用于联合治疗的WT1靶向DNA疫苗的制作方法
本发明涉及一种用于治疗癌症的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码肾母细胞瘤蛋白(wilms’tumorprotein，wt1)的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，其中所述治疗还包含施用至少一种检查点抑制剂，特别是选自至少一种抗pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、ox-40、gitr、tim-3和lag-3的抗体。本发明还涉及一种药物组合物，其包括一种用于治疗癌症的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码wt1的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，其中所述治疗还包含施用至少一种检查点抑制剂，特别是选自至少一种抗pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、ox-40、gitr、tim-3和lag-3的抗体。
背景技术：
肾母细胞瘤基因1(wt1)编码参与细胞增殖和分化的锌指转录因子。它在很多种恶性肿瘤中高度表达，包括几种类型的血液恶性肿瘤和各种实体瘤。相反地，wt1在成人中的正常组织表达限于生殖腺、子宫、肾、间皮和各种类型的组织中的cd34+祖细胞。wt1最初被提出作为肿瘤抑制基因。然而，最近的证据指向该转录因子的致癌功能；wt-1对分化有负面影响并促进祖细胞的增殖。此外，过表达的wt1是免疫原性的；在癌症患者中已经观察到wt1特异性t细胞以及igg抗wt1抗体。因此，wt-1是开发癌症疫苗的有希望的候选者。
已经报道了基于hla(人白细胞抗原)限制性wt1肽片段的wt1疫苗的人体临床试验。osada等人,clincancerres2009；15:2789-2796公开了编码wt1的腺病毒疫苗。
wo2014/173542公开了一种用于癌症免疫治疗的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含编码wt1的重组dna分子。编码wt1的沙门氏菌减毒株在用鼠白血病细胞攻击的小鼠模型中显示出抗肿瘤活性。因此，编码wt1的沙门氏菌减毒株作为用于治疗这些适应症的癌症疫苗具有巨大潜力。
wo2013/09189公开了一种用于使伤寒沙门氏菌减毒突变株生长的方法，所述伤寒沙门氏菌减毒突变株缺乏半乳糖差向异构酶活性并携带重组dna分子。
肿瘤可以是免疫原性的这一发现，致使开发了许多这样的癌症免疫疗法，该癌症免疫疗法被设计成使用免疫系统来选择性地消除恶性细胞，同时保留正常组织。然而，仅接种抗肿瘤抗原的疫苗所带来的存活益处仍然不大。抗癌疫苗面临诸多挑战，其中之一是免疫抑制微环境。肿瘤脉管系统异常产生了低氧微环境，使炎性细胞趋向免疫抑制。此外，肿瘤通过分泌生长因子和细胞因子来系统地改变免疫细胞的增殖、分化和功能。
为了治愈癌症，彻底根除癌症干细胞是至关重要的。人类肿瘤的多种免疫逃避机制仍然是癌症免疫治疗中的主要挑战。因此，非常需要改善的癌症治疗方法，但迄今为止尚未得到满足。
发明目的
鉴于现有技术，本发明的目的在于提供新型癌症疗法。这种新型疗法将为改善癌症患者的治疗选择提供主要优势。
技术实现要素：
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗癌症的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码肾母细胞瘤蛋白(wt1)的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，其中所述治疗还包含施用至少一种检查点抑制剂。
令人惊讶地发现，编码wt1的沙门氏菌减毒菌株和至少一种检查点抑制剂的联合治疗显示出强烈且持续的抗肿瘤作用。令人惊讶的是，我们观察到，编码wt1的沙门氏菌减毒菌株与检查点抑制剂抗-pd-l1或抗-ctla-4的联合施用对整体存活率具有协同作用。
不希望囿于理论的，vxm06被认为能够产生wt-1特异性效应t细胞，其可能被肿瘤微环境灭活。检查点抑制剂单克隆抗体分别靶向免疫细胞或肿瘤细胞上的结构，因此据报道可抵抗或预防t细胞抑制作用。
在具体的实施方案中，所述至少一种检查点抑制剂选自至少一种抗pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、ox-40、gitr、tim-3和lag-3的抗体。
在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株是肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)菌种。特别是，所述沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌ty21a。
在具体实施方案中，表达盒是真核表达盒。特别是，所述表达盒包含cmv启动子。
在具体的实施方案中，wt1选自由以下组成的组：具有如seqidno4所示氨基酸序列的人wt1以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。特别是，wt1被截短，更特别是，wt1的锌指结构域被删除。在具体的这种实施方案中，wt1选自由以下组成的组：具有如seqidno1所示氨基酸序列的wt1以及与其具有至少80％序列一致性的蛋白。
