含有紫萁酮或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗骨病的组合物的制作方法

本申请要求于2016年9月30日提交的韩国专利申请第10-2016-0126767号和2016年10月28日提交的韩国专利申请第10-2016-0142422号的优先权，这两个韩国专利申请的公开内容通过引用整体并入本文。本发明涉及包含紫萁酮或其药学上可接受的盐的用于预防或治疗骨病的组合物，更具体地，涉及用于预防或治疗骨病的药物组合物和用于减轻骨病的食品组合物，所述组合物各自含有紫萁酮或其药学上可接受的盐或紫萁(osmundajaponica)提取物作为活性成分，并涉及用于制备预防或治疗骨病的药剂的用途，以及治疗骨病的方法。
背景技术：
：骨在形成身体的骨骼结构和维持血钙(ca2+)水平方面起着非常重要的作用。骨是通过破骨细胞代谢性吸收骨和成骨细胞形成骨之间的骨重建循环的平衡来维持的。当由于骨吸收和形成之间的平衡破坏而导致骨摄取量大于骨形成量时，会发生各种骨相关疾病。与破骨细胞分化和活化相关的代表性疾病可包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节疼痛、佩吉特氏病(paget'sdisease)、骨转移癌和骨折(kimjh和kimn，2016；shiozaway等人，2011；以及singerfr，2016)。其中，当由于破骨细胞的活化破坏了骨吸收和形成之间的平衡而导致骨摄取量大于骨形成量时，诱发骨质疏松症。在骨质疏松症中，骨实质的密度降低，因此骨折的频率增加。骨质疏松症最常发生于激素失衡的女性，例如中年和老年女性，并且也发生在因骨折或严重疾病而无法移动的患者中。近来，甚至在中年或老年男性中，骨质疏松症的发病率也在增加。以下两种细胞因子在骨髓巨噬细胞/单核细胞谱系细胞分化为破骨细胞的分子机制中起重要作用(teitelbaumsl和rossfp，2003)。(i)当巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)与其受体c-fms结合时，破骨细胞祖细胞增殖并存活。当核因子-κb配体(rankl)的受体激活剂与其受体rank结合时，破骨细胞分化和骨吸收被激活并且使成熟破骨细胞存活(laceydl等人，1998；luml等人，1999；sherrcj，1990；sudat等人，1999；以及wongbr等人，1999)。(ii)当m-csf诱导c-fms活化时，破骨细胞祖细胞经由erk和pi3k/akt途径增殖并存活(mancini等人，1997)。(iii)rankl(opgl，odf，trance)和rank还控制破骨细胞的形成和功能(andersondm等人，1997；dougallwc等人，1999；以及kongyy等人，1999)。当rankl与rank结合时，tnf受体相关因子(traf)，例如traf1、2、3、5和6，与rank结合(darnaybg等人，1998；以及walshmc和choiy，2003)。其中，traf6在破骨细胞的形成和功能中最为重要(lomagama等人，1999；以及naitoa等人，1999)。traf6向nf-κb、c-junn-末端激酶(jnk)、细胞外信号调节激酶(erk)、p38、akt、活化t细胞核因子1(nfatc1)发送rankl/rank信号以诱导破骨细胞增殖、融合和分化(kobayashin等人，2001；lomagama等人，1999；naitoa等人，1999；takayanagih等人，2002；wongbr等人，1998；以及wongbr等人，1999)。骨质疏松症药物的现有开发方向是挖掘能够通过抑制破骨细胞的骨吸收来防止骨实质损失的物质。代表性药物是双膦酸盐家族fosamax。在同样的背景下，已经对花生四烯酸代谢物对骨组织代谢起到的作用进行了很多研究(leesung-eun，1999)。白三烯-b4(ltb4)是5-脂氧合酶途径的代谢产物之一，而5-脂氧合酶途径是花生四烯酸的代谢途径(ford-hutchinson，a.w.等人，1980)。c433，作为从巨细胞瘤获得的间质细胞，已被报道通过增加5-脂氧合酶代谢物来增加成骨细胞的数量和活性(mundy，g.r.等人，1993)。据观察，在骨组织培养期间施用ltb4后增加了骨吸收(bonewald，l.f.等人，1996)。体外和体内研究还表明，ltb4增加破骨细胞的产生而诱发骨吸收(bonewald，l.f.等人，1996)。因此，已经开发出ltb4受体拮抗剂用于治疗骨质疏松症，但是这样的拮抗剂未能成功地充分抑制破骨细胞的骨实质吸收。此外，现有骨质疏松症药物的副作用及其高价格也是以充分剂量施用这样的骨质疏松症药物进行患者治疗的主要障碍。fosamax的主要副作用包括严重的食道炎、肾损害、肝损害、低钙血症、肌肉痉挛等，而罗氏(roche)的bonviva的副作用如全身肌肉疼痛和身体疼痛。诺华(novartis)的aclasta(唑来膦酸盐)以及礼来(elililly)的forsteo和forteo(特立帕肽)，后二者是作为合成代谢药物的甲状旁腺激素，非常有效，但由于它们价格过高而使用非常有限。特别是，forsteo/forteo不能用于妊娠或哺乳的患者，有药物过敏、代谢性骨病(如高钙血症、肾竭、甲状旁腺功能亢进和佩吉特氏病(pagets'disease))、碱性磷酸酶不明原因升高的患者、接受放疗的患者、或患有骨髓癌或骨转移癌的患者，因此其适用的患者群体不大。因此，迫切需要开发与现有药物相比更有效和更安全并且生产成本可以较低的骨病相关药物。技术实现要素：技术问题本发明人研究了天然物质成分，以开发副作用少、安全且显示出优异效果的骨相关疾病药物，结果，本发明人证实，已长期用于食品的紫萁提取物具有骨损失抑制活性，从而完成了本发明。因此，本发明的一个方面是提供一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物包含紫萁酮或其药学上可接受的盐作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的另一个方面是提供一种用于预防或减轻骨病的食品组合物，所述组合物包含紫萁酮或其药学上可接受的盐作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的又一个方面是提供一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物包含紫萁提取物作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的又一个方面是提供一种用于预防或减轻骨病的食品组合物，所述组合物包含紫萁提取物作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的又一个方面是提供紫萁酮或其药学上可接受的盐用于制备用于预防或治疗骨病的药剂的用途，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的又一个方面是提供一种治疗受试者的骨病的方法，所述方法包括将有效量的紫萁酮或其药学上可接受的盐施用于对其有需求的受试者，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的又一个方面是提供紫萁提取物用于制备用于预防或治疗骨病的药剂的用途，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的又一个方面是提供一种治疗受试者的骨病的方法，所述方法包括将有效量的紫萁提取物施用于对其有需求的受试者，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。