稳定的药物泡沫的制作方法

本发明涉及药物泡沫的领域，诸如包含通过蛋白质的酶促水解制备的蛋白胨的药物泡沫。

背景技术：

泡沫为通过将气体分散在液体中、使得气体的气泡被捕获在液体中而形成的物质，其中液体的薄膜使气体区域分开。

不包含溶解颗粒的纯液体(例如，100％h20)不起泡，使得通常需要添加表面活性剂以降低液体的表面张力，从而使气体能够与液体混合以形成稳定泡沫。表面活性剂本质上通常是两亲性的(即，具有亲水性基团和亲脂性基团)，具有长疏水链。

由用作表面活性剂的全长蛋白制备的泡沫是已知的。全长蛋白质需要变性以提供所需的表面活性剂特征。为了制备泡沫，需要两亲性试剂，即具有亲水性基团和亲水性基团两者的分子，从而使变性蛋白的链形成胶束，气体诸如空气被捕获在该胶束内。此特征允许形成空气气泡，该空气起泡在液体内是稳定的。

泡沫广泛用于工业中，诸如用于食品工业中或用作泡沫灭火剂。泡沫可能用于各种各样的医疗和手术过程，例如用于提供对表面的保护，递送药物，或充当用于各种手术过程的屏障。使用液体泡沫能够用最少量的液体快速且高效地覆盖大面积。

对于大多数手术程序，重要的是，所用的泡沫必须是坚固且耐用的。泡沫的强度可表示为压缩泡沫所需的力(即，压缩强度)，该力可使用诸如由instron或lloyd制造的装置、使用与用于确定明胶凝胶强度bloom数(bloomnumber)所执行的方法相似的方法来测量。bloom数为使给定样品区域压缩4mm的距离所需的力的量度(以克为单位的重量)。更高的bloom数指示更强的凝胶。bloom数与平均分子质量成比例。低bloom数(50-125)与20,000-25,000的平均分子质量相关；中bloom数(175-225)与40,000-50,000的平均分子质量相关；而高bloom数(225-325)与50,000-100,000的平均分子质量相关。

背景技术包括美国专利8,778,883；8,512,740；8,753,670；8,741,335；2,492,458；6,454,787；8,603,543；以及6,730,299；pct公布wo2014/086996；2014/071053；以及2010/088469；以及欧洲专利1257304。

技术实现要素：

在本发明的某些方面，本发明涉及一种药物(即，用于医疗和/或手术用途)泡沫组合物，该药物泡沫组合物包含通过全长蛋白的酶促水解制备的蛋白胨，其中该泡沫不含全长蛋白。

本发明的各方面和实施方案在下文说明书和所附权利要求书中描述。

通常已知，对于由全长蛋白产生的凝胶，该凝胶的压缩力与蛋白质的平均分子质量成正比。分子量对压缩力的影响的这一特征可与由变性蛋白制备的泡沫相关。

本发明人意外地发现，包含短肽长度(例如，90个或更少氨基酸)的蛋白胨可用于产生稳定的泡沫，该稳定的泡沫具有优异的性能，诸如与由全长均一蛋白产生的已知泡沫相比具有更高的泡沫压缩强度，具有更高的平均分子质量。

一般来讲，蛋白胨可由衍生自不同来源(例如，明胶、酪蛋白或蛋白质混合物)的全长蛋白制备，以获得肽片段。肽片段为通过酰胺键连接的氨基酸单体的短链。蛋白胨可通过不同的方法获得，诸如通过全长蛋白的酶促水解、酸水解和/或碱水解获得。

最短的肽可以是二肽，由通过单个肽键连接的两个氨基酸组成。

用于本发明的蛋白胨为包含肽和任选地游离氨基酸的水溶性混合物，该水溶性混合物通过全长蛋白的酶促水解/消化形成。在一些实施方案中，这些蛋白胨缺乏游离氨基酸。

根据本发明的一个方面，提供了一种药物泡沫组合物，该药物泡沫组合物包含通过全长蛋白的水解制备的蛋白胨，其中该泡沫不含全长蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了一种药物泡沫组合物，该药物泡沫组合物包含通过全长蛋白的酶促水解制备的蛋白胨，其中该泡沫不含所述全长蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了一种药物泡沫组合物，该药物泡沫组合物包含通过全长蛋白的酶促消化制备的蛋白胨，其中该泡沫不含全长蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了一种药物泡沫组合物，该药物泡沫组合物包含通过全长蛋白的酶促水解制备的蛋白水解产物，其中所述泡沫不含全长蛋白。

如本文所用，术语“水解产物”是指通过水解产生的材料。术语“水解”通常意指通过添加水使化学键裂解。在一些实施方案中，术语“蛋白质水解”涉及蛋白质分解为较小的肽和游离氨基酸。在一些实施方案中，术语“蛋白质水解”涉及通过肽键的水解而分解蛋白质。术语“蛋白质水解产物”是指蛋白质的水解产物，该产物通常包含肽和游离氨基酸。