在具体的实施方案中，所述dna分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pmb1ori和cmv启动子。特别是，所述dna分子包含如seqidno2所示的dna序列。
在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株与所述至少一种检查点抑制剂同时施用、在所述至少一种检查点抑制剂之前施用或在所述至少一种检查点抑制剂之后施用。
在具体实施方案中，所述治疗伴随化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法，特别是其中所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗周期或生物癌症疗法之前、期间或之后施用，或者，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗周期或生物癌症疗法之前和期间施用。
在具体实施方案中，生物癌症疗法包括施用一种或多种另外的沙门氏菌减毒株，所述另外的沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的表达盒的dna分子的至少一个拷贝。在具体的这种实施方案中，所述一种或多种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌ty21a。特别是，所述肿瘤抗原选自由间皮素(msln)、cea、cmvpp65组成的组，优选地，所述肿瘤抗原选自组(a)间皮素(msln),特别是具有如seqidno5所示氨基酸序列的msln及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，(b)cea，特别是具有如seqidno6所示氨基酸序列的cea及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，和(c)cmvpp65，特别是具有如seqidno7所示氨基酸序列的cmvpp65及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，具有如seqidno8所示氨基酸序列的cmvpp65及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白和具有如seqidno9所示氨基酸序列的cmvpp65及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。特别是，所述肿瘤基质抗原选自由以下组成的组：vegf受体蛋白和人成纤维细胞活化蛋白(fap)，其中优选地，所述vegf受体蛋白是vegfr-2，更优选是人vegfr-2，甚至更优选是具有如seqidno10中所示氨基酸序列的人vegfr-2或与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质。
在具体实施方案中，口服施用减毒的沙门氏菌菌株。
在具体实施方案中，癌症选自白血病，特别是选自急性髓性白血病(aml)和急性淋巴性白血病(all)，选自多发性骨髓瘤，和选自实体瘤，特别是选自肺癌、乳腺癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和前列腺癌。
在具体的实施方案中，单剂量的沙门氏菌减毒株包含约105至约1011，特别是约106至约1010，更特别是约106至约109，更特别是约106至约108，最特别是约106至约107个菌落形成单位(cfu)。
在具体的实施方案中，所述治疗是个体化的癌症免疫疗法，其包括以下步骤：评估患者中的wt1表达和/或针对wt1的免疫前应答。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括一种用于治疗癌症的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码wt1的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，其中所述治疗还包含施用至少一种检查点抑制剂。优选地，所述至少一种检查点抑制剂选自至少一种抗pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、ox-40、gitr、tim-3和lag-3的抗体。
在具体实施方案中，沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌ty21a，表达盒是真核表达盒，并且wt1选自由以下组成的组：具有如seqidno1所示氨基酸序列的人wt1以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。
特别是，真核表达盒包含cmv启动子。特别是，人wt1具有如seqidno1所示的氨基酸序列。
具体实施方式
通过参考本发明的以下详细描述和其中所包括的实施例，可以更容易地理解本发明。
在一个方面，本发明涉及一种用于治疗癌症的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码肾母细胞瘤蛋白(wt1)的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，其中所述治疗还包含施用至少一种检查点抑制剂。
