用于治疗脑癌的组合疗法的制作方法
本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2016年11月1日提交的美国临时专利申请第62/416,075号的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
发明领域
本申请涉及医学、肿瘤学、病毒疗法和免疫疗法领域。具体地，它涉及溶瘤腺病毒和针对pd-1的抗体组合用于治疗脑癌，如胶质母细胞瘤和胶质肉瘤。
背景
相关技术的描述
癌症是一大类特征在于体内细胞的不受控制生长的疾病。它是导致死亡的主要原因之一，全球每年估计有1410万新病例(在2012年)，并且仅在美国估计有160万新病例(在2016年)。
已经开发了许多治疗癌症的疗法，包括例如手术切除癌症、使用化疗药物(即，使用杀死癌细胞的药物)以及使用放疗。尽管如此，据估计，在2016年仅在美国，癌症杀死估计600,000人。
一种特别难以治疗的癌症形式，即复发性胶质母细胞瘤(gbm)的中位生存时间仅为3至7个月。尽管在一些患者中进行了复发性疾病的手术，但尚未确定对于复发性疾病患者，单独的手术是否延长生存和/或提高生活质量。此外，只有两种药物，即贝伐珠单抗
目前在若干i期临床研究中正在针对患有复发性gbm的患者研究作为单一疗法或与其他药剂一起的dnx-2401。迄今为止，dnx-2401耐受性良好，并未在所有研究中报告意想不到的临床上显著相关的毒性。在首次人体i期剂量递增研究中，在任何剂量水平均未观察到与病毒直接相关的剂量限制性毒性(dlt)或临床上显著的不良事件(ae)。总的来说，ae的严重程度通常为轻度至中度，并被认为与dnx-2401无关。
首次人体i期研究评价了单独肿瘤内施用dnx-2401(a组)及肿瘤内施用14天后进行肿瘤切除，随后在整个切除的肿瘤腔内内部递送dnx-2401(b组)。当作为单一肿瘤内注射施用时，52％的对象(25名中的13名)根据麦克唐纳标准获得临床益处[完全应答(cr)+部分应答(pr)+病情稳定(sd)]，包括3例耐久性cr。无论dnx-2401剂量浓度如何，该组的1年生存率为32％(n＝8)。这8名对象中有4名(总共20％)生存至少3年，包括4名均获得pr(n＝1)或cr(n＝3)的对象。截至2016年2月，3名对象在治疗后保持生存3.8年、4.1年和4.3年。
dnx-2401的早期研究表明，该药在患有复发性恶性胶质瘤的患者中具有有利的安全性特征以及很强的肿瘤杀伤潜力。另外，已经观察到dnx-2401：1)在人肿瘤中复制数周至数月的时间，2)在注射数周内引发肿瘤坏死，3)导致可通过磁共振成像(mri)检测到的长期肿瘤破坏，以及4)触发肿瘤内免疫细胞浸润。越来越多的证据显示癌组织中肿瘤浸润性淋巴细胞(til)与各种恶性肿瘤预后之间存在相关性。i,ii,iii,iv,v,vi,vii,viii,ix,x,xi,xiii,xiv
帕博利珠单抗
在背景中论述的所有主题不一定是现有技术，并且不应仅仅因为其在背景部分中的论述而被认为是现有技术。按照这些原则，除非明确地陈述为现有技术，否则在背景中论述的或与此类主题相关的现有技术中问题的任何认识都不应被视为现有技术。相反，对背景中任何主题的论述应被视为发明人对特定问题的方法的一部分，该问题本身也可能具有创造性。
概述
根据本公开内容，提供了治疗患有脑肿瘤的对象的方法，所述方法包括(a)向所述对象施用溶瘤腺病毒；和(b)向所述对象施用抗pd-1抗体。溶瘤腺病毒可以是腺病毒血清型5株系，可以在缺乏rb/p16肿瘤抑制途径的细胞中有选择性复制能力，可以含有编码腺病毒e1a蛋白的氨基酸122至129的24个核苷酸的缺失，和/或可以含有整联蛋白结合rgd-4c基序。溶瘤腺病毒可以是dnx-2401。抗pd1抗体可以是人源化抗体，如帕博利珠单抗。脑肿瘤可以是多形性胶质母细胞瘤或胶质肉瘤。对象可以是人类。
诸如经由插管或针来肿瘤内递送溶瘤腺病毒。可以以5x108个病毒颗粒/剂量、5x109个病毒颗粒/剂量或5x1010个病毒颗粒/剂量递送溶瘤腺病毒。可通过静脉内输注递送抗pd1抗体。可以以200mg/剂量递送抗pd1抗体。可以历经30分钟施用剂量。可以在连续三个剂量的抗pd1抗体之前提供单剂量的溶瘤腺病毒。溶瘤腺病毒施用与抗pd1抗体的第一施用之间的时间可以是约7-9天。抗pd1抗体的依序施用之间的时间可以是约三周。
所述方法还可以包括向对象施用类固醇、抗惊厥药或抑制血管内皮生长因子a的抗体中的一种或多种。治疗还可以包括自溶瘤腺病毒施用之日起另外施用抗pd1抗体长达105周或24个月。评价对象的总生存期、肿瘤反应、临床获益率、karnofsky体能状况、神经系统状况、细胞因子水平、淋巴细胞水平或生物标志物(如pd-1水平或pdl-1水平)中的一种或多种。可以通过mri测量肿瘤反应。所述方法还可以包括脑肿瘤的立体定向引导的活检。
