用于设计高效力糖皮质激素的结构与机制的制作方法

本发明是在国立糖尿病、消化和肾脏疾病研究所/国立卫生研究院(nationalinstituteofdiabetesanddigestiveandkidneydiseases/nationalinstitutesofhealth)授予的dk066202和dk071662的政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。

本发明涉及新型糖皮质激素化合物。本发明还涉及使用这些化合物的方法、这些化合物的合成，并且涉及包含该糖皮质激素化合物的组合物和配制品及其用途。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年10月14日提交的美国临时申请序列号62/408,314的优先权，将其公开内容通过引用以其全文并入本文。

背景技术：

诸如泼尼松、地塞米松(dex)和布地奈德等的糖皮质激素是高效的抗炎药物。它们被广泛用于治疗炎症和自身免疫性疾病，诸如哮喘、关节炎、狼疮和克罗恩病(1,2)。这些药物通过与糖皮质激素受体(gr)(一种核受体超家族的配体激活的转录因子)结合而发挥其生理作用。在没有糖皮质激素的情况下，gr存在于细胞质中并且与伴侣蛋白诸如hsp90和hsp70结合。激素的结合导致gr的构象变化，导致其易位至细胞核，在细胞核中它发挥其转录控制活性，即激活(转录激活)或抑制(转录抑制)。在转录激活中，gr二聚化、直接结合特定的糖皮质激素反应元件，并且然后募集共激活因子以激活转录。在转录抑制中，通用模型如下：gr结合其他转录因子(例如，nf-κb、ap-1)以通过蛋白质-蛋白质相互作用间接拴系其结合位点。在靶标启动子附近被拴系时，gr抑制下游基因表达(3)。通常认为转录抑制不需要gr二聚化(4,5)。

转录抑制是糖皮质激素充当抗炎药物的主要机制(6)。gr与nf-κb/ap-1启动子的拴系导致主要下游促炎因子的转录抑制，这些下游促炎因子包括促炎细胞因子(例如，tnf-α、il-1β和il-6)、趋化因子(例如，ccl2、ccl19)、以及与炎症发作相关的酶(例如，cox2、mmp13和磷脂酶a2)(2)。由于其快速作用和可持续的效应，糖皮质激素仍然是治疗炎性疾病的首选。然而，长期使用糖皮质激素，尤其是高剂量，具有许多不良后果，包括糖尿病/葡萄糖耐受不良、高血压、肥胖和骨质疏松症(7,8)。这些后果中的大部分归因于gr的转录激活。例如，糖皮质激素诱导编码肝脏中葡萄糖生成途径的限速酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因(9,10)，从而增加葡萄糖的从头合成并且最终导致体重增加或糖尿病。糖皮质激素还诱导骨发育的关键调节基因dickkopf-1(dkk1)，其上调导致骨质疏松症和骨质流失(11)。通常观察到糖皮质激素的许多副作用与糖皮质激素的高剂量使用相关(12-14)。例如，观察到使用泼尼松的“阈值模式”：以每天7.5mg，它会引起青光眼、抑郁症和高血压(12)。这些副作用是由gr转录激活以及其他受体(诸如盐皮质激素受体(mr))的非靶标激活引起的，其激活会引起高血压(15)。因此，重要的是开发高效力和选择性糖皮质激素以减少不想要的副作用。

效力和功效是糖皮质激素的两个关键药代动力学参数。虽然功效是给定药物可达到的最大活性，但通常在最大浓度下，效力是达到半数最大活性所需的给定药物浓度(ec50)。对于具有相同功效的两种糖皮质激素，高效力糖皮质激素将需要较低的剂量才能达到相同的治疗效果(14,15)。重要的是，糖皮质激素对转录激活和转录抑制可能具有不同的效力；例如，gr经由dex的基因诱导需要比基因抑制高5至6倍的糖皮质激素浓度(16-18)。这种差异反应提供了开发如下高效力糖皮质激素的机会，该高效力糖皮质激素可以低剂量使用以实现炎症信号的完全抑制同时具有最小的转录激活活性和副作用。最后，对糖皮质激素疗法的不敏感性和抗性的发展是治疗常见炎性疾病诸如慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎和炎性肠病的主要问题(19)。糖皮质激素抵抗对于白细胞癌症、尤其是儿童急性白血病也是未解问题(20)。已经鉴定或提出了若干种糖皮质激素抗性机制，包括激酶途径的改变、辅因子的变化、和受体的缺失或突变(19,21)。一个常见的观察结果是在糖皮质激素抵抗患者中配体对受体的亲和力降低。用高效力糖皮质激素治疗的此类患者已显示出改善，但效果逐渐降低(22)。因此，迫切需要开发新一代更高效力的糖皮质激素。

皮质醇是由肾上腺产生的内源性糖皮质激素。相对于最常用的合成糖皮质激素诸如dex，皮质醇具有低效力和受体结合能力(23)。在另一方面，糠酸莫米松(mf)是用于治疗炎性皮肤障碍(elocon)、哮喘(asmanex)和鼻窦炎症(nasonex)的有效力的糖皮质激素(24,25)。mf在类固醇d环的c17α位置具有亲脂性糠酸酯，这被认为是其高效力的根源(26)。在此，诸位发明人确定了与mf和皮质醇结合的grlbd的晶体结构，这揭示了区分mf与皮质醇之间的配体效力的潜在机制。然后，我们使用观察到的结构机制设计了若干种新型糖皮质激素，其具有大大提高的效力和功效，这可以作为开发针对治疗炎性疾病的治疗的起始线索。

技术实现要素：

糖皮质激素药物的演化是由对降低不想要的副作用同时保持有益的抗炎作用的需求驱动的。效力是这种演化的非常重要的方面，因为许多不良副作用与高剂量相关。通过高效力糖皮质激素可以使副作用最小化，这些糖皮质激素在较低剂量下实现相同的治疗效果。这种需求推动了糖皮质激素从低效力至高效力的演化。皮质醇是具有相对较低效力的内源性糖皮质激素，而糠酸莫米松(mf)是已用于治疗许多炎症疾病的高效力合成糖皮质激素。为了理解驱动糖皮质激素演化的潜在机制，诸位发明人确定了与皮质醇和mf结合的糖皮质激素受体(gr)配体结合结构域(lbd)的x射线结构。皮质醇结合的grlbd揭示了类固醇a环中1,2单键的柔性(flexibility)是皮质醇对gr的低亲和力的主要原因。同时，mf结合的grlbd揭露了mf的高效力是通过其17α糠酸酯基实现的，该基团完全填充配体结合口袋，因此提供了针对高亲和力结合的额外锚接触。该配体结合口袋中的单个氨基酸q642在mf与皮质醇之间的配体效力上起着区别作用。基于结构的设计导致效力大大提高的若干种新型糖皮质激素的合成。这些结果共同揭示了糖皮质激素效力的关键结构机制，并且为开发高效糖皮质激素提供了合理的基础。

在一方面，本发明提供了式i的化合物

或其药学上可接受的盐，其中x是-o-或-s-；是一个键或不存在；r1选自氢、c1-6烷基、环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、或杂环烷基，其中任一个是任选经取代的；r2是-l-r’-，其中l是一个键或-c(o)-，并且r’选自氢、c1-6烷基、环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、或杂环烷基，其中r'是任选经取代的；r3是氢或任选经取代的c1-6烷基；每个r4独立地是c1-6烷基、-oh、卤素、卤代烷基、-cn、-no2、-c(o)(c1-6烷基)、-nhc(o)(c1-6烷基)、-oc(o)(c1-6烷基)、-c(o)nh(c1-6烷基)、-c(o)o(c1-6烷基)、-so2(c1-6烷基)、或-so2nh(c1-6烷基)，其中r4的烷基是任选经取代的；r5和r6各自独立地选自氢、卤素、或c1-4烷基；并且n是0、1、2、3、4或5。

附图说明

图1：皮质醇结合的grlbd和mf结合的grlbd的总体结构。(a)皮质醇结合的grlbd和mf结合的grlbd的架构。(b)dex结合的grlbd和mf结合的gr-lbd的结构比较。箭头指示两者之间的差异，1：螺旋1前的环区域；2：螺旋5至螺旋7之前的环区域；3：af2螺旋的c末端的取向。(c)在grlbd的配体结合口袋中皮质醇和mf的电子密度图。

图2：皮质醇、dex和mf的效力。(a)皮质醇、dex和mf的化学结构。指示了类固醇环(a-d)。关键原子编号标记为靠近右侧位置的小文本。dex与皮质醇之间的差异在dex结构中指示。指示了mf的糠酸酯基。(b-c)皮质醇、dex和mf对于ad293细胞中诱导报告基因mmtv-luc和抑制报告基因ap1-luc的剂量反应曲线，rlu：相对荧光素酶单位。误差条代表标准偏差，n＝3。(d)mf、dex和皮质醇的体外gr结合测定。cpm：计数/秒。误差条代表标准偏差，n＝2。

图3：1,2单键的柔性归因于皮质醇的低亲和力。(a)grlbd的配体结合口袋中皮质醇和dex的氢键网络。(b)皮质醇、泼尼松龙和dex对于ad293细胞中mmtv-luc上的gr转录激活的剂量反应曲线。泼尼松龙仅通过1,2双键区分于皮质醇。误差条代表标准偏差，n＝3。

图4：gr配体结合口袋中17α糠酸酯基的完全占据。(a、b)dex和mf的三维结构。(c)grlbd的配体结合口袋中dex和mf的比对。mf的17α糠酸酯基扩大了gr配体结合口袋并且完全占据类固醇d环上方的疏水腔。(d)17α糠酸酯基与grlbd配体结合口袋中的疏水腔中的残基的详细疏水相互作用。

图5：q642在识别不同效力的配体中起关键作用。(a)q642与不同配体的详细相互作用：dex结合的gr-lbd和mf结合的gr-lbd。(b)在不饱和浓度(dex10nm；mf1nm)的类固醇下q642突变的转录激活活性。误差条代表标准偏差，n≥3。(c)mf、dex和皮质醇对于ad293细胞中mmtv-luc上的野生型(wt)gr和q642n突变体的剂量反应曲线。误差条代表标准偏差，n＝3。

图6：-o-或-s-酯化合物的设计，以及随后的肝脏水解。

图7：溶解度突变和结晶突变的位置。上图：溶解grlbd的突变的位置；下图：促进grlbd结晶的表面突变。

图8：所选择的grlbd突变的蛋白质表达和纯化。grlbd突变体在10μm皮质醇存在下表达并且纯化。

图9：皮质醇结合的grlbd和mf结合的grlbd的蛋白质晶体和衍射图。(a)皮质醇结合的grlbd。(b)mf结合的grlbd。

图10：grayvti突变的转录活性。(a)ad293细胞中mmtv-luc上的grayvti突变的转录激活活性。dex，100nm。误差条代表标准偏差，n＝3。(b)ad293细胞中ap1-luc上的grayvti突变的转录抑制活性。dex，100nm。误差条代表标准偏差，n＝3。

图11：grlbd的配体结合口袋中dex的类固醇c-9α基团和c-16基团和皮质醇的详细结构比较。(a)在dex的c-9α位置处的f原子与grlbd的配体结合口袋中的f623、l563和m646紧密接触。(b)dex的c-16甲基与grlbd的配体结合口袋中的y735、l732、m646和q642紧密接触。

图12：f623和m639突变不能分离mf和dex的活性。(a)ad293细胞中mmtv-luc上的f623突变的转录激活活性。dex10nm，mf1nm。误差条代表标准偏差，n＝3。(b)ad293细胞中mmtv-luc上的m639突变的转录激活活性。dex10nm，mf1nm。误差条代表标准偏差，n＝3。

图13：grq642a突变蛋白的体外结合测定。(a)使用来自表达野生型gr或q642a突变型gr的ad293细胞的胞质溶胶的体外配体结合实验。cpm：计数/分钟。误差条代表标准偏差，n＝2。(b)mmtv-luc报告基因测定中wtgr和q642agr的dex剂量反应曲线。误差条代表标准偏差，n＝3。(c)grq642a配体竞争测定。误差条代表标准偏差，n＝2。