锌指转录因子肾母细胞瘤蛋白1由wt1基因编码。其在c-末端含有四个锌指基序，在n-末端含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的dna-结合结构域。由在两个编码外显子处的选择性剪接而产生的多个转录变异体已被很好地表征。wt1在泌尿生殖系统的发育中起着重要作用，并参与细胞增殖和分化。wt1基因作为引起儿童肾肿瘤—肾母细胞肿瘤的基因被分离。它在很多种恶性肿瘤中高度表达，包括几种类型的血液恶性肿瘤和各种实体瘤。相反地，wt1在成人中的正常组织表达限于生殖腺、子宫、肾、间皮和各种类型的组织中的祖细胞。由于其表达谱、致瘤功能和免疫原性，肿瘤抗原wt1是癌症疫苗开发的有前景的候选者。
根据本发明，所述沙门氏菌减毒株作为含有编码wt1的表达盒的重组dna分子的细菌载体起作用，用于将所述重组dna分子递送到靶细胞中。含有编码异源抗原，如wt1——一种肿瘤抗原——的dna分子的递送载体被称为dna疫苗。
在本发明的背景中，术语“疫苗”是指在施用时能够诱导受试者免疫应答的试剂。优选地，疫苗可以预防、改善或治疗疾病。
本发明的减毒活沙门氏菌菌株稳定地携带编码wt1的重组dna分子。它可以用作口服递送这种重组dna分子的载体。
遗传免疫可能比常规疫苗接种有利。靶dna可以在相当长的一段时间内被检测到，从而充当抗原的储库。一些质粒中的序列基序，如gpc岛，是免疫刺激性的，可以作为被lps和其他细菌成分所产生的免疫刺激所促进的佐剂。
与仅能介导针对wt1蛋白的小片段的免疫力的肽疫苗相反，基因疫苗接种可导致针对所编码的wt1蛋白的全长上存在的多种表位的免疫。
除此之外，由于肽的hla限制，即它们对抗原呈递细胞(apc)的hla分子的结合能力，wt1肽疫苗(其在大多数情况下已用于临床试验)具有有限的应用。相反，本发明的dna疫苗不受hla限制。此外，尽管对wt-1具有阳性，但编码的肽片段可能不存在于患者的肿瘤中。由于vxm06编码全长蛋白wt-1(除了wt1的锌指结构域)，因此呈递给免疫系统的肽片段由患者产生。
减毒活沙门氏菌载体在原位产生它们自己的免疫调节因子如脂多糖(lps)，这可能与其他形式的施用(例如微胶囊化)相比构成优势。此外，根据本发明的粘膜疫苗具有淋巴内作用模式，这被证明是有益的。摄入本发明的减毒疫苗后，肠道派伊尔结中的巨噬细胞和其他细胞被修饰的细菌侵入。细菌被这些吞噬细胞摄取。由于它们的减毒突变，伤寒沙门氏菌ty21菌株细菌不能保持在这些吞噬细胞中，而是在这个时间点死亡。重组dna分子被释放，并随后通过特定的运输系统或通过内体泄露(endosomalleakage)转移到免疫吞噬细胞的胞质溶胶中。最后，重组dna分子进入细胞核，在细胞核内转录，导致wt1在吞噬细胞的胞质溶胶中大量表达。被感染的细胞经历细胞凋亡，装载wt1抗原，并被肠道免疫系统摄取和加工。细菌感染的危险信号在此过程中充当强力佐剂，导致在全身和粘膜隔室水平上产生强烈的靶抗原特异性cd8+t细胞和抗体应答。免疫应答在接种后十天左右达到峰值。抗载体应答的缺乏使得随相同疫苗的多次使用而效果增强。
在本发明的背景中，术语“减毒的”是指与不具有减毒突变的亲本细菌菌株相比毒性降低的细菌菌株。优选地，减毒细菌菌株丧失了其毒力，但保留了其诱导保护性免疫的能力。减毒可以通过各种基因包括毒力、调控和代谢基因的缺失来完成。减毒细菌可以天然存在，或者可以在实验室中人工生产，例如通过使其适应新的培养基或细胞培养物，或者它们可以通过重组dna技术生产。施用约1011cfu的本发明的沙门氏菌减毒株在优选地小于5％，更优选小于1％，最优选小于1‰受试者中引起沙门氏菌病。
在本发明的背景中，术语“包含”是指“包括但不限于”。该术语旨在是开放式的，旨在具体说明任意陈述的特征、元件、整体、步骤或组分的存在，但并不排除一种或多种其他特征、元件、整体、步骤、组分或其组的存在或添加。因此，术语“包含”包括更限制性的术语“由……组成”和“基本上由……组成”。在一个实施方案中，贯穿本申请、特别是在权利要求书中使用的术语“包含”可以被术语“由……组成”代替。
含有编码wt1的表达盒的dna分子合适地是重组dna分子，即工程化的dna构建体，优选由不同来源的dna片段组成。dna分子可以是线性核酸，或者优选地，是通过将编码wt1的开放阅读框引入表达载体质粒而产生的环状dna质粒。
在本发明的背景中，术语“表达盒”是指包含至少一个开放阅读框(orf)的核酸单位，所述开放阅读框在控制其表达的调节序列的控制下。优选地，表达盒可以介导靶细胞中所包括的编码肿瘤抗原(如wt1)的开放阅读框的转录。表达盒通常包含启动子、至少一个开放阅读框和转录终止信号。
在具体的实施方案中，所述至少一种检查点抑制剂选自至少一种抗pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、ox-40、gitr、tim-3和lag-3的抗体。优选地，所述至少一种检查点抑制剂是至少一种抗pd-1、pd-l1或ctla-4的抗体，或其组合，更优选地，所述至少一种检查点抑制剂是至少一种抗pd-l1或ctla-4的抗体，或其组合。
免疫系统的一个重要部分是它能够辨别体内的正常细胞和它看作是“外来”的细胞。这使得免疫系统攻击外来细胞，同时保留正常细胞。为此，它使用“检查点”——某些免疫细胞上的分子，其需要被激活(或失活)才能开始免疫反应。
癌细胞有时会找到使用这些检查点以避免被免疫系统攻击的方法。但靶向这些检查点的药物作为癌症治疗方法拥有很好的前景。例如，pd-1是称为t细胞的免疫细胞上的检查点蛋白。它通常作为一种“关闭开关”，有助于防止t细胞攻击体内的其他细胞。当它附着在pd-l1上时就会发生这种情况，pd-l1是一些正常(和癌症)细胞上的蛋白质。当pd-1与pd-l1结合时，它基本上是命令t细胞离开另一个细胞。一些癌细胞含有大量的pd-l1，这有助于它们逃避免疫攻击。
靶向pd-1或pd-l1的单克隆抗体已被证明是治疗某些癌症的有希望的候选者。令人惊讶的是，发现这些检查点抑制剂可以增强针对表达wt-1的癌细胞的免疫应答(其是由编码wt1的沙门氏菌减毒株介导的)。
