒可用于(例如)疫苗和/或免疫原性组合物，其包括但不限于纯化的病毒、灭活的病毒、减毒的病毒、重组的病毒或用于亚单位疫苗的纯化的和/或重组的病毒蛋白。

在一些实施方案中，本公开的细胞是哺乳动物细胞(例如哺乳动物细胞系)。适用于培养本公开的所述至少一种病毒的细胞系优选为哺乳动物来源，且包括但不限于：vero细胞(来自猴肾脏)、马、牛(如mdbk细胞)、绵羊、犬(如来自犬肾脏的mdck细胞，atccccl34mdck(nbl2)或mdck33016，如wo97/37001中所述的保藏号dsmacc2219)、猫、啮齿类动物(如仓鼠细胞，例如bhk21-f、hkcc细胞或中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞))，且可从多种发育阶段获得，包括(例如)成体、新生儿、胎儿和胚胎。在某些实施方案中，所述细胞是永生化的(如perc.6细胞，如wo01/38362和wo02/40665中所述，保藏在ecacc保藏号96022940下)。在优选的实施方案中，使用哺乳动物细胞，且可选自和/或衍生自下列非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如皮肤、肺)、内皮细胞(例如主动脉、冠状动脉、肺、血管、皮肤微血管、脐带)、肝细胞、角化细胞、免疫细胞(如t细胞、b细胞、巨噬细胞、nk、树突状细胞)、乳腺细胞(如上皮细胞)、平滑肌细胞(如血管、主动脉、冠状动脉、动脉、子宫、支气管、宫颈、视网膜周细胞)、黑素细胞、神经细胞(如星形胶质细胞)、前列腺细胞(如上皮细胞、平滑肌)、肾细胞(如上皮细胞、肾小球系膜、近端小管)、骨骼细胞(如软骨细胞，破骨细胞，成骨细胞)、肌细胞(如成肌细胞、骨骼、平滑肌、支气管)、肝细胞、视网膜细胞和基质细胞。wo97/37000和wo97/37001描述了能够在悬浮和无血清培养基中生长且可用于病毒的生产和复制的动物细胞和细胞系的产生。

在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物肾细胞。合适的哺乳动物肾细胞的实例包括但不限于mdck、mdbk、bhk-21、vero、hek和hkcc细胞。

在某些实施方案中，所述细胞是vero细胞。合适的vero细胞系的实例包括但不限于whovero10-87、atccccl-81、vero76(atcc登记号crl-1587)或veroc1008(atcc登记号crl-158)。

在一些实施方案中，所述细胞是贴壁细胞。如本文所用，贴壁细胞可指在培养期间粘附或锚定于基质的任何细胞。

上述细胞类型的培养条件是已知的且在各种出版物中描述，或者培养基、补充剂和条件可以商购，例如，如cambrexbioproducts(eastrutherford,n.j.)目录和其他文献中所述。

已知的无血清培养基包括iscove's培养基、ultra-cho培养基(biowhittaker)或ex-cell(jrhbioscience)。常见的含血清培养基包括伊格尔(eagle's)基础培养基或最小必需培养基(mem)(eagle,science,130,432(1959))或杜氏改良的伊格尔培养基(dmem或edm)，这些培养基通常与最高达10％的胎牛血清或类似添加剂一起使用。任选地，可以使用不含任何含血清的补充物的最小必需培养基(mem)(eagle,science,130,432(1959))或杜氏改良的伊格尔培养基(dmem或edm)。无蛋白质的培养基，如pf-cho(jhrbioscience)、化学成分确定的培养基，如procho4cdm(biowhittaker)或smif7(gibco/brllifetechnologies)和促有丝分裂肽(如primactone、pepticase或hypep.tm.(全部来自questinternational))或乳蛋白水解产物在现有技术中也是充分已知的。基于植物水解产物的培养基添加剂具有特别的优点，即可排除病毒、支原体或未知感染因子的污染。

本公开的方法的某些方面涉及培养的细胞的密度。在一些实施方案中，在第一培养基中培养的细胞的密度或绝对数量可指接种细胞培养物(即在病毒接种之前)的细胞的密度或绝对数。如本文所述，且不希望受理论约束，认为以较低密度培养细胞可有利于降低病毒接种时的细胞密度、延长细胞生长期和/或减少包括但不限于接种物的大小、劳动时间、预培养步骤中的足迹、培养箱的数量和/或污染的风险等因素。

在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。例如，在一些实施方案中，开始初始细胞培养的接种密度为约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²。在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²；约5,000个细胞/cm²；约6,000个细胞/cm²；约7,000个细胞/cm²；约8,000个细胞/cm²；约9,000个细胞/cm²；约10,000个细胞/cm²；约11,000个细胞/cm²；约12,000个细胞/cm²；约13,000个细胞/cm²；约14,000个细胞/cm²；约15,000个细胞/cm²或约16,000个细胞/cm²被接种，其包括其间的任何值。在一些实施方案中，接种前的细胞密度少于任何下列密度(以个细胞/cm²计)：16,000；15,500；15,000；14,500；14,000；13,500；13,000；12,500；12,000；11,500；11,000；10,500；9,000；8,500；8,000；7,500；7,000；6,500；6,000；5,500；5,000；或4,500。在一些实施方案中，接种前的细胞密度大于任何下列密度(以个细胞/cm²计)：4,000；4,500；5,000；5,500；6,000；6,500；7,000；7,500；8,000；8,500；9,000；9,500；10,000；10,500；11,000；11,500；12,000；12,500；13,000；13,500；4,000；14,500；15,000；或15,500。即接种前细胞细胞密度可以是下列密度范围：上限为16,000；15,500；15,000；14,500；14,000；13,500；13,000；12,500；12,000；11,500；11,000；10,500；9,000；8,500；8,000；7,500；7,000；6,500；6,000；5,500；5,000；或4,500，以及独立选择的下限为4,000；4,500；5,000；5,500；6,000；6,500；7,000；7,500；8,000；8,500；9,000；9,500；10,000；10,500；11,000；11,500；12,000；12,500；13,000；13,500；14,000；14,500；15,000；或15,500；其中下限低于上限。在某些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被接种。在某些实施方案中，使用约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²作为初始接种密度，然后培养直至达到约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²，用于接种肠病毒c(如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)。

在一些实施方案中，本发明的细胞在所述肠病毒c病毒接种所述细胞的条件下用本发明的肠病毒c病毒(如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)接种。肠病毒c病毒感染细胞的条件在本领域中已知，且可取决于细胞类型、肠病毒c类型、培养基、温度、细胞密度、病毒密度(如moi)、细胞生长率、细胞传代数等。肠病毒c病毒感染细胞的条件的示例性描述在下文中提供。例如，在一些实施方案中，可以使用图8b中描述的一种或多种条件以任何组合培养和/或接种细胞培养物。

本公开的方法的某些方面涉及病毒接种时候的细胞密度。如本文所用，且不希望受理论约束，认为感染时的细胞密度可影响病毒产量(如病毒生产力)。病毒接种时的最佳细胞密度可导致比(每细胞)生产力、体积(每ml收获物)生产力和/或稳定性增加，以及培养基消耗和/或收获物中的污染物减少。

在一些实施方案中，约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被肠病毒c(如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)接种。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被肠病毒c(如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)接种。在一些实施方案中，约150,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被肠病毒c接种。在一些实施方案中，约120,000个细胞/cm²至约200,000个细胞/cm²被肠病毒c接种。在一些实施方案中，接种时细胞密度少于任何下列密度(以个细胞/cm²计)：300,000；275,000；250,000；225,000；200,000；175,000；150,000；125,000；100,000；75,000；50,000；45,000；40,000；35,000；30,000；25,000；20,000，17,500；15,000；12,500；10,000；7,500；或5,000。在一些实施方案中，接种时细胞密度大于任何下列密度(以个细胞/cm²计)：2,500；5,000；7,500；10,000；12,500；15,000；17,500；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；75,000；100,000；120,000；150,000；175,000；200,000；225,000；250,000；或275,000。即接种时细胞密度可以是任一下列密度范围：其上限为300,000；275,000；250,000；225,000；200,000；175,000；150,000；125,000；100,000；75,000；50,000；45,000；40,000；35,000；30,000；25,000；20,000，17,500；15,000；12,500；10,000；7,500；或5,000，且独立选择的下限为2,500；5,000；7,500；10,000；12,500；15,000；17,500；20,000；25,000；30,000；35,000；40,000；45,000；50,000；75,000；100,000；120,000；150,000；175,000；200,000；225,000；250,000；或275,000；其中所述下限低于所述上限。在一些实施方案中，约5,000个细胞/cm²被肠病毒c(如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)接种。

本公开的方法的某些方面涉及培养本公开的细胞时(例如，在接种肠病毒c(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)病毒之前、期间或之后)的体积/表面积比。如本文所述，并且不希望受理论束缚，认为培养细胞时的体积/表面积比可影响病毒产量(例如病毒生产力)。最佳体积/表面积比可以导致比(每细胞)生产力、体积(每ml收获物)生产力和/或稳定性增加，以及培养基消耗和/或收获物中的污染物降低。

在一些实施方案中，培养本公开的细胞时的体积/表面积比为约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²。在一些实施方案中，培养本公开的细胞时的体积/表面积比是指接种前培养所述细胞的条件。在一些实施方案中，培养本公开的细胞时的体积/表面积比是指接种期间培养所述细胞的条件。在一些实施方案中，培养本公开的细胞的体积/表面积比是指接种后培养所述细胞的条件。在一些实施方案中，所述细胞是贴壁细胞，且所述细胞在具有基质的固定床中培养，如本文所述的和/或本领域中已知的其他方式。在一些实施方案中，体积/表面积比少于任何下列比率(以ml/cm²计)：0.3、0.275、0.25、0.225、0.2、0.175、0.15或0.125。在一些实施方案中，体积/表面积比大于任何下列比率(以ml/cm²计)：0.1、0.125、0.150、0.175、0.2、0.225、0.25或0.275。即体积/表面积比可以是任何下列的比率范围：上限为0.3、0.275、0.25、0.225、0.2、0.175、0.15或0.125，且独立选择的下限为0.1、0.125、0.150、0.175、0.2、0.225、0.25或0.275；其中所述下限低于所述上限。

本公开的方法的某些方面涉及用于接种本公开的细胞培养物的肠病毒的moi。本文使用的moi与其在本领域中公认的含义一致，即病毒物质(例如肠病毒c病毒)与病毒靶标(例如本公开的细胞)的已知或预测的比率。本领域已知moi影响培养物中被至少一种病毒感染的细胞百分比。虽然较高的moi可提高病毒生产力，但moi感染率在一定范围内可能饱和，故在达到阈值或期望的感染率后降低moi可以降低相应病毒种子库的体量和成本。

在一些实施方案中，用肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)以约0.01至约0.0009的moi接种细胞。在一些实施方案中，moi小于任何下列moi：0.010、0.008、0.005、0.002或0.0010。在一些实施方案中，moi大于任何下列moi：0.0009、0.0010、0.002、0.005、0.008或0.010。即moi可以是任何下列的moi范围：上限为0.010、0.008、0.005、0.002或0.0010，且独立选择的下限为0.0009、0.0010、0.002、0.005、0.008或0.010，其中所述下限低于所述上限。

本公开的方法的某些方面涉及接种本公开的细胞时的ph(例如包含所述细胞的细胞培养基的ph)。如本文所述，ph可影响细胞病毒产生。

在一些实施方案中，以范围为约6.8至约7.4的ph用所述肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)接种所述细胞。在一些实施方案中，接种时的ph低于任何下列ph：7.4、7.3、7.2、7.1、7.0或6.9。在一些实施方案中，接种时ph大于任何下列ph：6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。即接种时的ph可以是任何下列的ph范围：上限为7.4、7.3、7.2、7.1、7.0或6.9，且独立选择的下限为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3，其中所述下限低于所述上限。例如，在一些实施方案中，接种时的ph可以是约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3或约7.4。

感染后，可以在第二细胞培养基中培养(例如，在本公开的固定床中)本公开的感染细胞。如本文所述的培养的细胞可在病毒接种之前在第一培养基中培养，且在病毒接种时和/或之后在第二培养基中培养。例如，在一些实施方案中，可以在第一细胞培养基中培养本公开的细胞，然后可移除该第一细胞培养基，可任选地冲洗细胞(例如，用pbs等水性缓冲溶液)，可将第二种培养基加入该细胞中。在一些实施方案中，所述第二培养基可含有肠病毒c病毒(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)用于接种所述细胞。在一些实施方案中，第一培养基和第二培养基是相同的培养基(例如，具有相同的成分，在一些实施方案中，二者不一定是同一培养基)。在其他实施方案中，所述第一培养基和所述第二培养基是不同的(例如具有不同成分)。

在一些实施方案中，所述第一细胞培养基包含血清(如胎牛血清)。可使用适合培养的细胞生长的任何类型的血清。本领域的血清的实例包括但不限于胎牛血清、胎牛血清(fetalcalfserum)、马血清、山羊血清、兔血清、大鼠血清、小鼠血清和人血清。在一些实施方案中，所述第一细胞培养基含有10％以下的血清(例如胎牛血清)，并且该细胞不适合于无血清培养基。在某些实施方案中，所述第一细胞培养基含有5％血清(例如胎牛血清)。

在一些实施方案中，所述第二培养基是无血清培养基。在一些实施方案中，所述第二培养基是不含蛋白质的培养基。在本公开的上下文中，不存在来自人或动物的血清的添加物的培养基(例如本公开的培养基)被称为无血清培养基。无蛋白质被理解为意指其中发生细胞增殖，但不包含蛋白质、生长因子、其他蛋白质添加和非血清蛋白质的培养物，但可任选地包括病毒生长所必需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其他蛋白酶。在这种培养物中生长的细胞本身天然自然含有蛋白质。

在一些实施方案中，在用肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)接种细胞期间或收获前约1小时至约四个小时将表面活性剂和/或葡聚糖添加至所述第二细胞培养基。多种表面活性剂可适用于本公开的细胞培养基，其包括但不限于聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20(也称为20)、40、60和80(也称之为80)；和基于聚乙二醇的表面活性剂，例如triton^tm系列(例如triton^tmx-100，dowchemical)和ca-630(rhodiaoperations)/nonidet^tmp-40(shellchemical)。在一些实施方案中，加入细胞培养基中的表面活性剂和/或葡聚糖的量为0.005％至0.05％(例如，作为细胞培养基体积的v/v百分比)，例如0.005％、0.010％、0.015％、0.020％、0.025％、0.030％、0.035％、0.040％、0.045％或0.050％，其包括其间的任何值。在某些实施方案中，加入0.05％聚山梨醇酯。在某些实施方案中，加入0.005％聚山梨醇酯。

如本文所述的，发现在用病毒接种期间或之前添加表面活性剂和/或葡聚糖可促进总病毒收获物和生产力的显著提高。在一些实施方案中，相较于在缺少所述表面活性剂和/或葡聚糖的情况下收获的肠病毒c病毒的产量，通过添加表面活性剂(例如，在收获期间或之前)和/或葡聚糖，增加了收获的肠病毒c病毒的产量。例如，相较于在缺少所述表面活性剂和/或葡聚糖的情况下收获的肠病毒c病毒的产量，通过添加表面活性剂(例如在收获期间或之前)和/或葡聚糖，收获的肠病毒c病毒的产量增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约两倍、至少约三倍、至少约四倍、至少约五倍、至少约六倍、至少约七倍、至少约八倍或至少10倍。在某些实施方案中，相较于在缺少所述表面活性剂和/或葡聚糖的情况下收获的肠病毒c病毒的产量，通过添加表面活性剂(例如在收获期间或之前)和/或葡聚糖，收获的肠病毒c病毒的产量增加了至少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约两倍、至少约三倍、至少约四倍、至少约五倍、至少约六倍、至少约七倍、至少约八倍或至少十倍。

在一些实施方案中，所述细胞培养物在具有基质的固定床生物反应器中(例如使用贴壁细胞)。在一些实施方案中，所述细胞在微载体上培养。在一些实施方案中，细胞培养物在生物反应器中。适用于悬浮生长和使用贴壁细胞的各种生物反应器是本领域已知的和/或本文所述的。

在一些实施方案中，在用所述病毒接种期间添加聚山梨醇酯至所述第二细胞。在其他实施方案中，在收获前约一个小时至约四个小时添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养基。在一些实施方案中，在收获前约两小时、三小时或四小时后添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养物中。在一些实施方案中，在收获前约一小时、两小时或三小时后添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养物中。即，可在上限为收获前的两小时、三小时或四小时、独立选择的下限为约一小时、两小时或三小时的的任何时间添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养物中。例如，在一些实施方案中，收获前的约一小时、约两小时、约三小时或约四小时添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养物中。

本公开的方法的某些方面涉及在本公开的肠病毒c病毒(脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)接种细胞期间或即将接种之前的细胞培养基中存在的葡萄糖的量。如本文所述，代谢胁迫(例如，表现为细胞培养基中可用的低葡萄糖水平和/或培养的细胞中的乳酸脱氢酶活性)可以增强病毒的细胞产量。在一些实施方案中，从本公开的第二细胞培养基中耗竭葡萄糖。例如，细胞培养基可以用具有较低(例如耗尽的)葡萄糖水平的细胞培养基替换，或者细胞可以在所述第二细胞培养基中生长，使得在没有外源葡萄糖替代/补充的条件下，所述细胞培养基中的葡萄糖被细胞耗尽。在一些实施方案中，不添加额外的葡萄糖至本公开的第二细胞培养基中。在一些实施方案中，在本公开的细胞培养基中培养的细胞在接种前经历至少24小时、至少48小时或至少72小时葡萄糖短缺(例如，相对于细胞培养物中存在的起始量，葡萄糖量减少)。在一些实施方案中，低于250mg/l的细胞培养物葡萄糖水平指示第二天葡萄糖短缺。在一些实施方案中，相较于通过标准方法培养的细胞，本公开的细胞培养基中培养的细胞在感染时或之前显示乳酸脱氢酶(ldh)活性增加和/或乳酸产量增加。

病毒接种物和病毒培养物优选不含(即已经检测下列病毒且对于下列病毒引起的污染呈阴性结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、sars冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双rna病毒(birnaviruses)、圆环病毒(circoviruses)和/或细小病毒[wo2006/027698]。

细胞培养的其他参数和细胞培养基也可影响病毒的生产。在一些实施方案中，本公开的细胞可以以期望的体积/表面积比在本公开的第一和/或第二培养基中培养。不希望受理论约束，培养细胞时的体积/表面积比可影响参数，例如细胞生产力、细胞大小、生长速率和/或培养基中营养物和其他组分的获取。在某些实施方案中，以约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养细胞(例如，病毒接种之前、期间和/或之后)。

在一些条件下，在培养期间本公开的细胞可产生乳酸。本领域已知培养中的细胞可因为糖酵解和厌氧型代谢产生乳酸。不希望受理论约束，认为细胞培养中的过量乳酸可通过降低培养基中的ph来负面影响细胞生长、代谢和/或病毒生产力。进一步地，由培养的细胞产生过量的乳酸可指示病毒生产和/或生长可不需要的细胞代谢状态。在一些实施方案中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基中的乳酸盐浓度不超过约25mm。测量细胞培养基中乳酸浓度的方法是本领域已知的，且包括但不限于使用乳糖计、乳酸酶测定(例如，通过使用乳酸脱氢酶和比色或荧光检测试剂)、微透析取样装置等。

在一些实施方案中，本公开的感染细胞可以在第二细胞培养基中培养(例如在本公开的固定床中)，在该第二细胞培养基中，感染的细胞产生所述肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)。感染的细胞产生肠病毒c的条件是本领域已知的，并且可取决于细胞类型、肠病毒c的类型、培养基、温度、细胞密度、病毒密度(例如moi)、细胞生长速率、细胞传代数量等。肠病毒感染细胞的条件的示例性描述在下文中提供。

本文公开的方法其他方面涉及细胞培养基中的氧密度(do)。在细胞培养基中维持合适的氧水平可通过提供用于细胞呼吸的氧来促进细胞生长和/或病毒生产力。此外，细胞培养物中细胞的氧利用可反映其健康状况、生长状态和/或代谢状态。在一些实施方案中，所述第一细胞培养基和/或所述第二细胞培养基中的氧密度维持在约50％以上。用于维持和/或测量细胞培养基中do的方法是本领域已知的，并且可包括但不限于自动氧气注射、使用氧气控制器，使细胞培养基暴露于氧气(优选地同时最小化污染的风险)、使用氧气控制器、施用氧传感器等等。在一些实施方案中，本公开的第一细胞培养基中的氧密度(do)保持在约50％以上。本公开的第二细胞培养基中的氧密度(do)保持在约50％以上。在一些实施方案中，本公开的第一细胞培养基中的氧密度(do)保持在约60％以上。在一些实施方案中，本公开的第二细胞培养基中的氧密度(do)保持在约60％以上。

在一些实施方案中，本公开的第一细胞培养基含有不超过约25mm的乳酸浓度。在一些实施方案中，本公开的第二细胞培养基含有不超过约25mm的乳酸浓度。测量细胞培养基中乳酸浓度的方法是本领域已知的，例如，如本文所述的。

本文描述了示例性培养参数和条件。预期如上所述的细胞培养技术和参数可采用实施例11中描述的一种或多种条件，和/或参考图24a-24c，以任何组合。

可以使用本领域已知的各种方法来测量通过本公开的方法产生的感染性病毒的滴度。此类方法包括但不限于终点稀释测定(例如，确定tcid50值)、蛋白质测定、定量透射电子显微镜(tem)、噬斑测定、焦点形成测定(ffa)等。在一些实施方案中，病毒滴度以tcid50/ml测量。在一些实施方案中，收获至少5.0×10⁷tcid50/ml的肠病毒a病毒。

在一些实施方案中，通过裂解所述宿主细胞(即用所述病毒接种的并产生所述病毒的细胞)来收获本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)。如本文所述，可在生产细胞中的细胞内发现显著量的产生的病毒，因此细胞裂解可显著增加病毒收获量和产量。多种细胞裂解方法是本领域已知的并且适用于一系列生产细胞。在一些实施方案中，所述细胞通过冻融来裂解。在一些实施方案中，所述细胞通过表面活性剂(包括但不限于聚山梨醇酯(例如吐温-80)或基于聚乙二醇的表面活性剂(例如triton^tmx))裂解。在一些实施方案中，所述细胞通过物理剪切裂解。

细胞培养装置

本公开的某些方面涉及用于培养细胞的方法。在一些实施方案中，细胞在诸如固定床、摇动或搅拌/搅拌槽生物反应器的装置中培养。示例性细胞培养装置是可商购的，且是本领域已知的。参见，如us8597939、us8137959、uspgpub2008/0248552、wo2014093444和genzel,y.等.(2006)vaccine24:6074-87中描述的生物反应器；来自medorex的生物反应器；来自gehealthcarelifescience的wave或xcellerex生物反应器；或来自lifesciences,portwashington,ny的生物反应器，例如nano,500/100和500/66生物反应器。

在一些实施方案中，所述细胞在固定床生物反应器中培养。固定床生物反应器包括呈固定填充材料形式的载体，所述载体形成用于促进细胞粘附和生长的固定床或填充床。固定床的填充材料的布置影响局部流体、热量和质量传递，并且通常非常密集以使给定空间内的细胞培养最大化。在一个实施方案中，反应器包括与由填充材料(诸如纤维、珠粒、球粒或类似材料)组成的填充床或固定床形成内部的壁，以用于促进细胞粘附和生长。所述材料位于反应器内部内的隔室中，所述隔室可包括中空的垂直延伸管的上部分。第二隔室设置在反应器内部内，以用于将流体来回运输到至少部分形成固定床的隔室的材料。通常，填充材料应被布置来使用于细胞生长的表面积最大化，其中1,000平方米被认为是有利的表面积量(这例如可使用医用级聚酯微纤维作为填充材料来实现)。在一个实施方案中，均匀分布的培养基循环通过建立磁力驱动叶轮来实现，从而确保低剪切应力和高细胞活力。细胞培养基从底部到顶部流动穿过固定床。在顶部，培养基以薄膜形式从外壁上下落，其中它吸收o2，以维持生物反应器中的高kla.。此瀑布式样充氧作用连同轻微搅拌和生物质固化使得生物反应器能够实现并维持高细胞密度。在一些实施方案中，固定床具有约2cm的床高。在其他实施方案中，固定床具有约10cm的床高。