图14：本发明化合物的活性条形图，作为相对荧光素酶单位提供。

图15：示出了化合物4相对于糠酸氟替卡松(ff)的8倍效力增加的线图。

图16：(a)提供了候选化合物在报告基因系统中的效力的线图。(b)使用ova诱导的小鼠哮喘模型提供对候选化合物在抑制肺部炎症中的作用进行的评价的线图。

提供前述附图是出于示例性目的，并且不意在以任何方式进行限制。

具体实施方式

糖皮质激素已经使用了近60年，并且它们仍然是治疗许多炎症和自身免疫疾病的首选。然而，长期使用糖皮质激素会引起许多不良反应。了解gr激活和抑制的结构基础对于开发具有较少副作用的新型糖皮质激素非常重要。然而，细菌系统中gr的低表达水平(尤其是对于低亲和力配体而言)阻碍了这种重要细胞调节因子的结构研究。通过比较类固醇受体家族中的保守残基，诸位本发明人已成功鉴定了可促进受体表达而不影响受体生理功能的氨基酸突变。这种方法将加速gr的结构研究，尤其对于诸如非甾体配体等的那些低亲和力配体而言，这可能会成为下一代糖皮质激素的未来。

高效力糖皮质激素的开发受到两种类型的紧迫因素的推动，一种是高剂量使用引起的糖皮质激素副作用，并且另一种是临床糖皮质激素抵抗症状。虽然配体亲和力是效力的决定因素，但它不是唯一的决定因素。细胞辅助因子也通过识别由配体结合引起的表面差异而发挥关键作用，并且由不同配体的结合诱导的细微变化可对辅因子选择性产生深远影响。已应用不同的策略来修饰刚性皮质醇骨架以增加效力，并且导致dex的发展。皮质醇结合的grlbd和dex结合的grlbd的结构比较显示，在这些修饰中，δ¹双键对于最佳定位c3酮是关键的，该酮与r611形成关键氢键。随后，研究人员发现，在c-17α位置处的亲脂性酯基团诸如烷基或丙酸酯(26)可以强烈增强糖皮质激素活性。最常用的哮喘药物之一，丙酸氟替卡松(fp)，是通过用羟基替代c-17α位置处的丙酸酯而产生的。这些数据表明配体结合口袋中的类固醇d环上方存在疏水腔。用糠酸酯基团进一步优化fp以替代丙酸酯产生了高效力糖皮质激素，糠酸氟替卡松(ff)，指示糠酸酯基可能在腔内配合最佳。尽管已经解决了ff结合的grlbd的结构(35)，但mf的高效力的结构机制未定义。这里，诸位发明人已发现，mf的高效力可归因于占据整个配体结合口袋的c-17α糠酸酯基和由配体结合引起的表面构象变化二者。使用诱变，诸位发明人证明，单个氨基酸残基q642在识别c-17α糠酸酯基并且协调其他氨基酸侧链的定位中起关键作用。q642n与野生型蛋白质的区别仅在于一个甲基，但足以完全分离mf、dex和皮质醇的活性，指示受体活性的调节有多精确。

诸位本发明人已证明，c-17α糠酸酯基可以用作“锚定”点，以将低亲和力配体精确且牢固地定位在配体结合口袋中。在对针对增加解离特性而设计的dac衍生物的修饰上的成功证明了用于设计治疗性解离的糖皮质激素、具有降低的临床糖皮质激素抵抗症状的糖皮质激素、或非类固醇糖皮质激素化合物(这些化合物通常显示差的对受体的亲和力)的稳健策略。总之，我们已经解决了与生理配体、低效力糖皮质激素皮质醇结合的grlbd的第一晶体结构，以及与临床上重要的高效力合成配体mf结合的lbd的结构。结合生化分析和突变分析，诸位发明人在结构上鉴定了糖皮质激素亲和力和效力的关键决定因素，并且通过高效糖皮质激素的基于结构的设计和合成验证了这些决定因素。

i.定义

为了本发明的目的，化学元素根据元素周期表，cas版本，handbookofchemistryandphysics第75版来鉴定。另外，有机化学的通用原理描述于“organicchemistry”,thomassorrell,universitysciencebooks,sausolito:1999和“march’sadvancedorganicchemistry”,第5版,编辑:smith,m.b.和march,j.,johnwiley&sons,newyork:2001中，将其全部内容通过引入特此并入。

出于本发明的目的，式i的化合物的碳编号是对于类固醇结构的认可惯例。因此，式i的化合物编号如下：

如本文所述，本发明的化合物可任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如上文一般性说明的，或如本发明的特定类别、亚类和种类所例示的。

如本文所述，“保护基团”是指这样的部分或官能团，该部分或官能团通过官能团的化学修饰引入到分子中以便在随后的化学反应中获得化学选择性。标准保护基团提供在wuts和greene:“greene’sprotectivegroupsinorganicsynthesis”第4版,wuts,p.g.m.和greene,t.w.,wiley-interscience,newyork:2006中。

如本文所用，术语“羟基”是指-oh部分。

如本文所用，术语“脂族的”包括术语烷基、烯基、炔基，其中的每一个是如下所述任选经取代的。

如本文所用，“烷基”是指含有1-12(例如，1-8、1-6或1-4)个碳原子的饱和脂族烃基。烷基可以是直链或支链的。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正庚基、或2-乙基己基。烷基可以被一个或多个取代基取代(即，任选取代)，该取代基诸如卤素、磷酸基、环脂族基[例如，环烷基或环烯基]、杂环脂族基[例如，杂环烷基或杂环烯基]、芳基、杂芳基、烷氧基、芳酰基、杂芳酰基、酰基[例如，(脂族基)羰基、(环脂族基)羰基、或(杂环脂族基)羰基]、硝基、氰基、酰胺基[例如，(环烷基烷基)羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(杂环烷基烷基)羰基氨基、杂芳基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、或杂芳基氨基羰基]、氨基[例如，脂族氨基、环脂族氨基、或杂环脂族氨基]、磺酰基[例如，脂族-so2-]、亚磺酰基、硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、羧基、氨基甲酰基、环脂族氧基、杂环脂族氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、杂芳基烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、或羟基。非限制性地，经取代的烷基的一些例子包括羧基烷基(诸如hooc-烷基、烷氧基羰基烷基、和烷基羰基氧基烷基)、氰基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、酰基烷基、芳烷基、(烷氧基芳基)烷基、(磺酰基氨基)烷基(诸如(烷基-so2-氨基)烷基)、氨基烷基、酰胺基烷基、(环脂族基)烷基、或卤代烷基。

如本文所用，“烯基”是指含有2-8个(例如2-12、2-6或2-4个)碳原子和至少一个双键的脂族碳基团。与烷基相像，烯基可以是直链或支链的。烯基的例子包括但不限于烯丙基、1-或2-异丙烯基、2-丁烯基、和2-己烯基。烯基可任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如卤素、磷酸基、环脂族基[例如，环烷基或环烯基]、杂环脂族基[例如，杂环烷基或杂环烯基]、芳基、杂芳基、烷氧基、芳酰基、杂芳酰基、酰基[例如，(脂族基)羰基、(环脂族基)羰基、或(杂环脂族基)羰基]、硝基、氰基、酰胺基[例如，(环烷基烷基)羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(杂环烷基烷基)羰基氨基、杂芳基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、芳基氨基羰基,或杂芳基氨基羰基]、氨基[例如，脂族氨基、环脂族氨基、杂环脂族氨基,或脂族磺酰基氨基]、磺酰基[例如，烷基-so2-、环脂族-so2-,或芳基-so2-]、亚磺酰基、硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、羧基、氨基甲酰基、环脂族氧基、杂环脂族氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、杂芳烷氧基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、或羟基。非限制性地，经取代的烯基的一些例子包括氰基烯基、烷氧基烯基、酰基烯基、羟基烯基、芳烯基、(烷氧基芳基)烯基、(磺酰基氨基)烯基(诸如(烷基-so2-氨基)烯基)、氨基烯基、酰胺基烯基、(环脂族基)烯基、或卤素烯基。

如本文所用，“炔基”是指含有2-8个(例如2-12、2-6或2-4个)碳原子并具有至少一个三键的脂族碳基团。炔基可以是直链或支链的。炔基的例子包括但不限于炔丙基和丁炔基。炔基可任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如芳酰基、杂芳酰基、烷氧基、环烷基氧基、杂环烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、硝基、羧基、氰基、卤素、羟基、磺基、巯基、硫烷基[例如，脂族硫烷基或环脂族硫烷基]、亚磺酰基[例如，脂族亚磺酰基或环脂族亚磺酰基]、磺酰基[例如，脂族-so2-、脂族氨基-so2-,或环脂族-so2-]、酰胺基[例如，氨基羰基,烷基氨基羰基、烷基羰基氨基、环烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、环烷基羰基氨基、芳基氨基羰基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(环烷基烷基)羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、杂芳基羰基氨基或杂芳基氨基羰基]、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、烷氧基羰基,烷基羰基氧基、环脂族基、杂环脂族基、芳基、杂芳基、酰基[例如，(环脂族基)羰基或(杂环脂族基)羰基]、氨基[例如，脂族氨基]、硫氧基、氧代、羧基、氨基甲酰基、(环脂族基)氧基、(杂环脂族基)氧基、或(杂芳基)烷氧基。

如本文所用，“酰氨基”包括“氨基羰基”和“羰基氨基”。当单独使用或与另一个基团结合使用时，这些术语是指酰氨基，例如当用在末端时是指-n(r^x)-c(o)-r^y或-c(o)-n(r^x)2，以及当用在内部时是指-c(o)-n(r^x)-或-n(r^x)-c(o)-，其中r^x和r^y可以是氢、脂族基、环脂族基、芳基、芳脂族基、杂环脂族基、杂芳基或杂芳脂族基。酰氨基的例子包括烷基酰氨基(诸如烷基羰基氨基或烷基氨基羰基)、(杂环脂族基)酰氨基、(杂芳烷基)酰氨基、(杂芳)酰氨基、(杂环烷基)烷基酰氨基、芳基酰氨基、芳烷基酰氨基、(环烷基)烷基酰氨基、或环烷基酰氨基。

如本文所用，“氨基”是指-nr^xr^y，其中r^x和r^y中的每一个独立地是氢、脂族基、环脂族基、(环脂族基)脂族基、芳基、芳脂族基、杂环脂族基、(杂环脂族基)脂族基、杂芳基、羧基、硫烷基、亚磺酰基、磺酰基、(脂族基)羰基、(环脂族基)羰基、((环脂族基)脂族基)羰基、芳基羰基、(芳脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、((杂环脂族基)脂族基)羰基、(杂芳基)羰基、或(杂芳脂族基)羰基，其中的每一个是本文所定义的并且是任选经取代的。氨基的例子包括烷基氨基、二烷基氨基、或芳基氨基。当术语“氨基”不是末端基团(例如，烷基羰基氨基)时，它由-nr^x-表示，其中r^x具有与如上所定义相同的含义。

如本文所用，单独使用或作为较大部分的一部分如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中使用的“芳基”是指单环(例如，苯基)环系；双环(例如，茚基、萘基、四氢萘基、四氢茚基)环系；和三环(例如，芴基四氢芴基、或四氢蒽基、蒽基)环系，其中该单环环系是芳族的，或者双环或三环环系中的至少一个环是芳族的。双环和三环基团包括苯并稠合的2-3元碳环。例如，苯并稠合基团包括与两个或更多个c4-8碳环部分稠合的苯基。芳基是任选被一个或多个取代基取代的，该取代基包括脂族基[例如，烷基、烯基、或炔基]；环脂族；(环脂族基)脂族；杂环脂族；(杂环脂族基)脂族；芳基；杂芳基；烷氧基；(环脂族基)氧基；(杂环脂族基)氧基；芳基氧基；杂芳基氧基；(芳脂族基)氧基；(杂芳脂族基)氧基；芳酰基；杂芳酰基；氨基；氧代(在苯并稠合的双环或三环芳基的非芳族碳环上)；硝基；羧基；酰胺基；酰基[例如，(脂族基)羰基；(环脂族基)羰基；((环脂族基)脂族基)羰基；(芳脂族基)羰基；(杂环脂族基)羰基；((杂环脂族基)脂族基)羰基；或(杂芳脂族基)羰基]；磺酰基[例如，脂族-so2-或氨基-so2-]；亚磺酰基[例如，脂族-s(o)-或环脂族-s(o)-]；硫烷基[例如，脂族-s-]；氰基；卤素；羟基；巯基；硫氧基；脲；硫脲；氨磺酰基；磺酰胺；或氨基甲酰基。可替代地，芳基可以是未经取代的。