技术解决方案根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物包含紫萁酮或其药学上可接受的盐作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物的活性成分由紫萁酮或其药学上可接受的盐组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物的活性成分必要地由紫萁酮或其药学上可接受的盐组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或减轻骨病的食品组合物，所述组合物包含紫萁酮或其药学上可接受的盐作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或减轻骨病的食品组合物，所述组合物的活性成分由紫萁酮或其药学上可接受的盐组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或减轻骨病的食品组合物，所述组合物的活性成分必要地由紫萁酮或其药学上可接受的盐组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物包含紫萁提取物作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物的活性成分由紫萁提取物组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物的活性成分必要地由紫萁提取物组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防或减轻受试者的骨病的食品组合物，所述组合物包含紫萁提取物作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防或减轻受试者的骨病的食品组合物，所述组合物的活性成分由紫萁提取物组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防或减轻受试者的骨病的食品组合物，所述组合物的活性成分必要地由紫萁提取物组成，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了紫萁酮或其药学上可接受的盐用于制备用于预防或治疗骨病的药剂的用途，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种治疗受试者的骨病的方法，所述方法包括将有效量的紫萁酮或其药学上可接受的盐施用于对其有需求的受试者，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了紫萁提取物用于制备用于预防或治疗受试者的骨病的药剂的用途，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。根据本发明的又一个方面，提供了一种治疗受试者的骨病的方法，所述方法包括将有效量的紫萁提取物施用于对其有需求的受试者，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。以下，将详细描述本发明。本发明提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物包含紫萁酮或其药学上可接受的盐作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明的药物组合物可以是包含紫萁酮作为活性成分的组合物、活性成分由紫萁酮组成的组合物、或活性成分必要地由紫萁酮组成的组合物。用在本文中时，术语“包含”与“含有(包括)”或“特征在于”同义使用，并且不排除本发明的组合物和方法中未具体列举的和另外的成分或方法步骤。术语“由......组成”意味着排除未另外指出的其它元素、步骤或成分。术语“必要地由......组成”意味着不仅包括所描述的材料或步骤，还包括在组合物或方法的范围内基本上不影响其基本特征的任何材料或步骤。<紫萁酮的结构>紫萁酮是一种化合物，其由分子式c10h10o3(分子量：178.184da)表示并具有上面化学式的结构。此外，紫萁酮是由本发明人从紫萁提取物中分离和鉴定为具有抑制破骨细胞的增殖和分化以及激活成骨细胞分化的能力的成分。或者，紫萁酮被称为二羟基亚苄基丙酮、(3e)-4-(3,4-二羟基苯基)-3-丁烯-2-酮、或以iupac名称5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)-8-[[(2s,3r,4r,5s,6r)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)恶烷-2-基]-6-[(2s,3r,4s,5s)-3,4,5-三羟基恶烷-2-基]-4h-色烯-4-酮称呼，在室温下呈现为无色或黄色至棕色晶体。在许多美国有毒物质监管机构对于人体毒性、刺激性、致癌性、环境毒性等的所有测试中，紫萁酮被确定为无害且安全(注：tsca：未列出；cleanwateract(cwa)：未列出；sara313：未列出；海洋污染物(marinepollutant)：未列出；知情权清单(righttoknowlist)(新泽西州(newjersey))：未列出；知情权清单(马萨诸塞州(massachusetts))：未列出；知情权清单(宾夕法尼亚州(pennsylvania))：未列出；伊利诺斯州有毒空气污染物(illinoistoxicaircontaminants)：未列出；清洁空气法(cleanairact)(caa)：未列出；dhs关注的化学物质(dhschemicalsofinterest)：未列出；加州65号提案(californiaprop65)：未列出；osha：未列出；加州65号提案毒性类型(癌症，发育，女性，男性)(californiaprop65toxicitytype(cancer，developmental，female，male))：无；osha危险类别(致癌性，腐蚀性，可燃性，反应性，毒性)(oshahazclass(carcinogen，corrosive，flamable，reactive，toxic))：无，等等)。本发明的组合物中含有的紫萁酮可以作为紫萁酮本身或以盐的形式、优选药学上可接受的盐的形式使用。用于本文中时，术语“药学上可接受”是指生理上可接受，并且当施用于人时通常不会引起过敏反应或类似反应。由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐优选作为所述盐。无机酸和有机酸可以用作所述游离酸。有机酸的例子包括但不限于柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、间位磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸和天冬氨酸。无机酸的例子包括但不限于盐酸、溴酸、硫酸和磷酸。紫萁酮可以化学合成，或从天然物质中分离。当使用从天然物质中分离的紫萁酮时，这样的紫萁酮可以从特别是紫萁科(osmundaceae)的植物中分离。最优选地，紫萁酮可以从属于紫萁科的紫萁(osmundajaponica)中分离。紫萁科植物是属于紫萁目(osmundales)的唯一一个科的植物。紫萁目是一群起源于大约2.1亿年前的中生代三叠纪时期的古老蕨类植物，被归类为薄囊蕨类。属于紫萁科的紫萁的学名为osmundajaponicathunb.或osmundanipponicamakino，拉丁文名为osmundaerhizoma。紫萁是一种英文称为japaneseroyalfern(日本皇家蕨)或japanesefloweringfern(日本开花蕨)的植物，并在东亚例如日本、中国、韩国、台湾和俄罗斯生长。紫萁是一种药用植物，因为它的幼叶不仅长久以来已用作食料，而且还通过传统医学和民间疗法用于各种疾病。紫萁含有紫萁内酯、紫萁酮、紫萁甙、二氢异紫萁甙、类花楸酸甙和蜕皮激素，例如松甾酮a、蜕皮素和蜕皮甾酮。在传统医学中紫萁的根和茎被称为紫萁或紫萁贯众，其轻微有毒，但用于消灭蛔虫、绦虫、线虫等；包括抗病毒或抗菌效果的杀虫效果；散热和排毒；通过去除血流淤积来止血；以及治疗由风热引起的感冒、由流行性发热引起的皮疹、吐血、流鼻血、内痔引起的便血、痢疾、白带等(东方草药全书)。本发明人从实施例中证实，紫萁提取物有效抑制起破坏和吸收骨组织功能的破骨细胞的分化。从分离自小鼠的骨髓细胞中分离作为破骨细胞的干细胞前体细胞的单核细胞，用rankl和m-csf作为分化促进因子刺激，并用紫萁提取物处理，由此考查所述提取物对破骨细胞分化起到的作用。结果证实，紫萁提取物的热水提取物或乙酸乙酯提取物有效地抑制了骨髓细胞分化成多核破骨细胞。本发明人通过使用hplc和nmr从紫萁提取物中分离并鉴定了具有抑制破骨细胞分化和激活成骨细胞分化作用的成分。紫萁酮是从紫萁的热水提取物和乙酸乙酯提取物/级分中分离和鉴定的单一化合物。紫萁酮不仅具有优异的破骨细胞分化抑制活性和成骨细胞活化活性，而且由于细胞毒性非常低，所以也是安全的。因此，本领域技术人员可以理解，通过利用由本发明人确立的紫萁提取物和紫萁酮的上述活性，可以预期有效预防、减轻症状或治疗因破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的新骨基质形成之间的平衡以及后续矿化期间骨代谢过程的平衡的破坏而导致骨密度和强度降低所引起的各种骨病。优选地，本文中的骨病可以是骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌或骨折，并将参考本说明书的应用例描述各种疾病和破骨细胞之间的相关性。用于本文中时，术语“治疗”意指旨在改变待治疗的个体或细胞的天然过程的临床程序，并且也可以进行治疗来预防临床病理。治疗的优选效果包括抑制疾病的发生或复发，减轻症状，减少疾病的直接或间接病理后果，减慢疾病进展速率，改善、好转或减轻疾病状况，或改善预后。用于本文中时，术语“预防”是指所有抑制疾病发生或延迟疾病进展的举动。