在一些实施方案中，固定床含有巨载体(例如基质)。在一些实施方案中，所述巨载体为纤维基质。在一些实施方案中，所述巨载体为碳纤维基质。巨载体可选自织造或非织造微纤维、聚酯微纤维(例如医用级聚酯微纤维)多孔碳和壳聚糖基质。微纤维可任选地由pet或任何其他聚合物或生物聚合物制成。在一些实施方案中，巨载体包括珠粒。聚合物可被处理来与细胞培养物相容，如果此类处理必需的话。

适合巨载体、基质或“携带材料”为与细胞生长相容的矿物载体，诸如硅酸盐、磷酸钙、有机化合物诸如多孔碳、天然产物诸如壳聚糖、聚合物或生物聚合物。基质可具有带有规则或不规则结构的珠粒形式，或者可包含与细胞生长相容的聚合物或任何其他材料的织造或非织造微纤维。填充物也可以具有孔和/或通道的单件形式提供。器皿中的填充物可具有各种形式和尺寸。在一些实施方案中，基质为固体或多孔球、薄片、多边形的微粒材料。通常，使用充分量的基质来避免基质颗粒在使用时在器皿中移动，因为这会损害细胞并且可能对气体和/或培养基的循环具有影响。可选地，基质由配合到内部器皿中或配合到器皿隔室中的元件组成，并且具有适合的孔隙率和表面。其实例为通过cinvention(德国)制造的碳基质(carboscale)。在一些实施方案中，纤维基质具有的细胞可及的表面积为约150cm²/cm³至约1000cm²/cm³。在一些实施方案中，纤维基质具有的细胞可及的表面积为约10cm²/cm³至约150cm²/cm³。例如，纤维基质具有的细胞可及的表面积为约10cm²/cm³；约20cm²/cm³；约40cm²/cm³；约60cm²/cm³；约80cm²/cm³；约100cm²/cm³；约120cm²/cm³；约150cm²/cm³；约200cm²/cm³；约250cm²/cm³；约500cm²/cm³；或约1000cm²/cm³，包括其间的任何值。在一些实施方案中，纤维基质具有的细胞可及的表面积小于以下任何一个(cm²/cm³)：1,000；900；800；700；600；500；400；300；200；175；150；125；100；90；80；70；60；50；40；30；或20。在一些实施方案中，纤维基质具有细胞可及的表面积，其大于以下任何一个(cm²/cm³)：10；20；30；40；50；60；70；80；90；100；125；150；175；200；300；400；500；600；700；800；或900。即，纤维基质具有细胞可及的表面积，其可以是上限为1,000；900；800；700；600；500；400；300；200；175；150；125；100；90；80；70；60；50；40；30；或20和下限为10；20；30；40；50；60；70；80；90；100；125；150；175；200；300；400；500；600；700；800；或900的任何范围(cm²/cm³)；其中下限小于上限。在一些实施方案中，纤维基质具有的细胞可及的表面积为约120cm²/cm³。

在一些实施方案中，巨载体(例如纤维基质)具有约60％与99％之间的孔隙率。在一些实施方案中，巨载体(例如纤维基质)具有约80％与约90％之间的孔隙率。任选地，填充可具有50％至98％的范围内的孔隙率p。术语孔隙率p为给定材料体积内存在的空气的体积，并且表示为给定材料体积的百分比。孔隙率可通过测量每体积多孔材料的重量wx并使用以下公式来测量：

p＝100-(1-wxw比)

其中w比为材料的比重。多孔材料可以是一个固体单元的多孔材料，或者可以是多个单独单元，诸如晶粒、碎片、珠粒、纤维或纤维聚结物。

在一些实施方案中，固定床为单次使用或一次性固定床。例如，可商购获得的生物反应器诸如nano500/100和500/66生物反应器bioreactors(lifesciences,portwashington,ny)可包括具有可移除、一次性或单次使用的固定床的生物反应器系统，所述固定床提供压实生物反应器体积的大生长表面积。与使用微载体的标准搅拌罐生物反应器相比，此类系统避免若干个精妙且耗时的程序，包括人工操作、微载体的消毒和水合以及从预培养到最终过程的珠粒至珠粒转移。如本文所用，此类生物反应器可使得能够实现在大规模(例如500平方米)培养面积当量和高达1500至2000l的收获流体体积下的过程，其有利于工业规模生产病毒(例如用于制备疫苗)。如本文所列举的，此类设备可能够实现另外的优点，诸如低细胞接种体；在短预培养时段达到最佳感染细胞密度；和/或对培养生长阶段期间的moi、培养基和血清浓度最优化。此类设备可被配置来允许将细胞快速灌注于培养物中，例如使得90％或更多的细胞经历相同的培养基环境。此外，并且不希望受到理论约束，单次使用或一次性固定床可允许流水线化下游处理以使生产率最大化并且减少处理区的足迹，甚至在使比例放大相对于若干大规模常规培养容器的情况下也是如此。这样，可使用最少步骤和成本实现有利的生产率和纯度。

在一个实施方案中，用于细胞培养的器皿具有内部空间，其可以是环形的但也可以采用其他形式。所述空间含有填充物。当器皿用于细胞培养时，填充物应与细胞生长相容。在环形配置中，内部空间具有由以下各项限定的环形体积：外管状壁，其具有第一外端和第二外端以及在纵向方向上延伸的纵向壁。外管状壁在纵向方向上限定了环形体积的外边界；第一闭合件和第二闭合件，其分别在外管状壁的第一外端和第二外端处对环状体积进行限界和封闭；内伸长壁，其具有朝向外管状壁的第一外端定向的第一外端和朝向外管状壁的第二外端定向的第二外端。内伸长壁定位在外管状壁内。内伸长壁在纵向方向中延伸并且限定了环形体积的内边界，所述内边界由所述外边界包围。内伸长壁的第二外端与第二闭合件相重合。作为实例，外管状壁通过圆柱形外管状元件提供。内伸长壁可通过实心内圆柱形元件诸如圆柱形杆提供。外管状元件为圆柱形管状元件，并且具有平行于纵向方向的中心轴线。内圆柱形元件和外管状元件可以同轴安装。

在一些实施方案中，内圆柱形元件的第一外端可包括联接元件以将内圆柱形元件联接至驱动机构，并且所述联接元件也通过与内圆柱形元件和外管状元件固定的闭合件将外管状元件联接至驱动机构，所述驱动机构例如是生物反应器的马达。第二闭合件设置有连接器，所述连接器适于将器皿联接至培养基源或气体源，以向内部空间提供培养基和/或气体和/或从所述内部空间中抽取培养基和/或气体。可为第一闭合件或第二闭合件提供这种连接器或可选地另外的连接器。

在一些实施方案中，当移动器皿中，填充物(具体地为多孔材料)可相对于器皿处于固定的相对位置，或者可在器皿内并相对于器皿移动，或者可视情况在器皿隔室内移动。器皿围绕其轴线，任选地以每分钟0.1转与25转之间的旋转速度旋转。

在一些实施方案中，内部空间部分填充有培养基，诸如细胞培养用培养基。作为实例，液体水平至少接触内伸长壁，或者内伸长壁部分浸入在培养基中。位于液体水平下方的填充物部分被培养用培养基诸如细胞培养用培养基浸湿。位于液体水平上方的填充物与内部空间中存在的气体或空气接触。当器皿在一个方向上围绕轴线旋转，例如顺时针旋转时，培养用培养基诸如细胞培养用培养基反向旋转，即在相对于填充物逆时针方向中。培养用培养基诸如细胞培养用培养基以活塞流的形式穿过整个填充物。在器皿例如顺时针旋转时，培养用培养基诸如细胞培养用培养基迫使活塞流前沿处的气体或空气逆时针移位。在培养基的后沿处，形成任选受限低压，使得气体或空气被朝向所述尾缘抽吸。如此，培养基和气体或空气穿过整个填充物。

在一些实施方案中，替代性器皿的内伸长壁可通过圆柱形管状元件来提供。外管状壁通过外管状元件提供。内伸长壁通过伸长圆柱形管状元件提供。外管状元件和伸长圆柱形管状元件固定至两个可移除的闭合件。第一闭合件设置有联接元件，其用于将器皿联接至驱动装置以使器皿沿纵向方向上的轴线旋转。第一闭合件还包括用于将内部空间连接至导管诸如柔性管的连接器。

在一些实施方案中，外管状元件可以是玻璃管，其具有例如110mm的长度l和例如135mm的内径do。内伸长元件可以是具有例如88.9mm的外径di的聚偏二氟乙烯(pvdf)管。内伸长元件的外端(因此内伸长壁的外端)与闭合件相重合。闭合件可以是不锈钢或pvdf环形盘，其可使用硅树脂连接至内部元件和外部元件。可设置有连接器的第一闭合件具有外径di为例如约35mm的联接元件。内部空间至少部分填充有填充物。

在一些实施方案中，器皿还包括2个流体可渗透分隔件，其将内部空间分隔为2个隔室。流体可渗透分隔件在平行于管轴方向的纵向方向上从内伸长壁延伸到外管状壁并且从第一闭合件延伸到第二闭合件。一个隔室设置有填充物。一个隔室未设置有填充物。流体可渗透分隔件可设置有孔隙，诸如通过使用多孔材料来提供多孔分隔件，或者设置有孔，从而在任何情况下均允许液体即培养用培养基和气体通过。然而，分隔件具有小到足以防止填充物从分隔件一侧穿到另一侧的孔隙或孔。

在一些实施方案中，外管状壁通过外管状元件提供，所述外管状元件沿垂直于纵向方向的平面的径向(racial)截面，所述截面具有圆的形状。内延伸壁通过内延伸元件提供，所述内延伸元件具有沿垂直于纵向方向的平面的径向截面，所述横截面具有截圆或圆弓形的形状。在一个实施方案中，圆弓形具有圆弧区段和弦。例如，圆弓形的高度具有200mm(dec)、400mm(do)、240mm(di)和125mm(l)的尺寸。分隔件在此实施方案中与圆弓形的弦共面。两个闭合件中的第二闭合件设置有两个连接器。第一连接器设置于外管状壁附近。第二连接器设置于内伸长壁附近。当器皿仅部分填充有培养用培养基(其具有液体表面)时，则器皿可旋转至如下位置，液体并不接触内伸长壁的，而是与内伸长壁保持给定距离。当器皿处于此位置时，第一连接器可用于从隔室移除或向隔室提供培养基，所述隔室未填充有填充物。可通过连接器将气体移除或将气体提供在培养基液体表面上方。通过顺时针或逆时针旋转器皿，例如以多至360°或甚至更大角度旋转，培养基将穿过两个分隔件之一，更具体地穿过将逐渐浸入在培养基中的分隔件。随着填充物将由于旋转而逐渐穿过培养基，培养基将缓慢地流过填充物。由于器皿旋转，培养基将以活塞流的方式穿过并流过整个填充物。将在整个环状体积中发生培养基与填充物之间的均匀接触。一旦一部分填充物穿过培养基，所述培养基将从填充物逐渐渗出并且因此器皿中的气体可再次接触填充物，从而允许细胞均匀生长在整个填充物中。

在器皿的一个替代实施方案中，内部空间的环形体积通过多个环形区段(在此具体情况下为四个环形区)提供。每个区段通过外管状壁区段提供一部分外管状壁。每个区段通过内伸长壁区段提供一部分内伸长壁。每个区段具有两个径向延伸区段壁。这些区段壁为液体和气体不可渗透的。每个区段壁设置有允许相邻区段彼此联接的安装装置。第一区段闭合件和第二区段闭合件分别在外管状壁的第一外端和第二外端处对环状区段的体积进行限定和封闭。区段闭合件一起分别形成器皿的环形体积的第一闭合件和第二闭合件。

在一些实施方案中，每个区段可进一步设置有两个流体可渗透分隔件，所述两个流体可渗透分隔件将每个环状区段的内部空间分为三个隔室。流体可渗透分隔件，例如多孔分隔件在平行于管状轴线方向的纵向方向上从内伸长壁延伸到外管状壁并且从第一闭合件延伸到第二闭合件。一个隔室设置有填充物。两个隔室未设置有填充物。对于每个环形区段，第一连接器设置于外管状壁附近。第二连接器设置于内伸长壁附近。当器皿围绕轴线旋转时，每个区段可充当器皿的独立器皿区段。在每个区段中填充物提供有培养基，所述培养基根据区段的径向位置而存在于此区段中。

通过安装这些区段(在此实施方案中为四个区段)，获得了具有外管状壁和伸长壁的器皿，其环形体积通过两个闭合件在外管状壁的两个外端处封闭。因为区段的联接通过安装和联接两个径向延伸的区段壁来提供，两个连续区段壁的组合形成液体和气体不可渗透分隔件，其在平行于管轴线方向的纵向方向上从内伸长壁延伸至外管状壁并且从第一闭合件延伸到第二闭合件。此实施方案具有以下优点：每个区段可提供有用于不同细胞培养的不同培养基。而且，在这些区段之一中的反应填充物的功能不正确的情况下，仅替换一个区段。器皿(或本文所公开的任何其他器皿)的旋转可由旋转器提供。在一个实例中，此旋转器可包括使外管状壁的外表面与至少两个支撑轮接触，所述支撑轮中的至少一个被驱动。

在一个替代性实施方案中，器皿的每个区段具有两个径向延伸区段壁。这些区段壁为液体和气体可渗透的。每个区段壁包括许多个孔，这些孔中的每个在邻隔室的第二区段壁中存在对应的孔。第一区段壁的孔可设置有向外延伸的边缘，其延伸穿过第二区段壁的对应孔。任选地，在相邻区段壁中的孔周围设置密封件，以防止培养基在接触壁之间渗漏。在替代性实施方案中，在器皿之间安置有柔性管而不是密封件。

在利用器皿的生物反应器的一个实施方案中，至少一个器皿以可旋转方式安装在容器中，所述容器可具有任何适合的径向截面，例如像圆形或多边形诸如矩形(任选地正方形)。容器部分地填充有培养用培养基，因此液体水平任选地不升高至高于生物反应器的轴线，而是至少接触内伸长壁。器皿围绕此轴线旋转，所述轴线与器皿的纵向轴线相同。器皿的纵向轴线是平行于外管状壁的纵向方向的轴线。任选地外管状壁设置有孔，或者由多孔的例如液体和气体可渗透材料制成。当此流体可渗透外管状壁在部分填充有培养基的容器中旋转，以使得仅外管状壁的一部分浸入在培养基中时，填充物可提供有通过外管状壁流入到环形体积中的培养基。当器皿在容器中旋转时，部分培养基可连同填充物一起受到拖曳。

在一些实施方案中，至少一个器皿包括磁力元件。生物反应器还包括与器皿的磁力元件协作的磁力元件。两个磁力元件被定位来使得生物反应器的磁力元件围绕旋转轴线的旋转将诱导器皿的磁力元件旋转，因此将使整个器皿旋转。相邻器皿可安装在共用轴上，它们围绕所述共用轴旋转。相邻器皿可在固定位置中彼此联接，因此器皿的旋转也诱导器皿旋转。

在一些实施方案中，器皿具有液体和气体不可渗透外管状壁，其具有用于通过任选柔性管将器皿连接至气体或培养基储存器的连接器。器皿可通过驱动系统旋转以用于提供生物反应器。器皿安装在可旋转轴上，其可围绕与器皿轴线重合的旋转轴线旋转。轴被设定外形并配合在内伸长元件的内空隙内的独特旋转位置中。这样，通过控制轴的旋转位置，明确地限定了器皿绕轴线的位置。驱动系统还可包括精确控制轴旋转的电动机(诸如线性马达)或任何其他适合的装置。防止器皿在轴上沿纵向方向移位的夹紧螺钉或任何其他装置可将固定器皿在轴上沿纵向方向的位置。应理解任选地超过一个器皿可安装在共同轴上。内伸长元件的内部空隙和轴的外周的形状被选择来使得所述轴和器皿可以受限的方式或甚至以独特的方式安装。

在器皿的一个实施方案中，内伸长元件在内伸长元件的内壁中具有纵向凹槽。轴上的边缘配合到此凹槽中。器皿以明确的方式固定在轴上。边缘可在凹槽中可滑动地移动。在器皿的一个替代性实施方案中，内伸长元件具有在所述内伸长元件的内壁中的两个纵向凹槽。轴上两个互相垂直凸脊配合到这些凹槽中。器皿以两种方式配合在轴上，第一位置围绕轴线相对于第二位置旋转180°。这些凸脊可在凹槽中可滑动地移动。在器皿的另一个实施方案中，内伸长元件具有四个纵向凹槽，在由隔室提供的内伸长元件的每个内壁中都存在一个。轴具有基本上十字形的截面，其包括轴上四个互相垂直的凸脊。每个凸脊配合到一个隔室的凹槽中。器皿以四种方式固定在轴上。这些凸脊可在凹槽中可滑动地移动。

在生物反应器器皿的另一个实施方案中，内部空间的体积通过多个区段(在此具体情况下为四个四分之一部分)提供。每个区段通过外管状壁部提供外管状壁的一部分。每个弓形通过内伸长壁部提供内伸长壁的一部分。每个弓形具有两个径向延伸弓形壁。作为实例，弓形具有两个径向延伸弓形壁。培养用培养基还可填充内伸长壁的内部空隙。通过孔，培养用培养基可流入或流出所述区段，并任选地流到相邻区段。器皿包括形成纵向壁的主体和呈帽的形式的末端。所述帽可为可移除的，并且在连接位置中形成用于在主体内包含任何流体的流体密封，。每个帽可包括形成用于接收培养基的入口或出口的开口，但是入口和出口各自也可设置在同一帽中或在主体的纵向壁中。提供至少一个或一对流体可渗透结构诸如穿孔隔板，从而形成用于包含任何填充物的隔室。每个隔板中的穿孔可在形状和尺寸上被设定，以控制流体在隔室中的流动和驻留时间，并且这些隔板可以是相同或不同的。可以下述方式提供填充物：使得它完全占据器皿的隔室的方式提供，并且因此沿圆周接触主体壁的内表面以及流体可渗透结构。

在一些实施方案中，器皿可与旋转设备相关联。所述设备可包括一对辊，其用于接收、支撑器皿并使器皿围绕主体纵向轴线旋转。器皿可设置有大体圆柱形主体，其适于接合辊并通过所述辊旋转以帮助分布穿过隔室中存在的任何填充物的任何流体(例如培养基或任何冲洗剂或回收剂)。管状连接器也可设置成与入口和出口相关联，以用于将流体递送至隔室。这可在器皿固定的同时或在它旋转的同时来进行。在后一种情况下，连接器可以按允许相对旋转的方式连接，例如通过使用卡扣接合产生的旋转接头或通过使用轴承而相对旋转。密封件诸如o-形环可用于帮助防止任何渗漏并且帮助维持细胞培养所需要的无菌条件。器皿的一个优点为布置的简单性。例如，器皿不包括传感器、探头、混合物或类似装置，在希望它包括此类结构的情况下，它可以包括这些结构，并且可通过将器皿与储罐以闭环回路连接来实现。储罐可包括用于测量循环流体的一个或多个特征的任何数目的传感器或类似装置，并且可包括单次使用容器(诸如柔性袋)以避免对清洁和消毒的需要。还可提供泵诸如蠕动泵以用于使流体循环通过回路。

在此实施方案中，器皿可根据任何以上细节而构造(因此形成滚瓶)，并且包括入口和出口。每个入口和出口可连接至导管，在不过度地约束(biding)或扭转该导管的情况下，该导管允许器皿以不干扰流体传输的方式旋转，并且因此可在器皿旋转的同时允许流体连续流入和流出器皿。确切地说，导管可包括具有开口端的盘管，以用于分别连接至入口或出口，并且可在相反端处于任何流体储罐相关联。适合的泵送布置也可被提供来使流体移动通过导管和器皿。

在一个实施方案中，器皿可使用适合旋转器(诸如辊)在第一方向上(诸如顺时针)旋转，进行一次或多次完整旋转。在不约束导管的情况下，可能的旋转次数可发生改变，但设想的是2-3次旋转可能是最小旋转次数。器皿然后可在第二相反方向上旋转，进行一次或多次完整旋转。更确切地说，旋转可以是在第一方向上使盘管回到其原来位置的旋转次数，加上在第二位置上的对应旋转次数，只要盘管不约束或以其他方式干扰流体传输。旋转和反向旋转可连续或间断地发生，并且对于经由导管对流体进行的递送和回收同样如此。还应理解在器皿包括传感器的事件中，它也可连接至用于感测的任何能量源。在此情况下，也可以盘绕或缠绕任何传输线诸如电缆，以在无扭转或约束的情况下适应以上文所预期的方式进行的相对旋转。同样，希望将任何传感器或类似装置置于任何再循环回路中，因为这降低了器皿的成本。

在滚瓶形式的器皿的另一个实施方案中，入口和出口可设置于共用壁中。所述入口也可与定位在固定床内的流体可渗透内部圆柱体内的管相关联，这有助于确保所引入的流体(气体、液体或两者)并不简单地通过入口立即流出。气体可通过将注射器诸如转子流量计放置于再循环回路中而引入到液体中。所述放置可恰好在入口的上游。这种气体引入方式与液体流动的结合有利地有助于减少发泡的发生率并提高传质速率，因为气体保留在由液体隔开的气穴中。与出口相关联的传输线回到储罐，这可通过所示的过滤器对所述储罐通气，以避免与器皿直接连接的通气孔。

在一些实施方案中，其他元件可添加至器皿和生物反应器。作为实例，内伸长壁可以是伸长管状的，任选地为圆柱形壁。内管壁的内空隙可用于容纳一个或多个传感器，诸如温度传感器、位置传感器(例如用于限定器皿相对于旋转轴线的取向)、光学传感器(例如用于生成关于培养用培养基诸如细胞培养用培养基的颜色的数据)、ph传感器、氧传感器(诸如溶解氧(do)-传感器)、co2～传感器、氨传感器或细胞生物质传感器(例如浊度密度计)。此类传感器可另外地或任选地位于闭合件之中或之上。器皿还可适应灌注、新鲜营养培养基的连续添加和抽出等体积的已用培养基，从而允许实现尽可能近似地接近体内情形的细胞培养条件。灌注细胞培养物与利如酶葡萄糖生物传感器的组合允许连续监控细胞培养物的葡萄糖消耗。还应理解可以为外部和任选地内壁提供加热元件诸如加热毯，以用于加热或维持器皿内培养基和填充物的温度。

在一个替代实施方案中，生物反应器包括细胞培养容器，其包括基本上垂直和圆柱形的培养容器，但是也可以设想其他形式，例如任何棱柱形状，优选地为规则形状。培养容器包括彼此连通的至少四个区。从容器中心至外部，容器包括第一区、第三区、第二区和第四区。

在一些实施方案中，培养容器包括在其底部中的培养基循环装置。在此优选实施方案中，培养基循环设备由围绕真实或虚拟的中心旋转轴线旋转的磁力设备，例如磁力棒，其第一端容纳在顶部接合装置中并且其第二端容纳在底部接合装置中。磁力棒由在培养容器外部且在此未示出的旋转磁力驱动马达驱动。循环装置包括至少一个培养基入口。培养基入口包括至少一个第一端，该端是培养基流动的转向挡板。磁力棒充当离心泵，即培养基通过通过所述棒产生的培养基移动而被吸入相对中心区中并且培养基相对于中心点向外推进。培养基转向挡板将培养基引导在所述棒的相对中心区中，以使得培养基被吸入其中并且然后向外推进。有利的是，入口处于相同平面(星形构型)中并且入口的数目将是使得其位置表现出对称性的数目。更具体地说，如果考虑三个入口，则对其有利的是它们各自以约120°角度彼此分开；如果入口数目等于4，则入口将以基本上等同于90°的角度彼此分开；如果入口数目等于10，则入口将以大约等于36°的分离角度设置。培养基循环装置还包括至少一个培养基出口。培养基出口有利地位于培养基通过磁力棒的离心作用而被推进的位点处。有利的是，出口的数目将是使得其位置将表现出对称性的数目。更具体地说，如果考虑三个出口，则对其有利的是它们各自以约120°角度彼此分开；如果出口数目等于四，则出口将以基本上等同于90°的角度彼此分开；如果出口数目等于10，则出口将以约36°的分离角度设置。优选地，出口并不位于与入口相同的水平平面中。培养容器的底部包括与所述至少一个出口相邻的至少一个培养基导向装置，其引导培养基朝向培养容器顶部推进。