经取代的芳基的非限制性例子包括卤素芳基[例如，单-、二(诸如对、间二卤素芳基)、和(三卤代)芳基]；(羧基)芳基[例如，(烷氧基羰基)芳基、((芳烷基)羰基氧基)芳基、和(烷氧基羰基)芳基]；(酰胺基)芳基[例如，(氨基羰基)芳基、(((烷基氨基)烷基)氨基羰基)芳基、(烷基羰基)氨基芳基、(芳基氨基羰基)芳基、和(((杂芳基)氨基)羰基)芳基]；氨基芳基[例如，((烷基磺酰基)氨基)芳基或((二烷基)氨基)芳基]；(氰基烷基)芳基；(烷氧基)芳基；(氨磺酰基)芳基[例如，(氨基磺酰基)芳基]；(烷基磺酰基)芳基；(氰基)芳基；(羟基烷基)芳基；((烷氧基)烷基)芳基；(羟基)芳基、((羧基)烷基)芳基；(((二烷基)氨基)烷基)芳基；(硝基烷基)芳基；(((烷基磺酰基)氨基)烷基)芳基；((杂环脂族基)羰基)芳基；((烷基磺酰基)烷基)芳基；(氰基烷基)芳基；(羟基烷基)芳基；(烷基羰基)芳基；烷基芳基；(三卤代烷基)芳基；对氨基-间烷氧基羰基芳基；对氨基-间氰基芳基；对卤代-间氨基芳基；或(间(杂环脂族基)-邻(烷基))芳基。

如本文所用，“芳脂族”，诸如“芳烷基”，是指被芳基取代的脂族基团(例如，c1-4烷基)。“脂族”、“烷基”和“芳基”是本文中所定义的。芳脂族基团诸如芳烷基的例子是苄基。

如本文所用，“芳烷基”是指被芳基取代的烷基(例如，c1-4烷基)。“烷基”和“芳基”二者均已在上面定义。芳烷基的例子是苄基。芳烷基任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如脂族基[例如，烷基、烯基、或炔基，包括羧基烷基、羟基烷基、或卤代烷基诸如三氟甲基]、环脂族基[例如，环烷基或环烯基]、(环烷基)烷基、杂环烷基、(杂环烷基)烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基氧基、杂环烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、杂芳烷基氧基、芳酰基、杂芳酰基、硝基、羧基、烷氧基羰基,烷基羰基氧基、酰胺基[例如，氨基羰基,烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、(环烷基烷基)羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(杂环烷基烷基)羰基氨基、杂芳基羰基氨基,或杂芳烷基羰基氨基]、氰基、卤素、羟基、酰基、巯基,烷基硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、或氨基甲酰基。

如本文所用，“双环环系”包括形成两个环的6-12(例如，8-12或9、10或11)元结构，其中这两个环具有至少一个共用原子(例如，2个共用原子)。双环环系包括双环脂族基团(例如，双环烷基或双环烯基)、双环杂脂族基团、双环芳基、和双环杂芳基。

如本文所用，“环脂族”基团包括“环烷基”和“环烯基”，其中每个基团是如下所述任选经取代的。

如本文所用，“环烷基”是指3-10(例如，5-10)个碳原子的饱和碳环单或双(稠合或桥连)环。环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基、降冰片基、环庚基、八氢-茚基、十氢-萘基、双环[3.2.1]辛基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.3.1]壬基、双环[3.3.2]癸基、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基、或((氨基羰基)环烷基)环烷基。

如本文所用，“环烯基”是指具有一个或多个双键的3-10(例如4-8)个碳原子的非芳族碳环。环烯基的例子包括环戊烯基、1,4-环己-二-烯基、环庚烯基、环辛烯基、六氢-茚基、八氢-萘基、环己烯基、双环[2.2.2]辛烯基、或双环[3.3.1]壬烯基。

环烷基或环烯基可任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如磷酸基、脂族基[例如，烷基、烯基,或炔基]、环脂族基、(环脂族基)脂族基、杂环脂族基、(杂环脂族基)脂族基、芳基、杂芳基、烷氧基、(环脂族基)氧基、(杂环脂族基)氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、(芳脂族基)氧基、(杂芳脂族基)氧基、芳酰基、杂芳酰基、氨基、酰胺基[例如，(脂族基)羰基氨基、(环脂族基)羰基氨基、((环脂族基)脂族基)羰基氨基、(芳基)羰基氨基、(芳脂族基)羰基氨基、(杂环脂族基)羰基氨基、((杂环脂族基)脂族基)羰基氨基、(杂芳基)羰基氨基,或(杂芳脂族基)羰基氨基]、硝基、羧基[例如，hooc-、烷氧基羰基、或烷基羰基氧基]、酰基[例如，(环脂族基)羰基、((环脂族基)脂族基)羰基、(芳脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、((杂环脂族基)脂族基)羰基,或(杂芳脂族基)羰基]、氰基、卤素、羟基、巯基、磺酰基[例如，烷基-so2-和芳基-so2-]、亚磺酰基[例如，烷基-s(o)-]、硫烷基[例如，烷基-s-]、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、或氨基甲酰基。

如本文所用，术语“杂环脂族”包括杂环烷基和杂环烯基，其中的每一个是如下所述任选经取代的。

如本文所用，“杂环烷基”是指3-10元单或双环(稠合的或桥接的)(例如，5至10元单或双环)饱和环结构，其中一个或多个环原子是杂原子(例如，n、o、s或其组合)。杂环烷基的例子包括哌啶基、哌嗪基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、1,4-二氧戊环基、1,4-二噻烷基、1,3-二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、硫代吗啉基、八氢苯并呋喃基、八氢色烯基、八氢硫代色烯基、八氢吲哚基、八氢吡啶基、十氢喹啉基、八氢苯并[b]噻吩基、2-氧杂-双环[2.2.2]辛基、1-氮杂-双环[2.2.2]辛基、3-氮杂-双环[3.2.1]辛基、和2,6-二氧杂-三环[3.3.1.03,7]壬基。单环杂环烷基可以与苯基部分稠合以形成诸如四氢异喹啉的结构，该结构将被归类为杂芳基。

如本文所用，“杂环烯基”是指具有一个或多个双键的单或双环(例如，5至10元单或双环)非芳族环结构，并且其中一个或多个环原子是杂原子(例如，n、o或s)。单环和双环杂环脂族基团根据标准化学命名法编号。

杂环烷基或杂环烯基可任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如磷酸基、脂族基[例如，烷基、烯基,或炔基]、环脂族基、(环脂族基)脂族基、杂环脂族基、(杂环脂族基)脂族基、芳基、杂芳基、烷氧基、(环脂族基)氧基、(杂环脂族基)氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、(芳脂族基)氧基、(杂芳脂族基)氧基、芳酰基、杂芳酰基、氨基、酰胺基[例如，(脂族基)羰基氨基、(环脂族基)羰基氨基、((环脂族基)脂族基)羰基氨基、(芳基)羰基氨基、(芳脂族基)羰基氨基、(杂环脂族基)羰基氨基、((杂环脂族基)脂族基)羰基氨基、(杂芳基)羰基氨基,或(杂芳脂族基)羰基氨基]、硝基、羧基[例如，hooc-、烷氧基羰基、或烷基羰基氧基]、酰基[例如，(环脂族基)羰基、((环脂族基)脂族基)羰基、(芳脂族基)羰基、(杂环脂族基)羰基、((杂环脂族基)脂族基)羰基,或(杂芳脂族基)羰基]、硝基、氰基、卤素、羟基、巯基、磺酰基[例如，烷基磺酰基或芳基磺酰基]、亚磺酰基[例如，烷基亚磺酰基]、硫烷基[例如，烷基硫烷基]、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、或氨基甲酰基。

如本文所用，“杂芳基”是指具有4至15个环原子的单环、双环或三环环系，其中一个或多个环原子是杂原子(例如，n、o、s或其组合)，并且其中该单环环系是芳族的，或者该双环或三环环系中的至少一个环是芳族的。杂芳基包括具有2至3个环的苯并稠合的环系。例如，苯并稠合的基团包括与一个或两个4至8元杂环脂族部分稠合的苯并基(例如，吲嗪基、吲哚基、异吲哚基、3h-吲哚基、二氢吲哚基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩-基、喹啉基、或异喹啉基)。杂芳基的一些例子是氮杂环丁烷基、吡啶基、1h-吲唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻唑基、呫吨、噻吨、吩噻嗪、二氢吲哚、苯并[1,3]二氧杂环戊烯、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、噌啉基、喹啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、异喹啉基、4h-喹嗪基、苯并-1,2,5-噻二唑基、或1,8-萘啶基。

非限制性地，单环杂芳基包括呋喃基、噻吩-基、2h-吡咯基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、1,3,4-噻二唑基、2h-吡喃基、4-h-吡喃基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡唑基、吡嗪基、或1,3,5-三嗪基。单环杂芳基根据标准化学命名法编号。

非限制性地，双环杂芳基包括吲嗪基、吲哚基、异吲哚基、3h-吲哚基、二氢吲哚基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、喹啉基、异喹啉基、吲嗪基、异吲哚基、吲哚基、苯并[b]呋喃基、bexo[b]噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4h-喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉、喹喔啉基、1,8-萘啶基、或蝶啶基。双环杂芳基根据标准化学命名法编号。

杂芳基任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如脂族基[例如，烷基、烯基,或炔基]；环脂族；(环脂族基)脂族；杂环脂族；(杂环脂族基)脂族；芳基；杂芳基；烷氧基；(环脂族基)氧基；(杂环脂族基)氧基；芳基氧基；杂芳基氧基；(芳脂族基)氧基；(杂芳脂族基)氧基；芳酰基；杂芳酰基；氨基；氧代(在双环或三环杂芳基的非芳香族碳环或杂环上)；羧基；酰胺基；酰基[例如，脂族羰基；(环脂族基)羰基；((环脂族基)脂族基)羰基；(芳脂族基)羰基；(杂环脂族基)羰基；((杂环脂族基)脂族基)羰基；或(杂芳脂族基)羰基]；磺酰基[例如，脂族磺酰基或氨基磺酰基]；亚磺酰基[例如，脂族亚磺酰基]；硫烷基[例如，脂族硫烷基]；硝基；氰基；卤素；羟基；巯基；硫氧基；脲；硫脲；氨磺酰基；磺酰胺；或氨基甲酰基。可替代地，杂芳基可以是未经取代的。

经取代的杂芳基的非限制性例子包括(卤代)杂芳基[例如，单和二-(卤代)杂芳基]；(羧基)杂芳基[例如，(烷氧基羰基)杂芳基]；氰基杂芳基；氨基杂芳基[例如，((烷基磺酰基)氨基)杂芳基和((二烷基)氨基)杂芳基]；(酰胺基)杂芳基[例如，氨基羰基杂芳基、((烷基羰基)氨基)杂芳基、((((烷基)氨基)烷基)氨基羰基)杂芳基、(((杂芳基)氨基)羰基)杂芳基、((杂环脂族基)羰基)杂芳基、和((烷基羰基)氨基)杂芳基]；(氰基烷基)杂芳基；(烷氧基)杂芳基；(氨磺酰基)杂芳基[例如，(氨基磺酰基)杂芳基]；(磺酰基)杂芳基[例如，(烷基磺酰基)杂芳基]；(羟基烷基)杂芳基；(烷氧基烷基)杂芳基；(羟基)杂芳基；((羧基)烷基)杂芳基；(((二烷基)氨基)烷基]杂芳基；(杂环脂族基)杂芳基；(环脂族基)杂芳基；(硝基烷基)杂芳基；(((烷基磺酰基)氨基)烷基)杂芳基；((烷基磺酰基)烷基)杂芳基；(氰基烷基)杂芳基；(酰基)杂芳基[例如，(烷基羰基)杂芳基]；(烷基)杂芳基；或(卤代烷基)杂芳基[例如，三卤代烷基杂芳基]。