关于本发明药物组合物的剂量，其适当的有效量可以根据前述特定用途由本领域技术人员考虑各种因素例如施用途径、施用时间、治疗次数、疗程、以及需要治疗的受试者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、药物易感性、饮食和排泄率来确定。术语“有效量”是指当施用于受试者时足以显示减轻、治疗、预防、检测或诊断骨病的效果的量。术语“受试者”可以是动物，优选哺乳动物，更优选是包括人类的动物，并且可以是源自于动物的细胞、组织、器官等。受试者可以是需要治疗的骨病患者。施用可以每天进行一次或分成几次。本发明的药物组合物可以单独施用或与已知对预防或治疗骨病有效的另一种治疗剂共同施用。在共同施用的情况下，所述药物组合物和另一种治疗剂可以顺序或同时施用。当单独或组合施用时，本发明的药物组合物的剂量优选使得可以用最小量获得最大效果而没有副作用，并且这样的量可以由本领域技术人员容易地确定。本发明的药物组合物的总有效量可以单剂施用于患者，或者可以通过分次治疗方案在长时间中以多剂施用。在本发明的药物组合物中，所述活性成分的含量可以取决于疾病的严重程度而改变。相对于每天1kg患者体重，本发明的药物组合物的总剂量可以优选为约0.01μg至10000mg，更优选0.1μg至500mg。关于所述药物组合物的剂量，其对患者的有效剂量应考虑到各种因素例如制剂、施用途径、治疗次数、以及患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和排泄率来确定，因此考虑到这些因素，本领域技术人员可以确定本发明组合物的适当有效剂量。本发明的药物组合物不特别限于剂型、施用途径和施用方法。本发明的药物组合物可以与药学上可接受的载体一起根据给药途径通过本领域已知的方法进行各种配制。术语“药学上可接受的”组合物是指生理上可接受的无毒组合物，当施用于人时不抑制活性成分的作用，并且通常不引起过敏反应或类似反应，例如胃肠道问题和头晕。所述载体包括各种各样的溶剂、分散介质、水包油或油包水乳液、含水组合物、脂质体、微珠和微粒体。施用途径可以是口服或肠胃外途径。肠胃外施用可以是，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下或直肠施用。当口服施用时，本发明的药物组合物可以与用于口服施用的合适载体一起通过本领域已知的方法配制成粉末、颗粒、片剂、丸剂、糖衣片剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、悬液、晶片等的形式。合适的载体的例子可包括：糖类，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和麦芽糖醇；淀粉包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；以及填料，例如明胶和聚乙烯吡咯烷酮。在一些情况下，可以添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸、藻酸钠等作为崩解剂。此外，所述药物组合物还可含有抗凝结剂、润滑剂、润湿剂、芳香剂、乳化剂、防腐剂等。关于肠胃外施用，本发明的药物组合物可以与合适的肠胃外载体一起通过本领域已知的方法配制成注射剂、透皮施用制剂和鼻吸入剂的形式。注射剂需要基本上灭菌，并且需要防护微生物例如细菌和真菌的污染。用于注射剂的合适载体的例子可以是溶剂或分散介质，包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其混合物和/或植物油，但不限于此。更优选地，合适的载体可以是等渗溶液，例如hank's液、林格氏液、含有三乙醇胺或无菌注射用的磷酸盐缓冲盐水(pbs)水、10％乙醇、40％丙二醇、和5％右旋糖。为了保护注射剂免受微生物污染，注射剂还可以含有各种抗微生物剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。在大多数情况下，注射剂还可含有等渗剂，例如糖或氯化钠。透皮施用制剂的剂型包括软膏、乳膏、洗剂、凝胶、外用溶液、糊剂、搽剂和气溶胶。“透皮施用”是指通过将药物组合物局部施用到皮肤中，将药物组合物中含有的有效量的活性成分递送到皮肤中。例如，可以将本发明的药物组合物制备成注射制剂，然后将其通过使用30号针头轻微刺破皮肤或直接涂敷于皮肤来施用。这些制剂在文献中描述，该文献是药物化学中通常已知的配方书(雷氏药物科学(remington'spharmaceuticalscience)，第15版，1975，mackpublishingcompany，easton，宾夕法尼亚州)。对于吸入施用制剂，根据本发明使用的化合物可以通过使用合适的推进剂，例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳、或其它合适的气体，从加压包装或喷雾器以气溶胶喷雾的形式方便地递送。关于加压气溶胶，剂量单位可以通过设置递送计量的量的阀来确定。例如，可以将明胶胶囊和用于吸入器或吹入器的药筒配制成含有化合物和合适的粉末基质材料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。其它药学上可接受的载体可以在下面的文献中提到(雷氏药物科学，第19版，mackpublishingcompany，easton，pa，1995)。本发明的药物组合物还可以含有至少一种缓冲剂(例如，盐水溶液或pbs)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如，edta或谷胱甘肽)、佐剂(例如，氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。本发明的药物组合物也可以通过本领域已知的方法配制，以便在施用于哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。此外，本发明提供了一种用于预防或减轻骨病的食品组合物，所述组合物包含紫萁酮或其药学上可接受的盐作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明人确立的紫萁酮对预防或减轻骨病的效果如本说明书中所述。所述食品组合物包括所有类型，包括功能性食品、营养补充剂、保健食品、食品添加剂等。上述类型可以根据本领域已知的常规方法制备成各种形式。例如，对于保健食品，本发明的食品组合物本身可以通过制备成茶、果汁和饮料的形式来饮用，或者可以通过造粒、胶囊化或粉末化来服用。本发明的食品组合物可以通过与已知具有预防或减轻骨病的效果的已知物质或活性成分混合而制备成组合物的形式。此外，功能性食品可以通过将本发明的食品组合物添加到饮料(包括酒精饮料)、水果及其加工食品(例如，罐装水果、瓶装食品、果酱、柑桔酱等)、鱼类、肉类及其加工食品(例如，火腿、香肠、腌牛肉等)、面包、面条(例如乌东、荞麦面、拉面、意大利面、通心粉等)、果汁、各种饮料、饼干、糖浆、乳制品(例如，黄油、奶酪等)、食用植物油、人造黄油、植物蛋白、蒸煮袋装食品、冷冻食品和各种调味料(例如，豆瓣酱、酱油、酱汁等)中来制造。相对于最终制造的食品的总重量，本发明的食品组合物的优选含量为0.01-50wt％，但不限于此。为了以食品添加剂的形式使用本发明的食品组合物，可以将所述食品组合物制备成粉末或浓缩物的形式。此外，本发明提供了一种用于预防或治疗骨病的药物组合物，所述组合物包含紫萁提取物作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。本发明人确立的紫萁提取物对预防或减轻骨病的预期效果如本说明书中所述。特别是，已经确立紫萁提取物中含有的化合物紫萁酮，具有抑制负责骨吸收的破骨细胞的增殖和分化以及激活成骨细胞分化的能力。紫萁提取物可以从新鲜的紫萁制备，并且可以使用经过储存处理程序例如冷冻或干燥的紫萁。紫萁提取物其形态或性质不受限制，可以是溶液或浓缩物，或通过除去在制备提取物时使用的溶剂而获得的固体或粉末。紫萁提取物可以没有限制地使用，只要已知所述提取物是通过天然产物提取方法获得的即可。特别是，最优选使用能够制备含有紫萁酮的提取物的提取方法。例如，紫萁提取物可以通过选择适当的提取溶剂并使用本领域已知的提取方法来制造，所述提取方法例如酸/碱提取、热水提取、室温搅拌提取、冷提取、回流冷却提取、超声提取、高压釜提取、低温高压提取、酶处理提取或溶剂提取。作为提取溶剂，可以使用至少一种选自由水、乙醇、谷物乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、环己烷、石油醚、二乙醚和苯组成的组中的溶剂。本发明的紫萁提取物可以是通过溶剂提取方法初步提取的提取物，或者可以通过将初步提取物和从初步提取后提取残余物的再提取而得到的提取物混合而得到，以增加提取效率。为了除去杂质并增加活性成分的浓度，可以通过进一步进行各种纯化或过滤方法，例如根据本领域已知的方法，通过色谱法、分级、硅藻过滤和超滤(膜分离)，来获得紫萁提取物。