在一些实施方案中，培养容器的第一区是基本上中心区并且是培养基转移区。第一区包括基底部分并且在具体实施方案中任选地也是圆柱形部分。基底部分的直径小于培养容器的直径。基底部分与培养基循环装置的所述至少一个培养基出口处于培养基连通。基底部分在第一区的顶部部分中缩小至具有小于基底部分的直径的圆柱形部分。顶部圆柱形部分包括外壁并且与所述第一培养基转移区的基底部分处于直接的培养基连通。第三区是培养基转移区，在第一培养基转移区的外部。第三区还包括基本上基底部分(呈套筒形式)并且在具体实施方案中任选地也是基本上圆柱形顶部部分。

在一些实施方案中，第三培养基转移区的基本上圆柱形部分基本上与第一培养基转移区的基本上圆柱形部分同心并且这两个部件是处于培养基连通的。培养基连通借助于通过孔口或管、通过经由溢流而产生的溢出(如图所示)或用于实现此连通的任何其他可能的手段来实现。第二区是细胞培养区，其具有或不具有载体或微载体。第二区也呈套筒形式，在其中心处为第一培养基转移区和第三培养基转移区。第二区包括底部壁和顶部壁，每个壁设置有孔口，从而允许转移基本上不含细胞的培养基。第二培养区通过底部壁中的孔口与第三培养基转移区的相对基底部分处于培养基连通，从而允许培养基穿过。第四区为培养基转移区，其在第二培养区外部但在培养容器内部。第四区与第二培养区处于培养连通。第四区也经由所述至少一个入口与培养基循环装置处于培养基连通。培养基连通借助于通过孔口或管、通过溢出或通过用于实现此连通的任何其他可能的手段来实现。

在一些实施方案中，培养设备包括基本上圆柱形培养容器，但是也可以设想其他实施方案，如先前所提及的，例如基本上菱柱形容器，优选地为规则的。明显，也可以是具有各种培养基和培养转移区的情况。它们也可以是菱柱形，优选地为规则的，可能是任何的形状组合。在此情况下，术语套筒必须设想为截面类似于所设想菱柱的截面的包裹物。当操作培养基循环装置时，培养基通过所述至少一个出口(当存在多个出口时，通过各个出口)离开所述装置，并通过导向装置转向，所述培养基终止于第一培养基转移区的基本上基底部分。第一培养基转移区的结构和泵的输出要求将培养基朝向第一培养基转移区的基本上圆柱形部分引导。当培养基到达基本上圆柱形部分的壁的顶部时，它经由溢流溢出到第三培养基转移区中。

本领域技术人员清楚的是，在此具体实施方案中，出于效率和流速的原因，第一培养基转移区的基本上圆柱形部分的壁的高度小于第三培养基转移区的壁，但将容易理解的是第一培养基转移区的基本上圆柱形部分的壁也可高于第三培养基转移区的基本上圆柱形部分的壁。培养基因此经历由泵所施加的流速和重力，它被从第三培养基转移区向下引导、从基本上圆柱形部分向下流动，并且到达第三培养基转移区的基本上基底部分。接着，培养基通过连通容器效应以及通过泵所施加的流速向上流动，并且到达第二培养区的顶部。培养基经由第二培养区的底部壁中的用于基本上不含细胞的培养基通过的孔口从第三培养基转移区到达第二培养区。如已经提及的，培养基通过孔口根据培养类型设定大小。如果培养是不使用载体的培养，则包括孔口的壁将是多孔膜，其中孔径小于细胞直径。如果培养是在微载体上或载体上，则孔口的大小将小于微载体或载体的大小。当培养基流动边缘到达第二培养区的壁的顶部时，它溢出到第四培养基转移区中。自然，如果存在孔口或管，则必须理解当培养基流动边缘到达孔口或管时，它流入到第四区中。

在一个实施方案中，第四培养基转移区包括斜壁，当培养基从第二区进入第四区时，所述培养基在所述斜壁上流动。斜壁优选地包括亲水性膜，以便改进膜在所述斜壁上的形成。膜必须优选地为层状物，以便尽可能防止泡沫的形成。为了使膜稳定，还可以将添加剂添加到培养基中以便改变水的流变特性，具体地为培养基的流变特性，所述添加剂诸如由以下组成的组中包括的添加剂：表面活化剂、普朗尼克f68、甘油、季铵以及用于改变培养基流变特性的任何其他添加剂。亲水性膜例如将是由聚氧乙烯组成的膜。膜在斜壁上的形成是一个重要的步骤，因为它允许在“薄膜”上充氧。实际上，气体体积相对于此第四培养基转移区中培养基的量较大并且提高了交换。另外，膜在斜壁上的形成增加了气体-液体接触表面积。

在一些实施方案中，培养容器优选地包括盖，至少一个气体入口孔口和至少一个气体出口孔口穿过所述盖。气体入口孔口优选地定位使得与第四培养基转移区直接连通。在一些变形中，可优选的是气体入口孔口存在于培养容器的垂直壁上或存在于培养容器的底部，即气体通过贯穿培养容器的与盖相对的壁的孔口穿过，并且此孔口由管提供以终止于液体水平上方。

在此实施方案中，盖通过固定装置固定到第二培养区的顶部壁。在变形中，盖可制成第二培养区的顶部壁的整体部分，此部分当培养容器的盖升高时打开。以这种方式，容易在使用或不使用载体的情况下获取细胞样品以评价细胞密度、细胞结构以及反映培养物健康状态的细胞的其他物理特征。实际上，将两者相连接使得可以仅通过升高培养容器的盖来打开培养隔室。在悬浮培养的情况下，可有利的是将多孔膜连接至设置有第二培养区的孔口的顶部壁，此组件可改进盖/或膜组件的刚度以便取样。

在一些实施方案中，磁力棒具有螺旋形状。具有基本上中心旋转轴线的磁力设备的设计将基本上取决于培养物的体积。实际上，对于小培养而言，所述设备被设定为能够使用简单棒诸如磁力芯片来使培养基循环。对于大体积，所述设备设想磁力转子，其也由外部马达驱动，例如像允许高培养基循环速率的养鱼缸中所使用的转子。

细胞培养设备的一些实施方案可以设想使用气泡产生设备，根据所产生气泡的大小更通常地称为“分布器”或“微型分布器”。有利的是，当将使用气泡时，气泡产生设备例如管的冲孔端将浸入在第四培养基转移区底部处或第一培养基转移区中的培养基中。当选择这种类型的充氧时，常常还可能在薄膜上继续充氧，这使得可以减少气体流动并形成更少的气泡并且因此减少泡沫的形成。在此情况下，还采取在培养容器的盖中或在培养容器的垂直壁上具有两个气体入口的措施。另外，还可以设想气泡产生设备仅作为sos程序存在，并且仅在需要时使用。

在一些实施方案中，培养设备还包括一系列培养参数传感器，例如溶解氧分压po2、酸度ph、温度、浊度、光密度、葡萄糖、co2、乳酸盐、铵以及通常用于监测细胞培养的任何其他参数。这些传感器优选地为不需要培养容器内部与其外部之间相连的光学传感器。这些传感器的优选位置为临界位置，因为使这些传感器位于培养容器壁附近以便于它们与培养基接触是有利的，且优选地处于策略性位置中，如在培养基穿过细胞之前或紧接之后培养基穿过的区中。

在一些实施方案中，出于先前提及的所有简单性和经济的原因，细胞培养设备包括一次性生物反应器。因此，这是要减少培养容器的内部与外部之间的连接的原因。另外，生物反应器包括特别可靠的生物反应器，其中污染的风险由于是一次性的而特别低。

设备的一个实施方案还设想模块化设计，其包括用于以较大体积培养的一系列模块。例如，在使用这种类型的模块化设计的情况下，例如通过使用非常有限数目的标准模块设想约500毫升至100升的培养体积。在一些实施方案中，所述设备提供一系列模块，所述模块可放置于包括培养循环设备和盖的标准培养容器内、在第一培养基转移区周围“滑动”。在一个具体变形中，所述设备包括安装系统，其包括各种标准模块。这些标准模块例如是放置于组件底部处的循环装置模块、一个或多个培养模块和盖模块。尽管可以设想固定这些模块的其他装置，但是这些模块将彼此夹紧，例如通过从液体和气体角度而言完全不可渗透的快速连接器。

因此，根据培养类型和所需体积，使用者将能够从储备中取出包含培养基循环装置的底部模块，他也将必须根据所需培养体积从中取出需要的数目的培养模块并且然后取出与盖相对应的头部模块。接着，所有这些模块以无菌方式包装，他只需要将它们拆开并将一个“夹持”在另一个上面即可。所述叠加可形成“一次性生物反应器”或者可放置于适当容器中。

在一些实施方案中，包括循环装置的底部模块可固定至培养容器底部，也可滑动到培养容器中，以便能够安置它并且使用另一个模块进行另一次培养并且因此防止交叉污染。这些循环装置包括围绕中心旋转轴线旋转的磁力设备，其第一端容纳在顶部接合装置中并且其第二端容纳在底部接合装置中。循环装置包括至少一个培养基入口。培养基循环装置还包括至少一个培养基出口。培养容器的底部模块包括与所述至少一个出口相邻的至少一个培养基导向装置，其引导培养基朝向培养容器顶部推进。

在一些实施方案中，培养容器包括一个叠加在另一个上的一系列培养模块。还可设想的是它们简单地彼此相邻，即并排放置。在一些实施方案中，所述模块可通过快速连接器或夹子彼此夹持。另外，可能有利的是每个模块包括与每个培养模块的第四区连通的气体或气体混合物入口。容器也可包括用于过量气体或气体混合物的出口作为其部分。例如，气体入口孔口可存在于培养容器的底部，即气体通过贯穿培养容器的与盖相对的壁穿过，并且此孔口由管提供以便终止于模块的液体水平上方。因此，气体混合物到达此模块的第四培养基转移区。放置于所述模块上方的模块还可包括使得培养模块的第四区中存在的气体混合物能够与所述模块的第四区连通的管。此管因此有利地穿过模块的底部壁。

在某些实施方案中，对于长持续时间培养，可有利的是用新鲜培养基替换部分培养基或者进行营养物的添加。因此，底部模块然后可包括营养物入口。还有利的是，培养容器可在培养基循环装置处包括培养基出口，以便防止溢出。以类似方式，培养容器包括头部模块，其包括盖，所述盖有利地通过固定装置连接至设置有培养基通过孔口的顶部壁，以便简化在位于上方的模块中的样品取样。另外，有利的是，培养参数传感器也可设置于每个培养模块中。还可以在仅一个或若干个培养模块的所有区处或底部模块中提供传感器。

在一些实施方案或底部模块中，培养基经由所述至少一个出口(当存在若干个出口时，经由各个出口)从培养基循环装置推进，并且通过导向装置转向。培养基终止于在第一培养基转移区的基本上基底部分。此实施方案的基本上基底部分是所有培养模块所共有的区，并且在所示的实施方案中，位于底部模块中。无论培养模块是叠加还是并置的，这都是有效的。第一培养基转移区的结构和泵的输出需要将培养基引导朝向第一模块的第一培养基转移区的基本上圆柱形部分、朝向第二模块的第一培养基转移区的基本上圆柱形部分。在此实施方案中，模块组装形成包括基本上圆柱形部分的大第一培养基转移区。当培养基到达第二培养模块的基本上圆柱形部分的壁的顶部时，所述培养基溢出到第二培养模块的第三培养基转移区中。

在一些实施方案中，培养基因此经历由泵所施加的流速和重力，它被引导朝向第二培养模块的第三培养基转移区底部、从第二培养模块的基本上圆柱形部分向下流动，并且到达第二培养模块的第三培养基转移区的基本上基底部分。接着，培养基通过连通容器效应以及通过泵所施加的流速向上流动，并且到达第二培养模块的第二培养区的顶部。培养基经由第二培养模块的底部壁的用于基本上不含细胞的培养基通过的孔口从第二培养模块的第三培养基转移区到达第二培养模块的第二区。当培养基流动边缘到达第二培养模块的第二培养区的外部壁的顶部时，所述培养基溢出到第二培养模块的第四培养基转移区中。自然，如果孔口或管存在于培养区的此外部壁中时，需要理解的是当培养基流动边缘到达孔口或管时所述培养基流入到第二培养模块的第四区。在所述设备的特别优选的实施方案中，第二培养模块的第四培养基转移区包括斜壁，当培养基从第二培养模块的第二区进入第二培养模块的第四区时所述培养基在所述斜壁上流动。斜壁优选地包括亲水性膜，以便改进膜在所述斜壁上的形成。膜必须优选地为层状物，以便尽可能防止泡沫的形成。为了使膜稳定，还可以将添加剂添加到培养基中，以便改变水的流变特性，如之前所提及的。接着，第二培养模块的第四培养基转移区中存在的培养基通过管或经第二培养模块的第四培养基转移区的壁的顶部溢出到第一培养模块的第三培养基转移区中。

在一些实施方案中，培养基经历由泵所施加的流速和重力，它被从第一培养模块的第三培养基转移区向下引导、从第一培养模块的基本上圆柱形部分向下流动，并且到达第一培养模块的第三培养基转移区的基本上基底部分。接着，培养基通过连通容器效应以及通过由泵所施加的流速向上流动，并且到达第一培养模块的第二培养区的顶部。培养基经由第一培养模块的底部壁中用于基本上不含细胞的培养基通过的孔口从第一培养模块的第三培养基转移区到达第一培养模块的第二区。当培养基流动边缘到达第一培养模块的第二培养区的壁的顶点时，所述培养基溢出到第一培养模块的第四培养基转移区中。明显，如果孔口或管存在于此壁中时，必须理解的是当培养基流动边缘到达孔口或管时所述培养基流入到第一培养模块的第四培养基转移区。第一培养模块的第四培养基转移区还可包括斜壁，当培养基从第一培养模块的第二培养区进入第一培养模块的第四培养转移区时所述培养基在所述斜壁上流动。斜壁可能设置有如上亲水性膜。接着，培养基通过入口(管)回到底部模块和培养基循环装置，即第一培养模块的第四培养基转移区中存在的培养基通过管或经第一培养模块的第四培养基转移区的壁的顶部溢入管道中，所述管道终止于由构成培养基循环装置的所述离心泵形成的虹吸管的基本上中心区。

在此实施方案的一个变形中，叠加的模块构成培养容器。在此变形中，可存在例如三种类型的模块，即底部模块、包括四个区的模块、以及头部模块mx。底部模块或基底模块包括培养基循环装置和组装装置；所述组装装置被设计成接合如上所解释的四个区模块的第一组装装置，并且构成容器的底部。头部模块被设计为接合四个区模块的第二组装装置。由底部模块接合的四个区模块可以与由头部模块接合的模块相同或者由底部模块接合的四个区模块可以是一系列四区模块中的第一个并且由头部模块接合的模块因此是所述系列的四区模块中的第二四区模块。

在一些实施方案中，所有模块包括固定装置，从而使得可以获可与另一个培养模块以及与底部模块或头部模块组装的单一培养模块。这些固定装置例如是设置有圆形密封件的同心圆、细胞培养领域中已熟知的快速连接器、螺距和锯齿或用于组装这些模块的任何其他设备。

在此实施方案中，底部模块的基底部分与基本上管形孔口接合，在此情况下所述孔口是允许引入气体或气体混合物的孔口。气体入口孔口连接管，所述管终止于培养基水平上方，使得气体或气体混合物到达培养设备的至少第四培养基转移区。第四培养基转移区的所有环境气氛通过类似管连接，以使得气体混合物可到达顶部。这在具有在高度上可叠加的模块的设备中特别有利，所述高度可以非常高，从而可通过反应器底部供给气体。在一个变形中，基底部分包括用于将气体物质引入到磁力设备所位于的区中的气体或气体混合物进料管。以这种方式，通过磁力设备旋转来搅拌进入气体并且通过移动培养基来改进氧溶解。过量气体也被搅拌并且再以小气泡形式向上移动。另外，提供用于从外部接近这些孔口的凹槽，这使得可以将这些孔口连接至气体、气体混合物、新鲜培养基等的供给。模块的顶部部分m0b是被设计为凭借固定装置抓握并凭借底部模块的底部部分上的环形密封件密封的元件。

在一些实施方案中，所述设备还包括营养物进料件，其可在穿过盖的管或穿过设备的一个壁的管中。同样，加热装置也可以存在于设备或模块各个四区模块的第一区或第四区中。可能，所述设备还可包括若干培养基循环设备，例如若干离心泵。所述设备使得培养基在穿过第二区的底部部分中的孔口后能够均质流动并且因此在进一步穿过此第二区期间也能够均质流动。这与，其中第一区与第二区直接接触而引起整个第二区中的非均质流动的装置形成对比。此类非均质流动导致细胞培养区内存在供应有不足的氧和营养素的低供应区或死区，并且其中细胞生长和/或代谢远非最佳。

设备和方法的具体实施方案涉及设备及其用途，其中第三区是在所述第二区内部并且在所述第一区外部的区。所述培养基从第一区的基底部分经由第一区的顶部圆柱形部分朝上流动、经由第三转移区的圆柱形顶部部分进一步朝下流动到第三区的基底部分，从而在进入第二区的底部部分后生成所需的均质流动。圆柱形部分的存在进一步允许容易接近培养基，以在进入第二区之前测定其特性。圆柱形元件的存在还防止在设备内建立高压。圆柱形部分的存在另外允许制造包括不同模块的设备。

其他实施方案涉及被修改来使得能绕过穿过圆柱形部分的液体流的设备。在设备的这些替代性实施方案中，第三区完全位于第二区下方并且完全位于第一区上方。在设备的一个实施方案中，所述设备的与第一区和第二区的圆柱形部分相对应的部分通过例如塑料、玻璃或金属的实心元件替换。

在另一个实施方案中，第一区和第二区由分别对应于基底部分且缺乏圆柱形部分的扁平形体积组成。在此改变下，培养基可同样经由溢流从第一区溢出到第三区。由搅拌设备形成的培养基流动能够通过第一区与第三区之间的隔离壁来使其均质并且在进入第二区后产生均质流动。

在具体实施方案中，第一区与第三区之间的隔离壁由水平部分以及垂直部分组成，其中在溢流的情况下此垂直部分具有的高度为第三区的高度的约多至5％、多至10％、多至20％或甚至多至50％。在其他具体实施方案中，第一区与第三区之间的隔离壁不存在垂直部分。

在具体实施方案中，实心元件设置有适于并入例如探头的通道，以测量培养基在第三区中的条件(ph、氧、温度)。在其他具体实施方案中，实心元件设置有包括安全压力阀的通道，所述安全压力阀当在第一区和第三区中建立过度压力时打开。在设备的一个替代性实施方案中，第一区和第三区、第二区各自的圆柱形部分不存在。先前由元件占据的体积现在变成第二区的部分，使得设备的使用更有效，这是由于适用于细胞生长体积得以扩大。

为了防止培养基从第一区直接流入到第二区中而不均质流动分布到第三区中的情况，第二区的底部壁中的孔口在位于第一区与第三区之间的壁中的开口上方的那些区域处闭合。通过在开口上方提供闭合区域来修改设备使得培养基从第一培养基转移区溢出到第三培养基转移区中，之后培养基作为均质流进入第二区中。

在具体实施方案中，将多个开口和对应的闭合区域分别提供到第一区与第二区之间的隔离壁中和第三区与第二区之间的壁中。通常，此类多个开口和对应的闭合区域对称地分布。

在设备的一个替代性实施方案中，培养基的均质流动通过在第三区内提供流再分布元件来实现。此元件可具有适用于适当再分布来自第一区的培养基的任何形状，以在进入第二区之前在第三区中获得均质液体流动。在一个具体实施方案中，元件具有一系列径向延伸杆的形式，其具有圆形、菱形或椭圆形截面，位于对应的径向应用的开口上方。

下游病毒纯化

在一些实施方案中，本公开的用于产生肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的方法包括在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；在所述肠病毒c感染所述细胞且所述感染的细胞产生所述肠病毒c的条件下，在第二细胞培养基中用所述肠病毒c接种所述细胞，并收获由所述细胞产生的所述肠病毒c。在一些实施方案中，在用所述肠病毒c接种所述细胞期间或在步骤(c)之前的约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。在一些实施方案中，所述细胞以约0.01至约0.0009的moi用肠病毒c接种。在一些实施方案中，所述细胞在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养。在一些实施方案中，步骤(b)进一步包括在所述肠病毒c感染所述细胞且所述感染的细胞产生所述肠病毒c的条件下培养所述接种的细胞，且步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c。在一些实施方案中，所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph接种。在一些实施方案中，使收获的由所述细胞产生的肠病毒c通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c；使所述第一洗脱液与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c；从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c；使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c；且从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c。在一些实施方案中，本公开用于产生肠病毒c的方法包括在第一细胞培养基中培养细胞；在所述肠病毒c感染所述细胞且所述感染的细胞产生所述肠病毒c的条件下，在第二细胞培养基中用所述肠病毒c接种所述细胞；且收获由所述细胞产生的所述肠病毒c，其中在用所述肠病毒c接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加聚山梨醇酯。

在一些实施方案中，将本公开的收获的肠病毒c病毒(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)通过深层过滤器以产生含有所述病毒的第一洗脱物。如本领域已知的，深层过滤可用于从肠病毒c(例如，由培养的细胞产生的和/或通过细胞裂解从培养的细胞收获的)分离生产细胞、细胞碎片和其他试剂，以提供收获的病毒的澄清。深层过滤器可以以柱式或胶囊形式应用，例如使用bio20seitz深度过滤板的supracap^tm系列深层过滤器胶囊(pall公司)。其他合适的深层过滤技术和设备在本领域中是已知的。在一些实施方案中，深层过滤器的孔径为约0.2μm至约3μm。在一些实施方案中，深层过滤器的孔径小于以下任何孔径(以μm计)：3、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6和0.4。在一些实施方案中，深层过滤器的孔径大于以下任何孔径(以μm计)：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6或2.8。即，深层过滤器的孔径可以是上限范围为3、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6和0.4、且独立选择的下限为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6或2.8的任何孔径范围；其中下限小于上限。

如本文所述，阳离子交换和阴离子交换色谱可以用于本公开的方法中以纯化从本公开的细胞收获的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)。有利地，如本文所证明的，这些色谱技术的组合可获得高产率和纯度的收获的病毒。例如，澄清的病毒收获物可以加以酸化，装载到阳离子交换膜上，通过盐或ph洗脱，过滤，碱化，装载到阴离子交换膜上，通过盐或ph洗脱，过滤和灭活。这仅是示例性方案，本领域技术人员可以容易地预期经替换、删除、插入或重新排序步骤的变化方式。

阴离子和阳离子交换色谱均依赖于流动相中带电荷的大分子(例如病毒)对具有相反电荷的基质的吸引力。在阳离子交换色谱中，带负电的基质或膜吸引带正电荷的大分子。在阴离子交换色谱中，带正电的基质或膜吸引带负电的大分子。一旦大分子结合或加载到基质上，可以根据它们的特征以线性或分步的方式从基质洗脱它们，从而实现不同电荷分子的分离。该原理可用于从其他大分子中纯化病毒。洗脱可受到流动相缓冲液的ph或盐含量变化的影响。如本文所证明的，特定的装载和洗脱参数(如ph和盐含量)对肠道病毒c纯化的产率和纯度具有显著影响。各种合适的缓冲液是本领域已知的，并在本文中描述。使用离子交换色谱的病毒纯化方法也是公知的；例如，参见https://www.pall.com/pdfs/biopharmaceuticals/mustangqxt_acroprep_usd2916.pdf在线提供的流感病毒的纯化。