如本文所用的“杂芳脂族”(诸如杂芳烷基)是指被杂芳基取代的脂族基团(例如，c1-4烷基)。“脂族”、“烷基”和“杂芳基”已在上面定义。

如本文所用，“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基(例如，c1-4烷基)。“烷基”和“杂芳基”均已在上面定义。杂芳烷基任选被一个或多个取代基取代，该取代基诸如烷基(包括羧基烷基、羟基烷基、和卤代烷基诸如三氟甲基)、烯基、炔基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环烷基、(杂环烷基)烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基氧基、杂环烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、杂芳烷基氧基、芳酰基、杂芳酰基、硝基、羧基、烷氧基羰基,烷基羰基氧基、氨基羰基,烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、(环烷基烷基)羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(杂环烷基烷基)羰基氨基、杂芳基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、氰基、卤素、羟基、酰基、巯基、烷基硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、或氨基甲酰基。

如本文所用，“环状部分”和“环状基团”是指单、双和三环环系，包括环脂族、杂环脂族、芳基或杂芳基，其中的每一个已在前面定义。

如本文所用，“桥连双环环系”是指双环杂环脂族环系或双环环脂族环系，其中环是桥连的。桥连双环环系的例子包括但不限于金刚烷基、降冰片基、双环[3.2.1]辛基、双环[2.2.2]辛基、双环[3.3.1]壬基、双环[3.3.2]癸基、2-氧杂双环[2.2.2]辛基、1-氮杂双环[2.2.2]辛基、3-氮杂双环[3.2.1]辛基、和2,6-二氧杂-三环[3.3.1.03,7]壬基。桥连双环环系可任选被一个或多个取代基取代，该取代基诸如烷基(包括羧基烷基、羟基烷基、和卤代烷基诸如三氟甲基)、烯基、炔基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环烷基、(杂环烷基)烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、环烷基氧基、杂环烷基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、芳烷基氧基、杂芳烷基氧基、芳酰基、杂芳酰基、硝基、羧基、烷氧基羰基,烷基羰基氧基、氨基羰基,烷基羰基氨基、环烷基羰基氨基、(环烷基烷基)羰基氨基、芳基羰基氨基、芳烷基羰基氨基、(杂环烷基)羰基氨基、(杂环烷基烷基)羰基氨基、杂芳基羰基氨基、杂芳烷基羰基氨基、氰基、卤素、羟基、酰基、巯基,烷基硫烷基、硫氧基、脲、硫脲、氨磺酰基、磺酰胺、氧代、或氨基甲酰基。

如本文所用，酰基是指甲酰基或r^x-c(o)-(诸如烷基-c(o)-，也称为烷基羰基)，其中r^x和烷基已在前面定义。乙酰基和新戊酰基是酰基的例子。

如本文所用，“芳酰基”或“杂芳酰基”是指芳基-c(o)-或杂芳基-c(o)-。芳酰基或杂芳酰基的芳基和杂芳基部分如前面所定义地任选被取代。

如本文所用，“烷氧基”基团是指烷基-o-基团，其中“烷基”已在前面定义。

如本文所用，“氨基甲酰基”是指具有-o-co-nr^xr^y或-nr^x-co-o-r^z结构的基团，其中r^x和r^y已在上面定义，r^z可以是脂族基、芳基、芳脂族基、杂环脂族基、杂芳基或杂芳脂族基。

如本文所用，“羧基”当用作末端基团时是指-cooh、-coor^x、-oc(o)h、-oc(o)r^x；或者当用作内部基团时是指-oc(o)-或-c(o)o-。

如本文所用，“卤代脂族”基团是指被1-3个卤素取代的脂族基团。例如，术语卤代烷基包括基团-cf3、-chf2、和-ch2f。

如本文所用，“巯基”是指-sh。

如本文所用，“磺基”当用在末端时是指-so3h或-so3r^x，或者当用在内部时是指-s(o)3-。

如本文所用，“磺酰胺”基团是指当用在末端时是指-nr^x-s(o)2-nr^yr^z，并且当用作内部时是指-nr^x-s(o)2-nr^y-，其中r^x、r^y、和r^z已在上面定义。

如本文所用，“氨磺酰基”是指-o-s(o)2-nr^yr^z结构，其中r^y和r^z已在上面定义。

如本文所用，“磺酰胺”基团当用在末端时是指-s(o)2-nr^xr^y或-nr^x-s(o)2-r^z结构；或者当用在内部时是指-s(o)2-nr^x-或-nr^x-s(o)2-，其中r^x、r^y和r^z是上面所定义的。

如本文所用，“硫烷基”当用在末端时是指-s-r^x，并且当用在内部时是指-s-，其中r^x已在上面定义。硫烷基的例子包括脂族-s-、环脂族-s-、芳基-s-等。

如本文所用，“亚磺酰基”当用在末端时是指-s(o)-r^x，并且当用在内部时是指-s(o)-，其中r^x已在上面定义。示例性亚磺酰基包括脂族-s(o)-、芳基-s(o)-、(环脂族基(脂族基))-s(o)-、环烷基-s(o)-、杂环脂族-s(o)-、杂芳基-s(o)-等。

如本文所用，“磺酰基”当用在末端时是指-s(o)2-r^x，并且当用在内部时是指-s(o)2-，其中r^x已在上面定义。示例性的磺酰基包括脂族-s(o)2-、芳基-s(o)2-、(环脂族基(脂族基))-s(o)2-、环脂族-s(o)2-、杂环脂族-s(o)2-、杂芳基-s(o)2-、(环脂族基(酰氨基(脂族基)))-s(o)2-等。

如本文所用，当用在末端使用时，“磺酰氧基”是指-o-s(o)-r^x或-s(o)-o-r^x，并且当用在内部时是指-o-s(o)-或-s(o)-o-，其中r^x已在上面定义。

如本文所用，“卤素”或“卤代”基团是指氟、氯、溴或碘。

如本文所用，术语羧基所涵盖的“烷氧基羰基”，单独使用或与另一基团结合使用，是指诸如烷基-o-c(o)-的基团。

如本文所用，“烷氧基烷基”是指烷基，诸如烷基-o-烷基-，其中烷基已在上面定义。

如本文所用，“羰基”是指-c(o)-。

如本文所用，“氧代”是指＝o。

如本文所用，术语“磷酸基”是指次膦酸酯和膦酸酯。次膦酸酯和膦酸酯的例子包括-p(o)(r^p)2，其中r^p是脂族基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、(环脂族基)氧基、(杂环脂族基)氧基芳基、杂芳基、环脂族或氨基。

如本文所用，氨基烷基是指(r^x)2n-alkyl-结构。

如本文所用，“氰基烷基”是指(nc)-烷基-结构。

如本文所用，“脲基”是指-nr^x-co-nr^yr^z结构，并且“硫脲基”当用在末端时是指-nr^x-cs-nr^yr^z结构并且当用在内部时是指-nr^x-co-nr^y-或-nr^x-cs-nr^y-，其中r^x、r^y和r^z已在上面定义。

如本文所用，“胍基”是指-n＝c(n(r^xr^y))n(r^xr^y)或-nr^x-c(＝nr^x)nr^xr^y结构，其中r^x和r^y已在上面定义。

如本文所用，术语“脒基”是指-c＝(nr^x)n(r^xr^y)结构，其中r^x和r^y已在上面定义。

通常，术语“近位”是指将取代基放置在包含两个或更多个碳原子的基团上，其中这些取代基附接在相邻的碳原子上。

通常，术语“孪位”是指将取代基放置在包含两个或更多个碳原子的基团上，其中这些取代基附接在相同的碳原子上。

术语“在末端”和“在内部”是指基团在取代基内的位置。当基团存在于取代基末端而不进一步与化学结构的其余部分键合时，该基团是末端的。羧基烷基，即，r^xo(o)c-烷基，是用在末端的羧基的例子。当基团存在于化学结构的取代基的中间时，该基团是内部的。烷基羧基(例如，烷基-c(o)o-或烷基-oc(o)-)和烷基羧基芳基(例如，烷基-c(o)o-芳基-或烷基-o(co)-芳基-)是在内部使用的羧基的例子。

如本文所用，“脂族链”是指支链或直链的脂族基团(例如，烷基、烯基或炔基)。在一些实施例中，直链脂族链具有-[ch2]v-结构，其中v为1-12。在一些实施例中，支链脂族链是被一个或多个脂族基团取代的直链脂族链。支链脂族链具有-[cqq]v-结构，其中q独立地是氢或脂族基团；但是，在至少一个实例中，q应为脂族基团。术语脂族链包括烷基链、烯基链和炔基链，其中烷基、烯基和炔基是上面所定义的。

短语“任选经取代的”可与短语“经取代或未经取代的”互换使用。如本文所述，本发明的化合物可任选地被一个或多个取代基取代，该取代基诸如上文一般性说明的，或如本发明的特定类别、亚类和种类所例示的。如本文所述，变体r1、r2、r3、r4、r5、r6和x以及本文所述的式中含有的其他变量涵盖特定基团，诸如烷基和芳基。除非另有注明，否则这些变量的每个特定基团可任选地被一个或多个本文所述的取代基取代。特定基团的每个取代基进一步任选地被1至3个卤素、氰基、氧代、烷氧基、羟基、氨基、硝基、芳基、环脂族基、杂环脂族基、杂芳基、卤代烷基、和烷基取代。例如，烷基可以被烷基硫烷基取代，并且该烷基硫烷基可任选地被1至3个卤素、氰基、氧代、烷氧基、羟基、氨基、硝基、芳基、卤代烷基、和烷基取代。作为另外的例子，(环烷基)羰基氨基的环烷基部分可任选地被1至3个卤素、氰基、烷氧基、羟基、硝基、卤代烷基、和烷基取代。当两个烷氧基与相同原子或相邻原子键合时，这两个烷氧基可与它们所键合的一个或多个原子一起形成环。

通常，术语“经取代的”，无论前面是否有术语“任选地”，是指用给定的取代基替代给定结构中的氢基。具体的取代基描述在上面定义中以及在下面的其化合物和例子的描述中。除非另有指示，否则任选经取代的基团可以在该基团的每个可取代的位置具有取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置可以被多于一个选自特定基团中的取代基取代时，该取代基可以在每个位置相同或不同。环取代基，诸如杂环烷基，可以与另一个环(诸如环烷基)键合，以形成螺-双环环系，例如，两个环共享一个共用原子。如本领域普通技术人员将认识到的，本发明所设想的取代基的组合是导致形成稳定或化学上可行的化合物的那些组合。

除非另有说明，否则本文描绘的结构也意在包括该结构的所有异构(例如，对映异构、非对映异构、和几何异构(或构象异构))形式；例如，每个不对称中心的r和s构型、(z)和(e)双键异构体、以及(z)和(e)构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体、非对映异构体和几何异构体(或构象异构体)混合物都在本发明的范围内。

另外，除非另有说明，否则本文描绘的结构也意在包括仅在一个或多个同位素富集原子的存在下不同的化合物。例如，具有本发明结构的化合物(除了用氘或氚替代氢或用富集¹³c或¹⁴c的碳替代碳)都在本发明的范围内。此类化合物例如可用作生物测定中的分析工具或探针，或者用作治疗剂。

ii.化合物

在一方面，本发明提供了一种式i的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

x是-o-或-s-；

是一个键或不存在；

r1选自氢、c1-6烷基、环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、或杂环烷基，其中任一个是任选经取代的；

r2是-l-r’-，其中l是一个键或-c(o)-，并且r’选自氢、c1-6烷基、环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、或杂环烷基，其中r'是任选经取代的；

r3是氢或任选经取代的c1-6烷基；

每个r4独立地选自氢、c1-6烷基、-oh、卤素、卤代烷基、-cn、-no2、-c(o)(c1-6烷基)、-nhc(o)(c1-6烷基)、-oc(o)(c1-6烷基)、-c(o)nh(c1-6烷基)、-c(o)o(c1-6烷基)、-so2(c1-6烷基)、或-so2nh(c1-6烷基)，其中r4是任选经取代的；

r5和r6各自独立地是氢、卤素、或c1-4烷基；并且

n是0、1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，r1是氢、c1-6烷基、环烷基、或芳基，其中该烷基、环烷基或芳基是任选经取代的。例如，r1是烷基、环烷基或芳基，其中任一个任选被卤素取代。在其他实施例中，r1是氢或c1-6烷基，其中该c1-6烷基任选被1-3个卤素取代。并且，在一些实施例中，r1是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基，其中任一个任选被1-3个卤素取代。例如，r1是氟甲基。在其他实施例中，r1是未经取代的c1-6烷基。例如，r1是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基。在某些情况下，r1是乙基。在某些情况下，r1是异丙基。。在某些情况下，r1是叔丁基。在某些情况下，r1是氢。在一些实施方案中，r1是任选经取代的3-7元环烷基、苯基、或萘基，其中任一个是任选经取代的。