在本发明的以下方面中，蛋白胨或蛋白质水解产物包括酶促消化的蛋白质或酶促水解的蛋白质。

在本文公开的药物泡沫组合物中的任一种的一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质缺乏大小大于11.7kda的肽。

在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质包含大小小于10.0kda的肽。

在一些实施方案中，蛋白肽、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质，例如由明胶制备的蛋白胨或蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质，主要由低于10.0kda(大约90个或更少氨基酸)，诸如例如约1000da高至约10kda、约300da至约500da或甚至低于300da的链长度组成。

在一个实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质包含为长的、连续的且非支链肽链的肽。

在一个实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质包含大约90个或更少氨基酸的肽。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白为两种或更多种类型的全长蛋白质的组合。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白为单一类型的全长蛋白质。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白选自由以下项组成的组：乳蛋白(诸如酪蛋白)、胶原衍生的蛋白质(诸如明胶)、卵蛋白、血蛋白(诸如白蛋白)、酵母蛋白、植物蛋白或它们的组合。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白选自由酪蛋白和明胶组成的组。

在一些实施方案中，该泡沫是稳定的。

在一些实施方案中，酶促水解包括使用选自由以下项组成的组的蛋白酶：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶以及它们的组合。

在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质在高于约0.05％w/v至低于约20％w/v的泡沫的浓度下，诸如例如在高于约1.5％w/v至低于约18.0％w/v的泡沫的浓度下，或在高于约1.66％w/v至低于约17.86％w/v的泡沫的浓度下存在于泡沫中。

在一些实施方案中，该药物泡沫组合物还包含任选地在约0.1mg/ml至约10mg/ml的泡沫范围内的浓度下，诸如例如在约2.3mg/ml至约7mg/ml的泡沫范围内的浓度下的血纤蛋白和/或纤维蛋白原。

在一些实施方案中，该药物泡沫组合物还包含任选地在约0.1iu/ml至约100iu/ml的泡沫范围内的浓度下的凝血酶。

根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备药物泡沫组合物的方法，该方法包括以下步骤：用气体使蛋白胨、肽水解产物或酶促水解蛋白质的溶液发泡，蛋白胨、肽水解产物或酶促水解蛋白质的该溶液通过在水溶液中酶促水解全长蛋白来制备，其中蛋白胨、肽水解产物或酶促水解蛋白质的该溶液不含全长蛋白。

根据本发明的另一个方面，提供了一种用于制备药物泡沫组合物的方法，该方法包括以下步骤：用气体使蛋白胨、肽水解产物或酶促水解蛋白质的液体溶液发泡，蛋白胨或肽水解产物的该液体溶液通过在液体水溶液中酶促水解全长蛋白来制备，其中蛋白胨、肽水解产物或酶促水解蛋白质的该溶液不含全长蛋白。

如本文所用，术语“发泡”是指通过将液体溶液与气体混合来制备泡沫的方法。

发泡可手动地或自动地实现。例如，发泡可通过以下来实现：提供彼此流体连通的两个容器(诸如两个注射器)，其中液体溶液存在于两个容器中的第一个中，并且气体诸如空气存在于两个容器中的第二个中；将来自第一注射器的液体传递到第二注射器中的气体中，或者将来自第二注射器的气体传递到来自第一注射器的液体中；然后在两个注射器之间传递液体和气体，直到实现泡沫。

例如，发泡可通过以下来实现：提供彼此流体连通的两个容器(诸如两个注射器)，其中用于重构的液体存在于两个容器中的第一个中，并且气体诸如空气连同蛋白胨粉末或蛋白质水解产物存在于两个容器中的第二个中；将来自第一注射器的液体传递到第二注射器中的气体中，或者将来自第二注射器的气体传递到来自第一注射器的液体中；然后在两个注射器之间传递液体和气体，直到实现泡沫。

另选地，液体溶液可提供在密封容器，该密封容器不与气体具有流体连通，直至激活操作机构以使气体与液体接触。此类机构可包括例如用于打开密封容器的密封件的泵装置或机构。

在一个实施方案中，液体在两个注射器之间的传递执行至少6次。

如本文所用，术语“水溶液”是指包含水和至少一种溶解于其中的溶质的溶液。在一个实施方案中，该术语旨在排除包含油的乳液或溶液。

乳液为两种或更多种通常不混溶(不可混合或不可共混)的液体的混合物。

“液体”为例如使形状适形于其容器的形状、但是独立于压力保持(几乎)恒定体积的液体和/或可流动材料。

在一些实施方案中，蛋白胨或肽水解产物包括酶促消化蛋白质。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备药物泡沫组合物的方法，该方法包括以下步骤：用气体使酶促消化蛋白质的溶液发泡，酶促消化蛋白质的该溶液通过在水溶液中酶促水解全长蛋白来制备，其中酶促消化蛋白质的该溶液不含全长蛋白。