阳离子交换色谱可用于纯化本公开的肠病毒c。如本文所证明的，用于阳离子交换色谱装载(例如，结合至阳离子交换膜)和洗脱的缓冲液和条件极大地影响病毒纯度和产率。在一些实施方案中，含有本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的洗脱物与阳离子交换膜结合以产生含有该病毒的结合级分。在一些实施方案中，洗脱物已经过深层过滤。在一些实施方案中，在阳离子交换色谱之前，稀释含有本公开的肠病毒c的洗脱物(例如，使用2x、3x、4x或5x稀释系数)。在其他实施方案中，在阳离子交换色谱之前，不稀释含有本公开的肠病毒c的洗脱物。在一些实施方案中，在结合至阳离子交换膜之前，将含有本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的洗脱物调节至约5.7的ph。在一些实施方案中，在结合至阳离子交换膜之前，将含有本公开的肠病毒c(例如，使用脊髓灰质炎病毒如s3)的洗脱物调节至约5.0的ph。本领域已知的各种装置适用于阳离子交换色谱(任选地包括过滤)，例如s系统(pall公司)，该系统使用具有0.65μm孔径的阳离子交换膜。多种官能团用于阳离子交换膜，包括但不限于交联聚合物涂层中的磺酸侧基官能团。可以使用多种缓冲液以使含有本公开的肠病毒c的洗脱物结合至阳离子交换膜。示例性缓冲液包括但不限于柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液(下文描述了额外的缓冲液)。在一些实施方案中，阳离子交换色谱中(例如，装载和/或洗脱中)使用的缓冲液含有聚山梨醇酯(例如，0.05％、0.1％、0.25％或0.5％的-80)。

在一些实施方案中，含有本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的洗脱物与ph范围为约4.5至约6.0的阳离子交换膜结合。在一些实施方案中，洗脱物在小于以下ph值的任何ph时与阳离子交换膜结合：6.0、5.5或5.0。在一些实施方案中，洗脱物在大于以下ph值的任何ph时与阳离子交换膜结合：4.5、5.0或5.5。即，洗脱物可以在下列ph值范围内的ph值时结合至阳离子交换膜，该ph值范围的上限为6.0、5.5或5.0，且独立选择的下限为4.5、5.0或5.5；其中下限小于上限。在一些实施方案中，含有本公开的肠病毒c的洗脱物以约8ms/cm至约10ms/cm结合至阳离子交换膜。例如，洗脱物可以约8、约9或约10ms/cm结合。

在一些实施方案中，从阳离子交换膜洗脱含有本公开的肠病毒c病毒(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的结合级分以产生含有该病毒的洗脱物。在一些实施方案中，本公开的阳离子交换色谱包括过滤步骤，例如在结合膜之前，色谱期间和/或从膜洗脱之后。洗脱可以是梯度或逐步的。如本文所述，可以使用流动相的ph变化或通过使用流动相的离子强度的变化(例如，通过添加盐)来实现洗脱。多种盐用于洗脱，包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、乙酸钠、磷酸钾、氯化钙和氯化镁。在某些实施方案中，所述盐是nacl。例如，在一些实施方案中，通过添加约0.20m至约0.30m氯化钠(例如通过添加约200mm、约225mm、250mm、约275mm或约300mm氯化钠)从阳离子交换膜洗脱含有本公开的肠病毒c病毒的结合级分。在一些实施方案中，以约20ms/cm至约25ms/cm(例如约20、约21、约22、约23、约24或约25ms/cm)从阳离子交换膜洗脱含有本公开的肠病毒c病毒的结合级分。多种缓冲液用于ph洗脱，包括但不限于马来酸、甲基丙二酸、柠檬酸、乳酸、甲酸、琥珀酸、乙酸、mes、磷酸盐、hepes和bicine。在某些实施方案中，缓冲液是磷酸盐或柠檬酸盐。使用这些缓冲液中的每一种进行洗脱的合适ph范围是本领域已知的；通常，缓冲液的ph在分子(例如，肠病毒c病毒)的pi和固定相上的带电基团的pka之间。例如，在一些实施方案中，通过将ph调节至约8.0，从阳离子交换膜洗脱含有本公开的肠病毒c病毒的结合级分。

本文描述了示例性的阳离子交换结合和洗脱参数以及条件。预期如上所述的阳离子交换色谱可以采用实施例8-10和12中所述的一种或多种条件，和/或参考图9a-11e、12a-20b、21a-23g和25-33b，以其任何组合形式。

阴离子交换色谱可用于纯化本公开的肠病毒c病毒(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)。如本文所示，用于阴离子交换膜装载(例如结合至阴离子交换膜)和洗脱的缓冲液和条件极大地影响病毒纯化和产率。在一些实施方案中，含有本公开的肠病毒c病毒的洗脱物结合至阴离子交换膜以产生含有该病毒的结合级分。在一些实施方案中，对所述洗脱物进行深层过滤和/或阳离子交换色谱。在一些实施方案中，在阴离子交换色谱之前，稀释含有本公开的肠病毒c病毒的洗脱物(例如，使用2x、3x、4x或5x稀释系数)。在其他实施方案中，在阴离子交换色谱之前，不稀释含有本公开的肠病毒c病毒的洗脱物。在一些实施方案中，在结合至阴离子交换膜之前，将含有本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的洗脱物调节至约8.0至约8.5的ph。在一些实施方案中，在结合至阴离子交换膜之前，将含有本公开的肠病毒c病毒(例如，使用脊髓灰质炎病毒如s2)的洗脱物调节至约8.0的ph。在一些实施方案中，在结合至阴离子交换膜之前，将含有本公开的肠病毒c病毒(例如，使用脊髓灰质炎病毒如s2)的洗脱物调节至约8.5的ph。本领域已知的各种装置适用于阴离子交换色谱(任选地包括过滤)，例如q系统(pall公司)，该系统使用具有0.8μm孔径的阴离子交换膜。多种官能团用于阴离子交换膜，包括但不限于交联聚合物涂层中的季胺侧基官能团。可以使用多种缓冲液以使含有本公开的肠病毒c病毒的洗脱物结合至阴离子交换膜。示例性缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(下文描述了额外的缓冲液)。在一些实施方案中，阴离子交换色谱中(例如，装载和/或洗脱中)使用的缓冲液含有聚山梨醇酯(例如，0.05％、0.1％、0.25％或0.5％的-80)。

在一些实施方案中，含有本发明的肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)以范围为约7.5至约8.5的ph结合至阴离子交换膜。例如，将该ph调整至约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4或约8.5。在某些实施方案中(例如使用脊髓质炎病毒s1或s3)，所述洗脱物以约8.5的ph结合至阴离子交换膜。在其他实施方案中(例如使用脊髓质炎病毒s2)，所述洗脱物以约8.0的ph结合至阴离子交换膜。在一些实施方案中，含有本发明的肠病毒c病毒的洗脱物以约3ms/cm结合至阴离子交换膜。

在一些实施方案中，含有本发明的肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的结合级分从阴离子交换膜洗脱以产生含有该病毒的洗脱物。在一些实施方案中，本发明的阴离子交换膜包括过滤步骤，例如结合至该膜之前、色谱期间和/或从该膜洗脱之后。洗脱可是梯度或逐步的。如本文所述，可以使用流动相的ph变化或通过使用流动相的离子强度的变化(例如，通过添加盐)来实现洗脱。多种盐用于洗脱，包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、乙酸钠、磷酸钾、氯化钙和氯化镁。在某些实施方案中，所述盐是nacl。例如，在一些实施方案中，通过加入约0.05m至约0.10m氯化钠，从阴离子交换膜上洗脱含有本发明肠病毒c病毒的结合级分。在一些实施方案中，含有本公开内容的肠病毒c病毒的结合级分以约5ms/cm至约10ms/cm(例如约5、约6、约7、约8、约9或约10ms/cm)从阳离子交换膜洗脱。多种缓冲液用于ph洗脱，包括但不限于磷酸盐、n-甲基哌嗪、哌嗪、l-组氨酸、bis-tris、bis-tris、丙烷、三乙醇胺、tris、n-甲基二乙醇胺、二乙醇胺、丙烷1,3-二氨基、乙醇胺和哌啶。在某些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐或tris。使用这些缓冲液中的每一种进行洗脱的合适ph范围是本领域已知的；通常，缓冲液的ph在分子(例如，肠病毒c)的pi和固定相上的带电基团的pka之间。

本文描述了示例性阴离子交换结合和洗脱参数和条件。预期如上所述的阴离子交换色谱可采用实施例8-10和12中所述的一种或多种条件，和/或参考图9a-11e、12a-20b、21a-23g和25-33b，以任何组合方式。

病毒

本公开的某些方面涉及产生肠病毒c病毒。人类的脊髓灰质炎是由人肠道病毒c(hev-c)组的三种血清型病毒(pv1、pv2和pv3)引起的。人类肠道病毒c属于无包膜正义rna病毒的小核糖核酸病毒科，其还包括脊髓灰质炎病毒和许多柯萨奇a病毒血清型(例如，cav血清型1、11、15、17、18、19、20、21、22和24)(brown,b.等(2003)j.virol.77:8973-84)。因此，合适的肠病毒c的实例包括但不限于pv1、pv2、pv3或其任何组合、变体或重组体。在一些实施方案中，肠病毒c可指三种sabin菌株(例如，s1、s2和s3)中的一种或多种，包括其重组体和疫苗衍生的变体(参加，如kewom,nottaybk.evolutionoftheoralpoliovaccinestrainsinhumansoccurbybothmutationandintramolecularrecombination.in:chanockr,lernerr,editors.modernapproachestovaccines.n.y:coldspringharborpress；1984.pp.357–367)。本文提供了产生所有三种脊髓灰质炎病毒血清型的实例。在某些实施方案中，肠病毒c病毒是选自lsc、2ab(s1)；p712、ch、2ab(s2)；leon,12a1b(s3)的脊髓灰质炎病毒株；和任何组合。这些脊髓灰质炎病毒株是本领域已知的；参见，如toyoda,h.等.(1984)j.mol.biol.174:561-85。

因此，在一些实施方案中，本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)可用于本文公开的任何疫苗和/或免疫原性组合物中。例如，本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)可用于提供一种或多种抗原或病毒株(例如，灭活的或减毒的活病毒株)，其可用于治疗或预防有此需要的受试者的脊髓灰质炎和/或诱导有此需要的受试者中针对脊髓灰质炎的免疫应答，例如保护性免疫应答。

本公开的抗原可源自本公开的肠病毒c(例如，通过本文描述的方法产生和/或纯化的肠病毒c，例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)。本公开的抗原可以是能够引发免疫应答的任何物质。合适抗原的实例包括但不限于全病毒、减毒病毒、灭活病毒、蛋白质、多肽(包括活性蛋白质和蛋白质内的单个多肽表位)、糖多肽、脂多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖的肽和非肽模拟物和其他分子、小分子、脂质、糖脂和碳水化合物。

本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)可包括至少一种非人细胞适应性突变。可以通过使病毒适应特定细胞系中的生长来产生适应性突变。例如，细胞可以用病毒转染并传代，使得病毒复制并且其核酸发生突变。核酸突变可以是点突变、插入突变或缺失突变。核酸突变可导致促进病毒在非人细胞中的生长的病毒蛋白内的氨基酸改变。适应性突变可以促进病毒的表型变化，包括改变的斑块大小、生长动力学、温度敏感性、耐药性、毒力和细胞培养物中的病毒产量。这些适应性突变可通过提高细胞系中培养的病毒的速度和产量而用于疫苗生产。此外，适应性突变可通过改变免疫原性表位的结构来增强病毒抗原的免疫原性。

因此，在某些实施方案中，本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)可包括至少一种非人细胞适应突变。在某些实施方案中，适应突变是病毒抗原针对非人细胞的突变。在一些实施方案中，非人细胞可以是哺乳动物细胞。非人哺乳动物细胞的实例包括但不限于上述那些，例如vero细胞(来自猴肾)、mdbk细胞、mdck细胞、atccccl34mdck(nbl2)细胞、mdck33016(如wo97/37001中描述的保藏号dsmacc2219)细胞、bhk21-f细胞、hkcc细胞或中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)。在一些实施方案中，非人细胞可以是猴细胞。在一些实施方案中，猴细胞来自vero细胞系。合适的vero细胞系的实例包括但不限于whovero10-87、atccccl-81、vero76(atcc登记号crl-1587)或veroc1008(atcc登记号crl-1586)。

肠病毒c(如脊髓灰质炎病毒)具有线性、正义、单链rna基因组(参加，brown,b.等(2003)j.virol.77:8973-84)。这些病毒基因组中的每一个都编码结构和非结构多肽。由这些病毒中的每一种编码的结构多肽包括但不限于vp1、vp2、vp3和vp4，它们可一起构成病毒衣壳。由这些病毒中的每一种编码的非结构多肽包括但不限于2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d，其参与(例如)病毒复制和毒力。

因此，在某些实施方案中，本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)可包含一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种病毒抗原内(包括但不限于vp1、vp2、vp3、2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d)的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种或更多种非人细胞适应性突变。在一些实施方案中，本公开的肠病毒a包括完整的灭活病毒，其可包含至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种或更多种的病毒的5'或3'非翻译区(utr)内非人细胞适应突变。

在一些实施方案中，本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)可至少含有一种或更多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种非编码区和/或病毒抗原(包括但不限于vp1、vp2、vp3、2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d)内的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种、至少20种或更多种减毒突变。例如，来自sabin脊髓灰质炎病毒株的减毒突变是本领域已知的，包括但不限于在5'和3'非编码区中发现的突变(例如，ires突变)、衣壳蛋白等(参加，如kawamura,n.等.(1989)j.virol.63:1302-9和minor,p.d.(1992)j.gen.virol.73:3065-77)。

在一些实施方案中，肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)可用于本公开的任何疫苗和免疫原性组合物中。例如，本公开的肠病毒c可用于治疗或预防有此需要的受试者中的脊髓灰质炎和/或在有此需要的受试者中诱导针对脊髓灰质炎的免疫应答，例如保护性免疫应答。在一些实施方案中，肠病毒c可以是灭活的脊髓灰质炎病毒或可用于salk型灭活疫苗的脊髓灰质炎病毒血清型的组合。在一些实施方案中，肠病毒c可以是减毒脊髓灰质炎病毒或可用于sabin口服脊髓灰质炎疫苗的脊髓灰质炎病毒血清型的组合，包括其重组体和衍生物(参加，如kohara,m.等(1988)j.virol.62:2828-35andshimizu,h.(2016)vaccine34:1975-85)。

抗原的产生

用于疫苗和/或免疫原性组合物的本公开抗原可以通过本领域已知的任何适合方法产生和/或纯化或以其他方式分离，所述抗原包括但不限于纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒或用于亚单位疫苗的纯化和/或重组病毒蛋白，其治疗或预防脊髓灰质炎和/或诱导针对脊髓灰质炎的免疫反应，诸如保护性免疫反应。本公开的抗原可包括但不限于全病毒、减毒病毒、灭活病毒、蛋白质、多肽(包括活性蛋白质和蛋白质内的个别多肽表位)、糖多肽、脂多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽模拟物和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂、以及由引起脊髓灰质炎的至少一种病毒产生、衍生、纯化和/或以其他方式分离的碳水化合物。例如，适合抗原可包括但不限于结构性多肽诸如vp1、vp2、vp3和vp4以及非结构性多肽诸如来自本公开的肠病毒c的2a,2b,2c,3a,3b,3c和3d。

本公开的抗原可以化学方式或酶促方式合成、重组产生、从天然来源分离、或其组合。在某些实施方案中，本公开的抗原由本公开的引起脊髓灰质炎的至少一种病毒诸如s1,s2和s3(又称pv1,pv2和pv3)产生、纯化、分离和/或衍生。本公开的抗原可以是纯化的、部分纯化的或粗提取物。在一些实施方案中，本公开的抗原是如题为“疫苗和免疫原性组合物的产生”的以上部分中所述地产生的病毒，诸如灭活病毒。

在某些实施方案中，本公开的一种或多种抗原可通过培养非人类细胞产生。适用于产生一种或多种本公开的抗原的细胞系优选地具有哺乳动物来源，并且包括但不限于：vero细胞(来自猴肾)、马、牛(例如mdbk细胞)、羊、狗(例如来自狗肾的mdck细胞、atccccl34mdck(nbl2)或mdck33016，保藏号dsmacc2219，如wo97/37001所述的)、猫以及啮齿动物(例如仓鼠细胞，诸如bhk21-f、hkcc细胞或中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞))，并且可获自各个发展阶段，包括例如成年、新生儿、胎儿以及胚胎。在某些实施方案中，细胞为永生化的(例如perc.6细胞，如wo01/38362和wo02/40665所述的，并且以ecacc保藏号96022940保藏)。在优选的实施方案中，利用哺乳动物细胞，并且其可选自和/或来源于以下非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如皮肤、肺)、内皮细胞(例如主动脉的、冠状动脉的、肺的、血管的、皮肤微脉管的、脐带的)、肝细胞、角化细胞、免疫细胞(例如t细胞、b细胞、巨噬细胞、nk、树突状细胞)、乳腺细胞(例如上皮的)、平滑肌细胞(例如血管的、主动脉的、冠状动脉的、动脉的、子宫的、支气管的、子宫颈的、视网膜周皮细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如上皮的、平滑肌)、肾细胞(例如上皮的、肾小球系膜的、近端小管)、骨骼肌细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌细胞(例如成肌细胞、骨骼肌、平滑肌、支气管)、肝细胞、成视网膜细胞以及基质细胞。wo97/37000和wo97/37001描述能够在悬浮液和无血清培养基中生长并且可用于产生病毒抗原的动物细胞和细胞系的产生。在某些实施方案中，非人类细胞在无血清培养基中培养。

多肽抗原可使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法从天然来源中分离，所述方法包括但不限于液相色谱法(例如高效液相色谱法、快速蛋白质液相色谱法等)、尺寸排阻色谱法、凝胶电泳(包括一维凝胶电泳、二维凝胶电泳)、亲和色谱法或其他纯化技术。在许多实施方案中，抗原是纯化抗原，例如约50％至约75％纯的、约75％至约85％纯的、约85％至约90％纯的、约90％至约95％纯的、约95％至约98％纯的、约98％至约99％纯的或大于99％纯的。

可以采用固相肽合成技术，其中此类技术是为本领域技术人员已知的。参见jones,thechemicalsynthesisofpeptides(clarendonpress,oxford)(1994)。通常，在此类方法中，肽通过将活化单体单元依序添加到固相结合的逐渐生长肽链来产生。

公知的重组dna技术可用于产生多肽，其中例如包含编码多肽的核苷酸序列的表达构建体被引入到适当宿主细胞(例如作为单细胞实体在体外细胞培养物中生长的真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等)或原核细胞(例如在体外细胞培养物中生长)中，从而生成遗传修饰的宿主细胞；在适当培养条件下，蛋白质由遗传修饰的宿主细胞产生。

除了灭杀病毒和减毒病毒免疫原性组合物之外，可使用对动物呈现脊髓灰质炎抗原组分的亚单元免疫原性组合物或其他类型的免疫原性组合物。抗原组分可以是蛋白质、糖蛋白、脂质缀合蛋白质或糖蛋白、修饰的脂质部分或其他病毒组分，所述抗原组分当注入人类中时刺激人类的免疫应答，以使得人类产生针对脊髓灰质炎的保护性免疫。对于亚单元免疫原性组合物，病毒可以在哺乳动物细胞上培养，如以上所述。细胞培养物可均质化并且免疫原性组合物可通过使细胞培养物均浆物通过适当柱或穿过适当孔径过滤器或经由细胞培养物均浆物的离心来分离。

如果抗原组分是蛋白质，那么可分离编码所述蛋白质的核酸并生成含有所述分离核酸的免疫原性组合物。编码抗原组分的核酸可置于真核启动子的信号序列下游的质粒上。该质粒可含有一种或多种可选择标记并且可转染到减毒原核生物体中，诸如沙门氏菌属、志贺氏菌属或其他适合细菌。细菌然后可施用于人类，以使得人类可生成针对抗原组分的保护性免疫应答。可选地，编码抗原组分的核酸可置于原核启动子下游，具有一种或多种可选择标记，并且转染到减毒原核生物体诸如沙门氏菌属、志贺氏菌属或其他适合细菌中。细菌然后可施用于需要针对感兴趣抗原的免疫应答的真核受试者。参见，例如授予hone等人的美国专利号6,500,419。

对于亚单元免疫原性组合物，编码脊髓灰质炎病毒的蛋白质抗原组分的核酸可克隆到质粒中，诸如国际专利申请公布号wo00/32047(galen)和国际专利申请公布号wo02/083890(galen)中所述的那些质粒。然后质粒可转染到细菌中并且细菌可产生所需抗原蛋白质。可通过两份专利申请中所述的多种方法分离和纯化所需抗原蛋白质

病毒灭活

在一些实施方案中，通过本公开的方法产生和/或纯化的肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)是灭活的。灭活或杀灭病毒以破坏其感染哺乳动物细胞的能力的方法是为本领域已知的。此类方法包括化学方式和物理方式。用于灭活病毒的适合方式包括但不限于使用有效量的选自以下各项的一种或多种试剂进行处理：洗涤剂、福尔马林(在本文中也称为“甲醛”)、β-丙内酯(bpl)、二乙胺(bei)、乙酰基乙烯亚胺、热量、电磁辐射、x-射线辐射、γ辐射、紫外线辐射(uv辐射)、uv-a辐射、uv-b辐射、uv-c辐射、亚甲基蓝、补骨脂素、羧酸富勒烯(c60)以及其任何组合。

用于化学灭活的试剂和化学灭活的方法是为本领域已熟知的并且在本文中进行描述。在一些实施方案中，肠病毒c使用bpl、福尔马林或bei中的一种或多种化学灭活。在肠病毒c使用bpl化学灭活的某些实施方案中，病毒可含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸是烷基化的核酸。在其他实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，修饰的多肽含有修饰的氨基酸残基，包括修饰的半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸以及苏氨酸中的一种或多种。在肠病毒c使用福尔马林化学灭活的某些实施方案中，病毒可含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，一种或多种修饰可包括交联的多肽。在肠病毒c使用福尔马林化学灭活的一些实施方案中后，疫苗或免疫原性组合物还包含福尔马林。在本公开的某些实施方案中，肠病毒c使用bei灭活。在肠病毒c使用bei灭活的某些实施方案中，病毒含有一种或多种修饰。在一些实施方案中，一种或多种修饰包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸是烷基化的核酸。

在肠病毒c(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)使用bei或bpl化学灭活的一些实施方案中，任何残余的未反应bei或bpl可用硫代硫酸钠中和(即水解)。通常，过量添加硫代硫酸钠。在一些实施方案中，硫代硫酸钠可以下述范围的浓度添加：约25mm至约100mm、约25mm至约75mm或约25mm至约50mm。在某些实施方案中，硫代硫酸钠可以下述浓度添加：约25mm、约26mm、约27mm、约28mm、约29mm、约30mm、约31mm、约32mm、约33mm、约34mm、约35mm、约36mm、约37mm、约38mm、约39mm、或约40mm，比率为1份浓硫代硫酸钠比20份bei。在一些实施方案中，溶液可使用混合器诸如内联静态混合器混合，并且随后进行过滤(例如变得澄清)。通常，泵送两种溶液通过混合器引起完全混合和硫代硫酸钠对bei的中和。

本公开的某些实施方案涉及一种用于灭活肠病毒c(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的bei处理病毒制备物。在某些实施方案中，用有效量的bei处理包括但不限于用约0.25％v/v至约3.0％v/v范围的量的bei处理。在某些实施方案中，分离且处理的病毒选自以下各项中的一种或多种：pv1、pv2和pv3。在所述方法的某些实施方案中，病毒制备物在约25℃至约42℃范围的温度下用bei处理。在所述方法的某些实施方案中，病毒制备物用bei处理约1小时至约10小时范围内的时间段。在某些实施方案中，所述方法还涉及用有效量的硫代硫酸钠灭活(即水解)未反应的bei。在一些实施方案中，硫代硫酸钠的有效量范围为约25mm至约100mm、约25mm至约75mm或约25mm至约50mm。