最终提取物可以使用已知的浓缩方法和浓缩设备例如沉淀浓缩、蒸发浓缩、共沸浓缩、真空浓缩、蒸馏浓缩、离心和反渗透进行浓缩，并且可以通过冷冻干燥、喷雾干燥、热风干燥等除去溶剂、然后固化而制备成粉末的形式。为了增加紫萁提取物中紫萁酮的含量，优选从紫萁制备热水提取物，并使用有机溶剂例如乙酸乙酯将热水提取物再次制备成提取物和级分。可以包含在含有紫萁提取物作为活性成分的药物组合物中的载体、药物组合物的制剂、和施用方法例如施用途径和施用量，如上所述。此外，本发明提供了一种用于预防或减轻骨病的食品组合物，所述组合物含有紫萁提取物作为活性成分，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。用于制备所述食品组合物的紫萁提取物如上所述。所述食品组合物及其内容物的例子也如上所述。此外，本发明提供了紫萁酮或其药学上可接受的盐用于制备用于预防或治疗骨病的制剂的用途，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。用于本文中时，术语“药学上可接受”是指生理上可接受，并且当施用于人时通常不会引起过敏反应或类似反应。由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐优选作为所述盐。无机酸和有机酸可以用作所述游离酸。有机酸的例子包括但不限于柠檬酸、乙酸、乳酸、酒石酸、马来酸、富马酸、甲酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、苯甲酸、葡糖酸、间位磺酸、乙醇酸、琥珀酸、4-甲苯磺酸、谷氨酸和天冬氨酸。无机酸的例子包括但不限于盐酸、溴酸、硫酸和磷酸。关于本发明治疗用制剂的剂量，其适当的有效量可以根据前述特定用途由本领域技术人员考虑各种因素例如施用途径、施用时间、治疗次数、疗程、以及需要治疗的受试者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、药物易感性、饮食和排泄率来确定。术语“有效量”是指当施用于受试者时足以显示减轻、治疗或预防所述骨病的效果的量。术语“受试者”可以是动物，优选哺乳动物，更优选是包括人类的动物，并且可以是源自于动物的细胞、组织、器官等。受试者可以是需要治疗的骨病患者。施用可以每天进行一次或分成几次。本发明的治疗用制剂可以单独施用或与已知对预防或治疗骨病有效的另一种治疗剂共同施用。在共同施用的情况下，所述药物组合物和另一种治疗剂可以顺序或同时施用。当单独或组合施用时，本发明的治疗用制剂的剂量优选使得可以用最小量获得最大效果而没有副作用，并且这样的量可以由本领域技术人员容易地确定。紫萁酮的特征在于从紫萁科植物中分离，并且分离方法如上所述。此外，本发明提供了一种治疗骨病的方法，所述方法包括将有效量的紫萁酮或其药学上可接受的盐施用于对其有需求的受试者，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。用于本文中时，术语“治疗”意指旨在改变待治疗的个体或细胞的天然过程的临床程序，并且也可以进行治疗来预防临床病理。治疗的优选效果包括抑制疾病的发生或复发，减轻症状，减少疾病的直接或间接病理后果，减慢疾病进展速率，改善、好转或缓解疾病状况，或改善预后。用于本文中时，术语“预防”是指所有抑制疾病发生或延迟疾病进展的举动。此外，本发明提供了紫萁提取物用于制备用于预防或治疗骨病的药剂的用途，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。紫萁提取物可以没有限制地使用，只要已知所述提取物是通过天然产物提取方法获得的即可。特别是，最优选使用能够制备含有紫萁酮的提取物的提取方法。例如，紫萁提取物可以通过选择适当的提取溶剂并使用本领域已知的提取方法来制造，所述提取方法例如酸/碱提取、热水提取、室温搅拌提取、冷提取、回流冷却提取、超声提取、高压釜提取、低温高压提取、酶处理提取或溶剂提取。作为提取溶剂，可以使用至少一种选自由水、乙醇、谷物乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷、环己烷、石油醚、二乙醚和苯组成的组中的溶剂。本发明的紫萁提取物可以是通过溶剂提取方法初步提取的提取物，或者可以通过将初步提取物和从初步提取后提取残余物的再提取而得到的提取物混合而得到，以增加提取效率。为了除去杂质并增加活性成分的浓度，可以通过进一步进行各种纯化或过滤方法，例如根据本领域已知的方法，通过色谱法、分级、硅藻过滤和超滤(膜分离)，来获得紫萁提取物。最终提取物可以使用已知的浓缩方法和浓缩设备例如沉淀浓缩、蒸发浓缩、共沸浓缩、真空浓缩、蒸馏浓缩、离心和反渗透进行浓缩，并且可以通过冷冻干燥、喷雾干燥、热风干燥等除去溶剂、然后固化而制备成粉末的形式。为了增加紫萁提取物中紫萁酮的含量，优选从紫萁制备热水提取物，并使用有机溶剂例如乙酸乙酯将热水提取物再次制备成提取物和级分。此外，本发明提供了一种治疗受试者的骨病的方法，所述方法包括将有效量的紫萁提取物施用于对其有需求的受试者，其中所述骨病是选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的至少一种。紫萁提取物的有效量和施用方法，例如施用途径和施用量，如上所述。有利效果因此，本发明提供了一种用于预防、减轻或治疗至少一种选自由骨质疏松症、类风湿性关节炎、关节痛、佩吉特氏病、骨转移癌和骨折组成的组中的骨病的组合物，所述组合物包含紫萁酮或其衍生物、或含有紫萁酮或其衍生物的紫萁提取物作为活性成分。根据本发明的组合物具有非常低的毒性，并且显示出对引起骨丢失的破骨细胞的增殖和分化的强抑制作用，同时显示出激活成骨细胞分化的作用。附图说明图1显示了紫萁的水(热水)或乙酸乙酯(ea)提取物的hplc结果，以分离和鉴定紫萁中含有的具有破骨细胞分化抑制活性的物质(检测波长：280nm)。ea-2表示分离为七个级分的ea提取物中的第二个级分。紫萁酮的峰用黑色箭头标记。标有红色椭圆的峰指示在纯化过程期间观察的相同峰位置。图2显示了使用小鼠骨髓细胞的trap测定结果，以研究紫萁提取物、其级分和紫萁酮抑制破骨细胞增殖和分化的活性。图3显示了使用小鼠骨髓细胞的trap测定结果，以研究1、4、7和10μm商购紫萁酮(alfaaesar，thermofisherscientific)对破骨细胞增殖和分化的抑制活性，以便获得紫萁酮的破骨细胞分化抑制能力ic50。图4a显示了用各种浓度的紫萁酮和fosamax处理骨髓细胞以诱导其分化后，确认紫萁酮和已知药物fosamax的ic50的结果，以比较紫萁酮和fosamax之间的破骨细胞分化抑制作用。图4b显示了在共同温育破骨细胞前体细胞和成骨细胞前体细胞的同时，确认紫萁酮同时抑制破骨细胞分化和激活成骨细胞分化的能力的结果。图5显示了用紫萁酮处理后通过进行western印迹确认ocn表达的结果，以研究紫萁酮对成骨细胞产生ocn的作用。图6显示了用紫萁酮处理后通过进行western印迹确认runx2表达的结果，以研究紫萁酮对runx2表达的作用。具体实施方式以下，将详细描述本发明。然而，下面的实施例仅用于说明本发明，而不是意欲限制本发明的范围。<实施例1>实验方法1.紫萁提取物和级分的制备以及化合物的分离和鉴定将紫萁(osmundajaponica)(或osmundaerhizoma)依次用热水和乙酸乙酯提取，然后将乙酸乙酯提取物(ea提取物)通过hplc分成7个级分。具体地，使用热水提取物作为紫萁提取物，所述热水提取物通过将在韩国江原道收集的200-250g紫萁洗涤干净、放入汽蒸容器(osk-2002，doctorredginseng，wellsosanatm，daewoongpharmaceuticalinc.)中、添加1.5l水、蒸24小时、再添加3.5l水、熟成72小时并冷藏而得到的。将相同体积的乙酸乙酯(ea)添加到热水提取物中，然后充分混合，然后使用旋转蒸发器干燥ea层，然后用作ea提取物。将ea提取物溶解在最少量的dmso中，然后用水稀释，在此，关于稀释因子，假定收率大约为70％，将ea提取物稀释至热水提取物原始体积的70％。将ea提取物通过hplc分成七个级分。第二个级分使用旋转蒸发器干燥，然后用作ea-2提取物。观察到在七个级分之中，第二级分(ea-2)具有破骨细胞分化抑制活性(参见图1，<实施例2>)。为了鉴定具有破骨细胞分化抑制活性的物质，从ea-2级分中分离出9种单一化合物，然后进行纯化，然后通过核磁共振(nmr)和质谱法(ms)确立每种化合物的种类和化学结构。用于从ea-2级分中分离单一化合物的hplc条件示于表1中。在分离的化合物中显示破骨细胞分化抑制活性的物质被证实是紫萁酮(参见<实施例2>)。