因此，根据本发明的一个方面，提供了一种用于制备药物泡沫组合物的方法，该方法包括以下步骤：用气体使酶促消化蛋白质的溶液发泡，酶促消化蛋白质的该溶液通过在液体水溶液中酶促水解全长蛋白来制备，其中酶促消化蛋白质的该液体溶液不含全长蛋白。

在本文公开的方法的一些实施方案中，蛋白胨、肽水解产物或酶促消化蛋白质包含大小小于10.0kda的肽。

在一些实施方案中，蛋白胨、肽水解产物或酶促消化蛋白质包含至少1000da的肽。

在一些实施方案中，蛋白胨、肽水解产物或酶促消化蛋白质包含具有在1000da至小于10.0kda范围内的大小的肽。

在一些实施方案中，在发泡之前，将蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促消化蛋白质的溶液干燥，并且在制备之前用包含水的溶液重构。

在一些实施方案中，酶使全长蛋白水解以产生包含大小小于10.0kda的肽的蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质。

在一些实施方案中，该方法还包括在发泡之前，从蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液中去除大小大于11.7kda的肽。

在一些实施方案中，该方法还包括在发泡之前，从蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液中去除大小大于10kda的肽。

在一些实施方案中，去除选定大小的肽通过过滤来执行，例如，例如在离心过滤装置中穿过尺寸排阻膜来执行。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白质为蛋白质诸如2种、3种或更多种不同的全长蛋白的组合。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白为单一类型的蛋白质。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白质为酪蛋白。

在一些实施方案中，水解的全长蛋白为明胶。

在一些实施方案中，酶促水解用选自由以下项组成的组的蛋白酶实施：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶以及它们的组合，只要产生的蛋白质水解产物或蛋白胨包含具有在1000da至小于10.0kda范围内的大小的肽即可并且/或者只要蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的发泡能力不受损即可。

包含在小于约50％w/v溶液的浓度下的蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液被认为对用于制备如本文公开的泡沫是有益的。因此，在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质在低于约50％w/v溶液的浓度下存在，例如在高于约1％w/v至低于50％w/v的浓度下存在。

在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质在高于约1％w/v至低于约40％w/v的浓度下，诸如例如在高于约5％w/v至低于约25％w/v的浓度下存在于溶液中。

在一些实施方案中，该方法还包括在水解完成后使酶失活。酶失活可通过改变酶活性所需的条件诸如加热和/或ph调整，或通过去除酶(例如，通过亲和色谱法、尺寸排阻等)来实施，只要蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的发泡能力不受损即可。

在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质和/或泡沫不含用于制备蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的活性酶。

在一些实施方案中，该方法还包括在发泡之前和酶失活之后，向蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液添加任选地在1％w/v高至约30％w/v范围内的蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液的浓度下的纤维蛋白原，只要蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的发泡能力不受损即可。

在一些实施方案中，该方法还包括向药物泡沫组合物添加任选地在约0.1iu/ml至约100iu/ml的药物泡沫组合物的浓度下的凝血酶。在一个实施方案中，在发泡之后添加凝血酶。

在一些实施方案中，提供了一种根据本文公开的方法中的任一种获得的药物泡沫。

在一些实施方案中，提供了本文公开的药物泡沫组合物用于提供止血、密封(诸如胸膜组织的密封)、防粘连和/或伤口愈合的用途。

根据本文公开的一个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括容器，该容器包含蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质，用于获得泡沫的装置和任选地除经受水解的全长蛋白之外的全长蛋白。

在一些实施方案中，除经受水解的全长蛋白之外的全长蛋白为纤维蛋白原。

在一些实施方案中，该试剂盒还包括包含凝血酶的容器。

在如本文共的试剂盒的一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质包含大小小于10.0kda的肽。

在一个方面，本发明提供了一种药物泡沫组合物，该药物泡沫组合物包含通过全长蛋白的酶促水解制备的蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质，其中所述泡沫不含经受水解的全长蛋白。

在一些实施方案中，如本文公开的泡沫比本领域已知的泡沫更坚固且更耐用，具有更大的拉伸强度，这通过其増加的抗压缩性来确定。

高强度和耐用性对于其中泡沫需要在延长的时间段内存在的应用是重要的，诸如对于伤口愈合、对于密封程序或对于粘连预防是重要的。在一些情况下，必须在延长的时间段内确保止血，例如在用抗凝血剂药物治疗的患者中。对于密封，需要泡沫而具有高强度，以便承受由特定应用诸如肺手术后的空气密封所产生的应力。对于防粘连应用，泡沫的耐用性是重要的，以便在手术部位处在不同器官之间提供坚固的物理屏障。在一些实施方案中，对于伤口愈合，重要的是，细胞可在其中生长的基质(例如，泡沫)在整个初始愈合阶段将保持耐用。