在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株是肠道沙门氏菌菌种。肠道沙门氏菌的减毒衍生物是将外源抗原递送至哺乳动物免疫系统的有吸引力的载体，因为肠道沙门氏菌菌株可能通过免疫的粘膜途径(即经口或经鼻)递送，与肠胃外施用相比，提供了简单和安全的优点。此外，沙门氏菌菌株在全身和粘膜隔室水平上，均引起强烈的体液和细胞免疫应答。批量制备的成本低，并且活菌疫苗制剂非常稳定。减毒可以通过各种基因包括毒力、调控和代谢基因的缺失来完成。
已显示，几种通过aro突变而减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株是动物模型中递送外源抗原安全有效的递送载体。
在具体的实施方案中，所述沙门氏菌减毒株和所述至少一种另外的沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌ty21a。减毒活伤寒沙门氏菌ty21a菌株是
这种耐受性良好的、活体口服抗伤寒热疫苗是通过对野生型毒性细菌分离株伤寒沙门氏菌ty2的化学诱变衍生的，并且含有gale基因功能缺失性突变，导致其不能代谢半乳糖。减毒细菌菌株也不能将硫酸盐还原成硫化物，从而将其与野生型伤寒沙门氏菌ty2菌株区分开来。关于其血清学特性，伤寒沙门氏菌ty21a菌株含有o9-抗原(一种细菌外膜多糖)，并且缺乏o5-抗原，这相应地是鼠伤寒沙门氏菌的特征组分。该血清学特征支持将相应的测试包括在一组对批量释放的识别测试中的基本原理。
在具体实施方案中，表达盒是真核表达盒。特别是，所述表达盒包含cmv启动子。在本发明的背景中，术语“真核表达盒”是指允许在真核细胞中表达开放阅读框的表达盒。已显示，诱导适当的免疫应答所需的外源抗原的量对细菌可能是有毒性的，并可能导致细胞死亡、过度减毒或外源抗原表达缺失。使用在细菌载体中不表达而仅在靶细胞中表达的真核表达盒可以克服这一毒性问题，并且所表达的蛋白通常呈现出真核糖基化模式。
真核表达盒包含能够控制开放阅读框在真核细胞中表达的调控序列，优选为启动子和聚腺苷酸化信号。本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组dna分子所包括的启动子和聚腺苷酸化信号优选被选择为在待免疫的受试者的细胞内起作用。合适的启动子，特别是用于生产人类dna疫苗的实例包括但不限于来自巨细胞病毒(cmv)的启动子，如强cmv立即早期启动子；猿猴病毒40(sv40)；小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)；人类免疫缺陷病毒(hiv)，如hiv长末端重复(ltr)启动子；莫洛尼病毒；爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)；以及来自劳氏肉瘤病毒(rsv)；由cmv早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及兔β珠蛋白基因的剪接受体组成的合成cag启动子；以及来自人类基因如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人类金属硫蛋白的启动子。在一个具体的实施方案中，所述真核表达盒含有cmv启动子。在本发明的背景中，术语“cmv启动子”是指强立即早期巨细胞病毒启动子。
合适的聚腺苷酸化信号，特别是用于生产人类dna疫苗的实例包括但不限于牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化位点、sv40聚腺苷酸化信号和ltr聚腺苷酸化信号。在一个具体的实施方案中，本发明沙门氏菌减毒株所包含的重组dna分子所包括的真核表达盒包含bgh聚腺苷酸化位点。
除了表达wt1所需的调控元件，如启动子和聚腺苷酸化信号之外，重组dna分子中还可包含其他元件。这种其他元件包括增强子。增强子可以是例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子和病毒增强子如来自cmv、rsv和ebv的增强子。
调控序列和密码子通常是物种依赖的，因此为了使蛋白生产最大化，调控序列和密码子优选被选择为在待免疫的物种中有效。本领域技术人员可以生产在给定受试物种中起作用的重组dna分子。
在具体的实施方案中，wt1选自由以下组成的组：具有如seqidno4所示氨基酸序列的人wt1以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。特别是，wt1被截短，更特别是，wt1的锌指结构域被删除。在具体的这种实施方案中，wt1选自由以下组成的组：具有如seqidno1所示氨基酸序列的wt1以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。特别是，wt1具有如seqidno1所示的氨基酸序列。
wt1的c端的锌指结构域包含四个锌指基元。氨基酸序列如seqidno1所示的截短的wt1代表蛋白质分析数据库(uniprot)编号p19544-7的74至444位氨基酸。锌指结构域的缺失使与含转录因子的其他锌指的免疫交叉反应风险降至最低。此外，缺少锌指结构域的截短的wt1具有比全长wt1更强的免疫原性。另外，对dna结合所必需的锌指基元的缺失消除了wt1的致癌潜力，从而将致癌的风险降至最低。
在这一背景下，术语“约”或“近”是在给定值或范围的80％至120％以内，或者90％至110％以内，包括95％至105％以内。