在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的β-丙内酯(bpl)处理病毒制备物；以及任选地在用有效量的β-丙内酯(bpl)处理病毒制备物的同时或者之后用有效量的福尔马林处理病毒制备物。可选地，在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的β-丙内酯(bpl)处理病毒制备物第一时间段；以及用有效量的bpl处理病毒制备物第二时间段以完全灭活病毒制备物。在一些实施方案中，第一时间段和/或第二时间段的范围为约12小时至约36小时。在某些实施方案中，第一时间段和/或第二时间段为约24小时。在某些实施方案中，用有效量的bpl处理包括但不限于用以下范围的量的bpl处理：约0.05％v/v至约3.0％v/v、0.1％v/v至约2％v/v或约0.1％v/v至约1％v/v。在某些实施方案中，用有效量的bpl处理包括但不限于用0.05％v/v、0.06％v/v、0.07％v/v、0.08％v/v、0.09％v/v、0.1％v/v、0.2％v/v、0.3％v/v、0.4％v/v、0.5％v/v、0.6％v/v、0.7％v/v、0.8％v/v、0.9％v/v或1％v/vbpl处理。在所述方法的某些实施方案中，病毒制备物在约2℃至约8℃范围的温度下用bei处理。在某些实施方案中，所述方法涉及在37℃的温度下将病毒制备物加热足以水解bpl的时间段。在某些实施方案中，所述时间段的范围为约1小时至约6小时。可选地，在一些实施方案中，所述方法还涉及用有效量的硫代硫酸钠灭活(即水解)未反应的bpl。在一些实施方案中，硫代硫酸钠的有效量范围为约25mm至约100mm、约25mm至约75mm或约25mm至约50mm。

在一些实施方案中，所述方法涉及用有效量的福尔马林处理病毒制备物；以及从福尔马林中纯化病毒制备物。在某些实施方案中，用有效量的福尔马林处理包括但不限于用约0.05％v/v至约3.0％v/v、0.1％v/v至约2％v/v或约0.1％v/v至约1％v/v范围的量的福尔马林处理。在某些实施方案中，病毒制备物从福尔马林中纯化到以下量的程度：约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更大。使用福尔马林灭活脊髓灰质炎病毒的方法是本领域熟知的；参见，如wilton,t.等(2014)j.virol.88:11955-64。

疫苗和/或免疫原性组合物的制剂

本公开的其他方面涉及含有通过本公开的方法产生的病毒(例如本公开的肠病毒c，诸如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)的组合物、免疫原性组合物和/或疫苗。此类组合物、疫苗和/或免疫原性组合物可用于在有需要的受试者中治疗或预防脊髓灰质炎和/或在有需要的受试者中诱导针对脊髓灰质炎的免疫应答，诸如保护性免疫应答。

通常，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的可注射物；还可制备适用于在注射前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。此类制备物还可作为干粉乳化或产生。活性免疫原性成分通常与药学上可接受的且与活性成分相容的赋形剂混合。适合赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、蔗糖、甘油、乙醇或类似物以及其组合。另外，需要时，疫苗或免疫原性组合物可含有辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂或增强疫苗或免疫原性组合物的有效性的助剂。

疫苗或免疫原性组合物可常规地胃肠外、通过注射施用，例如皮下地、经皮地、皮内地、真皮下地或肌内地。适用于其他施用模式的其他制剂包括栓剂，并且在一些情况下包括口服、经口、鼻内、经颊、舌下、腹膜内、阴道内、肛门以及颅内制剂。口服和注射的脊髓灰质炎疫苗是本领域公知的，已经使用了超过50年。对于栓剂，传统粘合剂和载体可包括例如聚亚烷二醇或甘油三酸酯；此类栓剂可由含有0.5％至10％或甚至1％-2％范围的活性成分的混合物形成。在某些实施方案中，首先使低熔点蜡诸如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔融，并且例如通过搅拌均质分散本文所述的手足口病疫苗或免疫原性组合物抗原。随后，将熔融的均质混合物注入合宜大小的模中，使其冷却并固化。

适用于鼻内递送的制剂包括液体(例如作为气雾剂或滴鼻剂施用的水溶液)和干粉(例如用于在鼻通道内快速沉积)。制剂包含此类通常采用的赋形剂，例如像药用级甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇以及壳聚糖。粘膜粘附剂诸如壳聚糖可用于液体或粉末制剂中以延迟鼻内施用的制剂的粘膜纤毛清除。糖类诸如甘露醇和蔗糖可用作液体制剂中的稳定剂并用作干粉制剂中的稳定剂、填充剂或粉末流动剂和粒度剂。另外，助剂诸如单磷酰脂质a(mla)或其衍生物或cpg寡核苷酸可在液体制剂和干粉制剂中用作免疫刺激助剂。

适用于口服递送的制剂包括液体、固体、半固体、凝胶、片剂、胶囊、锭剂以及类似物。适用于口服递送的制剂包括片剂、锭剂、胶囊、凝胶、液体、食物产品、饮料、营养制品以及类似物。制剂包括此类通常采用的赋形剂，例如像药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁以及类似物。其他手足口病疫苗和免疫原性组合物可采用溶液、悬浮液、丸剂、持续释放制剂或粉末形式并且含有10％-95％或25％-70％的活性成分。对于口服制剂，霍乱毒素是感兴趣的制剂伴侣(并且也是可能的缀合伴侣)。

脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物当配制用于阴道施用时可以是呈阴道栓剂、棉栓、膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式。任何前述制剂可含有除脊髓灰质炎疫苗和免疫原性组合物抗原以外的本领域中已知的适当的试剂，诸如载体。

在一些实施方案中，本公开的脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物可配制用于全身性或局部递送。此类制剂是本领域已熟知的。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏或固定油。静脉内媒介物包括流体和营养素补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂)以及类似物。全身性和局部施用路径包括例如皮肤内、局部应用、静脉内、肌肉内等。

本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可以与剂量制剂相容的方式并以将具有治疗有效且免疫原性的量施用。待施用的量取决于待治疗的受试者，包括例如个体免疫系统引起免疫应答的能力和所需保护程度。适合的剂量范围具有每次疫苗接种几百微克活性成分的数量级，其示例性范围为约0.1μg至10μg(但是涵盖1-10mg范围的较高量)，诸如范围为约0.1μg至5μg，或甚至范围为0.6μg至3μg或甚至范围为约1μg至3μg，或甚至范围为0.1μg至1μg。在某些实施方案中，剂量可以是每次给药约0.1μg、约0.2μg、约0.3μg、约0.4μg、约0.5μg、约0.6μg、约0.7μg、约0.8μg、约0.9μg、约1μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg、或约3μg。在某些实施方案中，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可以每次给药1μg的量施用。

在一些实施方案中，剂量基于许多单位，例如脊髓灰质炎病毒疫苗的d-抗原单位。在一些实施方案中，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物含有脊髓灰质炎病毒毒株s1、s2和s3的剂量。例如，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的合适剂量可包括但不限于s1：s2：s3的比例为1.5:50:50、0.75:25:25或3:100:100(例如，基于每种菌株的du的比率)。

用于初始施用和加强注射的合适方案也是可变的，但典型的是初始施用，随后接种或其他施用。对于成人，婴儿和具有复杂适应症(例如肾功能损害)的患者，施用可变化。适用于施用口服脊髓灰质炎疫苗(opv)和灭活脊髓灰质炎疫苗(ipv)的给药方案是本领域已知的。例如，在成人和儿童中，orimune脊髓灰质炎疫苗可以以单一0.5ml口服剂量施用，在一些实施方案中，随后在8周后施用第二剂量，并且在第二剂量后8-12个月施用第三剂量。在婴儿中，可以在6-12周龄时施用第一次0.5ml口服剂量，然后在第一次给药后8周施用第二次0.5ml口服剂量，并且在6至18个月龄施用第三次0.5ml口服剂量。根据世界卫生组织，opv疫苗接种方案可包括3个opv剂量加1个ipv剂量，给药从6周龄开始且opv给药期间最小间隔4周。如果使用单一ipv剂量，优选从14周龄给药，并且可以与opv剂量共同施用。对于单独施用ipv，可以在2个月龄开始施用三个ipv剂量的基本系列，并且可以在至少6个月的间隔后施用加强剂量。

在一些实施方案中，可以产生本公开的肠病毒c(例如，脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)用于组合疫苗。例如，(葛兰素史克)是灭活脊髓灰质炎、dtap和乙型肝炎疫苗的组合；(葛兰素史克)是一种灭活脊髓灰质炎和dtap疫苗的组合；(赛诺菲巴斯德)是灭活脊髓灰质炎、dtap和流感疫苗的组合；和(赛诺菲巴斯德)是灭活脊髓灰质炎和dtap疫苗的组合。

应用方式可广泛变化。可应用任何用于施用疫苗或免疫原性组合物的常规方法。这些方法包括在固体生理上可接受的基质或在生理上可接受的分散体中，通过肠胃外注射等口服应用。疫苗或免疫原性组合物的剂量取决于施用途径，并且将根据接种者的年龄和抗原的制剂而变化。

改善粘膜粘附的递送剂也可用于改善递送和免疫原性，尤其是对于鼻内、经口或基于肺的递送制剂。一种这样的化合物——壳聚糖，即n-脱乙酰形式的几丁质，用于许多药物制剂中。由于其能够延迟粘膜纤毛清除并允许更多时间用于粘膜抗原摄取和处理，因此它是用于鼻内疫苗递送的有吸引力的粘膜粘附剂。此外，它可以瞬时打开紧密连接蛋白，该紧密连接蛋白可增强抗原跨上皮转运到nalt。在最近的人体试验中，鼻内施用具有壳聚糖但没有任何额外佐剂的三价灭活流感疫苗产生血清转化和hi滴度，其仅略低于肌肉内接种后获得的血清转化和hi滴度。

本公开的疫苗和/或免疫原性组合物是药学上可接受的。它们可包含除抗原和佐剂之外的组分，例如它们将通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。此类组分的充分讨论可见于gennaro(2000)remington:thescienceandpracticeofpharmacy.第20版，isbn:0683306472。

为了控制张力，优选地包含生理盐，诸如钠盐。优选氯化钠(nacl)，其可以存在于1与20mg/ml之间。可存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等等。

疫苗和/或免疫原性组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(具体地具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常将以5-20mm范围包含。

疫苗或免疫原性组合物的ph将通常是在5.0与8.1之间，并且更通常地在6.0与8.0之间，例如6.5与7.5之间或在7.0与7.8之间。本公开的制造方法可因此包括在包装之前调节原液疫苗的ph。

疫苗或免疫原性组合物优选地为无菌的。优选地为无热源的，例如含有<1eu(内毒素单位，标准量度)/剂量，并且优选地<0.1eu/剂量。它优选为不含谷蛋白。

在某些实施方案中，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包含有效浓度的洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂的有效量可包括但不限于约0.00005％v/v至约5％v/v或约0.0001％v/v至约1％v/v。在某些实施方案中，洗涤剂的有效量为约0.001％v/v、约0.002％v/v、约0.003％v/v、约0.004％v/v、约0.005％v/v、约0.006％v/v、约0.007％v/v、约0.008％v/v、约0.009％v/v或约0.01％v/v。不希望受到理论约束，洗涤剂有助于将本公开的疫苗和/或免疫原性组合物保持在溶液中并且有助于防止疫苗和/或免疫原性组合物聚集。

适合洗涤剂包括例如聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂(称为‘tween’)、辛苯聚醇(诸如辛苯聚醇-9(triton^tmx100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、鲸蜡基三甲基溴化铵(‘ctab’)以及脱氧胆酸钠，其特别用于片段或表面抗原疫苗。洗涤剂可仅以痕量存在。痕量的其他剩余组分可以是抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素b)。在一些实施方案中，洗涤剂含有聚山梨醇酯。在一些实施方案中，洗涤剂的有效浓度包括约0.00005％v/v至约5％v/v的范围。

疫苗和/或免疫原性组合物优选地保存在2℃与8℃之间。它们不应被冷冻。它们理想地应不暴露于直射光。抗原和乳液通常将是混合物，尽管它们初始可以单独组分的试剂盒的形式呈现以用于临时混合。疫苗和/或免疫原性组合物当施用于受试者时将通常为水溶液形式。

佐剂

本公开的组合物、免疫原性组合物和/或疫苗可以与一种或多种佐剂组合使用。本发明的这些佐剂化疫苗和/或免疫原性组合物可用于治疗或预防有此需要的受试者中的脊髓灰质炎和/或在有此需要的受试者中诱导针对脊髓灰质炎的免疫应答，例如保护性免疫应答。几种类型的佐剂(包括铝佐剂、磷酸钙、油乳剂、壳聚糖、维生素d、寡核苷酸、硬脂酰或十八烷基酪氨酸和脂质体)已经得到应用，并且已经表征了它们在ipv和opv中的有效性(参见，如hawkenj.和troys.b.(2012)vaccine30:6971-9)。

对疫苗实现佐剂作用的各种方法为已知的并且可与本文所公开的脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物结合使用。一般理论和方法详述于"thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants",1995,duncane.s.stewart-tull(编辑),johnwiley&sonsltd,isbn0-471-95170-6，并且还详述于"vaccines:newgenerationimmunologicaladjuvants",1995,gregoriadisg等人(编辑),plenumpress,newyork,isbn0-306-45283-9。

在一些实施方案中，脊髓灰质炎疫苗或免疫原性组合物包含抗原和佐剂。抗原可以下述的基于重量的比率与至少一种佐剂混合：约10:1至约10¹⁰:1抗原:佐剂，例如约10:1至约100:1、约100:1至约10³:1、约10³:1至约10⁴:1、约10⁴:1至约10⁵:1、约10⁵:1至约10⁶:1、约10⁶:1至约10⁷:1、约10⁷:1至约10⁸:1、约10⁸:1至约10⁹:1或约10⁹:1至约10¹⁰:1抗原:佐剂。本领域技术人员可容易地通过关于确定最佳比率的佐剂和常规实验的信息来确定适当比率。

示例性佐剂可包括但不限于铝盐、toll样受体(tlr)激动剂、单磷酰脂a(mla)、mla衍生物、合成脂质a、脂质a模拟物或类似物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(mdp)衍生物、cpg寡聚物、革兰阴性细菌的脂多糖(lps)、聚磷腈、乳剂、病毒小体、螺旋体、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plg)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全福氏佐剂(cfa)以及不完全福氏佐剂(ifa)。在一些实施方案中，佐剂为mla或其衍生物。

在一些实施方案中，佐剂为铝盐。在一些实施方案中，佐剂包括以下各项中的至少一种：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾以及铝胶85。在一些实施方案中，已发现本公开的铝盐佐剂增加本公开的肠病毒c病毒(例如脊髓灰质炎病毒s1、s2或s3)疫苗和/或免疫原性组合物的抗原的吸收。因此，在一些实施方案中，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的抗原被吸附至铝盐佐剂。

来自沙门氏菌的脂质a无毒衍生物m单磷酰脂a(mla)是已开发为疫苗佐剂的强效tlr-4激动剂(evans等人2003)。在临床前鼠类研究中，鼻内mla已显示增强分泌性以及全身性体液应答(baldridge等人2000；yang等人2002)。它已在多于120,000位患者的临床研究中证明作为疫苗佐剂是安全且有效的(baldrick等人,2002；2004)。mla通过tlr-4受体刺激先天免疫力的诱导并且因此能够引发针对广泛范围的感染性病原体的非特异性免疫应答，所述病原体包括革兰阴性细菌和革兰阳性细菌、病毒以及寄生虫(baldrick等人2004；persing等人2002)。在鼻内制剂中包含mla应提供对先天性应答的快速诱导，从而由病毒激发引发非特异性免疫应答，同时增强由疫苗的抗原组分生成的特异性应答。

因此，在一个实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含单磷酰脂a(mla)、3脱-o-乙酰化单磷酰脂a(3d-mla)或其衍生物作为适应性免疫力和先天性免疫力的增强剂。在化学上，3d-mla为具有4个、5个或6个乙酰化链的3脱-o-乙酰化单磷酰脂a。在欧洲专利0689454b1(smithklinebeechambiologicalssa)中公开了3脱-o-乙酰化单磷酰脂a的优选形式。在另一个实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含被设计来像tlr-4激动剂一样起作用的合成脂质a、脂质a模拟物或类似物(诸如biomira的pet脂质a)或合成衍生物。

另外的示例性佐剂包括但不限于可容易通过与多肽组分共同表达或与多肽组分融合来添加到本文所述的抗原中以产生嵌合多肽的多肽佐剂。鞭毛的主要蛋白质组分细菌鞭毛蛋白是由于先天性免疫系统通过toll-样受体tlr5(65)对它的识别而受到了作为佐剂蛋白质的逐渐增加的注意力的佐剂。通过tlr5进行的鞭毛蛋白信号传导通过诱导dc成熟和迁移以及巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肠上皮细胞的活化产生促炎性介质，而对先天性免疫和适应性免疫功能具有影响(66-72)。

tlr5识别鞭毛蛋白单体内对此蛋白质而言独特的且为鞭毛功能所需要的保守性结构，排除了响应于免疫压力而产生的突变(73)。受体对100fm浓度敏感但并不识别完整丝状体。鞭毛分解成单体是为结合和刺激所需要的。

作为佐剂，鞭毛蛋白具有用于诱导针对胃肠外或鼻内施用的异源抗原的保护性应答的强效活性并且还已报道了用于dna疫苗的佐剂作用。当采用适于呼吸道病毒诸如流感病毒的鞭毛蛋白时观察到th2偏倚，但是未观察到小鼠或猴中的ige诱导的证据。另外，未报道在猴内在鼻内或全身性施用之后的局部或全身性免疫应答。在使用鞭毛蛋白之后引发的th2应答特性是有些出乎意料的，因为通过tlr5以myd88-依赖性方式进行的鞭毛蛋白信号并且通过tlr进行所有其他myd88依赖性信号已显示导致th1偏倚。重要的是，针对鞭毛蛋白预先存在的抗体对佐剂功效不具有可感知的影响，使得它作为多用途佐剂是有吸引力的。

还可以使用细胞因子、集落刺激因子(例如gm-csf、csf以及类似物)；肿瘤坏死因子；白介素-2、-7、-12、干扰素以及其他类似生长因子作为佐剂，因为它们可容易地通过与多肽组分混合或融合来包含在脊髓灰质炎疫苗或免疫原性组合物中。

在一些实施方案中，本文所公开的脊髓灰质炎疫苗和免疫原性组合物可包含通过toll样受体起作用的其他佐剂，诸如包含5'-tcg-3'序列的核酸tlr9配体；咪唑喹啉tlr7配体；取代的鸟嘌呤tlr7/8配体；其他tlr7配体，诸如洛索立宾、7-脱氮脱氧鸟苷、7-硫杂-8-氧代脱氧鸟苷、咪喹莫特(r-837)以及瑞喹莫德(r-848)。

某些佐剂有利于apc诸如树突细胞对疫苗分子的摄取，并且活化这些分子。非限制性实例选自由以下组成的组：免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂，诸如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；胶束形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(iscom基质)；颗粒；dda；铝佐剂；dna佐剂；mla；以及包封佐剂。

佐剂的另外的实例包括试剂诸如铝盐诸如氢氧化物或磷酸盐(明矾)，通常在缓冲盐水中以0.05％至0.1％溶液使用(参见例如，nicklas(1992)res.immunol.143:489-493)，与以0.25％溶液使用的糖合成聚合物(例如)的混合，通过使用范围为70℃至101℃的温度分别进行30秒至2分钟时间段的热处理在疫苗中产生蛋白质聚集并且通过交联剂产生聚集也是可能的。还可以采用通过胃蛋白酶处理的抗白蛋白抗体(fab片段)进行再活化而聚集、与细菌细胞诸如微细隐孢球虫菌(c.parvum)或革兰阴性细菌的内毒素或脂多糖组分的混合、在生理学上可接受的油媒介物诸如二缩甘露醇单油酸酯(aracela)中乳化或用20％全氟化碳(fluosol-da)溶液作为嵌段取代物进行乳化。还可以使用与油类诸如鲨烯和ifa的混合。

dda(二甲基双十八烷基溴化铵)是用于佐剂的感兴趣的候选物，而且福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂以及皂树皂苷诸如quila和qs21也是感兴趣的。其他可能性包括脂多糖的聚[二(羧基苯氧基)磷腈(poly[di(earboxylatophenoxy)phosphazene)(pcpp)衍生物，诸如单磷酰脂a(mla)、胞壁酰二肽(mdp)和苏氨酰胞壁酰二肽(tmdp)。基于脂多糖的佐剂也可用于产生主要的th1-型应答，包括例如单磷酰脂a诸如3-脱-o-乙酰化单磷酰脂a与铝盐的组合。

也已知脂质体制剂赋予佐剂作用，并且因此脂质体佐剂可与手足口病疫苗和/或免疫原性组合物结合使用。

免疫刺激复合物基质型(基质)佐剂也可与手足口病疫苗抗原和免疫原性组合物一起使用，尤其是因为已显示这种类型的佐剂能够上调apc所进行的mhc类型ii表达。iscom基质由来自皂皮树(quillajasaponaria)的(任选分级分离的)皂苷(三萜类化合物)、胆固醇和磷脂组成。当与免疫原性蛋白质诸如脊髓灰质炎疫苗或免疫原性组合物抗原混合时，所得微粒制剂称为iscom颗粒，其中皂苷可占60％-70％w/w，胆固醇和磷脂占10％-15％w/w，并且蛋白质占10％-15％w/w。与免疫刺激复合物的组成和用途相关的细节例如可见于以上提及的使用佐剂处理的教科书，而且moreinb等人,1995,clin.immunother.3:461-475以及barrig和mitchellgf,1996,immunol.andcellbiol.74:8-25也提供关于完全免疫刺激复合物的制备的有用说明。

可以用于本文所公开的手足口病疫苗抗原和免疫原性组合物的佐剂组合中的皂苷(无论是否是iscom形式)包括来源于南美皂皮树的树皮的那些皂苷(称为quila)以及其级分，如美国专利号5,057,540和"saponinsasvaccineadjuvants",kensil,c.r.,critrevtherdrugcarriersyst,1996,12(1-2):1-55；以及ep0362279b1所述的。quila的示例性馏分为qs21、qs7和qs17。

β-七叶皂苷是用于手足口病疫苗和/或免疫原性组合物的佐剂组合物中的另一种溶血性皂苷。七叶皂苷在merck索引(第12版：条目3737)中描述为马栗树欧洲七叶树(lat:aesculushippocastanum)的种子中出现的皂苷混合物。描述了通过色谱法和纯化(fiedler,arzneimittel-forsch.4,213(1953))并通过离子交换树脂(erbring等人，美国专利号3,238,190)将其描述。七叶皂苷的级分已被纯化并显示为具有生物活性的(yoshikawam等人(chempharmbull(tokyo)1996年8月；44(8):1454-1464))。ββ-七叶皂苷也称为七叶树皂苷。

用于手足口病疫苗和/或免疫原性组合物中的另一种溶血性皂苷为毛地黄皂苷。毛地黄皂苷在merck索引(第12版，条目3204)中描述为一种皂苷，其来源于毛地黄(digitalispurpurea)的种子并且根据以下所述的程序进行纯化：gisvold等人,j.am.pharm.assoc.,1934,23,664；以及ruhenstroth-bauer,physiol.chem.,1955,301,621。其用途描述为用于胆固醇测定的临床试剂。

实现佐剂作用的另一种感兴趣的可能性为采用gosselin等人,1992中所述的技术。简言之，相关抗原诸如本公开的脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物中的抗原的呈递可以通过将抗原缀合至针对单核细胞/巨噬细胞上的fc受体的抗体(或抗原结合抗体片段)来增强。确切地说，已证实对于疫苗接种目抗原与抗-fcri之间的缀合物增强了免疫原性。抗体可在生成之后或者作为生成的一部分缀合至手足口病疫苗或免疫原性组合物抗原，包括通过表达为脊髓灰质炎疫苗和免疫原性组合物抗原的任一种多肽组分的融合物。

其他可能性涉及使用靶向和免疫调节物质(即细胞因子)。另外，还可使用细胞因子的合成诱导物诸如聚i:c。

适合分枝杆菌衍生物可以选自由以下组成的组：胞壁酰二肽、完全福氏佐剂、ribi(ribiimmunochemresearchinc.,hamilton,mont.)以及海藻糖二酯诸如tdm和tde。