在一些实施方案中，l是-c(o)-，并且r'是氢、c1-6烷基、芳烷基、杂芳基、或杂芳烷基，其中r2任选被卤素、cn、羧基或氧代基团取代。例如，l是-c(o)-，并且r2是杂芳基。在其他实施例中，r2是

在一些实施方案中，r3是任选经取代的c1-6烷基。例如，r3是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、或叔丁基，其中任一个是任选经取代的。在其他实施例中，r3是氢。

在一些实施方案中，每个r4独立地选自氢、c1-6烷基、-oh、卤素、-cn、-no2、-c(o)(c1-6烷基)、-nhc(o)(c1-6烷基)、-oc(o)(c1-6烷基)、-c(o)nh(c1-6烷基)、或-c(o)o(c1-6烷基)，其中r4的烷基任选被卤素、-cn、羧基或氧代基团取代。在一些实施例中，每个r4独立地选自氢、c1-6烷基、卤素、-cn、-no2、-c(o)(c1-6烷基)、-c(o)nh(c1-6烷基)、或-c(o)o(c1-6烷基)，其中r4的烷基任选地被卤素、羧基或氧代基团取代。并且，在一些实施例中，每个r4独立地是氢、c1-6烷基或卤素。在其他实施例中，每个r4是氢。

在一些实施方案中，r4是氢，并且r1是氢、c1-6烷基或卤代烷基。

在一些实施方案中，n是0、1或2。例如，n是0。

在一些实施方案中，x是-o-。

在一些实施方案中，x是-s-。

在一些实施方案中，是一个键。

在一些实施方案中，不存在

在一些实施方案中，r5和r6各自独立地是氢或卤素。例如，r5和r6都是-f。

在一些实施方案中，式i的化合物选自下表1中的化合物。

表1：式i的化合物。

iii.药学上可接受的组合物

在本发明的一个方面，提供了药学上可接受的组合物，其中这些组合物包含如本文所述的任何化合物，并且任选地包含药学上可接受的载体、佐剂或媒介物。在某些实施方案中，这些组合物任选还包含一种或多种另外的治疗剂。

还应理解，本发明的某些化合物可以处于用于治疗的游离形式，或在适当情况下，作为其药学上可接受的衍生物或前药存在。根据本发明，药学上可接受的衍生物或前药包括但不限于药学上可接受的盐、酯、此类酯的盐，或任何其他加合物或衍生物，其在给予有需要的患者后能够直接或间接提供本文另外描述的化合物或其代谢物或残余物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。“药学上可接受的盐”意指本发明化合物的酯的任何无毒盐或盐，其在给予接受者后能够直接或间接地提供本发明化合物或其抑制活性的代谢产物或残余物。

药学上可接受的盐是在本领域中熟知的。例如，s.m.berge等人在j.pharmaceuticalsciences,1977,66,1-19(将其通过引入并入本文)中详细描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括从合适的无机和有机酸和碱衍生的那些。药学上可接受的无毒的酸加成盐的例子是氨基基团与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其他方法(如离子交换)形成的盐。

其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、双葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙二磺酸盐(乙烷二磺酸盐)、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。从适当的碱衍生的盐包括碱金属、碱土金属、铵和n⁺(c1-4烷基)4盐。本发明还设想了本文公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。通过此类季铵化可以获得水溶性或油溶性或可分散的产物。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。当适当时，另外的药学上可接受的盐包括使用抗衡离子诸如卤根、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒铵，季铵和胺阳离子。

如上所述，本发明的药学上可接受的组合物另外包含药学上可接受的载体、佐剂或媒介物，其如本文所用包括如适合于所希望的特定剂型的任何和所有溶剂、稀释剂、或其他液体媒介物，分散或悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂，固体粘合剂，润滑剂等。remington’spharmaceuticalsciences,第十六版,e.w.martin(mackpublishingco.,easton,pa.,1980)披露了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除非任何常规载体介质与本发明化合物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学效应或在其他方面以有害方式与该药学上可接受的组合物的一种或多种任何其他组分相互作用，否则其用途预期在本发明的范围内。可用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白诸如人血清白蛋白，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸或山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，羊毛脂，糖诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇或聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其他非毒性相容的润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，释放剂，包衣剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，根据配制者的判断，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于该组合物中。

iv.化合物的使用和给予

在另一方面，本发明提供了一种治疗受试者中的炎症或减轻其严重程度的方法，该方法包括向有需要的受试者、优选哺乳动物给予有效量的包含式i的化合物的组合物。本发明还提供了一种治疗受试者中的炎性疾病或减轻其严重程度的方法，该方法包括向有需要的受试者、优选哺乳动物给予有效量的包含式i的化合物的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种治疗糖皮质激素受体所涉及的病症、疾病或障碍或减轻其严重程度的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗糖皮质激素受体活性缺乏所涉及的病症、疾病或障碍的方法，该方法包括向有需要的受试者、优选哺乳动物给予有效量的包含式i的化合物的组合物。在某些实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的炎性病症、疾病或障碍的方法，其中该受试者具有正常的糖皮质激素受体活性，该方法向有需要的受试者、优选哺乳动物给予有效量的包含式i的化合物的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种治疗糖皮质激素受体所涉及的病症、疾病或障碍或减轻其严重程度的方法，其中该病症、疾病或障碍选自哮喘、关节炎、狼疮、克罗恩病、炎性肠病、乳糜泻、肾小球肾炎、寻常痤疮、白血病和胰腺癌。

根据本发明，该化合物或药学上可接受的组合物的“有效量”是有效治疗如上所述一种或多种疾病、障碍或病症或减轻其严重程度的量。

根据本发明的方法的化合物和组合物可以使用有效治疗如上所述一种或多种疾病、障碍或病症或减轻其严重程度的任何给予量和任何给予途径进行给予。

取决于受试者的物种、年龄和一般状况、感染的严重程度、具体的药剂、其给予模式等，所需的确切量将因受试者而变化。优选地将本发明的化合物配制成剂量单位形式，以便于剂量的给予和均匀性。如本文所用的表述“剂量单位形式”是指适合用于待治疗的患者的物理上离散的药剂单位。然而，应当理解，本发明的化合物和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者或生物体的特定有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所用特定化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；所用特定化合物的给予时间、给予途径和排泄率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合或同步使用的药物，以及医学领域中熟知的相似因素。如本文所用，术语“患者”是指动物、优选哺乳动物、并且最优选人。

取决于所治疗的感染的严重程度，本发明的药学上可接受的组合物可以向人和其他动物口服地、直肠地、肠胃外地、脑池内地、阴道内地、腹膜内地、局部地(如通过粉剂、软膏、滴剂或贴剂)、经颊地、作为口服或鼻喷雾剂等给予。在某些实施方案中，本发明的化合物能以每天约0.01mg/kg至约50mg/kg、优选地从约0.5mg/kg至约25mg/kg的受试者体重的剂量水平每天一次或多次口服或肠胃外给予，以获得所需的治疗效果。

用于口服给予的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物外，这些液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，诸如例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、和脱水山梨糖醇脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂外，这些口服组合物还可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和芳香剂。

可以使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。该无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌的固定油用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸(诸如油酸)用于制备注射剂。

可注射配制品可以是经灭菌的，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂，可以在使用前将这些无菌固体组合物溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。

为了延长本发明化合物的效果，通常希望的是减缓从皮下或肌内注射的化合物吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，化合物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率进而可取决于晶体大小和晶形。可替代地，通过将化合物溶解或悬浮在油性载体中来实现胃肠外给予的化合物形式的延迟吸收。通过形成化合物在可生物降解聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中的微囊基质来制造可注射的储库(depot)形式。取决于化合物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制化合物释放的速率。其他可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库可注射配制品。

用于直肠或阴道给予的组合物优选为栓剂，这些栓剂可通过以下方式制备：将本发明化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合，该赋形剂或载体在环境温度下为固体但在体温下为液体并且因此在直肠或阴道腔内融化并且释放活性化合物。

用于口服给予的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，该活性化合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体混合，该赋形剂或载体诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、和硅酸；b)粘合剂，诸如例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、和阿拉伯胶；c)保湿剂，诸如甘油；d)崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠；e)溶解迟延剂，诸如石蜡；f)吸收促进剂，诸如季铵化合物；g)润湿剂，诸如十六醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；以及i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、以及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。

类似类型的固体组合物也可作为填充剂用于使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，这些包衣和外壳诸如肠溶包衣和药物配制领域中熟知的其他包衣。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以具有如下的组成，即它们仅释放一种或多种活性成分，或优先在肠道的某一部分中，优选以延迟的方式。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物也可作为填充剂用于使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中。

活性化合物也可以呈具有一种或多种如上所指的赋形剂的微囊化形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，这些包衣和外壳诸如肠溶包衣、控释包衣和药物配制领域中熟知的其他包衣。在此类固体剂型中，活性化合物可以与至少一种惰性稀释剂诸如蔗糖、乳糖或淀粉混合。这些剂型还可包含(作为通常实践)除惰性稀释剂例如压片润滑剂和其他压片助剂诸如硬脂酸镁和微晶纤维素之外的另外物质。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以具有如下的组成，即它们仅释放一种或多种活性成分，或优先在肠道的某一部分中，优选以延迟的方式。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。

用于局部或透皮给予本发明化合物的剂型包括软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。在无菌条件下将活性组分与药学上可接受的载体和如可能需要的任何所需的防腐剂或缓冲剂混合。眼科配制品、滴耳剂和滴眼剂也预期在本发明的范围内。另外，本发明考虑使用透皮贴剂，透皮贴剂具有向身体提供化合物控制递送的附加优点。此类剂型通过将化合物溶解或分配在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物跨越皮肤的通量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

在本发明中用作糖皮质激素受体调节剂的化合物的活性可以根据本领域和本文实施例中一般性说明的方法进行测定。

v.实施例

提供本文提供的实施例，使得可以更全面地理解本发明，并且不意在以任何方式进行限制。

通用合成方案

方案1：

方案1和2提供了从可商购皮质醇合成式1-g(其中r1、r4和r’是上面定义的)的化合物的通用合成。从方案1中，用诸如高碘酸的试剂将皮质醇氧化提供式1-a的羧酸，可以在该合成的后期将其进一步官能化。用碱和醛试剂诸如nah/甲酸甲酯条件处理1-a提供了式1-b的化合物。用任选经取代的苯基肼处理1-b(例如，方案1和2示出了在间位上的取代基)提供式1-c的化合物。用结构的酰氯将17α羟基取代基官能化提供了式1-d的化合物。

方案2提供了关于式1-d的化合物的羧酸部分的官能化的通用合成。为了获得酯，可以将式1-d的化合物用碱和式r¹-lg的化合物(其中lg是离去基团)处理以提供式1-e。可通过首先用合适的试剂诸如n,n-二甲基氨基硫代甲酰氯将羧酸部分转化为式1-f的硫代羧酸获得1-d的硫酯，可以使该硫代羧酸与式r¹-lg(其中lg是离去基团)的化合物进一步反应以提供式1-g的化合物。

方案3：

方案4：

根据以上方案3和4，可以从起始化合物诸如2-a合成式2-i的化合物。反应步骤、这些步骤的顺序、和所用试剂意在是说明性的并且不意在以任何方式限制本发明。

根据方案3，可以使用高碘酸来实现将2-a的α-羟基乙酰基的羟基甲基进行氧化裂解以提供2-b。使用例如氢气和pd/c催化剂来还原2-b的烯属部分以提供饱和产物2-c。使用例如分子溴进行后续溴化提供双-α,α’溴化物化合物2-d。使用碱(诸如碳酸钙)和催化剂(诸如溴化锂)进行溴取代基的双重消除提供2-e。可以用碱诸如氢化钠实现2-e的烯醇化物的生成，随后甲酸甲酯的亲核加成可以提供化合物2-f。将2-f用任选经取代的苯肼处理(例如，方案3和4示出了在间位的取代基)可以提供吡嗪化合物2-g。随后使用式r’-c(o)-x的活化羰基化合物(其中x为离去基团，诸如氯基)对2-g的游离羟基进行酯化可提供式2-h的化合物。