在本发明的背景中，术语“与给定蛋白质具有至少约80％序列一致性的蛋白质”(例如，具有如seqidno1或seqidno4中所示氨基酸序列的人wt1)是指在所述参考蛋白(例如，具有seqidno1或seqidno4的氨基酸序列的人wt1)的氨基酸序列和/或编码氨基酸序列的核酸序列中可以不同。所述蛋白可以是天然来源的，例如野生型蛋白的突变形式，例如野生型wt1的突变形式，或不同物种的同源物，或工程化的蛋白，例如工程化的wt1。已知密码子的使用在物种之间是不同的。因此，当在靶细胞中表达外源蛋白时，使核酸序列适应靶细胞的密码子使用可能是必要的或至少是有帮助的。用于设计和构建给定蛋白的衍生物的方法是本领域任一普通技术人员所熟知的。
与参照蛋白(例如，分别具有seqidno1或seqidno4的氨基酸序列的wt1)相比，与给定蛋白质(例如，具有如seqidno1或seqidno4中所示氨基酸序列的人wt1)具有至少约80％序列一致性的蛋白质可以含有一个或多个突变，其包含一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代。根据本发明的教导，所述缺失、添加和/或取代的氨基酸可以是连续的氨基酸，或者可以散布在与参照蛋白(例如分别具有如seqidno1或seqidno4中所示氨基酸序列的人wt1)具有至少约80％序列一致性的蛋白的氨基酸序列的长度上。根据本发明的教导，只要与参照蛋白的氨基酸序列一致性至少约80％并且突变的蛋白是免疫原性的，则可以添加、缺失和/或取代任意数目的氨基酸。优选地，通过elisa测量，与参照蛋白(例如，具有分别如seqidno1或seqidno4中所示氨基酸序列的wt1)相比，与给定的参照蛋白(例如，具有如seqidno1或seqidno4中所示氨基酸序列的人wt1)具有至少约80％序列一致性的蛋白的免疫原性减少了小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％。用于设计和构建蛋白同源物和用于测试这些同源物的免疫原性潜力的方法是本领域普通任一技术人员所熟知的。在具体的实施方案中，与参照蛋白(例如，具有seqidno1或seqidno4的氨基酸序列的人wt1)的序列一致性为至少约80％，至少约85％，至少约90％或最特别是至少约95％。用于测定序列一致性的方法和算法，包括亲本蛋白与其衍生物(所述衍生物相对于亲本序列具有缺失、添加和/或取代)的比较，是本领域普通技术人员公知的。在dna水平上，由于遗传密码的简并性，编码与给定参照蛋白(例如具有如seqidno1或seqidno4中所示氨基酸序列的人wt1)具有至少约80％序列一致性的蛋白的核酸序列可能在很大程度上不同。
在本发明的背景中，术语“截短的wt1”是指具有一个氨基酸或一个以上连续氨基酸每个的一个或多个缺失的wt1。根据本发明的教导，可以删除任意数量的氨基酸，只要突变的蛋白质是免疫原性的。优选地，如通过elisa测量，与具有如seqidno4(uniprotrefp19544-7)中所示氨基酸序列的全长wt1相比，截短的wt1蛋白的免疫原性降低少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或少于1％。用于设计和构建蛋白同源物和用于测试这些同源物的免疫原性潜力的方法是本领域普通任一技术人员所熟知的。在具体的实施方案中，从具有如seqidno4(uniprotrefp19544-7)中所示氨基酸序列的人全长wt1或与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质中删除少于500、少于400、少于350、少于300、少于250、少于200、少于175、少于150、少于125、少于100、少于75、少于50或少于25个氨基酸。特别是，截短的wt1缺失wt1的锌指结构域并且优选地选自由以下组成的组：具有如seqidno1所示氨基酸序列的wt1以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。
在具体的实施方案中，所述dna分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pmb1ori和cmv启动子。在具体的实施方案中，重组dna分子来源于市售的pvax1tm表达质粒(invitrogen，sandiego，california)。通过用pbr322的低拷贝pmb1复制起点取代高拷贝puc复制起点来修饰该表达载体。进行低拷贝修饰是为了降低代谢负担并使构建体更稳定。所产生的表达载体骨架被命名为pvax10。
在具体的实施方案中，所述dna分子包含如seqidno2所示的dna序列(载体骨架pvax10)。
具有如seqidno3中所示核酸序列的orf编码人wt1，其中锌指结构域被删除。通过nhei/xhoi将该orf插入表达载体骨架(pvax10)中，得到表达质粒pvax10.hwt1。表达质粒pvax10.hwt1示意图如图11。包含携带有表达质粒pvax10.hwt1的沙门氏菌减毒株ty21a的dna疫苗被命名为vxm06。
在具体实施方案中，所述沙门氏菌减毒株与所述至少一种检查点抑制剂同时施用、在其之前或之后施用。
在本发明的背景中，术语“与...同时”意指所述编码wt1的沙门氏菌减毒株和所述至少一种检查点抑制剂的施用在同一天，更特别是在12小时内，更特别是在2小时内进行。
在具体的实施方案中，所述编码wt1的沙门氏菌减毒株和所述至少一种检查点抑制剂的施用在连续的八周内，更特别是在连续的三周至六周内发生。所述编码wt1的沙门氏菌减毒株和所述至少一种检查点抑制剂可以通过相同的途径或通过不同的途径施用。
在具体的实施方案中，所述治疗伴随化学疗法、放射疗法或生物癌症疗法。为了治愈癌症，彻底根除癌症干细胞可能是必要的。为获得最大效力，联合不同的治疗方法可能是有益的。