适合的免疫靶向佐剂的实例包括cd40配体和cd40抗体或其特异性结合片段(参考以上论述)、甘露糖、fab片段以及ctla-4。

适合聚合物佐剂的实例包括碳水化合物诸如右旋糖酐、peg、淀粉、甘露聚糖以及甘露糖；塑料聚合物；以及乳胶诸如乳胶微珠。

调节免疫应答的另一种感兴趣的方式是在“虚拟淋巴结”(vln)(由immunotherapy公司开发的专利医疗设备，360lexingtonavenue,newyork,n.y.10017-6501)中包括免疫原(任选地连同佐剂和药学上可接受的载体和媒介物)。vln(细管状设备)模拟淋巴结的结构和功能。在皮肤下方插入vln产生无菌炎症位点，同时细胞因子和趋化因子高涨。t细胞和b细胞以及apc快速响应于危险信号，返回到炎症部位并且在vln的多孔基质内部累积。已显示当使用vln时引起对抗原的免疫应答所需要的必需抗原剂量减少，并且由使用vln进行疫苗接种而赋予的免疫保护超过了使用ribi作为佐剂的常规免疫。所述技术简单描述于gelberc等人,1998,"elicitationofrobustcellularandhumoralimmuneresponsestosmallamountsofimmunogensusinganovelmedicaldevicedesignatedthevirtuallymphnode"，于："fromthelaboratorytotheclinic,bookofabstracts,oct.12-15,1998,seascaperesort,aptos,calif"中。

寡核苷酸可作为佐剂与脊髓灰质炎疫苗和免疫原性组合物结合使用并且可含有由至少三个或更多个或甚至至少六个或更多个核苷酸分开的两个或更多个二核苷酸cpg基序。含cpg寡核苷酸(其中cpg二核苷酸为未甲基化的)诱导主要的th1应答。此类寡核苷酸为已熟知的并且描述于例如wo96/02555、wo99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中。

此类寡核苷酸佐剂可以是脱氧核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸主链为二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键，但是也可以使用磷酸二酯和其他核苷酸主链，诸如pna，包括具有混合主链键合的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于美国专利号5,666,153、美国专利号5,278,302和w095/26204中。

示例性寡核苷酸具有以下序列。所述序列可含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸主链：

(seqidno:1)oligo1：tccatgacgttcctgacgtt(cpg1826)；

(seqidno:2)oligo2：tctcccagcgtgcgccat(cpg1758)；

(seqidno:3)oligo3：accgatgacgtcgccggtgacggcaccacg；

(seqidno:4)oligo4：tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt(cpg2006)；以及

(seqidno:5)oligo5：tccatgacgttcctgatgct(cpg1668)

替代性cpg寡核苷酸包括其上具有无关紧要的缺失或添加的以上序列。作为佐剂的cpg寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法合成(例如ep468520)。例如，此类寡核苷酸可以利用自动合成仪来合成。此类寡核苷酸佐剂的长度可以是10-50个之间的碱基。另一种佐剂体系涉及含cpg寡核苷酸与皂苷衍生物的组合，具体地cpg与qs21的组合公开于wo00/09159中。

已描述许多单相或多相乳液体系。本领域技术人员可容易地使此类乳液体系适于脊髓灰质炎疫苗和免疫原性组合物抗原，以使得所述溶液不会破坏抗原的结构。水包油乳液佐剂本身已表明可用作佐剂组合物(epo399843b)，而且水包油乳液与其他活性剂的组合已描述为用于疫苗的佐剂(wo95/17210；wo98/56414；wo99/12565；wo99/11241)。已描述于其他油乳液佐剂，诸如油包水乳液(美国专利号5,422,109；ep0480982b2)和水包油包水乳液(美国专利号5,424,067；ep0480981b)。

用于本文所述的手足口病疫苗和/或免疫原性组合物中的油乳液佐剂可以是天然的或合成的，并且可以是无机的或有机的。无机油和有机油的实例对于本领域技术人员而言将为显而易见的。

为了使任何水包油组合物适用于人类施用，乳液体系的油相可包含可代谢油。术语可代谢油的含义是为本领域所熟知的。可代谢可定义为“能够通过代谢转化”(dorland'sillustratedmedicaldictionary,w.b.sanderscompany,第25版(1974))。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，所述油对于接受者而言为无毒的并且能够通过代谢转化。坚果(诸如花生油)、种子和谷物为常见植物油来源。合成油也可以使用并且可包括可商购获得的油诸如和其他合成油。鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四烷六烯)为大量见于鲨鱼肝油中而少量见于橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中的不饱和油，并且可用于手足口病疫苗和免疫原性组合物抗原中。鲨烯凭借以下事实而为可代谢油：鲨烯为胆固醇生物合成中的中间体(merck索引，第10版，条目号8619)。

示例性油乳液为水包油乳液，并且具体地为水包鲨烯乳液。

另外，用于手足口病疫苗和免疫原性组合物抗原中的油乳液佐剂可包括抗氧化剂，诸如油α-生育酚(维生素e，ep0382271b1)。

wo95/17210和wo99/11241公开了基于鲨烯、α-生育酚和80的乳液佐剂，其任选地与免疫刺激剂qs21和/或3d-mla一起配制。wo99/12565公开了通过将甾醇添加到油相中来对这些鲨烯乳液进行改进。另外，甘油三酯诸如三辛酸甘油酯(c27h50o6)可以添加到油相中，以便使乳液稳定(wo98/56414)。

稳定的水包油乳液中可见的油滴的大小可以小于1微米，可以是在基本上30-600nm的范围内，直径基本上为约30-500nm，或者直径基本上为150-500nm，并且具体地直径为约150nm，如通过光子相联光谱测量的。就这一点而言，按数量计80％油滴可以是处于这些范围内，按数量计超过90％或超过95％的油滴是处于限定的大小范围内。油乳液中存在的组分的量通常是在以下范围内：2％至10％油，诸如鲨烯；并且当存在时2％至10％α生育酚；以及0.3％至3％表面活性剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。油:α生育酚的比率可以等于或小于1，因为这提供更稳定的乳液。span85(tm)也可以约1％的水平存在。在一些情况下，可以有利的是本文所公开的脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物还将含有稳定剂。

产生水包油乳液的方法是为本领域技术人员已熟知的。通常，所述方法包括将油相与表面活性剂诸如pbs/溶液混合、接着使用均质器进行均质化的步骤，本领域技术人员将清楚的是包括使混合物两次穿过注射器针的方法将适用于使小体积的液体均质化。同样地，在微流化器中的乳化法(m110s微流体机，最多50道，在6巴最大压力输入(约850巴输出压力)下持续2分钟的时间段)可由本领域技术人员所改进以产生更小或更大体积的乳液。此改进可通过常规实验来实现，所述常规实验包括测量所得乳液直到获得具有所需直径的油滴的制备物。

可选地，脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物可以与以下各项组合：由壳聚糖(如以上所述)或其他聚阳离子聚合物组成的疫苗媒介物、聚丙交酯和聚丙交酯-共乙交酯颗粒、聚-n-乙酰基葡萄糖胺基聚合物基质、由多糖或化学修饰的多糖组成的颗粒、脂质体和基于脂质的颗粒、由甘油单酯组成的颗粒等等。皂苷也可以在胆固醇存在下配制以形成微粒结构诸如脂质体或iscom。此外，皂苷可以与聚氧乙烯醚或酯一起配制为非微粒溶液或悬浮液或微粒结构诸如少层(paucilamelar)脂质体或iscom。

用于如本文所述的脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物中的另外的说明性佐剂包括saf(chiron，美国加利福尼亚州)、mf-59(chiron，参见例如granoff等人(1997)infectimmun.65(5):1710-1715)、sbas系列的佐剂(例如，sb-as2(含有mla和qs21的水包油乳液)；sbas-4(含有明矾和mla的佐剂体系，可获自smithklinebeecham,rixensart,belgium)；detox(glaxosmithkline)、rc-512、rc-522、rc-527、rc-529、rc-544和rc-560(glaxosmithkline)以及其他氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(agp)，诸如待决美国专利申请序列号08/853,826和09/074,720中所述的那些。

佐剂的其他实例包括但不限于hunter's佐剂(cytrxcorp.,norcross,ga.)；gerbu佐剂(gerbubiotechnikgmbh,gaiberg,germany)；硝基纤维素(nilsson和larsson(1992)res.immunol.143:553-557)；明矾(例如氢氧化铝、磷酸铝)；基于乳液的制剂，包括矿物油、非矿物油、油包水或水包油乳液，诸如seppicisa系列的montamide佐剂(例如isa-51、isa-57、isa-720、isa-151等等；seppic,paris,france)；以及(idecpharmaceuticals)；om-174(与脂质a相关的葡糖胺二糖)；利什曼原虫延长因子；形成胶束的非离子型嵌段共聚物诸如crl1005；以及syntex佐剂制剂。参见例如，o'hagan等人(2001)biomoleng.18(3):69-85；以及"vaccineadjuvants:preparationmethodsandresearchprotocols"d.o'hagan编辑(2000)humanapress。

其他示例性佐剂包括具有以下通式的佐剂分子：

ho(ch2ch2o)n-a-r，(i)

其中n为1-50，a为键或--c(o)--，r为c1-50烷基或苯基c1-50烷基。

一个实施方案由包含具有通式(i)的聚氧乙烯醚的疫苗制剂组成，其中n在1与50之间、4-24或9；r组分为c1-50、c4-c20烷基或c12烷基，并且a为键。聚氧乙烯醚的浓度的范围应为0.1％-20％、0.1％-10％或范围为0.1％-1％。示例性聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-9-硬脂酰(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚以及聚氧乙烯-23-月桂醚。聚氧乙烯醚诸如聚氧乙烯月桂醚描述于merck索引(第12版：条目7717)。这些佐剂分子描述于wo99/52549中。

根据以上通式(i)的聚氧乙烯醚可按需要与另一种佐剂组合。例如，佐剂组合可包含如以上所述的cpg。

用于本文所公开的脊髓灰质炎疫苗和/或免疫原性组合物中的适合药学上可接受的赋形剂的其他实例包括水、磷酸盐缓冲盐水、等渗缓冲溶液。

在一些实施方案中，本公开的疫苗制剂包括针对s1、s2和s3(pv1、pv2和pv3)的sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sipv)，其中明矾为0.5mg/剂。在其他实施方案中，本公开的疫苗制剂包括针对i型、ii型和iii型sipv的sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sipv)，其中明矾为0.067mg/ml。在其他实施方案中，本公开的疫苗制剂包括针对i型、ii型和iii型sipv的sabin灭活脊髓灰质炎疫苗(sipv)加上白喉、破伤风和百日咳疫苗，其中明矾为0.133mg/ml。

本公开的其他方面涉及使用本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来治疗或预防有此需要的受试者中的脊髓灰质炎，和/或在有此需要的受试者中诱导对脊髓灰质炎的免疫应答的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种病毒的一种或多种抗原，所述病毒引起脊髓灰质炎。在一些实施方案中，本公开涉及用于通过施用有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物至有需要的受试者中来治疗或预防有此需要的受试者中脊髓灰质炎的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种病毒的一种或多种抗原，所述病毒引起脊髓灰质炎。在一些实施方案中，本公开涉及用于通过施用有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物至有需要的受试者中以在有此需要的受试者中诱导针对脊髓灰质炎的免疫应答，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种病毒的一种或多种抗原，所述病毒引起脊髓灰质炎。本公开的任何方法可使用灭活的或活的减毒脊髓灰质炎病毒。

在一些实施方案中，保护性免疫应答包括针对pv1、pv2和pv3的一种或多种的免疫应答。

在一些实施方案中，施用步骤包括一种或多种施用。施用可以是通过单剂量方案或多剂量(初免-加强)方案。在多剂量方案中，不同剂量可以通过相同或不同路径给予，例如胃肠外初免和粘膜加强、粘膜初免和胃肠外加强等等。通常它们将通过相同路径给予。多个剂量将通常间隔至少1周来施用(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等等)。间隔25-30天(例如28天)给予两个剂量是特别有用的。如上文描述的，脊髓灰质炎免疫接种的示例性给药方案是现有技术已知的。

本公开的方法包括施用治疗有效量的或免疫原性量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物。治疗有效量或免疫原性量可以是本公开的疫苗和/或免疫原性组合物将在它所施用的未感染、感染或未暴露的受试者中诱导保护性免疫应答的量。此应答将通常使得在受试者中产生针对疫苗的分泌性、细胞的和/或抗体介导的免疫应答。通常，此应答包括但不限于以下作用中的一种或多种：产生来自任何免疫学类别的抗体，诸如免疫球蛋白a、d、e、g或m；使b淋巴细胞和t淋巴细胞增殖；向免疫细胞提供活化、生长和分化信号；使辅助性t细胞、抑制性t细胞和/或细胞毒性t细胞扩增。

优选地，治疗有效量或免疫原性量足以引起对疾病症状的治疗或预防。需要的精确量将根据以下各项而改变：所治疗的受试者；待治疗受试者的年龄和一般状况；受试者的免疫系统合成抗体的能力；所需保护程度；所治疗病状的严重性；所选择的具体手足口病抗原多肽及其施用方式；以及其他因素。适当的治疗有效量或免疫原性量可容易地通过本领域技术人员来确定。治疗有效量或免疫原性量将落入相对广泛的范围，所述范围可通过常规试验来确定。

列举实施方案

下列列举的实施方案代表本公开的一些方面。

1.一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：

(a)在第一细胞培养基中培养细胞；

(b)在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，在第二细胞培养基中用所述肠病毒c病毒接种所述细胞；且(c)收获由所述细胞产生的所述肠病毒c病毒，

其中在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时向所述第二细胞培养基添加表面活性剂。

2.实施方案1的方法，其中与缺少所述表面活性剂时收获的肠病毒c病毒的产量相比，步骤(c)中收获的肠病毒c病毒的产量增加。

3.实施方案1或实施方案2的方法，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯。

4.实施方案1或实施方案2的方法，其中所述表面活性剂是基于聚乙二醇的表面活性剂。

5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

6.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述细胞在步骤(a)中在液体培养基中培养。

7.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述细胞是贴壁细胞，且所述细胞在步骤(a)中在微载体上培养。

8.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述细胞是贴壁细胞，且所述细胞在步骤(a)中在包含基质的固定床中培养。

9.实施方案1-5中任一项的方法，其中所述细胞在步骤(a)中在生物反应器中培养。

10.实施方案8的方法，其中以约0.01至约0.0009的moi用肠病毒c病毒接种所述细胞。

11.实施方案8或实施方案10的方法，其中约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。

12.实施方案8或实施方案10的方法，其中约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。

13.实施方案12的方法，其中约5,000个细胞/cm²被接种。

14.实施方案8或10-13中任一项的方法，其中在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。

15.实施方案8和10-14中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，培养被接种的细胞。

16.实施方案8和10-15中任一项的方法，其中所述细胞在范围为约6.8至约7.4的ph接种。

17.实施方案8和10-16中任一项的方法，其中无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基。

18.实施方案8和10-17中任一项的方法，进一步包括，在步骤(c)之后：

(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；

(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一结合级分以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；和

(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

19.一种用于产生肠病毒c的方法，其包括：

(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养。

(b)在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，用肠病毒c病毒接种所述细胞，其中以约0.01至约0.0009的moi用肠病毒c病毒接种所述细胞；且

(c)收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。

20.实施方案19的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

21.实施方案19或实施方案20的方法，其中在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时，添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养基。

22.实施方案19-21中任一项的方法，其中120,000个细胞/cm²至300,000个细胞/cm²被接种。

23.实施方案19-21中任一项的方法，其中4,000个细胞/cm²至12,000个细胞/cm²被接种。

24.实施方案23的方法，其中约5,000个细胞/cm²被接种。

25.实施方案19-24中任一项的方法，其中在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。

26.实施方案19-25中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，培养所述接种的细胞。

27.实施方案19-26中任一项的方法，其中所述细胞在范围约6.8至约7.4的ph被1接种。

28.实施方案19-27中任一项的方法，其中无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基。

29.实施方案19-28中任一项的方法，其进一步包括，在步骤(c)之后：

(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；

(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一洗脱物以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且

(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

30.一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：

(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；

(b)在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，用肠病毒c病毒接种所述细胞，其中约100,000个细胞/cm²至约320,000个细胞/cm²被接种；且

(c)收获由所述细胞产生的所述肠病毒c病毒。

31.实施方案30的方法，其中约120,00个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。

32.实施方案30的方法，其中约120,00个细胞/cm²至约250,000个细胞/cm²被接种。

33.实施方案30的方法，其中约200,000个细胞/cm²被接种。

34.实施方案30的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

35.实施方案30-34的方法，其中在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养基。

36.实施方案30-35中任一项的方法，其中以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c接种所述细胞。

37.实施方案30-36中任一项的方法，其中在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。

38.实施方案30-37中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下培养被接种的细胞。

39.实施方案30-38中任一项的方法，其中所述细胞在范围约6.8至约7.4的ph接种。

40.实施方案30-39中任一项的方法，其中无额外葡萄糖添加至所述第二细胞培养基。

41.实施方案30-40中任一项的方法，其进一步包括，在步骤(c)之后：

(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；

(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一洗脱物以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且

(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

42.一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：

(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养。

(b)在肠病毒c感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，用肠病毒c病毒接种细胞；且

(c)收获由细胞产生的肠病毒c病毒，

其中在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。

43.实施方案42的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

44.实施方案42或实施方案43的方法，其中在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养基。

45.实施方案42-44中任一项的方法，其中以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c病毒接种所述细胞。

46.实施方案42-45中任一项的方法，其中约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。

47.实施方案42-45中任一项的方法，其中约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。

48.实施方案47的方法，其中约5,000个细胞/cm²被接种。

49.实施方案42-48中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，培养被接种的细胞。

50.实施方案42-49中任一项的方法，其中在范围约6.8至约7.4的ph接种所述细胞。

51.实施方案42-50中任一项的方法，其中无额外葡萄糖添加至所述第二细胞培养基。

52.实施方案42-51中任一项的方法，其进一步包括，在步骤(c)之后：

(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；

(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一洗脱物以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且

(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

53.一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：

(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；

(b)在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的情况下，用肠病毒c病毒接种细胞，其中在范围为约6.8至约7.4的ph接种所述细胞；且

(c)收获由细胞产生的肠病毒c病毒。

54.实施方案53的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

55.实施方案53或实施方案54的方法，其中在用所述肠病毒c接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养基。

56.实施方案53-55中任一项的方法，其中以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c病毒接种所述细胞。

57.实施方案53-56中任一项的方法，其中约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。

58.实施方案53-56中任一项的方法，其中约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。

59.实施方案58的方法，其中约5,000个细胞/cm²被接种。

60.实施方案53-59中任一项的方法，其中所述细胞在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养。

61.实施方案53-60中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的情况下，培养被接种的细胞。

62.实施方案53-61中任一项的方法，其中无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基。

63.实施方案53-62中任一项的方法，其进一步包括，在步骤(c)之后：

(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；

(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一洗脱物以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且

(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

64.一种用于产生肠病毒c病毒的方法，其包括：

(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养。

(b)在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的情况下，在第二细胞培养基中用肠病毒c病毒接种细胞，其中无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖；且

(c)收获由所述细胞产生的所述肠病毒c病毒。

65.实施方案64的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

66.实施方案64或实施方案65的方法，其中在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养基。

67.实施方案64-66中任一项的方法，其中以约0.01至约0.0009的moi用肠病毒c病毒接种细胞。

68.实施方案64-67中任一项的方法，其中约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。

69.实施方案64-67中任一项的方法，其中约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。

70.实施方案69的方法，其中约5,000个细胞/cm²被接种。

71.实施方案64-70中任一项的方法，其中在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养细胞。

72.实施方案64-71中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的情况下，培养被接种的细胞。

73.实施方案64-72中任一项的方法，其中在范围为6.8至约7.4的ph接种所述细胞。

74.实施方案64-73中任一项的方法，其进一步包括，在步骤(c)之后：

(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；

(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一洗脱物以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且

(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

75.一种用于产生纯化的肠病毒c病毒的方法，其包括：

(a)在包含基质的固定床中培养贴壁细胞，其中所述细胞在第一细胞培养基中培养；

(b)在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的情况下，在第二细胞培养基中用肠病毒c病毒接种细胞；

(c)收获由细胞产生的肠病毒c病毒；

(d)使收获的由所述细胞产生的肠病毒c病毒通过深层过滤器以产生第一洗脱物，其中所述第一洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(e)使所述第一洗脱物与阳离子交换膜结合以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分包含所述肠病毒c病毒；

(f)从所述阳离子交换膜洗脱所述第一洗脱物以产生第二洗脱物，其中所述第二洗脱物包含所述肠病毒c病毒；

(g)使所述第二洗脱物与阴离子交换膜结合以产生第二结合级分，其中所述第二结合级分包含所述肠病毒c病毒；且

(h)从所述阴离子交换膜洗脱所述第二结合级分以产生纯化的肠病毒c病毒。

76.实施方案75的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1、s2和s3。

77.实施方案18、29、41、52、63和74-76中任一项的方法，其中所述深层过滤器的孔径为约0.2μm至约3μm。

78.实施方案18、29、41、52、63和74-77中任一项的方法，其中在步骤(e)之前，将所述第一洗脱物的ph调整至约5.7的ph值。

79.实施方案78的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1和s2。

80.实施方案18、29、41、52、63和74-76中任一项的方法，其中在步骤(e)之前，将所述第一洗脱物的ph调整至约5.0的ph值，且其中所述肠病毒c病毒是脊髓灰质炎病毒s3。

81.实施方案18、29、41、52、63和74-80中任一项的方法，其中用磷酸缓冲液使所述第一洗脱物结合到所述阳离子交换膜。

82.实施方案18、29、41、52、63和74-81中任一项的方法，其中用包含聚山梨醇酯的缓冲液使所述第一洗脱物结合到所述阳离子交换膜。

83.实施方案18、29、41、52、63和74-82中任一项的方法，其中所述第一洗脱物在范围为约4.5至约6.0的ph结合至所述阳离子交换膜。

84.实施方案18、29、41、52、63和74-83中任一项的方法，其中使所述第一洗脱物在约7ms/cm至约10ms/cm之间结合至所述阳离子交换膜。

85.实施方案18、29、41、52、63和74-84中任一项的方法，其中通过调整所述ph至约8.0使所述第一结合级分洗脱。

86.实施方案18、29、41、52、63和74-85中任一项的方法，其中通过添加约0.20m至约0.30m的氯化钠使所述第一结合级分洗脱。

87.实施方案18、29、41、52、63和74-86中任一项的方法，其中使所述第一结合级分在约20ms/cm至约25ms/cm之间洗脱。

88.实施方案18、29、41、52、63和74-87中任一项的方法，其中步骤(g)之前，将所述第二洗脱物的ph调整至约8.0至约8.5的ph值。

89.实施方案88的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎血清型：s1、s2和s3，且其中在步骤(g)之前，将所述第二洗脱物的ph调整至约8.0至约8.5的ph值。

90.实施方案88的方法，其中所述肠病毒c是选自下组的脊髓灰质炎病毒血清型：s1和s3，且其中在步骤(g)之前，将所述第二洗脱物的ph调整至约8.5的ph值。

91.实施方案88的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自s2和s3的脊髓灰质炎病毒血清型，且其中在步骤(g)之前，使所述第二洗脱物的ph调整至约8.0的ph值。