方案4提供了关于式2-h的化合物的羧酸部分的官能化的通用合成。为了获得酯，可以用碱和合适的亲电试剂(诸如卤代烷基)处理式2-h的化合物以提供式2-i。可通过首先用合适的试剂诸如n,n-二甲基氨基硫代甲酰氯将羧酸部分转化为式2-j的硫代羧酸获得2-h的硫酯，可以使该硫代羧酸与式r¹-lg(其中lg是离去基团)的化合物进一步反应以提供式2-k。

合成实施例

化合物2-b的合成：

将可商购的化合物2-a(4.1g，10mmol)溶解在甲醇(60ml)中，并且然后在0℃下滴加高碘酸(4.5g，在60ml水中，20mmol)。将混合物在室温下搅拌2h。将甲醇浓缩并且添加h2o(100ml)。过滤沉淀物，将其用水(15×3ml)洗涤，风干以给出作为白色固体的化合物2-b(3.2g)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:12.47(s,1h),7.26(dd,j＝10.2,1.2hz,1h),6.28(dd,j＝10.2,1.9hz,1h),6.09(s,1h),5.63(ddd,j＝48.5,9.6,6.7hz,1h),5.33(dd,j＝3.8,1.7hz,1h),4.71(s,1h),4.17–4.09(m,1h),3.34(s,1h),2.84(ddd,j＝11.1,7.1,4.1hz,1h),2.26–2.16(m,1h),1.49(s,3h),0.99(s,3h),0.86(d,j＝7.1hz,3h)。lr-质量(esi)m/z:397.1[m+h]⁺。

化合物2-c的合成：

将化合物2-b(1.9g，5mmol)溶解在甲醇(200ml)中，并且添加pb/c(200mg)。在室温下在h2下搅拌1天后。将溶液通过硅藻土垫过滤，并且然后在减压下浓缩以给出2-c(1.8g)，其不经纯化进一步使用。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:5.20–4.99(m,1h),4.93(d,j＝2.6hz,1h),4.21(m,1h),2.89–2.77(m,1h),2.56(m,j＝15.9hz,1h),1.24(s,3h),0.93(s,3h),0.86(d,j＝7.1hz,3h)。lr-质量(esi)m/z:401.2[m+h]⁺。

化合物2-d的合成：

将在乙酸(40ml)中的化合物2-c(1.6g)依次用在乙酸(1.6ml)中的6.6m溴化氢和溴在乙酸(4.5ml)中的溶液处理。在室温下搅拌40min后。用水稀释，给出粗2-d(2.1g)。¹hnmr(300mhz,dmso)δ:5.32–4.96(m,3h),4.69(m,2h),4.18(m,1h),3.07(m,1h),2.95(m,1h),2.81(s,1h),1.31(s,3h),0.88(s,3h),0.84(d,j＝7.1hz,3h)。lr-质量(esi)m/z:559.1[m+h]⁺。

化合物2-e的合成：

在氮气下将化合物2-d(2.0g)添加到保持在100℃的碳酸钙(1.1g)和无水溴化锂(0.8g)在二甲基乙酰胺(17ml)中的经剧烈搅拌的悬浮液中。3小时后，将冷却的混合物倒入过量稀盐酸中，将混合物用etoac萃取，用盐水洗涤，经na2so4干燥。通过色谱法将粗产物纯化以给出作为白色固体的化合物2-e，以给出固体(0.6g，43％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:5.85(s,1h),5.62(d,j＝14.8hz,1h),5.27–5.19(m,1h),4.74(m,1h),4.11(m,1h),3.07–2.78(m,3h),2.70–2.58(m,1h),2.42–2.03(m,6h),1.45(s,3h),1.03(s,3h),0.89(d,j＝7.1hz,3h)。lr-质量(esi)m/z:397.1[m+h]⁺。

化合物2-f的合成：

化合物2-e(0.5g)溶解在无水甲苯(15ml)和甲酸甲酯(2ml)中。然后，添加nah(900mg，20mmol，在矿物油中的60％分散体)。在室温下搅拌4h后，添加1nhcl(120ml)并且将混合物用etoac萃取若干次。将溶剂干燥并且除去以给出0.6g作为黄色泡沫的2-f，其不经纯化进一步使用。lr-质量(esi)m/z:425.3[m+h]⁺。

化合物2-g-1的合成：

将化合物2-f(0.50g)溶解在acoh(15ml)和h2o(3ml)中，添加苯基肼(0.14g)。将混合物在室温下搅拌4h。添加冷水(100ml)，过滤沉淀物，将其用h2o(10×3ml)洗涤，风干以给出作为黄色固体的化合物2-g-1(0.44g)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:7.61(s,1h),7.58–7.49(m,4h),7.42(m,1h),6.54(s,1h),5.33–5.20(m,2h),4.16(s,1h),2.38–2.29(m,1h),2.10(d,j＝14.1hz,1h),1.71(q,j＝11.5hz,1h),1.53(d,j＝13.7hz,1h),1.26(s,3h),1.05(s,3h),0.87(d,j＝7.1hz,3h)。lr-质量(esi)m/z:497.3[m+h]⁺。

实施例1：化合物1的合成：

在0℃下在n2下，向化合物2-g-1(400mg，tea(300ml)在干dcm(10ml)中的溶液中添加α-呋喃甲酰氯(200mg)。将混合物在室温下搅拌30min。在减压下蒸发溶剂以给出粗产物，将其通过色谱法用dcm:meoh(50:1)纯化以给出作为白色固体的化合物1(82％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:8.01–7.98(m,1h),7.64(s,1h),7.60–7.51(m,5h),7.45(m,1h),7.16(dd,j＝3.5,0.6hz,1h),6.70(dd,j＝3.5,1.7hz,1h),6.59(s,1h),5.38(dd,j＝21.7,8.8hz,2h),4.26(s,1h),1.29(s,3h),1.23(s,2h),1.11(s,3h),0.92(d,j＝7.1hz,3h)。lr-质量(esi)m/z:591.2[m+h]⁺。

实施例2：化合物2的合成：

将化合物1(50mg)添加到碳酸钾(30mg)和碘乙烷(20mg)在dmf(2ml)中的经剧烈搅拌的悬浮液中，并且将所得混合物在50℃下搅拌3小时。将反应溶液倒入水(30ml)中并且用etoac(20ml×3)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥。将粗产物通过制备型tlc纯化以给出作为白色固体的化合物2(41mg，79％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:8.00(s,1h),7.65(s,1h),7.61–7.51(m,4h),7.45(m,1h),7.19(d,j＝3.6hz,1h),6.71(dd,j＝3.2,1.6hz,1h),6.58(s,1h),5.47–5.28(m,2h),4.27(s,1h),4.23–4.06(m,2h),1.20(t,3h)。lc-ms(esi)m/z:619.3[m+h]⁺。

实施例3：化合物3的合成：

将化合物1(50mg)添加到碳酸钾(30mg)和2-溴丙烷(15mg)在dmf(2ml)中的经剧烈搅拌的悬浮液中，并且将所得混合物在50℃下搅拌3小时。将反应溶液倒入水(30ml)中并且用etoac(20ml×3)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥。将粗产物通过制备型tlc纯化以给出作为白色固体的化合物3(39mg，73％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.58(s,1h),7.54–7.47(m,6h),7.38(m,1h),7.15(d,j＝3.6hz,1h),6.75(s,1h),6.48(dd,j＝3.2,1.6hz,1h),5.25–5.08(m,2h),4.45(s,1h),1.31(d,3h),1.23(d,3h)。lc-ms(esi)m/z:633.3[m+h]⁺。

实施例4：化合物4的合成：

将化合物1(50mg)添加到碳酸钾(30mg)和氟-碘-甲烷(15mg)在dmf(2ml)中的经剧烈搅拌的悬浮液中，并且将所得混合物在50℃下搅拌3小时。将反应溶液倒入水(30ml)中并且用etoac(20ml×3)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥。将粗产物通过制备型tlc纯化以给出作为白色固体的化合物4(38mg，72％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:8.02(s,1h),7.65(s,1h),7.63–7.50(m,4h),7.45(m,1h),7.25(d,j＝3.6hz,1h),6.73(dd,j＝3.2,1.6hz,1h),6.60(s,1h),5.84(d,j＝112.4hz,1h),5.83(d,1h),5.54(d,1h),5.37(d,1h),4.28(s,1h)。lc-ms(esi)m/z:623.2[m+h]⁺。

实施例5：化合物5的合成：

部分i：向化合物1(200mg)在2-丁酮(5ml)中的经搅拌的溶液中添加n,n-二甲基氨基硫代甲酰氯(83mg)、三乙胺(100mg)和碘化钠(5mg)。将混合物在75℃下搅拌2小时并且然后在真空下浓缩。将所获得的残余物用水洗涤并且干燥以产生0.2g产物。将所获得的化合物添加到吗啉(3ml)中，并且将所获得的混合物在室温下搅拌过夜。然后，将水和乙酸乙酯的混合物在10℃-15℃下添加到上述反应溶液中。最后，逐滴添加冰醋酸(0.5ml)以将ph调节至ph5-7。将沉淀的固体过滤，用水洗涤并且干燥以给出170mg(1r,2r,10as,10br,11s,12as)-5,10b-二氟-1-((呋喃-2-羰基)氧基)-11-羟基-2,10a,12a-三甲基-7-苯基-1,2,3,3a,3b,7,10,10a,10b,11,12,12a-十二氢环戊并[5,6]萘并[1,2-f]吲唑-1-硫代甲s-酸(化合物2-j-1)，其直接用于下一步骤。

部分ii：将化合物2-j-1(50mg)添加到碳酸钾(30mg)和氟-碘-甲烷(15mg)在dmf(2ml)中的经剧烈搅拌的悬浮液中，并且将所得混合物在50℃下搅拌3小时。然后将所获得的溶液倒入水(30ml)中并且用etoac(20ml×3)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，然后浓缩并且通过制备型tlc纯化以给出作为白色固体的化合物5(35mg，66％)。¹hnmr(400mhz,dmso)δ:8.05(s,1h),7.65(s,1h),7.61–7.51(m,4h),7.45(m,1h),7.25(d,j＝3.6hz,1h),6.74(dd,j＝3.2,1.6hz,1h),6.60(s,1h),6.04(s,1h),5.92(s,1h),5.54(s,1h),5.39-5.31(m,1h),4.28(s,1h)。lr-质量(esi)m/z:639.2[m+h]⁺。

实施例6：化合物6的合成：

将化合物1(180mg)添加到碳酸钾(200mg)和2-溴-2-甲基丙烷(10ml)在dmf(5ml)中的经剧烈搅拌的悬浮液中，并且将所得混合物在室温下搅拌8天。将反应溶液倒入水(30ml)中并且用etoac(20ml×3)萃取，将合并的有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥。将粗产物通过制备型tlc纯化以给出作为白色固体的化合物6(11mg，5.6％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ:7.58(s,1h),7.54–7.46(m,6h),7.38(m,1h),7.13(d,j＝3.2hz,1h),6.75(s,1h),6.48(dd,j＝3.2,1.6hz,1h),5.22(d,h),4.45(s,1h),1.50(s,9h)。lc-ms(esi)m/z:647.3[m+h]⁺。