在本发明的背景中，术语“生物癌症疗法”是指这样的癌症疗法，所述癌症疗法包括使用生物体(包括病毒)、源自活生物体的物质或这些物质的实验室生产形式。一些癌症的生物疗法旨在刺激身体的免疫系统以对抗癌细胞(所谓的生物癌症免疫疗法)。生物癌症治疗方法包括递送肿瘤抗原和肿瘤基质抗原(例如通过基于沙门氏菌的dna疫苗，特别是基于伤寒沙门氏菌ty21a的dna疫苗)、递送作为药物的治疗性抗体、施用免疫刺激性细胞因子和施用免疫细胞(包括工程化t细胞)。治疗性抗体包括靶向肿瘤抗原或肿瘤基质抗原的抗体。
在具体实施方案中，生物癌症疗法包括施用一种或多种另外的沙门氏菌减毒株，所述另外的沙门氏菌减毒株包含含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤基质抗原的表达盒的dna分子的至少一个拷贝。在具体的这种实施方案中，所述一种或多种另外的沙门氏菌减毒菌株是包含真核表达盒的伤寒沙门氏菌ty21a。特别是，所述肿瘤抗原选自由间皮素(msln)、cea和cmvpp65组成的组，优选地，所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：(a)间皮素(msln),特别是具有如seqidno5所示氨基酸序列的msln，以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，(b)cea，特别是具有如seqidno6所示氨基酸序列的cea，以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白，和(c)cmvpp65，特别是具有如seqidno7所示氨基酸序列的cmvpp65，以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白；具有如seqidno8所示氨基酸序列的cmvpp65，以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白；和具有如seqidno9所示氨基酸序列的cmvpp65，以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。特别是，所述肿瘤基质抗原选自由vegf受体蛋白和人成纤维细胞活化蛋白(fap)组成的组，其中优选地，所述vegf受体蛋白是vegfr-2，更优选是人vegfr-2，甚至更优选是具有如seqidno10中所示氨基酸序列的人vegfr-2或与其具有至少约80％序列一致性的蛋白质。
可以与本发明的沙门氏菌减毒突变株联合使用的化学治疗剂可以是例如：吉西他滨、氨磷汀(乙醇)、卡巴他赛、顺铂、达卡巴嗪(dtic)、放线菌素d、多烯紫杉醇、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、链脲霉素、环磷酰胺、carrnustine(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂质体(doxil)、亚叶酸、吉西他滨(健择(gemzar))、道诺霉素、柔红霉素脂质体(daunoxome)、丙卡巴肼、酮康唑、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-fu)、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛(泰索帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、cpt-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(sn38)、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、伊立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、奥沙利铂、普卡霉素、米托坦、培门冬酶(pegaspargase)、喷司他汀、哌泊溴烷(pipobroman)、普卡霉素、链脲霉素、他莫西芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、噻替派、乌拉莫司汀(uracilmustard)、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、硼替佐米、沙利度胺、来那度胺及其组合。
与vxm06和至少一种检查点抑制剂组合的根据本发明的最优选的化学治疗剂是是卡巴他赛、卡铂、奥沙利铂、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素、伊达比星(idarubicine)、表柔比星(epirubicine)、依托泊甙、多西他赛、吉西他滨、多柔比星、紫杉醇、伊立替康、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、亚叶酸、5-氟尿嘧啶、异环磷酰胺和博来霉素，尤其是吉西他滨。
特别是，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗周期或生物癌症疗法之前、期间或之后施用。在其他具体的实施方案中，所述沙门氏菌减毒株在化疗或放疗治疗周期或生物癌症疗法之前和期间施用。
在具体实施方案中，口服施用减毒的沙门氏菌菌株。口服施用比胃肠外施用更简单、更安全且更舒适。然而，必须要注意的是，编码wt1的沙门氏菌减毒株也可以通过任意其他合适的途径施用。优选地，向受试者施用治疗有效剂量，并且该剂量取决于具体应用，恶性肿瘤类型，受试者的体重、年龄、性别和健康状况，施用方式和制剂等。根据需要，施用可以是单次或多次。