从紫萁提取物中鉴定的紫萁酮的具体nmr和ms结果如下：1h-nmr(700mhz，甲醇-d4)δ7.52(1h，d，j＝16.1，h-7)，7.08(1h，d，j＝2.1hz，h-2)，6.99(1h，dd，j＝7.7，2.1hz，h-6)，6.79(1h，d，j＝7.7hz，h-5)，6.55(1h，d，j＝16.1hz，h-8)，2.34(3h，s，h-10)；13c-nmr(175mhz，甲醇-d4)δ201.7(c-9)，150.1(c-4)，147.1(c-3)，147.0(c-7)，127.9(c-1)，124.9(c-8)，123.7(c-6)，116.7(c-5)，115.4(c-2)，27.2(c-10)；esi-ms(负离子模式)m/z177[mh]；esims(正离子模式)m/z179[m+h]+，201[m+na]+。[表1]流动相a(含0.05％tfa的h2o)％b(meoh)％0分钟802020分钟010030分钟01002.细胞培养将mc3t3-e1亚克隆4鼠成骨细胞(#crl-2593tm，atcc)使用α-mem(eagle-α改良的最低必需培养基(minimumessentialmediumeagle-alphamodification)，#lm00853，welgene，首尔，韩国)在37℃和5％co2的条件下温育。将hacat人表皮角质形成细胞，#atccpcs-200-011)使用dulbecco改良的eagle培养基(dmem，#dmem-hpa，capricornscientific，ebsdorfergrund，德国)在和5％co2的条件下温育。nih3t3小鼠胚胎成纤维细胞(#kclb21658)、raw264.7鼠巨噬细胞(前破骨细胞细胞系，#kclb40071)、hct116人结肠癌细胞(#kclb10247)、pc3人前列腺腺癌细胞(#kclb21435)、ht1080人纤维肉瘤细胞(#kclb1121)、和b16f10小鼠恶性黑色素瘤细胞(#kclb80008)从韩国细胞系银行(koreancelllinebank)购买，并使用dmem在37℃和5％co2的条件下温育。ags人胃腺癌细胞(#kclb21739)、a549人肺癌细胞(#kclb10185)、caki-1人肾癌细胞(#kclb30046)、t24人膀胱癌细胞(#kclb30004)、tc-1p3hpv-16e7-表达型小鼠肺上皮细胞、mhci类(由韩国大学(koreauniversity)教授tae-wookim提供)使用rpmi(rosewellparkmemorialinstitute)1640(#rpmi-a，capricornscientific，ebsdorfergrund，德国)在37℃和5％co2的条件下温育。人脂肪来源间充质干细胞，admsc(cefobio，首尔，韩国)，使用cb-admsc-gm(cefobio，首尔，韩国)在37℃和5％co2的条件下温育。3.破骨细胞的原代培养从5-8周龄雄性c57bl/6小鼠的股骨和胫骨收集骨髓细胞。从骨上除去肌肉，并储存在冷磷酸盐缓冲盐水(pbs；#cap08-050，gendepot，katy，tx，美国)中。切下每个骨的两端，使用25g针头用保持冷却的冲洗介质(无血清α-mem，2mm乙二胺四乙酸)冲洗骨髓。通过使用labogene1248r(labogene，lynge，丹麦)以3000rpm离心3分钟收集骨髓细胞，然后重悬于洗涤介质中。之后，将8ml收集的骨髓细胞覆盖在6ml淋巴细胞分离培养基(lsm；#50494，mpbiomedicals，santaana，ca，美国)上，然后以1600rpm离心20分钟，从而分离单核细胞。从培养基分界面收集单核细胞条带，并使用完全α-mem(含有10％胎牛血清(fbs；capricornscientific，ebsdorfergrund，德国)和1％(v/v)抗生素(包括100u/ml青霉素g和100mg/ml链霉素)在37℃和5％co2的条件下温育，同时每三天更换培养基。为了促进破骨细胞的分化，将1×105个细胞在购自peprotec(首尔，韩国)的破骨细胞分化因子m-csf(60ng/ml)和rankl(150ng/ml)存在下，在48孔板中的每孔0.5ml培养基中温育。正如所知，来自一个骨髓的巨噬细胞/单核细胞在6天后分化为成熟的多核破骨细胞(gurt等人，2015)。4.破骨细胞和成骨细胞的共培养以与上述相同的方式制备48孔板的每孔1x105个c57bl/6小鼠骨髓单核细胞，并使用500μlα-mem(含有10％fbs和1％抗生素(100u/ml青霉素g和100mg/ml链霉素)在37℃和5％co2的条件下与1.5x104个mc3t3-e1鼠成骨细胞一起共温育，同时每三天更换培养基。将阳性对照细胞与破骨细胞分化因子m-csf(60ng/ml)和rankl(150ng/ml)、以及成骨细胞分化因子抗坏血酸(50μg/ml)和10mmβ-甘油磷酸盐一起共温育。阴性对照细胞通过只添加m-csf作为分化因子来温育。为了考查紫萁酮对破骨细胞和成骨细胞分化起到的作用，在所述细胞分配到板上后的第1天，将紫萁酮以10μm的终浓度施用于阳性对照细胞中。在用紫萁酮处理的阳性对照组中，破骨细胞在细胞分配后的6-7天后完全消失，因此在只施用成骨细胞分化因子的同时，将细胞在细胞分配后8天后温育至21天。5.骨吸收的分析体外破骨细胞介导的人骨胶原降解的定量测量使用osteolysetmassaykit(lonzawalkersville，inc.walkersville，md，美国)根据制造商的说明书进行。该测定允许直接测量基质金属蛋白酶到破骨细胞吸收腔隙中的释放(delaisse等人，2003)。简而言之，将2×104个上述制备的小鼠骨髓细胞分配到涂有铕缀合的胶原的96孔osteolysetm细胞培养板中。将细胞在每孔0.1ml的完全α-mem中在m-csf(60ng/ml)和rankl(150ng/ml)存在下于37℃和5％co2的条件下温育6天。之后，在分配的第3天更换培养基。为了测量抑制成熟破骨细胞功能的能力，在第6天更换培养基，并以从trap分析获得的ic50浓度添加紫萁酮。在用紫萁酮处理成熟破骨细胞3天后，取细胞培养物的10μl上清液，并置于含有荧光团释放试剂的第二个96孔分析板中。使用时间分辨荧光计wallacvictor(perkinelmer，waltham，ma，美国)测量降解的胶原蛋白。在此，所述测量在400μs的初始延迟之后，使用340nm的激发和615nm的发射进行测量持续400μs。骨吸收率(％)通过计算与未处理的对照组相比的存在紫萁酮时的骨吸收量的比例而获得，并通过细胞dna归一化。6.western印迹为了分析分化期间的成骨细胞分化标志物的表达，将3×105个mc3t3-e1细胞与每孔10ml含有抗坏血酸(50μg/ml)和10mmβ-甘油磷酸盐的完全α-mem一起分配到100mm培养板中。在此，添加或不添加50μm紫萁酮，将细胞在37℃下在5％co2培养箱中温育21天，同时每3-4天更换培养基。阴性对照细胞在没有分化因子下培养，并分配成骨细胞及其培养物，然后在第7、14或21天收集。将细胞用ripa缓冲液裂解，然后分析runt相关转录因子2(runx2)的表达。还为了分析ocn分泌，收集培养物，并通过细胞dna归一化。在12.5％聚亚乙烯基-tris凝胶上使用sds-page来分析蛋白质，并通过电泳转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。用无脂乳封闭所述膜，并使用抗runx2(d1h7)兔单克隆抗体(#8486，cellsignalingtechnology，ma，美国)或抗ocn(fl-95)抗体(#sc-30045，santacruzbiotechnology，tx，美国)检查。抗肌动蛋白抗体(#m177-3，medical&biologicallaboratoriesco.，ltd.，nagoya，aichi，日本)被用作内部参比。印迹上的蛋白质条带使用增强化学发光检测试剂盒(#ebp-1073，picoepdwesternreagent，elpis-biotech，daejeon，韩国)显现。7.alp活性的测量使用quantichromalpassaykit(bioassaysystems，hayward，ca，美国)根据制造商的说明书评估alp活性。简而言之，将3×103个mc3t3-e1细胞与每孔10ml含有抗坏血酸(50μg/ml)和10mmβ-甘油磷酸盐的完全α-mem一起分配到96孔板中。在此，添加或不添加紫萁酮(10μm和50μm)，并每3-4天更换培养基。在温育的第14天，使用分光光度计读板器(moleculardevices，sunnyvale，ca，美国)在405nm处测量细胞级分中的由alp活性引起的比色变化(kim等人，2016)。alp活性的％激活通过比较用实验化合物处理的细胞的alp活性和未处理的对照细胞的alp活性来显示。8.trap测定(抑制破骨细胞增殖和分化的活性的测量)1)骨髓细胞的培养无菌切除6-8周龄雄性c57bl/6小鼠的胫骨和股骨，并使用注射器(21g，koreagreencross)无菌收集骨髓细胞。将骨髓细胞漂浮于500μl含有碳酸氢钠(2.0g/l)、链霉素(100mg/l)和青霉素(100000单位/ml)的α-mem培养基(gibcobrlco.)