方法和材料

实施例7a：蛋白质表达和纯化。含有对于糠酸莫米松的突变f602a、c622y、t668v、s674t、v675i、k699a、k703a和对于皮质醇的突变f602a、c622y、t668v、s674t、v675i、e684a、和e688a的grlbd(残基525-777)从表达载体pet24a(novagen)中表达为6xhis-gst融合蛋白。经修饰的融合蛋白在n末端含有his6-标签(mkkghhhhhhg)，并且在gst与grlbd之间含有凝血酶蛋白酶位点。使用表达质粒转化的bl21de3细胞在lb肉汤中在16℃下生长至约1的od600，并且用0.1mmiptg和50μm糠酸莫米松或皮质醇诱导。收获细胞，将其再悬浮于200ml提取缓冲液(50mmtris[ph8]、150mmnacl、2m脲、10％甘油+1μm配体)/12升细胞，并且通过压力设定为1000pa的弗氏压碎器(frenchpress)三次。将裂解物以20,000rpm离心30min，并且将上清液上样到25ml镍柱上。将柱用700ml提取缓冲液洗涤，并且用300ml50％缓冲液b(25mmtris[ph8]、500mm咪唑、10％甘油、1μm配体)洗脱。将grlbd在冷室中用凝血酶以1:1000的蛋白酶/蛋白质比率切割过夜，同时针对20mmtris[ph8]、500mmnacl、10％甘油、1μm配体进行透析。通过与ni-nta镍柱结合而除去h6gst标签。通过凝胶过滤(20mmtris[ph8]、500mmnacl、1mmdtt、1mmedta、10％甘油、1μm配体)将流过物进一步纯化。将糠酸莫米松结合的蛋白与较长形式的src2-3肽：spkkkenallrylldkddtkd复合并且过滤浓缩至6mg/ml。将皮质醇grlbd与较短形式的src2-3：kenallrylldkdd和0.2％b-辛基葡糖苷复合，并且过滤浓缩至7mg/ml。

实施例7b：结晶。使糠酸莫米松gr晶体在室温下在含有1μl与gp2肽复合的蛋白质和2μl孔溶液的悬滴中生长，该孔溶液含有0.1m柠檬酸钠[ph6]和2.2m的氯化钠。使皮质醇gr晶体在室温下在含有1μl蛋白质复合物和1μl孔溶液的悬滴中生长，该孔溶液含有0.1m咪唑ph6.5、1m乙酸钠三水合物。将在孔缓冲液中的30％蔗糖用作二者的冷冻保护剂。

实施例7c：结构测定。使用ccp4程序phaser进行分子置换(36)，其中grlbd/地塞米松结构(pdb代码：1m2z)(27)作为搜索模型。使用cns(37)和ccp4程序refmac5(38)手动重建并且细化初始模型。使用pymol(thepymolmoleculargraphicssystem，1.3版，llc)制备所有结构图。

实施例7d：细胞转染和报告基因测定。在转染前一天，在24孔板中将ad293细胞以20,000个/孔分离。对于转录激活，用x-tremegene9(roche)将100ngphhluc(mmtv-luc)质粒、0.1ngprshgr与5ngphrgtkrenilla一起转染到每个孔中的ad293细胞中。对于转录抑制，将10ngap1-luc、100ngprshgr和5ngphrgtkrenilla转染到每个孔中的ad293细胞中。在转染后一天，通过不同处理(类固醇或媒介物)诱导细胞16小时过夜。通过1×被动裂解缓冲液(promega)收获细胞，通过dual-glo荧光素酶系统(promega)测定荧光素酶活性。通过荧光素酶值/renilla值将数据绘制为相对荧光素酶单位(rlu)。

实施例7e：体外gr配体结合测定。体外gr结合测定与之前描述的类似(39)。将放射性标记的配体[³h]dex固定在25nm，并且与在taps缓冲液(ph8.8)中的5％gr胞质溶胶加20mm钼酸钠一起孵育，添加冷配体(从0.1nm至10μm变化)以竞争热配体结合。通过graphpadprism5将数据绘制为标准竞争曲线。

生物学实施例

实施例8：皮质醇结合的grlbd和mf结合的grlbd的总体结构。

归因于其溶解度问题，grlbd的结晶一直是一个挑战。用高亲和力配体dex(27)测定原始grlbd结构，该配体与具有f602s突变的grlbd结合，这提高了蛋白质溶解度。然而，皮质醇是比dex弱得多的配体，并且f602s突变不足以使与内皮激素皮质醇结合的grlbd稳定(图8，道1)。为了鉴定可能在不影响总体结构的情况下增加grlbd溶解度的氨基酸，我们将gr与比gr的溶解度大得多的最接近的类固醇激素家族成员mr、雄激素受体(ar)和孕酮受体(pr)进行比对。除了f602之外，残基c622、t668、s674和v675与该家族的保守序列不同，因此诸位本发明人将这些氨基酸突变回保守残基(f602a、c622y、t668v、s674t和v675i，称为ayvti)。这些残基中的大多数都发现于蛋白质内部，其中pr残基在prlbd结构中具有更好的包装(28)。实际上，当与皮质醇结合时，avytigrlbd具有比f602slbd好得多的溶解性(图8，道2)。可以将突变的grlbd表达并且纯化，产率大于5mg/升。然而，诸位发明人未能获得与皮质醇或mf结合的此突变的grlbd的晶体。该grlbd在其螺旋h9中具有若干个赖氨酸和谷氨酸残基，其长侧链可能影响结晶。具有这些残基的丙氨酸突变(对于mf为k669a/k703a，并且对于皮质醇为e684a/e688a)作为表面熵减突变的grlbd保持可溶(图8，道3和4)并且允许我们获得与mf和皮质醇结合的grlbd的晶体(图9)。所有这些突变远离配体结合口袋并且不改变配体介导的gr转录激活或转录抑制功能(图10)。

mf结合的grlbd和皮质醇结合的grlbd的总体结构(图1a)与dex结合的grlbd相似，其中11个螺旋包装在三层螺旋夹层束中，其中配体结合腔埋在该束的下半部分。表s1总结了数据收集和细化的统计。皮质醇结合的grlbd的总体结构与dex结合的grlbd几乎相同，而mf结合的grlbd与dex结合的grlbd之间存在一些显著差异，包括螺旋1之前的环的取向(在图1b中标记为“1”)；螺旋5与螺旋6之间的环区的扩展(在图1b中标记为“2”)；以及af-2螺旋的c-末端取向的变化(在图1b中标记为“3”)。皮质醇和mf的配体结合模式通过结合的配体和周围口袋残基的清楚电子密度图很好地定义(图1c)。

表2：数据集和结构细化的统计。

rmsd是与蛋白质的理想几何形状的均方根偏差。

实施例9：皮质醇、dex和mf的效力、亲和力。

皮质醇、dex和mf的化学结构的变化(图2a)概括出糖皮质激素的演化：从简单到复杂，从一个水平到多个水平。皮质醇结构提供了基本的4环类固醇骨架；然后dex增加了1,2双键、16甲基化和9α卤化(图2a)；并且mf在22处进一步氯化，并且更重要地，在17α处添加了亲脂性糠酸酯基(图2a)，该糠酸酯替代了dex和皮质醇的羟基。为了测试这些化学变化对gr效力的影响，诸位本发明人以全剂量反应曲线的形式并列地比较了mf、dex和皮质醇对gr转录激活和转录抑制二者的活性。对于转录激活，诸位发明人使用了mmtv驱动的荧光素酶报告基因系统(图2b)。mf和dex在饱和浓度(1μm)下显示出几乎相同的功效(最大活性)，而皮质醇在其饱和浓度(10μm)下仅具有dex功效的80％。相对于dex，mf剂量反应曲线存在大的向左移位，指示mf的效力比dex大20倍。在另一方面，皮质醇曲线具有向右较大移位，显示其效力比dex小10倍。转录激活中mf、dex和皮质醇的ec50值分别为0.33nm、6.7nm和70nm。

对于转录抑制，使用ap1驱动的荧光素酶报告基因(图2c)。mf、dex和皮质醇在其饱和浓度下显示出相似的功效。同样，mf显示出比dex高得多(60倍)的效力，并且皮质醇比dex弱得多；转录抑制中mf、dex和皮质醇的ec50值分别为0.005nm、0.32nm和2.7nm。与诱导需要较高的类固醇浓度的经常观察一致，每种化合物的诱导效力比抑制效力低至少10倍。这种差异提供了通过使用非常低剂量的糖皮质激素将转录抑制与转录激活分离的机会。例如，在0.1nm时，mf达到95％的转录抑制功效，但仅有25％的转录激活功效(图2b和2c)。

通常，高效力取决于对受体的高亲和力，但细胞辅因子也起重要作用。为了测试mf对gr的亲和力，诸位发明人进行了mf、dex和皮质醇的体外gr配体结合竞争测定(图2d)，该测定显示gr结合亲和力的顺序是mf>dex>皮质醇。mf、dex和皮质醇的ki值分别为0.7nm、8nm和91nm。此结果与诸位发明人的效力结果一致。然而，mf与dex之间的体外结合ic50的差异仅为约10倍，而效力差异大得多：对于诱导为20倍，并且对于抑制为60倍(图2b和2c)。效力差异的另一个成分必须借助于与识别由不同配体结合引起的表面构象变化的细胞因子的相互作用。

实施例10：1,2-单键的柔性归因于皮质醇对gr的低亲和力。

为了理解皮质醇的低亲和力的潜在机制，诸位本发明人进行了皮质醇结合的grlbd与dex结合的grlbd的结构比较。皮质醇结合的grlbd的整体结构与dex结合的grlbd几乎完全相同，不存在显著的构象变化。然后，诸位发明人研究了配体结合的细节。如上所述，dex与皮质醇的区分仅在于：1,2-双键、9α卤化和16甲基化(图2a)。dex的c1-c2双键使类固醇a环和c3-酮基团变为平面，从而允许c3-酮易于与r611和q570相互作用(图3a)。相反，由于皮质醇c1-c2单键的柔性，类固醇a环需要弯曲以与r611和q570形成氢键。此外，由于未结合的皮质醇的c1-c2单键在两个构象(a环平面的上方和下方)之间振荡，因此需要水分子来形成氢键网络以将配体保持在适当位置。这些观察结果解释了皮质醇对gr的相对低亲和力。为了证实c1-c2双键的重要性，我们在转录激活测定中测量了泼尼松龙的效力，泼尼松龙与皮质醇的区别仅在于添加了c1-c2双键(图3b，棕色)。实际上，泼尼松龙的c1-c2双键导致皮质醇剂量反应曲线向左移位约5倍(图3b)，并且因此可能占dex引起的总左移位的多于一半。剩余的效力增加很可能归因于c-9α卤化和c-16甲基化，这两者都增加了在受体口袋内的相互作用表面(图11)。

实施例11：17α糠酸酯测定mf的高亲和力。

dex的化学结构形成几乎平坦的二维表面(图4a)，但在mf中，17α糠酸酯以与环平面成几乎90°从所述表面伸出，使该配体成为三维物体(图4b)。在dex结合的grlbd中，在类固醇d环上方存在空的空间，一个由螺旋3、螺旋5、β3-β4弯、和螺旋6-7形成的疏水腔(图4c)。在mf结合的grlbd结构中，突出的17α糠酸酯使配体结合口袋略微扩大并且占据所述腔的大部分空间。亲脂性17α糠酸酯很好地配合该疏水腔，并且与周围的f623、i629、m639、c643、i559和l563氨基酸形成广泛的疏水相互作用(图4d)，类似于在套管接头内的牢固锚定的球，从而解释了为什么mf对gr的亲和力比dex高10倍。

实施例12：q642在识别不同效力的糖皮质激素中起关键作用。

已经描述了grlbd对糖皮质激素的基本识别(27,31,32)。如在dex结合的grlbd中，q570和r611与类固醇a环的c-3酮基相互作用，n564与类固醇c环的c-11羟基相互作用，并且t739与侧链c-21羰基相互作用(图3a)。这四对重要的氢键将类固醇骨架紧紧地固定在适当位置。相对于dex结合的grlbd和皮质醇结合的grlbd，mf的侵入性c-17α糠酸酯基在配体结合口袋内仅引起一种大的变化，这种变化是在螺旋7中q642的移动(图5a)。在dex结合的grlbd结构中，q642垂直于螺旋7的轴并且与dex的c-17α羟基形成氢键。在结合mf后，c-17α糠酸酯基将q642推开，将其弯曲近90°成平行于螺旋7的轴的位置(图5a)。