编码wt1的沙门氏菌减毒株可以以溶液、悬浮液、冻干物、肠溶包衣胶囊或任意其他合适的形式提供。所述沙门氏菌减毒株通常被配制成饮用溶液。该实施例的患者依从性有所改善。优选地，所述饮用溶液包含将胃酸至少中和至某一度的手段，即，使胃液的ph接近ph7。优选地，所述饮用溶液是包含编码wt1的沙门氏菌减毒株的缓冲悬浮液。在一个具体实施方案中，所述缓冲悬浮液通过使沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，优选地，所述合适的缓冲液含有2.6g碳酸氢钠、1.7gl-抗坏血酸、0.2g乳糖一水合物和100ml的饮用水。
至少一种检查点抑制剂优选以批准的商业产品的盖仑制剂施用。
在具体实施方案中，癌症选自白血病，特别是选自急性髓性白血病(aml)和急性淋巴性白血病(all)，选自多发性骨髓瘤，和选自实体瘤，特别是选自肺癌、乳腺癌、食道癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤和前列腺癌。
编码wt1的沙门氏菌减毒株在相对低的剂量下令人惊讶地有效。此外，在相对低剂量的编码wt1的沙门氏菌减毒株下，编码wt1的沙门氏菌减毒株与至少一种检查点抑制剂的联合施用令人惊讶地显示对wt1特异性t细胞应答、肿瘤生长和/或总体存活率具有协同效应。施用低剂量的活细菌疫苗使排泄的风险降至最低，并由此使传播给第三方的风险降至最低。
在具体的实施方案中，单剂量的沙门氏菌减毒株包含约105至约1011，特别是约106至约1010，更特别是约106至约109，更特别是约106至约108，最特别是约106至约107个菌落形成单位(cfu)。
在这一背景下，术语“约”或“近”意指给定值或范围的3倍以内，或者2倍以内，包括1.5倍以内。
在具体的实施方案中，所述治疗是个体化的癌症免疫疗法，其包括以下步骤：评估患者中wt1的表达和/或针对wt1的免疫前应答。可以在第一步中例如通过伴随诊断来评估患者的wt1表达和/或患者针对wt1的免疫前应答。用于在mrna或蛋白质水平上评估靶基因(例如wt1)的表达的方法是本领域普通技术人员所熟知的。例如，免疫组织化学染色、流式细胞术方法或rna测序，或使用标记的替代方法可用于鉴定肿瘤中靶标表达的水平。类似地，用于评估患者针对给定蛋白质(例如wt1)的免疫前应答的方法是本领域普通技术人员所熟知的。患者的预先存在的wt-1特异性t细胞池可以通过例如elispot或多聚体facs分析进行检测。高wt1表达和/或针对wt1的免疫前应答的发生是患者对用编码wt1的沙门氏菌减毒株治疗(单独或与至少一种检查点抑制剂组合)具有有利地响应的预后指标。
取决于可能发生的副作用，包括使用抗生素或抗炎剂的治疗可能是有利的。
如果发生类似由组胺、白三烯或细胞因子介导的过敏反应的不良事件，则可使用针对发热、过敏反应、血压不稳定、支气管痉挛和呼吸困难的治疗选择。在不期望的t细胞衍生的自我攻击的情况下，治疗选择来源于干细胞移植后应用的急性和慢性移植物抗宿主病的标准处理方案。环孢菌素和糖皮质激素被提出作为治疗选择。
在不太可能发生的系统性伤寒沙门氏菌ty21a型感染的情况下，推荐使用适当的抗生素疗法，例如用包括环丙沙星或氧氟沙星的氟罗喹诺酮。胃肠道的细菌感染使用相应的药剂例如利福昔明来进行治疗。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括一种用于治疗癌症的沙门氏菌减毒株，所述沙门氏菌减毒株包含含有编码wt1的表达盒的dna分子的至少一个拷贝，其中所述治疗还包含施用至少一种检查点抑制剂。优选地，所述至少一种检查点抑制剂选自至少一种抗pd-1、pd-l1、ctla-4、ido、ox-40、gitr、tim-3和lag-3的抗体。优选地，所述至少一种检查点抑制剂是至少一种抗pd-1、pd-l1或ctla-4的抗体，或其组合，更优选地，所述至少一种检查点抑制剂是至少一种抗pd-l1或ctla-4的抗体，或其组合。
药物组合物可以是溶液、悬浮液、肠溶包衣胶囊、冻干粉末或适用于预期用途的任意其他形式。
药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在本发明的背景中，术语“赋形剂”是指与药物的活性成分一起配制的天然或合成物质。合适的赋形剂包括抗粘剂，粘合剂，包衣，崩解剂，调味剂，着色剂，润滑剂，助流剂，吸着剂，防腐剂和甜味剂。
在本发明的背景中，术语“药学上可接受的”是指，当施用于哺乳动物(例如人)时生理上可耐受的并且通常不产生不利反应的药物组合物的分子物质和其他成分。术语“药学上可接受的”还可以意指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于哺乳动物，更特别是用于人的。
在具体实施方案中，药物组合物作为饮用溶液提供。该实施例的患者依从性有所改善，并且使得可以进行快速、可行且实惠的大规模疫苗接种。
特别是，合适的饮用溶液包含将胃酸至少中和至某一程度的手段，即，使胃液的ph接近ph7。在一个具体实施方案中，饮用溶液是缓冲悬浮液，所述缓冲悬浮液通过使本发明的沙门氏菌减毒株悬浮在合适的缓冲液中而获得，优选地，在将胃酸至少中和至某一程度的缓冲液中，优选地，在含有2.6g碳酸氢钠、1.7gl-抗坏血酸酸、0.2g乳糖一水合物和100ml饮用水的缓冲液中。
在具体实施方案中，沙门氏菌减毒株是伤寒沙门氏菌ty21a。
在具体实施方案中，表达盒是真核表达盒。
在具体实施方案中，wt1选自由以下组成的组：具有如seqidno1所示氨基酸序列的wt1以及与其具有至少约80％序列一致性的蛋白。
特别是，真核表达盒包含cmv启动子。
特别是，wt1具有如seqidno1所示的氨基酸序列。