92.实施方案18、29、41、52、63和74-91中任一项的方法，其中用磷酸缓冲液或tris缓冲液使所述第二洗脱物结合至所述阴离子交换膜。

93.实施方案18、29、41、52、63和74-92中任一项的方法，其中用包含聚山梨醇酯的缓冲液使所述第二洗脱物结合至所述阴离子交换膜。

94.实施方案18、29、41、52、63和74-93中任一项的方法，其中所述第二洗脱物以范围为约7.5至约8.5的ph结合至所述阴离子交换膜。

95.实施方案18、29、41、52、63和74-94中任一项的方法，其中使所述第二洗脱物在约3ms/cm结合至所述阴离子交换膜。

96.实施方案18、29、41、52、63和74-95中任一项的方法，其中通过添加约0.05m至约0.10m的氯化钠使所述第二结合级分洗脱。

97.实施方案18、29、41、52、63和74-96中任一项的方法，其中使所述第二结合级分在约5ms/cm至约10ms/cm之间洗脱。

98.实施方案75-97中任一项的方法，其中在用所述肠病毒c病毒接种所述细胞期间或在步骤(c)之前约一小时至约四小时添加聚山梨醇酯至所述第二细胞培养基。

99.实施方案75-98中任一项的方法，其中以约0.01至约0.0009的moi用所述肠病毒c接种所述细胞。

100.实施方案75-99中任一项的方法，其中约120,000个细胞/cm²至约300,000个细胞/cm²被接种。

101.实施方案75-99中任一项的方法，其中约4,000个细胞/cm²至约16,000个细胞/cm²被接种。

102.实施方案101的方法，其中约5,000个细胞/cm²被接种。

103.实施方案75-102中任一项的方法，其中在步骤(a)和/或(b)期间以约0.1ml/cm²至约0.3ml/cm²的体积/表面积比培养所述细胞。

104.实施方案75-103中任一项的方法，其中步骤(b)进一步包括在肠病毒c病毒感染细胞且感染的细胞产生肠病毒c病毒的条件下，培养被接种的细胞，且其中步骤(c)包括裂解所述细胞以收获由所述细胞产生的肠病毒c病毒。

105.实施方案75-104中任一项的方法，其中以范围为约6.8至约7.4的ph接种所述细胞。

106.实施方案75-105中任一项的方法，其中无额外的葡萄糖添加至所述第二细胞培养基和/或从所述第二培养基中耗竭葡萄糖。

107.实施方案1-106中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

108.实施方案107的方法，其中所述细胞是vero细胞。

109.实施方案108的方法，其中所述vero细胞系选自下组：whovero10-87、atccccl-81、vero76(atcc登录号crl-1587)和veroc1008(atcc登录号crl-1586)。

110.实施方案1-109中任一项的方法，其中在步骤(a)中约4,000个细胞/cm²和约16,000个细胞/cm²被培养。

111.实施方案109的方法，其中在步骤(a)中约5,000个细胞/cm²被培养。

112.实施方案1-111中任一项的方法，其中所述第一细胞培养基和所述第二细胞培养基是不同的。

113.实施方案112的方法，其进一步包括在步骤(a)和步骤(b)之间，去除所述第一细胞培养基，且用所述第二培养基冲洗所述细胞。

114.实施方案1-113中任一项的方法，其中步骤(a)期间的所述第一细胞培养基中的氧密度(do)保持在约50％以上。

115.实施方案1-114中任一项的方法，其中步骤(b)期间的所述第二细胞培养基中的氧密度(do)保持在约50％以上。

116.实施方案8-115中任一项的方法，其中所述固定床的床高度为约2cm。

117.实施方案8-116中任一项的方法，其中所述固定床的床高度为约10cm。

118.实施方案8-117中任一项的方法，其中所述基质是纤维基质。

119.实施方案118的方法，其中所述纤维基质是碳基质。

120.实施方案118或实施方案119的方法，其中所述纤维基质的孔隙率为约60％至99％。

121.实施方案120的方法，其中所述孔隙率为约80％至约90％。

122.实施方案118-121中任一项的方法，其中所述纤维基质的细胞可及的表面积为约150cm²/cm³至约1000cm²/cm³。

123.实施方案118-121中任一项的方法，其中所述纤维基质的细胞可及的表面积为约10cm²/cm³至约150cm²/cm³。

124.实施方案123的方法，其中所述纤维基质的细胞可及的表面积为约120cm²/cm³。

125.实施方案1-124中任一项的方法，其中在步骤(d)中收获至少5.0x10⁷tcid50/ml的所述肠病毒c病毒。

126.实施方案1-125中任一项的方法，其中所述肠病毒c病毒是选自下组的脊髓灰质炎病毒株：lsc,2ab；p712,ch,2ab；leon,12a1b；及其任何组合。

127.实施方案1-126中任一项的方法，其进一步包括用β-丙内酯(bpl)、福尔马林或二乙烯亚胺(bei)中的一种或多种将所述肠病毒c病毒灭活。

128.通过实施方案1-127中任一项的方法产生的肠病毒c病毒。

129.实施方案128的肠病毒c病毒，其中所述病毒包含一种或多种抗原。

通过参考下列实施例将更充分地理解本公开。然而，它们不应被解释为以任何方式限制本公开的任何方面或范围。

实施例

实施例1：使用icellis的感染时细胞密度(cdi)对脊髓灰质炎病毒生产的影响

固定床生物反应器系统(例如来自lifesciences,portwashington,ny的生物反应器，例如nano和500/100生物反应器)有助于提高可用于工业规模疫苗(例如，sabin灭活的脊髓灰质炎疫苗或sipv)生产的宿主细胞生长和病毒生产的效率。使用这些系统进行病毒生产的上游工艺步骤在图1中显示。认为这些系统能够提高产量并降低生产成本。例如，固定床生物反应系统可能仅需要38天的上游处理，相比之下，基于微载体的系统需要57天。然而，为了用固定床生物反应器系统实现病毒生产，需要先确定许多制造参数的最佳条件，工业规模生产才能划算甚至才有可能。这些参数包括上游工艺步骤的各个方面，例如培养前的生长和培养条件、接种和感染时的细胞密度、感染复数(moi)、培养/生长期ph、温度(如培养前、生长期和/或病毒培养中)和培养持续时间(如培养前、生长期和/或病毒培养中)。

考察感染时细胞密度(cdi)对nano系统中生产力的潜在影响

方法

病毒和细胞贮存物

使用s2脊髓灰质炎病毒和最初来自ccl-81^tm的vero细胞。

d-抗原的测量

使用标准elisa测定来测定d-抗原。

葡萄糖/乳酸测量

使用scouttm乳糖计测量乳酸。使用accu-chekavivaplus系统测量葡萄糖。

vero复苏

进行vero细胞复苏。将1ml小瓶的vero细胞在37℃预温热水浴中快速解冻，并在室温在15ml离心管中与10ml的生长培养基混合。取一份(1.0ml)用于细胞计数和活力试验。将其余部分与20ml37℃预温热的生长培养基混合在50ml离心管中，在每个t-175培养瓶(共3个)中将10ml的细胞混悬液与77ml的37℃预温热的生长培养基混合。将这些培养瓶置于37℃的co2(5％)培养箱中。次日，丢弃用过的培养基并用新鲜培养基(87ml)替换，继续进行培养。

细胞培养和感染

除非另有规定，否则使用下列培养条件。这些条件至少部分地基于对下文描述的各种参数的改进。

对于预培养，vero细胞在补充有5％fbs的dmem中以0.5ml/cm²的体积在通气的t-175培养瓶(sarstedtag&co.,nurembrechtgermany)中培养。细胞以15,000个细胞/cm²的接种密度传代4天。

对于冲洗，在无do或ph调节的情况下，将细胞在34℃在800mlm199培养基中冲洗。以530rpm震荡细胞，冲洗时间为15分钟。

对于icellis中的生长期，让细胞在37℃以5,000个细胞/cm²的接种密度在1600ml的补充有5％fbs和1g/l果糖的dmem中生长。总微载体面积是5300cm²(其对应于0.3ml/cm²的v/s以及最高达0.2x10⁶个细胞/cm²的容许密度。要更高的密度，使用0.5ml/cm²。)。震荡速率为430rpm。ph为7.15，且do为>50％。

对于感染期，细胞密度为0.125-0.2x10⁶个细胞/cm²。在34℃，在do调节至>50％且ph调节至7.40的情况下，在1600ml的补充有3.5g/l葡萄糖和0.05％-80的m199培养基中以0.002的moi感染细胞。以430rpm震荡细胞且孵育6天。

下游处理

下文描述了用于下游酸化、阳离子交换色谱和阴离子交换色谱步骤的参数。

结果

为了确定对生产力而言最佳的感染时密度，让细胞培养物在5个nano固定床生物反应器中生长，每个生物反应器以0.1至0.5x10⁶个细胞/cm²的不同细胞密度感染。测量d-抗原含量来表示生产力。

将结果作图以显示生产力随体积(即du/ml；图2a)或随细胞数量(即du/10⁶个细胞；图2b)的变化。这些数据表明在仅仅0.12x10⁶个细胞/cm²时，就获得了近乎最大的生产力，在0.12-0.35x10⁶个细胞/cm²之间的大范围的cdi内获得了稳定的接近最大值的生产力。有利地，这些结果表明可在较低的细胞密度获得近乎最大的生产力，从而减少细胞培养基消耗。例如，在体积/表面积比(v/s)为0.3ml/cm²时，可实现0.12-0.2x10⁶个细胞/cm²的cdi的目标，然而更高的cdi需要更高的v/s，因此需要更大的培养基消耗。换句话说，使用更高的cdi不提供生产力的显著改善，但导致更高的培养基消耗。

实施例2：使用icellis的感染复数(moi)对脊髓灰质炎病毒生产的影响

接下来，检测moi对生产力的影响。

结果

如实施例1中所述，培养细胞并用病毒感染。参考上文图2a所述测量体积生产力。

让细胞在2个nano固定床生物反应器中生长，并以0.01(“高moi”)或0.02(“低moi”)的moi用病毒感染。以相似的cdi(对于低moi为0.12x10⁶个细胞/cm²，对于高moi为0.16x10⁶个细胞/cm²)感染两种细胞。如图3所示，两种moi产生相似的生产力(如通过体积生产力(du/ml)测定的)。因此，可使用较小的病毒moi，同时仍获得最大的生产力和病毒释放动力学。因此，后续实验使用0.002的moi。

实施例3：使用icellis的细胞培养生产，与方瓶比较

与使用标准nano系统(即在本文描述的改进之前)相比，当细胞在常规组织培养瓶中生长时，生产力提高到两至三倍。nano系统和组织培养瓶之间的一个区别是nano使用具有循环培养基的动态环境，而培养瓶是静态环境。因此，测试了nano条件对病毒稳定性的影响。另一个区别在于ph和do的调节，因此还测试了nano中ph和do对生产力的影响。

结果

如实施例1中所述，培养并用病毒感染细胞。参考上文图2a所述测量体积生产力。

来自单个nano生物反应器的最终收获按照下列划分：将200ml培养物在cs-1烧瓶中于34℃在co2培养箱中孵育5天(“cs对照”)，并在50％do、在ph7.4和30ml/min的空气(“icellisnano”)的情况下，将1200ml培养物在nano在34℃搅拌下再循环5天。

如图4所示，在两组条件下，d-抗原的产量是稳定的。对于nano，观察到约15％的d-抗原损失，但这种损失并未随时间降低。这些数据表明，相较于使用方瓶，nano的动态环境不是较低的生产力的原因。

接下来，评估了nano中ph和do调节对生长的影响。在主动调节和未主动调节ph和do的情况下，让培养物在nano中生长。对于未主动调节的情况，将空气/co2的混合物以30ml/min的流速注射到所述生物反应器中。“未调节”和调节的cdi分别为0.18x10⁶和0.16x10⁶个细胞/cm²。

图5a显示主动ph/do调节的生产力远高于未调节。图5b和5c显示对照和“未调节”随时间的ph和do水平(在两种情况下在第6天左右发生感染)。这些结果强调了nano中主动ph和do调节的重要性。

实施例4：使用icellis进行细胞裂解对脊髓灰质炎病毒生产的影响

考察细胞裂解对回收的影响。

结果

细胞在用脊髓灰质炎病毒感染后，培养细胞并每天测定细胞外或细胞内d-抗原的体积生产力。从每种培养物中取样，冻融以裂解细胞，并测量d-抗原含量。在不进行冻融步骤的情况下，测量细胞外d-抗原含量。细胞内d-抗原计算如下：(冻融处理后样品的d-抗原水平)-(未冻融处理后的样品的d-抗原水平)。

图6显示细胞外和细胞内d-抗原随时间的产量。例如，在感染后4天，仍然在细胞内发现高达20％的总d-抗原。这些结果表明收获时的细胞裂解可提高病毒回收，例如，通过细胞裂解可回收10-20％的额外病毒。

实施例5：使用icellis的细胞代谢状态对脊髓灰质炎病毒生产的影响

检测代谢(例如，葡萄糖消耗和/或乳酸产生)对细胞生产力的影响。

结果

如上所述，培养细胞并用病毒感染细胞。如上所述地测量葡萄糖和乳酸。测量在微载体(例如，来自gehealthcarelifesciences的cytodex^tm微载体)上生长的细胞的每细胞生产力(du/10⁶个细胞)、葡萄糖短缺、和感染时的ldh活性，并与使用icellis系统培养的两批细胞进行比较(图7a)。如果在培养期间葡萄糖水平降至250mg/l以下，则在第二天将观察到葡萄糖短缺/耗竭。

结果表明，与未优化的基于icellis系统的方法相比，在微载体上培养的细胞的每细胞生产力提高。为了确定生产力的差异是否可以通过两个系统中培养的细胞之间的代谢差异来确定，考察了葡萄糖短缺和感染时的ldh活性。与在微载体上培养的细胞(其在感染48-72个小时前经历葡萄糖短缺)相比，在icellis系统中培养的细胞未经历葡萄糖短缺。与在微载体上培养的细胞相比，在icellis系统中培养的细胞还表现出感染时ldh活性降低到十分之一。这些结果证明了两种培养系统之间的代谢差异。不希望受理论束缚，这些结果表明代谢胁迫(例如，在感染时)和/或较高的细胞密度可导致生产力提高。

接下来，测量在根据本公开的微载体上培养的细胞中平均每细胞生产力，并与在根据科技文献中的方案的微载体上培养的细胞进行比较。如图7b所示，基于cytodex的培养方案的表现优于根据科技文献报道的培养进行的培养(参见“cytodex”和“lit.microodex”柱形)。在icellis系统中使用“cytodex”方案的相同温度和ph条件导致生产力轻微降低(参见“icellis中的cytodex复制-粘贴”与“cytodex”)。使用未经优化的icellis条件的最佳操作显示为“最佳操作”。

接下来在这些方案之间比较培养基中的葡萄糖水平(图7c)，并且还与icellis系统中的细胞生产力比较(图7d)。与微载体培养相比，icellis系统中的细胞胁迫大大降低。不希望受理论束缚，这些结果表明细胞胁迫和较高的细胞密度可导致生产力提高，并且考虑到细胞代谢，icellis更适用于细胞培养，因为晚些时候，在第三天，icellis中的细胞培养基中残留的葡萄糖(对细胞代谢至关重要)多于cytodex。

接下来，如图7e和7f所示，考察了感染期间添加葡萄糖对生产力的影响。两种培养物在方瓶中以范围为1至10g/l的初始葡萄糖浓度(在细胞培养基m199中)培养。细胞在方瓶中在生长期以0.5ml/cm²的v/s培养。标明了感染期的葡萄糖浓度。一个培养物显示出较高葡萄糖浓度对生产力的积极影响(图7e)，而另一个培养物未显示出影响(图7f)。由于葡萄糖的添加对生产力没有负面影响，且不希望受理论束缚，因此认为保持葡萄糖添加(例如，在4.5g/l的水平)可有利于避免感染阶段期间的葡萄糖短缺。

图7g显示感染前葡萄糖短缺对细胞生产力的影响。细胞在icellis系统中在生长期中培养，在感染前完全短缺葡萄糖24小时。在感染阶段(细胞浓度为0.3ml/cm²)，不添加额外的葡萄糖。由于系统的预期生产力为～20du/ml，因此观察到葡萄糖短缺对生产力具有潜在的负面影响(图7g)。没有观察到对对照细胞堆叠培养系统中培养的细胞的负面影响。

图7h显示了在感染时添加额外葡萄糖对细胞生产力的影响。细胞在icellis系统中在生长期中培养，感染前无葡萄糖短缺。在感染阶段(细胞浓度为0.3ml/cm²)，加入额外的葡萄糖(4.5g/l，含5％fbs)。由于icellis系统的预期生产力为～20du/ml，因此观察到在感染时添加额外的葡萄糖对生产力具有潜在的负面影响(图7h)。没有观察到对对照细胞堆叠培养系统中生长的细胞的负面影响。总之，向病毒培养基中添加额外的葡萄糖和fbs并未提高脊髓灰质炎病毒的产量。类似地，生长期的葡萄糖剥夺不会提高脊髓灰质炎病毒的产量。

实施例6：聚山梨醇酯对病毒收获的影响

考察添加聚山梨醇酯对病毒收获产量的影响。

结果

如上所述，在主动ph/do调节和震荡的情况下，在icellis中培养病毒。收获前一小时，向培养物中加入0.05％-80。收获后，用10mmtris缓冲液(ph7.4)冲洗icellis在添加-80之前、在添加-80之后和用tris缓冲液冲洗nano之后，在初次初始时测量d-抗原的生产。

图8a显示在收获之前添加聚山梨醇酯(在该实施例中，为-80)导致回收的病毒量增加到两倍。在总收获量(以du产量度量)中，在添加-80之前捕获了45％，在添加-80后捕获了46％，在用tris缓冲液冲洗后回收了9％。这些结果表明，由于在病毒收获之前或期间添加聚山梨醇酯，显著提高了生产力。

进行两种工艺(工艺1和工艺2)之间的比较，并总结在图8b中。与工艺1相比，工艺2中的差异以粗体显示。这些数据表明，在感染时使用高moi或较低的v/s比对生产力几乎没有影响。例如，使用0.1ml/cm²或0.3ml/cm²的感染时v/s比对总体生产力没有影响。

工艺1和2的生产力如图8c所示。在“感染期间存在吐温”条件下，感染培养基中存在0.05％-80。在“重复”条件下，使用相同的感染培养基但没有-80，结果在初始收获中回收的病毒量低得多。“重复”收获的“吐温额外回收量”部分表明在初始收获后用含有-80的冲洗缓冲液洗涤生物反应器后回收的d-抗原滴度。这些数据证明，在感染培养基中包含表面活性剂实现了产量增加。

实施例7：比较不同脊髓灰质炎病毒株的上游工艺改进

测量三种不同病毒株-s1、s2和s3(使用上述上游工艺改进)的病毒产量。用于每种血清型的病毒株是：i型：lsc,2ab，ii型：p712,ch,2ab，iii型：leon,12a1b。

结果

使用上述方法在icellis系统中产生三种病毒血清型。结果如下表a所示。

表a.使用生产s1、s2和s3病毒

*与0.05％-80孵育4小时后，滴度为33du/ml。

实验a(exp-a)和实验b(exp-b)之间的唯一参数差异是感染时的细胞密度(如上所示)和感染第1天和第2天的病毒培养基的循环。对于exp-as2，在第1天开始循环，对于exp-as3和exp-a2s1和s2，在第2天开始循环。

这些结果表明，上述上游工艺改进在提高三种不同脊髓灰质炎病毒血清型的产量方面是有效的。总之，在2,400ml体积的含fbs的培养基中收获每种血清型。s1的总d-抗原产量为104,890du，s2为61,001du，s3为302,208du。s1的d-抗原浓度(收获时的du/ml)为43.7，s2的d-抗原浓度为33.3，s3的d-抗原浓度为125.9。

实施例8：使用icellis的脊髓灰质炎病毒生产的下游处理步骤的改进

现有的下游处理方案是时间和资源密集的。例如，图9a将本文所述的改进的方案与美国专利号8,753,646的现有方案进行比较。本文所述的改进方法不需要多次过滤和超速离心步骤(像现有方案那样)，而是使用阴离子交换色谱法(例如，使用pallcorporation，pt.washington，ny的mustang-q膜)和阳离子交换色谱法(例如使用pallcorporation,pt.washington,ny的mustang-s膜)。这种改进的方法允许更加简化和成本有效的下游处理方案。

图9b中显示了说明用于病毒生产灭活的经改进的下游工艺的流程图。以下实施例详述了这种经改进的纯化工艺的验证和优化，以及此工艺与使用icellis系统的病毒生产的组合。

结果

采用三种实验设计来测试各种下游处理参数对病毒生产的影响(图10)。这些实验的结果在下表b和c中显示。

表b.实验c、d和8的结果

表c.实验c、d和8的结果

来自这些实验的各种纯化步骤的产物显示在图11a-11e中。来自实验8(图11a)的s2病毒的纯化类似于thomassen,y.e.等.(2013)plosone8:e83374的图3b中所示的。这表明来自阴离子交换膜的洗脱物(图11a中的泳道5)含有脊髓灰质炎病毒，并且使用相继的阳离子和阴离子交换色谱步骤充分纯化了该脊髓灰质炎病毒悬浮液。这些结果证明使用具有如本文所述的合适的参数设置的阳离子/阴离子交换色谱充分纯化了脊髓灰质炎病毒。图11b显示尽管在纯化工艺中改变了某些参数而提高了d-抗原回收，但未完全除去额外的蛋白质(例如，在60kd处)。如图11d所示，s3病毒株需要与菌株s1和s2不同的阳离子交换装载ph。图11e显示在相同的ph时，s3几乎未与阳离子交换膜结合。泳道7中显示的约30kd的条带不是s3脊髓灰质炎病毒组分。

这些结果表明，来自实验8(图11c)的s2病毒的纯化类似于使用现有方案的纯化方法产生的纯化(参见图11c的泳道1和2)。现有的方案(例如，如美国专利号8,753,646中所述)总结在图9b中(“现有的”)。因此，图9b和10中概述的简化纯化方案可产生高纯度，其条带类似于使用现有技术纯化的条带，例如现有方案、色谱法或thomasseny.e.等.(2013)plosone8:e83374中描述的方案。然而，s3病毒的纯化需要不同的ph用于阳离子交换装载，方可产生类似于现有方案的纯化的病毒(参见图11e的泳道1和2)。本文进一步描述了对下游处理的改进以促进s3病毒的纯化。

病毒血清型s1、s2和s3的纯化过程结果的概述在下表d中提供。

表d.三种病毒血清型的纯化的概述

这些结果证明，全部三种病毒血清型的阴离子和阳离子交换步骤、以及整个纯化工艺的回收率都是高的。纯化的药物物质中的总蛋白质/d-抗原比低于0.1。因此，所有血清型的最终纯化产物在灭活后均应符合此规格。

实施例9：鉴定阴离子和阳离子交换色谱的捕获条件

测试提高d-抗原产量的捕获条件(例如ph、缓冲液成分、聚山梨醇酯的有无、以及稀释系数)。

结果

使用96孔acroprep^tm板(pallcorporation)通过筛选条件评定阴离子交换色谱(例如使用mustangq系统,pallcorporation)的各种参数对病毒捕获的影响。样品是～12个d-抗原单位(理论上)的澄清收获物。样品被稀释5倍(图12a)或3倍(图12b)，使用标示的条件结合，并用0.75ml的0.75mnacl(于标示的缓冲液中)洗脱。分析洗脱级分的d-抗原(du)。

图12a显示使用5倍稀释系数的结果。使用ph7.0-8.5的tris缓冲液观察到高效率的捕获(产率～80％或更高)。与相当ph的tris缓冲液相比，使用磷酸盐缓冲液的条件大多捕获效率较低。在低ph，观察到一些捕获，但效率低。在大多数条件下，添加聚山梨醇酯(0.05％-80)对捕获效率的影响较小，但添加可影响纯度。不希望受到理论束缚，认为不稀释、含吐温的结果是矛盾的，很可能表明不稀释的情况下无捕获。

图12b显示3倍稀释系数的结果，相较于5倍稀释，稀释量的减少降低了在所有条件下的捕获效率，但值得注意的是ph8.0和8.5的tris是例外。这些结果表明有稀释的余地。总之，这些结果表明使用ph8.0-8.5的tris缓冲液观察到最高效的捕获，并且稀释因子可降低至3倍或更多。不希望受到理论束缚，认为不稀释、含吐温的结果是矛盾的，很可能表明不稀释的情况下无捕获。

接下来，如上所述通过筛选条件测定阳离子交换色谱(例如使用mustangs系统,pallcorporation)的各种参数对病毒捕获的影响。

图13a显示使用5倍稀释系数的结果。观察到的使用ph5.5柠檬酸缓冲液和聚山梨醇酯的最高捕获效率为～90％产量。ph4.5或6.0的柠檬酸盐缓冲液的捕获效率要低一些。使用聚山梨醇酯稍微增加了捕获效率。