中，分配在48孔板中，并一式三份进行测定。将作为破骨细胞前体细胞的单核细胞用rankl和m-csf作为分化促进因子处理，从而在5-7天内分化成破骨细胞。2)破骨细胞分化抑制的测量2-1)样品制备：通过与<实施例1>的第1部分相同的方法制备紫萁的热水提取物、ea提取物或级分。将ea-2提取物溶解在最少量的dmso中，然后假定ea-2提取的收率为约70％，并用水稀释至热水提取物原始体积的70％。2-2)样品施用：从骨髓细胞温育的第1天起，将样品以1:20(v/v；25μl样品/500μl培养基)持续施用于培养基，同时每2-3天更换培养基。2-3)破骨细胞分化的测量：破骨细胞以被trap染色的trap阳性多核细胞定义。关于trap染色溶液，将5mg作为基质的萘酚as-ms磷酸盐(sigman-4875)和25mg作为显色试剂的固红紫色lb盐(fastredvioletlbsalt)溶解在约0.5ml的n,n-二甲基甲酰胺中，然后与含有50mm酒石酸的0.1nnahco3缓冲溶液(50ml)混合。使用前将反应试剂保存在冰箱中。骨髓细胞在含有分化促进因子的培养基中培养7天后，除去培养基，将细胞用pbs洗涤，然后用含有10％福尔马林的pbs固定2-5分钟。之后，将细胞用乙醇和丙酮的1:1混合溶液固定，然后干燥。将固定的细胞用trap染色溶液处理15分钟，并用pbs洗涤，然后通过显微镜观察细胞染色的程度。在显微镜视野中，确定trap阳性细胞当中具有两个或更多个细胞核的细胞是破骨细胞，并测量细胞数。紫萁提取物的破骨细胞分化抑制作用通过作为与对照组相比的50％抑制浓度的ic50来计算。9.trap测定(抑制破骨细胞增殖和分化的活性ic50的确定)1)破骨细胞分化的测量1-1)样品制备：紫萁酮购自alfaaesar，thermofisherscientific，并将其溶解在最小量的二甲基亚砜(dmsa)中。fosamax购自cayman(annarbor，mi，美国)，并将其溶解在最小量的无菌蒸馏水中。1-2)样品施用：从骨髓细胞温育的第1天起，将紫萁酮和fosamax以1:20(v/v；25μl样品/500μl培养基)持续施用于培养基，使得终浓度分别为1、4、7和10μm，同时每2-3天更换培养基。1-3)破骨细胞分化的测量：所述测量通过与<实施例1>中的第8部分相同的方法进行。在显微镜视野中，确定trap阳性细胞当中具有两个或更多个细胞核的细胞是破骨细胞，并测量细胞数。紫萁酮的破骨细胞分化抑制作用通过作为与对照组相比的50％抑制浓度的ic50来计算。10.细胞毒性的研究使用mtt测定法研究了在<实施例1的第1部分中制备的从紫萁分离的化合物的细胞毒性。mtt测定法如下。将细胞在5％co2和37℃下以1x103个细胞/孔温育在96孔板中含有10％胎牛血清(fbs)的dmem中，然后将紫萁酮添加到细胞培养基中，接着温育24小时。之后，施用100μlmtt(0.5mg/mlpbs)，接着温育2小时。之后，除去每个孔的培养基，并添加100μldmso。温育10分钟后，使用微孔板读板器(spctramax340pc，moleculardevices，美国)在570nm处测量吸光度。吸光度是表示活细胞数的指标，并通过下面的等式计算。其再现性通过三次实验来验证。细胞增殖(％)＝od550(样品)/od550(对照)<实施例2>结果1.抑制破骨细胞增殖和分化的活性的确认使用作为破骨细胞特异性染色方法的抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)测定法，研究<实施例1>中制备的紫萁的提取物、级分和分离化合物对破骨细胞增殖和分化的抑制活性。从图2可以确认，在用dmso处理的骨髓细胞中正常形成巨破骨细胞，像在阳性对照组(培养基中只添加分化促进因子而没有紫萁提取物的组)中那样。相比之下，在用紫萁的相同体积的水提取物、ea提取物、ea-2级分和紫萁酮(10μm)处理的组中，作为多核细胞的巨破骨细胞的形成显著被抑制，与阴性对照组相似(培养基中既不添加分化促进因子也不添加紫萁提取物的组)，而且，除了结果像在阴性对照组中那样之外，破骨细胞前体细胞的增殖被显著抑制，导致对破骨细胞分化和增殖二者的重大抑制作用。特别是，当用10μm紫萁酮处理细胞时，骨髓单核细胞通过增殖和融合分化向作为多核细胞的破骨细胞的过程被抑制95％以上，几乎完全被抑制。用1μm紫萁酮处理的组显示出巨破骨细胞的形成，其数量与阳性对照组相比较少。用1μmfosamax处理的组也显示出巨破骨细胞的形成，其数量与阳性对照组相比较少，并且显示破骨细胞密度与用1μm紫萁酮处理的组中相似。还有，获得了破骨细胞增殖和分化抑制活性ic50。从图3可以确认，当用10μm紫萁酮(alfaaesar，thermofisherscientific)处理细胞时，几乎完全抑制了骨髓单核细胞通过增殖和融合分化成作为多核细胞的破骨细胞，并且当用7μm紫萁酮处理细胞时抑制约3-40％(ic50＝≤8μm)。已知的骨质疏松症药物fosamax(阿仑膦酸盐)用作阳性对照，其ic50值为≤4μm(图4a)。为了研究紫萁酮是否抑制完全分化的成熟破骨细胞的骨吸收功能，在上述ic50浓度的8μm紫萁酮存在下使用成熟破骨细胞进行骨吸收测定基于<实施例1>的第5部分中的方法，紫萁酮在ic50浓度下抑制成熟破骨细胞的骨吸收功能高达未处理的破骨细胞的58.7±13％。2.紫萁酮对激活成骨细胞和抑制破骨细胞分化的作用的确认为了研究紫萁酮是否具有同时抑制破骨细胞分化和激活成骨细胞分化的能力，将从c57bl/6小鼠收集的骨髓单核细胞和作为成骨细胞前体细胞的mc3t3-e1细胞在48孔板中以1×105个骨髓细胞和3×103mc3t3-e1个细胞/孔的浓度共温育。共温育的骨髓细胞和成骨细胞前体细胞中的骨髓单核细胞/巨噬细胞谱系细胞在m-csf和rankl存在下在6-7天内分化成成熟的多核破骨细胞。施用10μm紫萁酮后完全抑制破骨细胞的增殖和分化(图4b，os)。而成骨细胞不断增殖和分化。与未施用紫萁酮时相比，当施用10μm紫萁酮时，在共培养的第7、14和21天时的alp活性的％激活值分别为104％、111％和95％，这些结果与施用10μm紫萁酮后单独温育的成骨细胞的alp激活没有大差异。在存在和不存在成骨细胞的情况下，紫萁酮对破骨细胞分化均显示出相似的抑制活性。在施用10μm紫萁酮后的第6天，成熟破骨细胞完全消失，而成骨细胞持续增殖。因此，如前破骨细胞和前成骨细胞的共温育所示，紫萁酮对共存的成骨细胞的激活和增殖没有显示出抑制活性。在上述结果的基础上，确认了紫萁酮具有同时抑制破骨细胞分化和激活成骨细胞分化的能力。相反，在不存在紫萁酮的情况下，在破骨细胞和成骨细胞共温育后7天，破骨细胞和成骨细胞在破骨细胞和成骨细胞分化因子的存在下持续增殖和分化(图4b，阳性对照组)。然而，与不存在成骨细胞时生长的破骨细胞的大小相比，分化的破骨细胞的大小稍小，原因可能是由于破骨细胞和成骨细胞的共存导致细胞密度增加所致。在阴性对照组的温育中生长的细胞最可能构建巨噬细胞/单核细胞谱系细胞，因为只使用m-csf作为分化因子(图4b，阴性对照组)。总之，这些结果表明，紫萁酮具有独立和同时抑制破骨细胞分化和激活成骨细胞分化的能力。3.紫萁酮对成骨细胞产生alp和ocn的作用增加的确认为了评估紫萁酮诱导骨形成的能力，研究了紫萁酮是否增加碱性磷酸酶(alp)的活性，碱性磷酸酶是成骨细胞分化的初始/中间步骤的标志物。[表2]mc3t3-e1中紫萁酮的alp活性的％激活上述值由三次独立实验的平均值±s.d表示。*表示p<0.05。甲状旁腺激素相关肽用作阳性对照。如上表1所示，与未处理的对照细胞中的alp产生相比，用紫萁酮处理的成骨细胞样mc3t3-e1细胞中的atp产生显著增加。与先前已知文献(lyu等人，2008)中显示的结果相似，50μm的紫萁酮刺激alp产生279±61％(p<0.05)。另外，不管对共存破骨细胞的分化的抑制如何，紫萁酮都显示出增加mc3t3-e1细胞产生alp的趋势。当成骨细胞和破骨细胞前体与10μm紫萁酮以及破骨细胞和成骨细胞分化因子共温育时，成熟破骨细胞在第6天完全消失(图4b，os)。之后，用紫萁酮处理的细胞在成骨细胞分化因子存在下继续生长。与未处理的对照细胞相比，在成骨细胞和破骨细胞前体细胞共培养后的第7、14和21天，用紫萁酮处理的细胞的alp活性的％激活值分别为104％、111％和95％，这些结果几乎与在共存破骨细胞不存在时获得的％激活值相似(表1)。因此，结果显示，紫萁酮促进成骨细胞分化，并同时维持抑制破骨细胞分化的能力。据报道，ocn，其是一种主要的非胶原基质蛋白，仅在或接近矿化时间时，即诱导mc3t3-e1细胞分化后约21天(young等人，1992)，显示出表达增加最多。为了研究紫萁酮对破骨细胞产生ocn的作用，在50μm紫萁酮存在下温育mc3t3-e1细胞。根据western印迹测定，与未处理的阳性对照细胞相比，施用紫萁酮后第14天和第21天成骨细胞产生ocn的水平分别增加了2.9倍和1.2倍(图5a，os)。这些结果确认，紫萁酮最初诱导成骨细胞产生ocn的显著增加。