在一些实施方案中，与本领域已知的泡沫相比，如本文公开的泡沫具有降低的免疫原性和/或降低的过敏原特性，从而允许重复施加。

在一些实施方案中，如本文公开的泡沫比本领域已知的泡沫具有更大的粘连性，这在某些医疗应用中是高度有利的，以允许该材料在施加部位处保持在适当位置。例如，在一些实施方案中，如本文公开的泡沫具有大于1牛/英寸²诸如例如至少1牛/英寸²、至少2牛/英寸²、至少3牛/英寸²、至少4牛/英寸²、至5牛/英寸²或甚至至少6牛/英寸²的对组织的平均粘连力。在一些实施方案中，对组织的平均粘连力在约1牛/英寸²至约6牛/英寸²的范围内。

在一些实施方案中，如本文公开的泡沫比本领域已知的泡沫具有更大的硬度，这在某些医疗应用中是高度有利的，即对于施加到组织而言，其中泡沫必须具有强内聚力以密封流体或空气泄漏，尤其是其中压力可能升高。例如，在一些实施方案中，如本文公开的泡沫具有至少3n/mm诸如例如3n/mm、4n/mm、至少5n/mm、至少6n/mm、至少7n/mm、至少8n/mm、至少9n/mm、至少10n.mm、至少11n/mm、至少12n/mm、至少13n/mm、至少14n/mm、至少15n/mm、至少16n/mm、至少17n/mm或甚至至少18n/mm的平均刚度。在一些实施方案中，平均刚度在约3n/mm至约19n/mm的范围内。另外，在一些实施方案中，如果下面的组织扩张或收缩，则泡沫必须能够保持完整。

在一些实施方案中，泡沫是稳定的，不是瞬态的，并且在形成之后保持其泡沫结构包括高度、体积和/或孔隙率/平均孔径至少一小时。

如本文所用，关于泡沫(例如，非干燥泡沫)的术语“稳定的”是指可基本上支撑其自身结构而不在指定温度下塌缩的泡沫。例如，在生理温度下在体外稳定的泡沫在环境温度下保持其初始结构包括高度、体积和/或孔隙率/平均孔径的至少80％(诸如90％、95％或更高)至少1小时。通常，塌缩的最明显的特征在于泡沫形成之后泡沫结构的丧失。塌缩通常导致其体积显著小于初始制备泡沫的体积的结构。

在一些实施方案中，如本文公开的泡沫比本领域已知的泡沫具有更快的体内降解时间。由于蛋白胨已经是部分降解的蛋白质，因此这些蛋白质可比天然的完整/折叠蛋白质更快地完全降解。该特性可减少炎症反应、异物反应和手术后粘连中的一个或多个。

如本文所用，术语“降解时间”意指泡沫的蛋白胨组分的至少90％在体内降解所需的时间。

期望的泡沫降解时间取决于预期用途(例如，作为密封剂或止血剂)、组织类型、使用的量、再出血或再泄漏的机率、所涉及的压力、患者状况等。一般来讲，期望密封剂或止血剂存在足够长以允许组织修复，但不妨碍组织修复。例如，在一些实施方案中，优选的是，用作密封剂或止血剂的泡沫具有4-5天的寿命。

在一些实施方案中，如本文公开的泡沫不含非蛋白表面活性剂。

在一些实施方案中，本文公开的泡沫在不存在非蛋白表面活性剂的情况下制备。

在一些实施方案中，用于制备泡沫(即，在发泡之前)的蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质在发泡之前不经受变性。

在本发明的一些实施方案中，蛋白胨未变性。

在一些实施方案中，经受水解以制备蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的全长蛋白在发泡之前不经受变性。

在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液不含变性蛋白质。

在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液除水解酶之外不含变性蛋白质。

在一些实施方案中，蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质的溶液包含另一种全长蛋白，其中该另一种全长蛋白为不经受酶促水解的蛋白质。在一些实施方案中，该另一种全长蛋白存在于除水解酶以外的蛋白胨、蛋白质水解产物或酶促水解蛋白质中，并且该另一种全长蛋白在发泡之前不经受变性。

通常，变性为例如通过加热、通过用碱、酸、脲或洗涤剂处理来修饰蛋白质/肽的二级和/或三级分子结构的方法。当蛋白质变性时，二级和/或三级结构被改变，但是氨基酸之间的初级结构的肽键保持完整。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有”及其语法变体应视为指定所述特征、整数、步骤或组分，但不排除一种或多种另外特征、整数、步骤、组分或它们的组的添加。这些术语涵盖术语“由……组成”和“基本上由……组成”。

如本文所用，不定冠词“一个”和“一种”意指“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”，除非上下文另有明确说明。

如本文所用，术语“约”是指±10％。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。另外，说明、材料、方法和实施例仅为示例性的而非旨在用于限制。类似于或等同于本文所述的那些方法和材料可用于实践本发明。