在具体的实施方案中，所述治疗包括单次或多次施用编码wt1的沙门氏菌减毒株或包含其的药物组合物和/或至少一种检查点抑制剂。施用的单一剂量可以相同或不同。特别是，所述治疗包括1、2、3、4、5或6次施用编码wt1的沙门氏菌减毒株和/或至少一种检查点抑制剂，优选地，其中多次施用发生在3至6个连续月中。
附图说明
图1：其中锌指结构域被删除的人wt1的氨基酸序列(seqidno1)，其由质粒pvax10.hwt1中包含的wt1cdna编码；
图2：空表达载体pvax10中所包含的核酸序列(不含限制性位点nhei和xhoi之间的多克隆位点部分的表达载体pvax10的序列)(seqidno2)；
图3：质粒pvax10.hwt1中所包含的，并编码seqidno1所示的人wt1的核酸序列；
图4：人全长wt1的氨基酸序列，uniprotrefp19544-7(seqidno4)；
图5：质粒pvax10.hmsln中所包含的mslncdna所编码的人msln的氨基酸序列(seqidno5)；
图6：质粒pvax10.hcea中所包含的ceacdna所编码的人cea的氨基酸序列(seqidno6)；
图7：质粒pvax10.cmvpp65_1中所包含的cmvpp65cdna所编码的人cmvpp65的氨基酸序列(seqidno7)；
图8：质粒pvax10.cmvpp65_2中所包含的cmvpp65cdna所编码的人cmvpp65的氨基酸序列(seqidno8)；
图9：质粒pvax10.cmvpp65_3中所包含的cmvpp65cdna所编码的人cmvpp65的氨基酸序列(seqidno9)；
图10：质粒pvax10.vr2-1中所包含的vegfr-2cdna所编码的vegfr-2的氨基酸序列(seqidno10)；
图11：pvax10.hwt1的质粒图谱；
图12：vxm06m与抗-ctla-4联合施用对携带散播性fbl-3的c57bl/6小鼠的存活率的影响；
图13：vxm06m与抗-pd-l1联合施用对携带散播性fbl-3的c57bl/6小鼠的存活率的影响；
实施例
vxm06m联合pd-l1和ctla-4检查点抑制剂阻断的抗肿瘤活性的评估：
本研究的目的是研究vxm06m联合pd-l1和ctla-4检查点抑制剂阻断在由c57bl/6小鼠腹膜内植入的小鼠细胞系fbl-3诱导的白血病同系肿瘤模型中的抗肿瘤活性。
将60只雄性c57/bl6小鼠(4-6周龄，平均体重约20g/小鼠)随机分成4组，每组15只动物。
第1组(对照组)：在第1、3、5、7、14和22天，用空载体vxm0m_empty(不含外源表达质粒的鼠伤寒沙门氏菌细菌载体对照)处理小鼠(n＝15)。在第20天，通过i.p.途径将fbl-3肿瘤细胞植入小鼠体内。
第2组：在第1、3、5、7、14和22天，以108cfu/施用的剂量用vxm06m(含有编码截短的小鼠wt1的pvax10.mwt1的鼠伤寒沙门氏菌)处理小鼠(n＝15)。同时，在第24天和第29天，通过i.p.途径用100μg/施用的抗pd-l1单克隆抗体(bp0101，invivoplus抗小鼠pd-l1，克隆10f.9g2，bioxcell)处理小鼠。在第20天，通过i.p.途径将fbl-3肿瘤细胞植入小鼠体内。
第3组：在第1、3、5、7、14和22天，以108cfu/施用的剂量用vxm06m处理小鼠(n＝15)。同时，在第11天和第18天，通过i.p.途径ef用100μg/施用的抗ctla-4单克隆抗体(抗ctla-4抗体，克隆uc10-4f10，bioxcell)处理小鼠。在第20天，通过i.p.途径将fbl-3肿瘤细胞植入小鼠体内。
第4组(对照组)：在第1、3、5、7、14和22天用空载体vxm0m_empty(108cfu/施用)，并在第11和18天用抗-ctla-4(100μg/剂)处理小鼠(n＝15)。在第20天，通过i.p.途径将fbl-3肿瘤细胞植入小鼠体内。
fbl-3是源自c57bl/6小鼠的friend白血病病毒诱导的红白血病细胞系。该细胞系表达可被免疫系统识别的独特tsta(肿瘤特异性移植抗原)。用fbl-3肿瘤细胞致敏同系小鼠导致后续对未来活肿瘤攻击的排斥。虽然fbl-3具有免疫原性，但将活fbl-3肿瘤细胞注射到幼稚同系小鼠中会导致肿瘤生长，这表明fbl-3肿瘤细胞具有逃避免疫识别和破坏的机制。重要的是，已显示fbl-3过表达wilms肿瘤1(wt1)。
在整个研究中仔细监测小鼠存活时间，并在图12和13中说明。
在第7天在用空载体处理的第1组中观察到一只小鼠死亡，这可能是由于在疫苗施用当天意外穿孔食道导致。
-在第23天，第4组中有一只小鼠死亡。
-在第25天，第4组中有一只小鼠死亡。
-第29天；每组处死5只小鼠并收集脾脏。
-在第30天，第2组中有一只小鼠死亡。
-在第39天，第1组中有一只小鼠死亡。
-在第58天，第1组中有3只小鼠死亡。
-在第65天，第1组中有2只小鼠死亡。
-在第74天，第1组中有2只小鼠死亡。
-在第83天，第1&4组中有2只小鼠死亡。
-在第90天，第4组中有一只小鼠死亡。
因此，在第20天第一次肿瘤细胞攻击后，仅在第1、2和4组中观察到动物死亡，并且对于其他组，所有动物都是健康的并且未观察到肿瘤发展。
这些结果清楚地表明，vxm06m与检查点抑制剂抗-ctla-4或抗-pd-l1的组合在fbl-3模型中非常有效，产生快速且持续的抗肿瘤作用。vxm06m加抗ctla-4组合在研究结束时(第196天)达到100％存活率。
相反，用空载体处理未显示抗肿瘤作用，肿瘤攻击后平均存活45天且0％恢复。在研究结束时用抗-ctla-4治疗导致40％死亡。
序列表
<110>万科斯蒙股份有限公司
<120>用于联合治疗的wt1靶向dna疫苗
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