即使在前成骨细胞和前破骨细胞的共温育中，紫萁酮仍维持最初增加ocn产生和抑制破骨细胞分化的能力(图5b，os)。细胞分配后第7天至第21天，在没有施用紫萁酮的共温育环境中在成骨细胞和破骨细胞分化因子存在下生长的阳性对照组成骨细胞最初诱导和增加ocn产生达到与成骨细胞在用紫萁酮处理的共温育环境中相似的水平(图5b，pc)。原因被认为是ocn产生的增加最初是由与破骨细胞的相互作用引起的。有趣的是，与没有破骨细胞下生长的成骨细胞相比，在没有成骨细胞分化因子的情况下生长的阴性对照组前成骨细胞显示，在第14天和第21天，ocn产生显著增加至存在破骨细胞时的阳性对照细胞中的水平。这些结果提示，在不存在成骨细胞分化因子的情况下，与骨髓单核细胞或成熟破骨细胞的相互作用可能有助于增加成骨细胞中的ocn产生。因此，确认了紫萁酮抑制破骨细胞分化并维持增加成骨细胞中alp和ocn表达的能力。4.紫萁酮的runx2表达增加作用然后，研究了紫萁酮是否增加runx2的表达，runx2是成骨细胞的初始分化标志物。已知runx2是通过刺激成骨细胞中alp和ocn转录来增加骨形成的转录因子(phimphlai等人，2006)。与未处理的阳性对照组相比，施用紫萁酮的mc3t3-e1细胞在施用后7、14和21天的runx2表达水平增加了1.1倍、1.1倍和2.1倍(图6)。在用细胞分配后第21天，用紫萁酮处理的成骨细胞中的runx2表达没有显著降低，而第21天时未处理的成骨细胞中的runx2表达降至第14天时最大表达水平的几乎一半。这些结果确认了紫萁酮具有延长成骨细胞中runx2表达时间的能力。5.紫萁酮的癌细胞特异性细胞毒性紫萁酮显示出对癌细胞比对非癌细胞更高的选择性指数的特异性毒性。ic50小于100μm的化合物可被认为在细胞杀灭/抗增殖活性中具有活性(boyd，2003)。因此，参考下表3，紫萁酮对正常细胞系没有显示出细胞毒性。[表3]上述值由三次独立实验的平均值±标准差表示。fosamax用作参比化合物。本实验中使用的细胞如下。hacat，人表皮角质形成细胞；admsc，人脂肪来源间充质干细胞(cefo，韩国)；raw264.7，小鼠巨噬细胞系(前破骨细胞)；nih3t3，小鼠胚胎成纤维细胞；ags，人胃腺癌；a549，人肺癌；hepg2，人肝脏肝母细胞瘤；hct116，人结肠癌；pc3，人前列腺腺癌；caki-1，人肾癌；t24，人膀胱癌；ht1080，人纤维肉瘤；b16f10，小鼠黑色素瘤；tc-1p3，hpv-16e7-表达型小鼠肺上皮细胞(mhci类)特别地，根据mtt测定法，紫萁酮显示对admsc人脂肪来源间充质干细胞、hacat人表皮角质形成细胞和nih3t3小鼠胚胎成纤维细胞的ic50值分别为2760±220、3510±110和>5000μm，表明轻微毒性。同时，紫萁酮显示对raw264.7小鼠巨噬细胞系的ld50为507±98μm，表明相对显著的细胞毒性。因此，这些结果提示，紫萁酮可能在高浓度下抑制一些吞噬细胞的活力。有趣的是，根据mtt测定法，紫萁酮对包括ags人胃腺癌、pc3人前列腺腺癌和b16f10小鼠黑素瘤的癌细胞系显示出分别为59.9±6.1、65.5±8.7和75.8±9.2μm的低ld50，表明中度细胞毒活性。特别是，与人正常细胞系(hacat，admsc)相比，紫萁酮的细胞毒性中的癌症选择性指数为45-60，非常高地杀死人癌细胞系(ags，pc)。总之，紫萁酮抑制破骨细胞的抑制ic50为8μm，紫萁酮激活成骨细胞280％的浓度为50μm，并且紫萁酮对几种癌细胞系的ld50值为50-70μm，而紫萁酮对正常细胞系的ld50在2500-5000μm的范围内，因此基于这些结果，确认了紫萁酮当用作药物时具有很高的安全性。<应用例1>骨质疏松症骨是通过破骨细胞代谢性吸收骨和成骨细胞形成骨之间的骨重建循环的平衡来维持的。然而，当由于破骨细胞和成骨细胞之间的平衡被破坏而使破骨细胞极度激活时，骨吸收和形成之间的平衡被破坏，因此骨摄取量大于骨形成量，引起骨质疏松症(kimjh和kimn，2016；shiozaway等人，2011)。因此，本发明的紫萁酮同时显示出抑制破骨细胞增殖和分化的作用和激活成骨细胞的作用，并由此可以表现出对骨质疏松症预防或治疗的作用。<应用例2>类风湿性关节炎类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病，自身免疫性抗体促进破骨细胞分化。由此导致的过度骨吸收使类风湿性关节炎恶化(takayanagih，2007)。其机制如下。nfat转录因子(nfatc1/c2/c3/c4)，其是与破骨细胞分化相关的关键转录因子，基本上通过钙/钙调蛋白信号传导被激活(takayanagih等人，2002)。为了完全激活，带有基于酪氨酸的激活基序(itam)的分子，例如免疫调节蛋白dnax激活蛋白12(dap12)和免疫抗体fc受体共同γ链(fcrγ)，刺激免疫细胞中的钙信号传导(pitcherla和vanoersns，2003)。此外，dap12和fcrγ通过破骨细胞中的钙信号传导激活nfatc1。因此，dap12和fcrγ所涉及的免疫球蛋白样受体在破骨细胞的分化中起关键作用(kogat等人，2004；mocsaia等人，2004)。也就是说，fcrγ与破骨细胞中的破骨细胞相关受体(oscar)和配对的免疫球蛋白样受体(pir-a)相互作用。itam的磷酸化激活磷脂酶cγ(plcγ)，其有利于细胞内钙，细胞内钙激活钙依赖磷酸酶，后者是钙调蛋白依赖性磷酸酶。钙依赖磷酸酶直接使nfatc1的丝氨酸去磷酸化，导致易位到细胞核中，并激活nfatc1。结果，所述免疫抗体促进破骨细胞分化，破骨细胞过度骨吸收使类风湿性关节炎恶化。最终，在类风湿性关节炎患者中，抑制破骨细胞分化不能纠正自身免疫机制本身的异常，但可以治疗骨骼症状，例如关节炎和由此引起的疼痛。因此，本发明的紫萁酮显示出抑制破骨细胞增殖和分化的作用，并由此可以表现出对类风湿性关节炎的预防或治疗作用。<应用例3>佩吉特氏病(变形性骨炎)佩吉特氏病(变形性骨炎)也是由破骨细胞的骨吸收异常引起的(singerfr，2016)。因此，成骨细胞的异常成骨进展，并且该过程重复，导致骨畸形，由此导致疼痛、头痛，听力丧失等。佩吉特病经常在手臂、腿、骨盆、脊柱和头骨中引起。新形成的骨骼很脆弱，因此骨折的频率高。可能引起高钙血症、心脏病发作和轻偏瘫(ralstonesh，2016)。该病的病因不明，但怀疑遗传易感性和儿童期病毒感染是其原因。药物治疗有助于抑制疾病的进展。破骨细胞分化抑制剂fosamax和调节骨代谢的降钙素是目前最常用的药物。然而，fosamax由于其副作用，在一些患者中长期使用受到限制。对乙酰氨基酚(泰诺)或非甾体抗炎药(nsaid)用于剧烈疼痛。因此，本发明的紫萁酮显示出抑制破骨细胞增殖和分化的作用，并由此可以表现出对佩吉特氏病的预防或治疗作用。<应用例4>骨转移癌破骨细胞还促进实体瘤的骨转移。骨是最经常的癌症转移部位。癌症转移到骨骼引起剧烈疼痛和骨折，从而显著降低完全治愈的可能性(weilbaecherkn等人，2011)。在骨髓中的血液干细胞的增殖部位发现了遍布全身的癌细胞(shiozaway等人，2013)。癌细胞显著促进破骨细胞从骨髓细胞的分化，从而促进骨转移、癌症生长和骨破坏。因此，破骨细胞在癌症的骨转移中起关键作用，而抑制破骨细胞分化降低了骨转移。许多实体癌转移相当于骨转移，并且血液干细胞基于血液干细胞增殖部位驱动和生长，然后再次进入血液，并转移到不同部位。在前列腺癌中，最经常发生骨转移，并且这样的骨转移使癌症恶化而使癌症的治愈变得困难，导致主要死亡原因。人前列腺癌细胞的直接主要靶标也是血液干细胞的增殖部位，并且用作转移癌的关键基地(shiozaway等人，2011)。另外，破骨细胞促进前列腺癌组织中的血管生成，从而促进癌症生长(bruni-cardosoa等人，2010)。乳腺癌细胞也促进破骨细胞分化，因此破骨细胞在经历乳房切除术的乳腺癌患者中通过骨转移促进癌症复发(danilins等人，2012；lux等人，2011)。预防骨转移癌的骨靶向治疗剂目前正用于临床实践。破骨细胞是癌症骨转移的关键机制之一，因此成为开发新抗癌药的主要靶标。唑来膦酸是目前唯一被美国fda批准用于抑制破骨细胞分化的基于双膦酸盐的药物(el-ammj等人，2013)。唑来膦酸保留骨并提高生存率。唑来膦酸显著降低高风险非转移性前列腺癌的骨转移(wirthm等人，2014)。唑来膦酸与激活成骨细胞的甲状旁腺激素的共同施用进一步降低骨转移(schneidera等人，2005)。再次证实，针对破骨细胞分化的信号传导物质rankl的单克隆抗体地诺单抗，也抑制前列腺癌的骨转移，因此破骨细胞抑制对于抑制癌症的骨转移是重要的(smithmr等人，2012)。施用唑来膦酸抑制破骨细胞分化，从而显著抑制骨转移，甚至在多发性骨髓瘤患者中也是如此(zhuangj等人，2012)。也就是说，如果开发出副作用少并且成本低的破骨细胞抑制剂，则可以长时间施用这样的破骨细胞抑制剂来抑制癌症患者中的转移。因此，本发明的紫萁酮同时显示出抑制破骨细胞增殖和分化的作用和激活成骨细胞的作用，并由此可以表现出对骨转移癌的预防或治疗作用。