如本文所用，术语“酶促水解”意指全长蛋白质酶促水解至蛋白胨溶液不含原始全长蛋白的程度。

在一个实施方案中，根据本发明的酶促水解还包括水解至给定酶不水解/消化该酶所识别的全长蛋白的所有可能的消化位点的程度。

在一些实施方案中，本文公开的药物泡沫组合物基本上缺乏和/或基本上不含经受酶促水解的全长蛋白。如本文所用，关于全长蛋白的术语“基本上不含”或“基本上缺乏”意指组合物含有少于5w/v％、少于4w/v％、少于3w/v％、少于2w/v％、少于1w/v％、少于0.5w/v％、少于0.1w/v％或少于0.05w/v％的全长蛋白。

如本文所用，术语“蛋白胨的溶液”是指包含蛋白胨和任选地其它组分诸如小分子、盐、活性药物成分和凝血因子的溶液，诸如液体溶液。

如本文所用，术语“肽水解产物的溶液”是指包含肽水解产物和任选地其它组分诸如小分子、盐、活性药物成分和凝血因子的溶液，诸如液体溶液。

如本文所用，术语“酶促水解蛋白质的溶液”是指包含酶促水解蛋白质和任选地其它组分诸如小分子、盐、活性药物成分和凝血因子的溶液，诸如液体溶液。

在一些实施方案中，蛋白胨衍生自乳蛋白(诸如酪蛋白)、胶原衍生的蛋白质(诸如明胶，例如由皮肤、软骨或骨制备的明胶)、卵蛋白、血蛋白(诸如白蛋白)、酵母蛋白、植物蛋白或它们的组合。

除含有小肽以外，所得的蛋白胨溶液还可包含脂肪、金属、盐、维生素和许多其它生物化合物。

根据一个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括容器，该容器包含通过全长蛋白的酶促水解制备的蛋白质水解产物，用于使水解产物发泡的装置和任选地除经受酶促水解的全长蛋白之外的全长蛋白。

根据另一个方面，本发明提供了一种用于制备药物泡沫组合物的方法，该方法包括以下步骤：用气体使蛋白质水解产物的溶液发泡，蛋白质水解产物的该溶液通过在水溶液中酶促水解全长蛋白来制备，其中所述溶液不含所述全长蛋白。

然而，根据另一个方面，本发明提供了一种用于制备药物泡沫组合物的方法，该方法包括：在水溶液中酶促水解全长蛋白，直至所述溶液不含所述全长蛋白，从而获得蛋白胨或蛋白质水解产物的溶液；以及用气体使所述蛋白胨或蛋白质水解产物的所述溶液发泡。

在另一个方面，本发明提供了一种药物泡沫组合物，所述药物泡沫组合物根据本发明的方法获得。

根据本发明的一个方面，提供了一种通过全长蛋白的水解制备的基于蛋白胨的泡沫，其中该泡沫不含经受水解的全长蛋白。

术语“基于蛋白胨的泡沫”意指大部分泡沫(多于一半的泡沫总重量)由蛋白胨构成。

其它组分诸如纤维蛋白原、血纤蛋白、凝血酶等也可存在于泡沫中，例如，可存在除经受水解的全长蛋白之外的蛋白质。例如，该泡沫可包含总溶解组分中的1％至100％的蛋白胨。

除经受水解的全长蛋白之外的蛋白质可在多至或等于49％的浓度下存在于泡沫中，同时剩余的组分由蛋白胨组成。

如本文所用，术语“全长”蛋白是指水解/消化之前的蛋白质。

在一些实施方案中，用于制备泡沫的空气与液体的比率在1:3至3:1的空气:液体的范围内。在一些优选的实施方案中，空气与液体的比率在约2:1至约3:1的空气:液体的范围内。

蛋白质分子通常非常大，并且由数百至数千个氨基酸单元组成。蛋白质包括天然存在的蛋白质或它们的片段和/或合成蛋白。

该泡沫可以是干燥的或非干燥的。干燥泡沫可通过减少水的浓度，例如通过空气干燥、真空干燥或冷冻干燥获得。

术语“干燥泡沫”是指包含基于泡沫组合物的总重量等于或小于3重量％的液体含量(w/w)的泡沫。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于促进凝血；密封；防止和/或减少粘连；和/或伤口愈合的方法，该方法包括施加根据本发明的药物泡沫组合物。

涉及本文所述的蛋白胨的以上和以下的所有方面和实施方案在适用的情况下还旨在涉及“肽水解产物”或“酶促水解蛋白质”。

附图说明

本发明的一些实施方案在本文中参考附图进行描述。说明书连同附图使本领域的普通技术人员显而易见地知道如何实践本发明的一些实施方案。附图用于例示性讨论的目的，而非试图显示比基本理解本发明所需的更详细的实施方案结构细节。为清楚起见，附图中描绘的一些物体未按比例绘制。

在附图中：

图1为条形图，该条形图示出了由全长明胶和全长牛血清白蛋白(bsa)或由通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫的拉伸强度；

图2为条形图，该条形图示出了由全长bsa、酪蛋白或明胶以及由通过全长酪蛋白或明胶的酶促水解或酸水解获得的蛋白胨制备的泡沫的拉伸强度；

图3为条形图，该条形图示出了蛋白胨浓度对于通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨的拉伸强度的影响；