由于q642取向是在mf结合后在配体结合口袋中唯一的大变化，因此诸位本发明人将q642突变使其更小(q642a)、更大(q642f)、疏水(q642l)、或带电荷(q642e、q642k)，或者只使其略微改变(q642n)。我们使用亚饱和浓度的mf或dex(mf，1nm；dex，10nm)测试这些突变。令人感兴趣的是，对于一种突变(q642n)，dex活性几乎被消除，而mf活性保持最大(图5b)。因此，单个突变可以完全将mf的活性与dex的活性分开。其他突变导致dex和mf二者的大部分活性丧失；例外是，q642l具有与mf的一半活性，但没有或具有很低的与dex的活性。mf的17α糠酸酯也略微改变了m560和m639周围的构象，但这些残基的突变与q642n突变没有相同的效果(图12)。

为了分析q642在识别不同效力的配体上的突出作用，诸位本发明人在gr转录激活测定中确定了mf、dex和皮质醇—分别代表高、中等和低效力—与q642n的结合中的全剂量反应曲线(图5c)。对于mf，q642n的剂量反应曲线与野生型的剂量反应曲线无法区分。对于dex，相对于野生型，q642n导致曲线向右较大移位，ec50从7.5nm变为40nm，效力降低了5倍。对于皮质醇，即使在饱和浓度下，q642n受体变体也是无活性的。因此，单突变q642n具有完全分离高、中等和低效力配体的能力，表明q642用作识别不同效力的配体的传感器。当结合中等或低效力的糖皮质激素(例如，dex或皮质醇)时，q642与17α羟基形成氢键以在配体结合口袋内将结合配体拴系在适当位置。当与高效力配体诸如mf结合时，q642被17α亲脂基团推开。这种变化，与由配体结合引起的其他小变化结合，扰乱了螺旋6、6和7，导致螺旋5与螺旋6之间的环扩大，并且改变了af2螺旋的c-末端的取向(图1b)，产生高效力的特征。

为了研究q642在不同配体的结合中的确切作用，我们测试了grq642a的配体结合能力，其中dex在单一不饱和浓度下几乎没有转录激活活性(图5b)。在使用来自表达野生型gr或grq642a的ad293细胞的胞质溶胶的体外结合测定中，q642a突变体与野生型gr相比显示出对dex的结合亲和力的显著丧失(kd(q642a)＝22.3nm，相比于kd(wt)＝5.2nm)，但在高配体浓度下仍保持一些亲和力(图13a)。在另一方面，在报告基因分析中，q642a即使在饱和浓度的dex下也显示出几乎没有转录激活活性(图13b)。这些数据显示，grq642a的dex转录激活的缺乏是归因于配体亲和力的降低和抑制gr激活的构象变化二者。与dex和皮质醇不同，q642不与mf形成氢键。为了确定q642a是否仍具有结合mf的能力，我们使用grq642a突变蛋白进行了竞争结合实验(图13c)。mf和皮质醇二者均能够竞争³h-dex与grq642a的结合，但亲和力有较大下降(mf和皮质醇的ki分别为9nm和250nm，分别与在0.7nm和91nm下的野生型gr相比较)。总之，这些结果表明q642通过与含有c-17α羟基的配体形成氢键来充当支柱以支撑螺旋7的脊，同时推开具有c-17α糠酸酯基的配体。用小的残基像丙氨酸取代q642可导致螺旋7的脊崩塌，并且从而失去所有的转录激活。

实施例13：诱导活性的测定。

在24孔板的每个孔中，将ad293细胞用0.1ngprshgr、100ngmmtv-luc报告基因和10ngtk-renilla内部对照转染。在转染后一天，通过10nm或1um的浓度的候选化合物诱导细胞(参见图14)。收获细胞并且通过promegadual荧光素酶试剂盒测量荧光素酶活性。与10nm浓度的所有其他候选化合物以及vsgc12相比，化合物1显示出低得多的诱导活性。据yuanzhenghe,jingjingshi,weiyi等人discoveryofahighlypotentglucocorticoidforasthmatreatment,celldiscovery(2015)1,15035报道，vsgc12具有以下化学结构：

实施例14：抗炎作用的测定。

使用ova诱导的小鼠哮喘模型来检查候选化合物的抗炎作用。首先用ova(卵白蛋白)将7-9周龄balb/c小鼠进行免疫。在第一次免疫后三周，将小鼠用鼻内ova激发，并且同时施予不同的处理(给予乙醇或10nm的或1000nm的以下之一：dex、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、vsgc12、或ff)。通过flexivent系统(scireq)的强制振荡技术测量响应乙酰胆碱的相关肺(rl)功能。图15，ff与化合物4(标记为cmpd4)的并列比较显示，在小鼠哮喘模型中，化合物4在抑制肺部炎症方面的效力大得多。

实施例15：肺部炎症的效力和抑制的测定。

为了评价候选化合物在报告基因系统中的效力，使用mmtv-荧光素酶报告基因。通过候选化合物在从0.01nm至1000nm的不同剂量下的全剂量反应曲线测量效力，如图16a中指示的(rlu：相对荧光素酶单位)。化合物4显示出比vsgc12和dex二者更高的效力。

为了评价候选化合物抑制肺部炎症的作用，使用ova诱导的小鼠哮喘模型(rl：相对肺部功能)。在0.125mg/kg的相同低剂量下，化合物4在抑制肺部炎症方面显示出比vsgc12高得多的抑制活性，如图16b中所提供的。

表3：瞬时转染标准化-响应不同类固醇浓度的luc活性(图14所示)。

其他实施方案

应理解，虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围定义。其他方面、优点和修改在权利要求书的范围内。

参考文献

1.barnespj(1998)anti-inflammatoryactionsofglucocorticoids:molecularmechanisms.clinsci(lond)94(6):557-572.

2.debosscherk,vandenberghew,haegemang(2003)theinterplaybetweentheglucocorticoidreceptorandnuclearfactor-kappaboractivatorprotein-1:molecularmechanismsforgenerepression.endocrrev24(4):488-522.

3.lefstinja,yamamotokr(1998)allostericeffectsofdnaontranscriptionalregulators.nature392(6679):885-888.

4.hecks,etal.(1994)adistinctmodulatingdomaininglucocorticoidreceptormonomersintherepressionofactivityofthetranscriptionfactorap-1.emboj13(17):4087-4095.

5.reichardthm,etal.(1998)dnabindingoftheglucocorticoidreceptorisnotessentialforsurvival.cell93(4):531-541.

6.rosenj,minerjn(2005)thesearchforsaferglucocorticoidreceptorligands.endocrrev26(3):452-464.

7.schackeh,dockewd,asadullahk(2002)mechanismsinvolvedinthesideeffectsofglucocorticoids.pharmacolther96(1):23-43.

8.stanburyrm,grahamem(1998)systemiccorticosteroidtherapy--sideeffectsandtheirmanagement.brjophthalmol82(6):704-708.

9.nakaej,kitamurat,silverdl,accilid(2001)theforkheadtranscriptionfactorfoxo1(fkhr)confersinsulinsensitivityontoglucose-6-phosphataseexpression.jclininvest108(9):1359-1367.

10.opherkc,etal.(2004)inactivationoftheglucocorticoidreceptorinhepatocytesleadstofastinghypoglycemiaandameliorateshyperglycemiainstreptozotocin-induceddiabetesmellitus.molendocrinol18(6):1346-1353.

11.pinzonejj,etal.(2009)theroleofdickkopf-1inbonedevelopment,homeostasis,anddisease.blood113(3):517-525.

12.hoesjn,etal.(2009)adverseeventsoflow-tomedium-doseoralglucocorticoidsininflammatorydiseases:ameta-analysis.annrheumdis68(12):1833-1838.

13.spiescm,etal.(2011)glucocorticoids.bestpractresclrh25(6):891-900.

14.hoesjn,jacobsjw,buttgereitf,bijlsmajw(2010)currentviewofglucocorticoidco-therapywithdmardsinrheumatoidarthritis.natrevrheumatol6(12):693-702.

15.freyfj,odermatta,freybm(2004)glucocorticoid-mediatedmineralocorticoidreceptoractivationandhypertension.curropinnephrolhypertens13(4):451-458.

16.simonsss,jr.(2008)whatgoesonbehindcloseddoors:physiologicalversuspharmacologicalsteroidhormoneactions.bioessays30(8):744-756.

17.weip,etal.(1998)modulationofhormone-dependentglucocorticoidreceptorfunctionusingatetracycline-regulatedexpressionsystem.journalofsteroidbiochemistryandmolecularbiology64(1-2):1-12.

18.adcockim,nasuharay,stevensda,barnespj(1999)ligand-induceddifferentiationofglucocorticoidreceptor(gr)trans-repressionandtransactivation:preferentialtargettingofnf-kappabandlackofi-kappabinvolvement.brjpharmacol127(4):1003-1011.

19.barnespj,adcockim(2009)glucocorticoidresistanceininflammatorydiseases.lancet373(9678):1905-1917.

20.kaspersgj,etal.(1994)glucocorticoidresistanceinchildhoodleukemia.leuklymphoma13(3-4):187-201.

21.haarmaneg,kaspersgjl,veermanajp(2003)glucocorticoidresistanceinchildhoodleukaemia:mechanismsandmodulation.britjhaematol120(6):919-929.

22.gaynonps,carrelal(1999)glucocorticosteroidtherapyinchildhoodacutelymphoblasticleukemia.advexpmedbiol457:593-605.

23.baxterjd(1976)glucocorticoidhormoneaction.pharmacoltherb2(3):605-669.

24.onrustsv,lambhm(1998)mometasonefuroate.areviewofitsintranasaluseinallergicrhinitis.drugs56(4):725-745.

25.mccormackpl,ploskergl(2006)inhaledmometasonefuroate:areviewofitsuseinpersistentasthmainadultsandadolescents.drugs66(8):1151-1168.

26.crimc,pierreln,daley-yatespt(2001)areviewofthepharmacologyandpharmacokineticsofinhaledfluticasonepropionateandmometasonefuroate.clinther23(9):1339-1354.

27.bledsoerk,etal.(2002)crystalstructureoftheglucocorticoidreceptorligandbindingdomainrevealsanovelmodeofreceptordimerizationandcoactivatorrecognition.cell110(1):93-105.

28.williamssp,siglerpb(1998)atomicstructureofprogesteronecomplexedwithitsreceptor.nature393(6683):392-396.

29.simonsss(2003)theimportanceofbeingvariedinsteroidreceptortransactivation.trendsinpharmacologicalsciences24(5):253-259.

30.simonsss,jr.(2006)howmuchisenough？modulationofdose-responsecurveforsteroidreceptor-regulatedgeneexpressionbychangingconcentrationsoftranscriptionfactor.currtopmedchem6(3):271-285.

31.kauppib,jakobc,farnegardhm,etal.thethree-dimensionalstructuresofantagonisticandagonisticformsoftheglucocorticoidreceptorligand-bindingdomain:ru-486inducesatransconformationthatleadstoactiveantagonism.j.biolchem2003；278:22748-22754.

32.suino-powellk,etal.(2008)doublingthesizeoftheglucocorticoidreceptorligandbindingpocketbydeacylcortivazol.molcellbiol28(6):1915-1923.

33.harmonjm,schmidttj,thompsoneb(1982)non-glucocorticoidreceptor-mediatedeffectsofthepotentglucocorticoiddeacylcortivazol.cancerres42(6):2110-2114.

34.valotisa,hoggerp(2007)humanreceptorkineticsandlungtissueretentionoftheenhanced-affinityglucocorticoidfluticasonefuroate.respirres8:54.

35.biggadikek,etal.(2008)x-raycrystalstructureofthenovelenhanced-affinityglucocorticoidagonistfluticasonefuroateintheglucocorticoidreceptor-ligandbindingdomain.jmedchem51(12):3349-3352.

36.baileys(1994)theccp4suite-programsforproteincrystallography.actacrystallogrd50:760-763.

37.brungerat,etal.(1998)crystallography&nmrsystem:anewsoftwaresuiteformacromolecularstructuredetermination.actacrystallogrdbiolcrystallogr54(pt5):905-921.

38.murshudovgn,vaginaa,dodsonej(1997)refinementofmacromolecularstructuresbythemaximum-likelihoodmethod.actacrystallogrdbiolcrystallogr53(pt3):240-255.

39.hey,etal.(2011)identificationofalysosomalpathwaythatmodulatesglucocorticoidsignalingandtheinflammatoryresponse.scisignal4(180):ra44.