[参考文献]andersondm，maraskovskye，billingsleywl，dougallwc，tometskome，rouxer等人.tnf受体及其配体的同源物增强t细胞生长和树突细胞功能(ahomologueofthetnfreceptoranditsligandenhancet-cellgrowthanddendritic-cellfunction).nature1997；390：175-9.bonewald，l.f.等人，白三烯b4在体外和体内均刺激破骨细胞骨吸收(leukotrieneb4stimulatesosteoclasticboneresorptionbothinvitroandinvivo).j.boneminer.res.，11，1619-1627，1996.bonewald，l.f.等人.合成肽-白三烯对体外骨吸收的影响(effectsofsyntheticpeptido-leukotrienesonboneresorptioninvitro).j.boneminer.res.，11，521-529，1996.bruni-cardosoa，johnsonlc，vessellarl，petersonte，lynchcc.破骨细胞来源的基质金属蛋白酶-9直接影响前列腺肿瘤-骨微环境中的血管生成(osteoclast-derivedmatrixmetalloproteinase-9directlyaffectsangiogenesisintheprostatetumor-bonemicroenvironment).molcancerres.2010apr；8(4)：459470.pmcid：pmc2946627danilins，merkelar，johnsonjr，johnsonrw，edwardsjr，sterlingja.骨髓来源的抑制细胞在乳腺癌进展期间扩增并促进肿瘤诱导的骨破坏(myeloid-derivedsuppressorcellsexpandduringbreastcancerprogressionandpromotetumor-inducedbonedestruction).oncoimmunology.2012dec1；1(9)：14841494.darnaybg，haridasv，nij，moorepa，aggarwalbb.nf-κb受体活化剂(rank)的细胞内结构域的表征。与肿瘤坏死因子受体相关因子的相互作用并激活nf-κb和c-junn端激酶(characterizationoftheintracellulardomainofreceptoractivatorofnf-kappab(rank).interactionwithtumornecrosisfactorreceptor-associatedfactorsandactivationofnf-kappabandc-junn-terminalkinase).jbiolchem1998；273：20551-5.dougallwc，glaccumm，charrierk，rohrbachk，braselk，desmedtt等人.rank对破骨细胞和淋巴结发育至关重要(rankisessentialforosteoclastandlymphnodedevelopment).genesdev1999；13：2412-24.el-ammj，freemana，pateln，aragon-chingjb.转移性去势抵抗性前列腺癌的骨靶向治疗：进展性范例(bone-targetedtherapiesinmetastaticcastration-resistantprostatecancer:evolvingparadigms).prostatecancer.hindawipublishingcorporation；2013；2013：210686.pmcid：pmc3771418ford-hutchinson，a.w.等人，白三烯b，一种从多形核白细胞释放的强效化学动力学和聚集性物质(leukotrieneb，apotentchemokineticandaggregatingsubstancereleasedfrompolymorphonuclearleukocytes).nature(london)，286，264-265，1980.kimjhandkimn.破骨细胞分化中的信号传导途径(signalingpathwaysinosteoclastdifferentiation).chonnammedj2016；52：12-17.kobayashin，kadonoy，naitoa，matsumotok，yamamotot，tanakas等人.隔离traf6介导的信号传导途径阐明了其在破骨细胞生成中的作用(segregationoftraf6-mediatedsignalingpathwaysclarifiesitsroleinosteoclastogenesis).emboj2001；20：1271-80.kogat，inuim，inouek，kims，suematsua，kobayashie等人.由itam基序介导的共刺激信号与rankl合作用于骨稳态(costimulatorysignalsmediatedbytheitammotifcooperatewithranklforbonehomeostasis).nature2004；428：758-63.kongyy，yoshidah，sarosii，tanhl，timmse，capparellic等人.opgl是破骨细胞生成、淋巴细胞发育和淋巴结器官发生的关键调节剂(opglisakeyregulatorofosteoclastogenesis，lymphocytedevelopmentandlymph-nodeorganogenesis).nature1999；397：315-23.laceydl，timmse，tanhl，kelleymj，dunstancr，burgesst等人.骨保护素配体是调节破骨细胞分化和激活的细胞因子(osteoprotegerinligandisacytokinethatregulatesosteoclastdifferentiationandactivation).cell1998；93：165-76.leesung-eun，天然产物和设计的新杂化化合物的合成以及治疗ltb4相关疾病的生物活性(synthesisandbiologicalactivityofnaturalproductsanddesignednewhybridcompoundsforthetreatmentofltb4relateddisease)，博士论文，釜山大学研究生院(graduateschoolofpusanuniv.)，1999年8月lomagama，yehwc，sarosii，duncangs，furlongerc，hoa等人.traf6缺陷导致骨硬化病以及白细胞介素-1、cd40和lps信号传导缺陷(traf6deficiencyresultsinosteopetrosisanddefectiveinterleukin-1，cd40，andlpssignaling).genesdev1999；13：1015-24.luml，wongbr，josienr，bechererjd，erdjument-bromageh，schloj等人.肿瘤坏死因子-α(tnf-α)转化酶样蛋白酶在trance(一个参与破骨细胞生成和树突状细胞存活的tnf家族成员)脱落中的作用的证据(evidenceforaroleofatumornecrosisfactor-alpha(tnf-alpha)-convertingenzyme-likeproteaseinsheddingoftrance，atnffamilymemberinvolvedinosteoclastogenesisanddendriticcellsurvival).jbiolchem1999；274：13613-8.lux，mue，weiy，riethdorfs，yangq，yuanm，yanj，huay，tiedebj，lux，hafftybg，pantelk，massaguej，kangy.vcam-1通过接合α4β1阳性破骨细胞祖细胞促进乳腺癌惰性骨微转移的溶骨性扩张(vcam-1promotesosteolyticexpansionofindolentbonemicrometastasisofbreastcancerbyengagingα4β1-positiveosteoclastprogenitors).cancercell.2011dec13；20(6)：701714.pmcid：pmc3241854mancinia，niedenthalr，joosh，kocha，trouliariss，niemannh等人.v-fms酪氨酸激酶中第二个grb2结合位点的鉴定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