图13b显示使用3倍稀释系数的结果。相较于5倍稀释，减少稀释倍数至3倍降低了所有条件(除了ph4.5或5.5的柠檬酸盐缓冲液)下的捕获效率。总之，这些结果表明使用ph4.5或5.5的柠檬酸盐缓冲液以及聚山梨醇酯的观察的捕获效率最高，且表明稀释系数可降低至3倍或降低更多。

使用柠檬酸盐、tris或磷酸盐缓冲液与阳离子和阴离子交换色谱的结合效率随ph的变化显示在图14a-14d中。

接下来，测试阴离子交换条件以将工艺规模放大至mustangq规模。图14e显示使用无聚山梨醇酯的trisph8.0缓冲液以4倍稀释系数获得的洗脱曲线。获自每个级分的总病毒量以及百分比产率在图14f中显示。如图14e和14f中所示，在穿透液中未检测到显著的d-抗原，且产率约为100％。低电导率(例如10ms)提供了最佳的洗脱。

图14g显示使用具有聚山梨醇酯的trisph8.0缓冲液以4倍稀释系数获得的洗脱曲线。如sds-page银染色所测定的纯度显示在图14h中。如图14g和14h所示，在穿透液中未检测到显著的d-抗原，且纯度低于50％。低电导率(如10ms)提供了最佳的洗脱。

接下来，测试阳离子交换条件以将工艺规模放大到mustang规模。图14i显示使用无聚山梨醇酯的柠檬酸盐缓冲液(ph5.5)以4倍稀释系数获得的洗脱曲线。从每个级分获得的总病毒量(例如，总d-抗原)以及百分比产率显示在图14j中。如图14i和14j所示，在穿透液中检测到少于10％的d-抗原，产率约为90％。在高洗脱电导率下观察到两个峰。

图14k显示使用具有聚山梨醇酯的柠檬酸盐缓冲液(ph5.5)以4倍稀释系数获得的洗脱曲线。通过sds-page银染色测定的纯度显示在图14l中。如图14k和14l所示，在穿透液中检测到少于5％的d-抗原，产率约为95％。在高洗脱电导率下观察到两个峰。通过由sds-page解析的峰的银染色分析估计纯度高于50％。

表d2中提供了如上所述的放大阴离子和阳离子交换色谱步骤的概述。

表d2.放大结果概述。

图15a和15b中显示了一个用于测试各种下游处理参数的实验计划。测试了阳离子交换(图15a)和阴离子交换(图15b)条件的四种组合。这些测试的结果显示在图15c中。这些结果表明，对于阳离子交换色谱，可以使用柠檬酸盐或磷酸盐缓冲液，其对产率几乎没有影响。然而，当使用磷酸盐缓冲液进行上游阳离子交换步骤时，与使用柠檬酸盐进行上游阳离子交换步骤相比，阴离子交换产率似乎更高(参见mustangq编号3和4的步骤回收率和总体回收率，与编号1和2对比)。

接下来，结合降低阳离子交换洗脱ph和阴离子交换装载ph，考察增加缓冲液浓度的影响。这些实验旨在提高缓冲容量并以更中性的ph为目标。

实验装置如图16a所示。使用上述条件将dsp1.0的回收性能与dsp1.1的性能进行比较，dsp1.1使用较高的缓冲液浓度进行阳离子交换柱装载(20mm对比10mm磷酸盐缓冲液)、较低的阳离子交换洗脱ph(ph7.5对比8.0)和阴离子交换步骤(具有相同的较高缓冲液浓度和相同的装载ph值)。如图16b所示，dsp1.1导致较低的步骤回收率和整体回收率。对于阳离子交换，观察到在20ms时sipv的微量洗脱，这可归因于较低的洗脱ph。对于阴离子交换，观察到穿透液中有50％的sipv，这可归因于较低的装载ph和较高的缓冲液电导率。这些结果提示较高的缓冲液ph和/或降低的缓冲液电导率可导致较高的回收。

接下来，测试阳离子交换色谱步骤的稀释系数对回收的影响。使用mustangs作为膜。线上装载物是澄清的病毒收获物(例如，在澄清和酸化后)，ph调节至5.5。稀释缓冲液是10mm柠檬酸盐。如图17a所示，实现了近乎完全回收，即使在没有稀释的情况下在穿透液中也无回收(通过du测量)。因此，在ph5.5时，甚至0倍稀释系数也是可接受的，尽管在ph5.7时，2倍稀释系数也是可接受的。图17b显示稀释系数低于1.3导致穿透液中s2d-抗原损失超过5％。

接下来，比较用于阴离子交换色谱的基于ph和盐的洗脱。图18a显示使用ph8.0磷酸盐缓冲液的阴离子交换底物的基于ph的洗脱的洗脱曲线。图18b显示了使用nacl的ph8.0磷酸盐缓冲液的阴离子交换底物的基于nacl洗脱的洗脱曲线。这些结果表明，与ph洗脱相比，使用nacl洗脱获得了更好的纯度。两次洗脱均产生>100％的产率。ph洗脱在阴离子交换步骤之前不需要稀释，而nacl需要10倍稀释系数。然而，nacl洗脱产生比ph洗脱更高的纯度。因此，每种类型的洗脱都具有益处，并且所需的类型可取决于下游处理和放大的纯度要求。

总之，在图19中提供了用于放大病毒生产的示例性下游处理流程的图示。在图20a和20b中提供了详述整个生产过程的两个示例性流程图。

实施例10：改进中试规模工艺中病毒生产的工艺参数

使用500/66m²系统进行中试规模工艺操作的病毒生产、收获和纯化。与nano相比，这种按比例放大的系统使生物反应器体积增加了70倍(70l对比1l)。

结果

使用500/66m²系统进行病毒生产的完整过程流程图，以及随后的收获和下游过程步骤，如图21a所示。使用500/66m²系统的上游处理的优化参数如图21b所示。

图21a和21b所示的工艺以25l规模进行。分析该过程的结果并与较小的规模进行比较(图22)。如图22中突出显示的，关于d-抗原产率，在mustang-s洗脱步骤中使用逐步梯度程序观察到两个峰。将仅含有第一个峰的一个级分应用于mustang-q。在这种情况下，最终的d-抗原产率为35％。然而，不希望受理论束缚，如果将包括两个峰的病毒悬浮液应用于mustang-q，则认为最终产量可增加至52％。关于总蛋白质/du，最终纯化病毒的总值符合规格，并且总蛋白质浓度值在三种不同程序中是不同的。

为了研究低产率的潜在来源，接下来考察下游处理步骤。下游处理步骤的概述如图23a中的流程图所示。如图23b和23c所示，在阳离子交换色谱期间观察到两种不同电导率的洗脱(20和25ms/cm)。通过检测对应于来自20和25ms/cm洗脱的vp1、vp2和vp3的蛋白条带证实了这些结果(图23d)。未检测到vp4。

接下来，测定阴离子交换色谱的洗脱曲线(图23e)。如图23f所示，在第二次装载、穿透和第一次洗涤以及第二次洗涤等步骤中缺少病毒回收，这可指示～45％的损失。对各种阴离子交换洗脱物中蛋白质进行的检测证明，存在另外的、未鉴定的条带，其迁移的分子量比vp1、vp2和vp3更高(图23g)。

由于这些结果，进行了另外的实验以优化下游处理并以更大规模地提高纯度。不希望受理论束缚，认为如上所述观察到的洗脱曲线和纯度可由未明的病毒/蛋白质相互作用驱动。认为弱化这些相互作用可能会还原更多预期的洗脱曲线，并提供更强的病毒/膜相互作用，从而导致单个峰的洗脱和更好的纯度。

提高纯度

在一个方面，在色谱装载、洗涤和洗脱期间使用更高(例如，高5倍)的聚山梨醇酯浓度(例如，-80)。

在另一方面，在装载期间使用更高的导电率(例如，10-15ms/cm)。

在另一方面，鉴定了图23g中所示的染色带(例如，使用银染/ms分析)。如果所述条带反映bsa，则采用改进的icellis冲洗步骤。

获得单个阳离子交换洗脱峰

首先，使用较小的规模纯化500/66m²系统收获物，以确定是否观察到双峰洗脱。

在另一方面，在色谱装载、洗涤和洗脱期间使用更高(例如，高5倍)的聚山梨醇酯浓度(例如，-80浓度)。例如，测试以下浓度的聚山梨醇酯(例如，-80)：0％(作为阴性对照)、0.05％、0.1％、0.25％和0.5％。

在另一方面，在装载期间使用更高的电导率(例如，10-15ms/cm)。

增加阴离子交换色谱的回收

首先，使用较小的规模纯化500/66m²系统收获物，以确定是否观察到类似的回收。

在另一方面，重新考察25l规模的定量，以确定观察到的较低的产率(例如，与规模相比)是否由于定量误差所致。

调整色谱步骤规模

测定阳离子交换柱(例如，mustangs色谱膜)和阴离子交换柱(例如mustangq色谱膜)的最大装载容量。例如，以10mlmustang膜规模装载125ml/mlmv、250ml/mlmv、500ml/mlmv的收获物。

改进阴离子交换色谱

为了改进使用阴离子交换色谱法的捕获，使用多种方法。稀释后的最终ph为7.4，而不是8.0。在一个方面，在稀释期间增加缓冲容量以达到ph8.0。在另一方面，确定ph7.4对产率的影响。mustang-q装载的可接受的ph范围可以基于(例如)生产记录。

在另一方面，使用15mm和20mm磷酸盐缓冲液进行稀释，并考察它们对电导率、稀释系数和产率的影响。

在另一方面，测试在ph7.5时在阴离子交换膜上的捕获以评估较低ph的潜在用途。

使用s2病毒进行了完整的生产操作。下游工艺参数如图23h所示。结果(包括体积；d-抗原滴度、总量和回收率；总蛋白质；下游工艺的每个步骤的蛋白质/d-抗原比率)如图23i所示。

实施例11：比较中试规模工艺中用于病毒生产的上游工艺参数

使用500/66m²系统进行额外的中试规模工艺试验的病毒生产、收获和纯化，并与使用nano系统的生产比较。监测各种上游工艺参数对生产力的潜在影响。考察多种脊髓灰质炎病毒株的产生。

结果

进行四次独立的生产操作：两次细胞在500/66m²系统中培养，两次细胞在nano系统中培养。图24a显示了每种条件下细胞培养物的各种参数(所有条件均使用病毒株s2)。重要的是，在500/66m²系统(“icellis500/66b”)中培养的培养物中的一个观察到最高d-抗原滴度/ml，估计其产生了39.4mdu，相当于单次操作产生了0.55m剂量的疫苗。还进行了三次额外的操作，其中两次细胞在500/66m²系统中培养，另一次细胞在nano系统中培养，如图24b和24c所示(所有条件均使用病毒株s3)。这些结果表明，与nano系统中的生长相比，500/66m²系统的生长的相对生产力几乎相当(500/66的d-抗原滴度在v/s0.3为118.9du/ml，对于nano，为104.0du/ml)。

实施例12：改进中试规模工艺中用于病毒生产的下游工艺参数

接下来，考察了病毒生产的下游处理步骤的进一步改进。用于这些实验的上游处理步骤在图25a中用图表所示。

结果

用于病毒收获和纯化的示例性下游工艺在图25b中显示。一种工艺使用用nacl缓冲液的阴离子交换色谱的洗涤和洗脱，而替代工艺使用基于ph的洗涤以及磷酸盐缓冲液洗脱。这些工艺之间的差异总结在下表e和f中。

表e.下游工艺参数。

表f.下游工艺参数(续)

这些参数应用于s1和s3病毒，如下表g和h所示。

表g.使用s1病毒的结果。

表h.使用s3病毒的结果

使用病毒株s1考察阳离子交换膜装载的ph。如图26a所示，99.2％的总病毒(du)在ph5.4和5.7之间被捕获。还使用病毒株s1考察来自阳离子交换膜的nacl洗脱。观察到约100％的病毒在250mmnacl下洗脱(图26b和26c)。这些结果表明，对于使用s1病毒株的阴离子交换色谱，阳离子交换装载在ph5.7时最有效，并且含250mmnacl的10mm磷酸盐缓冲液对洗脱最有效。

接下来使用病毒株s1考察用于阴离子交换膜装载的ph。将样品稀释2倍并等分至2个单位(ph4.0和10.0)。装载电导率为3.88ms/cm，并且包括0.05％吐温-80。如图27a所示，81.17％的总病毒(du)在ph8.24和8.60之间被捕获。还使用病毒株s1考察了自阴离子交换膜的nacl洗脱。从ph8.5的装载液中纯化2864.55du病毒，并包括0.005％吐温-80。观察到大约90.61％的病毒在300mmnacl下洗脱(图27b)。在穿透液和洗涤液中未观察到du。这些结果表明，对于使用s1病毒株的阴离子交换色谱，含300mmnacl的10mm磷酸盐缓冲液的洗脱是最有效的。

还使用病毒株s3测试了阴离子和阳离子交换步骤。如图28a所示，对于装载到阳离子交换膜上的ph，100％的总病毒(du)在ph5.00和5.51之间被捕获。还使用病毒株s3考察了自阳离子交换膜的nacl洗脱。观察到大约91.7％的病毒在200mm至300mmnacl下洗脱(图28b和28c)。这些结果表明，使用s3病毒株装载阳离子交换膜在ph5.0最有效，且用10mm磷酸盐缓冲液和300mmnacl的洗脱最有效。

接下来，使用病毒株s3考察阴离子交换膜装载的ph。将样品稀释2倍并等分至2个单位(ph4.0和10.0)。装载电导率为3.88ms/cm，并包括0.05％吐温-80。如图29a所示，100％的总病毒(du)在ph8.15和9.93之间被捕获。还使用病毒株s3考察了自阴离子交换膜的nacl洗脱。从ph8.5的装载液中纯化出14161.2du病毒。观察到大约12.62％的病毒在200mmnacl洗脱(图29b)。在穿透液和洗涤液中未观察到du。这些结果表明，对于纯化s3病毒，200mmnacl对于自阴离子交换膜的洗脱是最有效的。不希望受理论束缚，认为s3和s1/s2之间的表面电荷差异导致针对s3病毒株的阴离子交换的参数设置比阳离子交换更严格。

总之，使用nacl和ph洗脱的下游处理方案分别提供在图30a和30b中。

还使用脊髓灰质炎病毒株s2进行了生产操作。使用nacl洗脱的工艺操作的每个工艺步骤的病毒回收率总结在图31a中。该操作的回收率和产率参数在下面的表i和j中提供。基于总蛋白质/du比率和观察到的bsa浓度获得目标纯度(参见表n)。阴离子交换色谱的总收获物的总产率为81.6％。使用lowry方法测量总蛋白。使用elisa测量bsa和宿主细胞蛋白(hcp)。使用实时pcr测量宿主细胞dna(hcd)。

表i.用nacl洗脱进行s2工艺操作的产率和纯度的总结。

表j.用nacl洗脱进行s2工艺操作的额外产率和纯度数据

使用ph洗脱的工艺操作的每个工艺步骤的病毒回收率总结在图31b中。来自该操作的回收率和产率参数在下表k和l中提供。基于总蛋白质/du比获得目标纯度(参见表n)。bsa浓度未测定。阴离子交换色谱的收获物的总收率为69.5％。

表k.使用ph洗脱的s2工艺试验的产率和纯度的总结。

缩写：adl：高于检测限；bdl：低于检测限。

表l.来自使用ph洗脱的s2工艺操作的额外产率和纯度数据。

接下来，使用从用nacl洗脱的s2工艺操作中获得的数据考察洗脱体积对阴离子交换色谱的产率和纯度的影响。如下表m中所示，级分1(参见图32中相应的色谱)具有目标范围内的纯度。然而，当还包括更多的级分2时，纯度降低并且在目标范围之外。这些结果表明洗脱体积对下游工艺纯度至关重要。基于60l规模的纯化，认为10ml膜体积(mv)是足够的。

表m.来自用nacl洗脱的s2工艺操作的各种阴离子交换级分的产率和纯度的总结。

通过sds-page分析法进一步分析使用两个工艺操作获得的s2病毒的纯度。图33a显示在nacl洗脱级分1中检测到vp1、vp2和vp3的产率高于阳离子交换色谱后的产率。图33b显示在100mmnacl的ph洗脱中检测到vp1、vp2和vp3的产率高于阳离子交换色谱后的产率。这些结果表明用100mmnacl的阴离子交换洗脱是最有效的，并且尽管通过sds-page检测到额外的蛋白质条带，但是使用如本文所述的阳离子和阴离子交换步骤可有效地纯化s2收获物。

下游工艺步骤的目标产率和纯度参数显示在下表n中。

表n.下游工艺的目标产率和纯度。

基于本文所述的结果，认为表o中的下游工艺参数是针对每种脊髓灰质炎病毒株的大规模生产的优化设置。

表o.下游工艺参数。

实施例13：应用改进的方法产生的sipv疫苗在兔中的毒理学研究

使用由本文所述的改进方法(参见上文实施例12)产生的病毒材料在兔中进行毒理学研究。使用来自s1、s2和s3的病毒材料，用明矾和药学上可接受的载体配制疫苗。将药物物质与含有2-苯氧基乙醇的磷酸盐缓冲盐水混合。然后将混合溶液用0.2微米的膜过滤，并通过加入明矾佐剂(铝胶)配制。s1、s2和s3的样品d抗原在所用的最高强度下为3、100、和100du/剂量。

结果

基于sabin的灭活脊髓灰质炎疫苗(sipv)以3:100:100du/剂量的s1:s2:s3剂量肌肉内施用于雄性和雌性kbl:jw兔一次(单剂量组：2只动物/性别/组)，或每周一次连续5周(多剂量组：5只动物/性别/组；在第1、8、15、22和29天给药)。单剂量和多剂量组中的动物分别在单次给药或第5次给药后2天进行尸体剖检，并评估潜在的毒性。每次施用每只动物接受0.5ml的测试物。每组设定两个并行的对照组(生理盐水和铝佐剂(媒介物))，并以与接种疫苗组相同的方式施用。提供额外5只动物/性别/组以在8周恢复期后考察任何潜在毒性变化的可逆性。基于本研究中收集的血清样品的免疫原性结果，证实兔是评估毒性的合适物种。

在给药期和恢复期间未观察到与测试物相关的死亡。接种疫苗的恢复组中的一只雄性表现出厌食症状，并在第38天处以安乐死。在该动物中，在第5次给药后注意到粪便量的减少、食物摄入量的减少和体重减轻。补液两次；然而，动物的情况没有改善。从动物福利的角度考虑，对动物处以安乐死，并进行尸体剖检以阐明动物健康恶化的原因。尸体剖检的发现包括小胸腺，胃中毛球，以及膀胱的管腔扩张。组织病理学发现包括胃肠道(食道、空肠和回肠)粘膜、皮肤表皮、泪腺腺泡细胞，盲肠淋巴组织和肝脏中门静脉肝细胞的空泡状态中的萎缩性变化。这些发现被归因于动物在安乐死之前恶化的厌食症状。由于胃毛团在兔子中很常见，甚至小毛球(或不太分散的聚集物)也会导致兔子厌食，这种动物中观察到的厌食症状可能是由于胃中发现的毛球，而不太可能与测试物相关。

在恢复组的预定尸检当天(第85天)，发现接种疫苗的恢复组中的一只雌性死亡，先前没有任何临床体征异常。在第84天和在给药期间(第2天、第8天和第30天)进行的血液学和血液化学检查未发现该动物的任何显著变化。虽然在显微镜下注意到注射部位有异物，但在其他给药铝佐剂或疫苗的恢复动物中也发现了这些观察结果。在尸体剖检或组织病理学检查中未观察到导致死因的损伤。虽然未确定这只兔子的死亡原因，但不认为其与测试物相关，因为在该动物的整个给药和恢复期间没有观察到显著的变化。

在恢复期的临床体征、体重、食物摄入、水摄入、体温、眼科、尿液分析或血液学中未发现与测试物相关的异常。在皮肤反应的观察中，在第5次给药后第30天至第34天，注意到接种疫苗组中的一只雄性右侧股外肌(注射部位3)注射时变红。在单剂量组的尸体剖检时，在生理盐水、铝佐剂和接种疫苗组中的两种性别中注意到左侧股外肌(注射部位1)注射时(第1次给药后2天)的暗红色焦点。在多剂量组中，在铝佐剂和接种疫苗组中的两种性别中均观察到注射部位3(第5次给药后2天)的暗红色焦点。

单剂量组的组织病理学检查显示铝佐剂组和接种疫苗组的注射部位1(第一次给药后2天)的单核细胞浸润、肌肉坏死/再生、出血、异物和/或巨噬细胞聚集。这些变化的发生率/严重程度在这些组之间相近。认为异物源自残留的给药材料，例如铝佐剂和疫苗。此外，巨噬细胞聚集指示针对给药材料的异物反应。

多剂量组的组织病理学检查显示铝佐剂组和接种疫苗组中的注射部位3处的肌肉的坏死/再生、出血、异物和免疫/炎症反应(例如单核细胞浸润、假嗜酸性粒细胞浸润、水肿和/或巨噬细胞聚集)。在这些变化中，接种疫苗组中免疫/炎症反应的发生率/严重程度高于铝佐剂组中观察到的发生率/严重程度。在注射部位1(第1次给药后4周)，在铝佐剂和接种疫苗组中注意到巨噬细胞聚集和异物，其具有相近的发生率/严重性。仅在接种疫苗组中注意到单核细胞浸润和假嗜酸性粒细胞浸润。与注射部位3相比，接种疫苗组中单核细胞和假嗜酸性粒细胞浸润和异物的发生率/严重程度降低，这表明注射疫苗后局部免疫/炎症变化的可逆性。在左侧骶棘肌(注射部位2)中的注射(第2次-第4次给药的多次给药后1周)时，在铝佐剂组和接种疫苗组中注意到单核细胞浸润、假嗜酸性粒细胞浸润、肌肉坏死/再生、异物和/或巨噬细胞聚集。在这些变化中，仅在接种疫苗组中注意到假嗜酸性粒细胞浸润。然而，与单次注射后的发现相比，未在接种疫苗组中注意到免疫/炎症反应或肌肉坏死的明显恶化。这些结果表明在相同区域中多次给药后的耐受性。

除了在多剂量组中注意到的注射部位的变化之外，脾和髂内淋巴结的生发中心的数量和大小增加。在副皮质中也有增加的淋巴细胞数量，且·髂内淋巴结的假嗜酸性粒细胞浸润增加。所有这些变化被认为是对重复接种的正常免疫反应；在接种疫苗的多剂量组中注意到这些变化。

在恢复期间，多次给药(第1次给药后4周)后的注射部位1中连续注意到具有可比较的发生率/严重程度的异物和巨噬细胞聚集；然而，其他发现在接种疫苗组中消失了。此外，在给药期结束时观察到的淋巴结和脾脏中的发现在恢复期后消失。因此，证实了疫苗接种诱导的免疫/炎症反应的可逆性。

总之，对兔子肌肉内施用sipv4周(以1周为间隔共给予5次剂量)和8周的恢复期耐受良好。在兔子中单次给药或多次给药后未观察到全身毒性。在接种组中注意到注射部位的局部免疫/炎症反应(以及区域淋巴结和脾脏中的相关发现)。然而，这些反应与疫苗接种一致，并且在给药期结束时观察到的这些发现在恢复期间得到解决，除了对给药材料的轻微异物反应之外。未基于注射部位的测试物相关的变化建立无明显作用水平(noel)：基于恢复期后免疫/炎症反应的可逆性，在本研究的条件下确定疫苗的无明显不良反应水平(noael)为0.5ml/动物。总之，这些实验显示使用本文所述的改进方法成功地生产了病毒材料，并随后配制成了含有该病毒材料的有效疫苗。

序列表

<110>rao,raman

sato,tatsuki

oda,kaori

nakamura,kuniaki

nishihama,takeshi

<120>用于产生用于疫苗生产的病毒的方法

<130>606772001241

<140>尚未指定

<141>同时用此方法

<150>62/382,621

<151>2016-09-01

<160>5

<170>针对windows版本4.0的fastseq

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>1

tccatgacgttcctgacgtt20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>2

tctcccagcgtgcgccat18

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>3

accgatgacgtcgccggtgacggcaccacg30

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>4

tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt24

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>合成的构建体

<400>5

tccatgacgttcctgatgct20