图4为条形图，该条形图示出了bac2浓度对于通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨的拉伸强度的影响；

图5为条形图，该条形图示出了在纤维蛋白原的存在和不存在下由全长明胶以及由衍生自全长明胶的酶促水解的蛋白胨制备的泡沫的拉伸强度；

图6为点图，该点图示出了与由全长白蛋白制备的泡沫相比由通过全长明胶或酪蛋白的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫的组织粘连强度；

图7为点图，该点图示出了与由全长白蛋白制备的泡沫相比由通过全长明胶或酪蛋白的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫的刚度；

图8示出了由全长明胶制备的泡沫(8a)和由通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫(8b)的扫描电子显微图；

图9示出了蛋白胨肽大小对于由全长明胶制备的泡沫、由衍生自全长明胶的酶促水解的蛋白胨制备的泡沫以及由衍生自全长明胶的酶促水解的具有小于约10kda的肽的蛋白胨制备的泡沫的拉伸强度的影响；并且

图10示出了将通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨与全长明胶混合对于泡沫的拉伸强度的影响。

具体实施方式

在其一些实施方案中，本发明涉及一种包含通过蛋白质的酶促水解制备的蛋白胨的药物泡沫组合物。

本文教导的原理、用途和具体实施可参考所附说明书得到更好理解。在精读说明书后，本领域技术人员能够实施本发明而无需过度努力或实验。

在详细说明至少一个实施方案之前，应当理解本发明不一定在其应用中限制于下述说明书中所示的组分和/或方法的构建和排列的细节。本发明能够具有其它实施方案，或能够以各种方式实践或实施。

本文采用的措辞和术语用于描述性目的且不应视为限制性的。

如以下呈现的实施例中所示，令人意外地发现，与由全长蛋白制备的泡沫相比，需要更大的力来压缩由蛋白胨获得的泡沫。

此外，出乎意料地，显示仅由酶促水解并且不由酸水解获得的蛋白胨产生耐用的泡沫。

在离体实验中，还示出了，与由全长蛋白获得的泡沫相比，由蛋白胨获得的泡沫具有增加的粘合剂特征。

还令人意外地发现，不需要交联剂的存在即可从蛋白胨获得坚固的泡沫，但是可任选地添加交联剂。

还令人意外地，发现包含等于或小于10kda的肽的蛋白胨比全长蛋白提供更坚固的泡沫。

实施例

材料和方法

材料

bsa(sigma，cat#a7030)

来自猪皮的明胶(sigma，cat#g1890)

通过明胶的酶促水解获得的蛋白胨(sigma，cat#70951)

酪蛋白(sigma，cat#c3400)

通过酪蛋白的酶促水解获得的蛋白胨(sigma，cat#70172)

通过酪蛋白的酸水解获得的蛋白胨(sigma，cat#70171)

的bac2组分，cat#3901、3902、3905，ethicon)

凝血酶(的凝血酶组分，cat#3901、3902、3905，ethicon)

用于制备和稀释溶液的水为去离子水。

使用lloydlfplus装置，用10mm平底模板或instron执行压缩测试。

实施例1：由蛋白胨和由全长bsa和明胶制备的泡沫的拉伸强度。

测量压缩以下泡沫中的每一种所需的力：

1.包含全长明胶、纤维蛋白原来源(bac2)和凝血酶的泡沫；

2.包含bsa、纤维蛋白原来源(bac2)和凝血酶的泡沫；

3.包含通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨、纤维蛋白原来源(bac2)和凝血酶的泡沫；以及

4.包含纤维蛋白原来源(bac2)和凝血酶的对照泡沫。

制备全长明胶、全长bsa和通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨中的每一种的5％w/v水溶液(泡沫编号1-3，从左到右)。向5ml的每种溶液添加500μl的浓bac2溶液，以提供包含总计约35mg纤维蛋白原的10％bac2的最终浓度。对于对照泡沫(编号4)，将5ml水添加到500μl的浓bac2溶液。

通过使用与2cmtyvec管材(～2mm直径)互连的两个注射器使溶液发泡。将如上制备的溶液抽取到第一注射器中，并且将10ml的空气抽取到第二注射器中。将溶液在第一注射器和第二注射器之间来回排出，从而将溶液与空气混合。

在制备的最后一步，通过将凝血酶溶液添加到第一注射器并且将泡沫再次来回排出来将200μl体积的40mmcacl2中的20iu凝血酶添加到泡沫。将制备的泡沫排出到24组织培养板的孔中，达到边缘高度。使泡沫在室温下静置一小时。然后使用10mm²模板、在5mm/min的速率下按压总计12mm的长度来评估压缩所需的力，一式三份进行。记录并分析结果。

如图1中所见，令人意外地发现，由通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫需要最高的力来压缩泡沫。如通过对照样品(水)所示，单独压缩bac2所需的力可忽略不计。此外，示出了压缩球状蛋白全长bsa(66.5kda)所需的力比压缩明胶所需的力小。

实施例2：由选定的全长蛋白的酶促水解或酸水解获得的蛋白胨制备的泡沫的拉伸强度。

为了研究由全长蛋白获得蛋白胨的不同水解机制对于压缩力的影响，测量压缩由通过酪蛋白的酶促水解或酸水解获得的蛋白胨的水溶液制备的泡沫所需的力。为了进一步进行比较，还测量压缩由全长明胶、bsa和酪蛋白获得的泡沫所需的力。

制备以下中的每一种的5％w/v水溶液：全长明胶、bsa和酪蛋白；通过酪蛋白的酶促水解或酸水解获得的蛋白胨；以及通过明胶的酶促水解获得的蛋白胨。在两个50ml注射器中制备泡沫。将第一注射器负载有20ml的5％蛋白质溶液和2mlbac2。在第二注射器中负载40ml空气。在通过将空气剧烈混合到液体中来进行发泡后，将制备的材料在20mm的高度下排出到具有60mm直径的杯中。

在0.5mm/sec下针对4mm的深度评估压缩所需的力。一式三份地测试由全长明胶和蛋白胨制备的泡沫，一式两份地测试由全长bsa和酪蛋白制备的泡沫。

结果呈现在图2中。

如图2中所示，压缩由通过酪蛋白或明胶的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫所需的力显著高于压缩由相应的全长蛋白制备的泡沫所需的力，从而指示链长和所需的压缩力之间的反向相关性。相比之下，发现由通过酪蛋白的酸水解获得的蛋白胨制备的泡沫比由全长酪蛋白制备的泡沫在压缩时更不稳定。还注意到，在由从明胶和从酪蛋白获得的蛋白胨制备的泡沫的情况下观察到非常相似的结果。

实施例3：蛋白胨浓度对于泡沫的拉伸强度的影响。

通过将50g蛋白胨粉末溶解在100ml水中来制备通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨的50％w/v水溶液。将溶液用水稀释以获得1％、5％、10％和25％的蛋白胨水溶液。

如实施例1所述使5ml的每种溶液发泡。

在制备的最后一步，将200μl的在40mmcacl2中的100iu/ml凝血酶溶液添加到泡沫，并且制备最终泡沫并且一式四份地测试压缩所需的力，基本上如以上实施例1所述，不同的是执行在5mm/sec下按压至4mm的深度(而非12mm)。结果呈现在图3中。

结果示出，对于包含在水中1％至25％之间的浓度的蛋白胨w/v的泡沫，压缩所需的力与蛋白胨浓度成正比。等于或大于50％w/v的蛋白胨浓度导致降低的泡沫品质，如压缩所需的力降低所反映的。

实施例4：bac2浓度对于泡沫的拉伸强度的影响。

制备通过明胶的酶促水解获得的蛋白胨的5％水溶液。

制备四个样品，每个样品包含5ml蛋白胨溶液。如实施例1所述使每个样品发泡。

在制备的最后一步，添加在1％、5％、10％或30％w/v下的bac2，其中每个百分比的bac2包含约7mg纤维蛋白原。制备并一式四份地测试最终泡沫，如实施例3所述。结果呈现在图4中。

结果示出，对于包含1％至30％之间的浓度的bac2的泡沫，压缩所需的力与蛋白胨浓度成正比。

实施例5：在纤维蛋白原的存在和不存在下由蛋白胨和由明胶制备的泡沫的拉伸强度。

为了测试对于蛋白质交联剂的需求，测量在纤维蛋白原(由bac2提供)的存在和不存在下由全长明胶和通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨中的每个的5％w/v水溶液制备的泡沫的拉伸强度。结果呈现在图5中。

基本上如实施例1所述制备泡沫，不同的是制备包含约35mg纤维蛋白原和20iu凝血酶的泡沫以及缺乏bac2的泡沫。测试三份样品。

如图5中所示，在由bac2提供的纤维蛋白原的存在和不存在下均观察到与由全长明胶制备的那些泡沫相比，压缩由通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫所需的力增加。

还测试了另选的交联剂4臂peg的用途。然而，与4臂peg交联的泡沫显示泡沫分解，因此可不对其进行评估。

实施例6：组织粘连。

如下制备水溶液：

5％w/v全长白蛋白+30mg/ml浓bac2+2iu/ml凝血酶(1:3比率的液体:空气)；

通过明胶的酶促水解获得的5％w/v蛋白胨+30mg/ml浓bac2+3iu/ml凝血酶(1:3比率的液体:空气)；以及

通过酪蛋白的酶促水解获得的5％w/v蛋白胨+30mg/ml浓bac2+10iu/ml凝血酶(1:3比率的液体:空气)。

从5ml的每种溶液制备泡沫，基本上如实施例1以上所述，不同的是添加到每种泡沫的bac2的量是相同的，并且调整凝血酶的量以实现相当的纤维蛋白原聚合速率。

对每种制剂测试五个复制品。每种泡沫制剂的液体:空气比率为1:3，从而提供均匀的泡沫，没有大的气穴或气泡。

使用astmf2258(拉伸时组织粘连的强度特性的标准测试方法)测试泡沫对组织的粘连。将作为组织基底的新鲜收获的猪胸膜安装在1英寸x1英寸的板上，该板固定到(具有10n测力传感器的拉伸测试仪模型5565)的测力传感器和底部夹以用于拉伸强度测量。降低十字头和测力传感器以确保两个组织表面对齐。针对每个样品维持组织表面之间的3mm间隙。

在表达泡沫之前，将十字头远离底部移动。在即将测试之前制备每种制剂，并且将大约3ml的制剂排出在每个组织的组织表面上。在将顶部板返回到初始间隙高度之后，立即将过量材料从固定装置的周边擦去。在测试之前，允许15分钟的时间段以用于泡沫的完全聚合。将十字头在5mm/min下沿竖直方向移动，直至测试停止。通过控制软件记录每个样品的负载-延伸输出。记录每个样品的峰值粘连力、刚度和失效模式。组织粘连结果呈现在图6中。刚度(材料强度)结果呈现在图7中。

如图6和图7中所见，与完整白蛋白相比，由明胶蛋白胨或酪蛋白蛋白胨制备的泡沫具有更大的组织粘连。由酪蛋白蛋白胨制备的泡沫具有最高的最大粘连和刚度。平均最大粘连分数如下：完整白蛋白0.97n；明胶蛋白胨1.19n；以及酪蛋白蛋白胨1.58n。

对于所有制剂，失效模式是粘连性的，即失效发生在组织:泡沫界面处，并且不是内聚的，即失效不发生在测试制品内。

实施例7：扫描电子显微镜(sem)研究。

在添加bac2和凝血酶的情况下由5％w/v全长明胶和通过全长明胶的酶促水解获得的5％w/v蛋白胨的水溶液制备泡沫，如实施例1以上所述。

图8a和图8b示出了由全长明胶制备的泡沫(8a)和由通过明胶的酶促水解获得的蛋白胨制备的泡沫(8b)的电子显微图。

如图8a和图8b中所见，由蛋白胨制备的泡沫比由全长蛋白制备的泡沫具有更高的密度和更小的气穴。预期由明胶制备的泡沫将由于大气泡结构而较不稳定，而从蛋白胨获得的泡沫将更稳定且更具刚性。假设差异可能是由于全长蛋白的更大的疏水性产生的。

实施例8：肽大小对于拉伸强度的影响。

为了研究肽大小对于拉伸强度的影响，制备5％w/v全长明胶的水溶液和通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨的5％w/v的水溶液。

将包含肽的10ml溶液经受在离心过滤装置(sigma，z706345)中通过amicon超离心过滤器，具有10kda截留离心过滤器的ultra-15进行的离心。将装置在室温下经受3500g离心力，持续10分钟，从而确保过滤的溶液仅包含具有小于10kda的长度的肽。

在具有和不具有过滤离心的情况下，由5ml的全长明胶溶液和包含蛋白胨的溶液中的每种制备泡沫，如实施例1所述。一式四份地测试压缩泡沫所需的力，如实施例1所述。结果呈现在图9中。

如图9中所示，由仅包含长度小于10kda的肽的蛋白胨溶液制备的泡沫需要更大的压缩力。

将全长蛋白与酶促水解的肽混合降低所需的压缩力。有趣的是，这些混合物产生与全长的均匀溶液或酶促水解的溶液相比更低的压缩力。

实施例9：将蛋白胨与全长蛋白混合对于拉伸强度的影响。

制备全长明胶的5％水溶液和通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨的5％水溶液。

还制备包含40:60和95:5的明胶:蛋白胨比率的全长明胶和蛋白胨的混合物的样品。

由5ml的仅全长明胶、蛋白胨和在两种比率中的每一种下的明胶:蛋白胨混合物中的每一种制备泡沫，如实施例1所述。一式四份地测试压缩每种泡沫所需的力，如实施例1所述。结果呈现在图10中。

如图10中所见，由包含全长明胶与通过全长明胶的酶促水解获得的蛋白胨的混合物的溶液制备的泡沫比单独包含全长明胶或蛋白胨的泡沫需要更小的压缩力。

应理解，为清晰起见，在独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可在单个实施方案中组合提供。相反地，为简明起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种结构也可单独地或以任何合适的子组合形式提供，或如其所适当地提供于本发明的任何其它所述实施例中。在各种实施方案的上下文中所述的某些特征不应视为那些实施方案的基本特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。

尽管本发明已结合其具体实施方案进行了描述，但显然许多替代、修改和变型对于本领域中那些技术人员而言是显而易见的。因此，本发明旨在涵盖落在所附权利要求书范围内的所有此类替代、修改和变型。

本申请中的任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。