对象可以表现出至少9个月、12个月、15个月、18个月、24个月、36个月或48个月、其间的任何间隔的总生存期。与未治疗的对照对象相比，对象可以表现出至少6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、24个月、36个月或48个月、其间的任何间隔的总生存期的增加。在治疗开始后，肿瘤可以表现出降低的生长、无生长、肿瘤团块减小10％、肿瘤团块减小20％、肿瘤团块减小30％、肿瘤团块减小40％、肿瘤团块减小50％、肿瘤团块减小60％、肿瘤团块减小70％、肿瘤团块减小80％、肿瘤团块减小90％或肿瘤团块减小100％。在步骤(b)后，karnofsky体能状况可以可测量和/或统计地改善或保持不变。对象可以在先前的治疗如化疗、放疗或抗体疗法后表现出复发性或进行性脑肿瘤。
在另一个实施方案中，提供了组合物，其包含：(a)溶瘤腺病毒；和(b)抗pd-1抗体。溶瘤腺病毒可以是腺病毒血清型5株系，和/或可以在缺乏rb/p16肿瘤抑制途径的细胞中有选择性复制能力，和/或可以包含编码腺病毒e1a蛋白的氨基酸122至129的24个核苷酸的缺失，和/或可以包含整联蛋白结合rgd-4c基序。溶瘤腺病毒可以是dnx-2401。抗pd1抗体可以是人源化抗体，如帕博利珠单抗。
组合物可以经配制用于肿瘤内递送，或经配制用于静脉内输注。组合物可以包含以5x108个病毒颗粒/剂量、5x109个病毒颗粒/剂量或5x1010个病毒颗粒/剂量的单位剂量的溶瘤腺病毒。抗pd1抗体可以包含在200mg的单位剂量中。组合物还可以包含类固醇、抗惊厥药或抑制血管内皮生长因子a的抗体中的一种或多种。
在又一个实施方案中，提供了包含腺病毒血清型5株系的溶瘤腺病毒的组合物，其中溶瘤腺病毒在缺乏rb/p16肿瘤抑制途径的细胞中有选择性复制能力，其中溶瘤腺病毒包含编码腺病毒e1a蛋白的氨基酸122至129的24个核苷酸的缺失，以及其中溶瘤腺病毒包含整联蛋白结合rgd-4c基序。溶瘤腺病毒可以是dnx-2401。溶瘤腺病毒可以包含在5x108个病毒颗粒/剂量、5x109个病毒颗粒/剂量或5x1010个病毒颗粒/剂量的单位剂量中。
在本文公开的方法和/或组合物的上下文中论述的实施方案可以针对本文描述的任何其他方法或组合物使用。因此，涉及一种方法或组合物的实施方案也可以应用于本公开的其他方法和组合物中。
如本文的说明书中所用，"一个/一种(a)"或"一个/一种(an)"可以意指一个或多个或者一种或多种。如本文的权利要求书中所用，当与"包括/包含(comprising)"一词结合使用时，词语"一个/一种(a)"或"一个/一种(an)"可以意指一个或多于一个或者一种或多于一种。
在权利要求书中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指示为仅指替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个(种)”可以意指至少第二个(种)或更多个(种)。
在整个本申请中，术语“约”用于表示数值包括用于确定该数值的装置、方法的固有误差变化，或研究对象之间存在的变化。
从下面的详述中，本公开内容的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，详述和具体实施例虽然表明本公开内容的优选实施方案，但是仅以说明的方式给出，这是因为本公开内容的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域的技术人员是显而易见的。
附图简述
以下附图构成本申请说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个结合本文提出的具体实施方案的详述，可以更好地理解本公开内容。
图1：整体研究设计。
图2：研究药物施用
图3：剂量限制毒性研究设计。
图4：进行性疾病的第一放射学证据后的成像和治疗。
图5：特定的实验室评价。
图6a和6b：药物相关的不良事件的帕博利珠单抗剂量修改指导。
发明详述
如上所述，本发明提供了用于治疗癌症(如，诸如胶质母细胞瘤的脑癌)的组合物和方法，所述方法包括向对象施用溶瘤腺病毒和抗pi1抗体的步骤。如上面更详细论述的，虽然溶瘤腺病毒(如，dnx-2401)和抗pd1抗体(如，帕博利珠单抗)的代表性实施方案在不同类型的癌症中都显示出疗效，但是它们尚未被一致地用于针对单一类型的癌症如脑癌的临床环境中。
i.癌症
如本文所用的“癌症”是指一大类特征在于体内细胞的不受控制生长的疾病。癌症的代表性形式包括癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和上述的混合类型。
癌症的代表性形式包括癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和上述的混合类型。另外的实例包括但不限于胆管癌、脑癌如胶质母细胞瘤、乳腺癌、宫颈癌、cns肿瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、结直肠癌、子宫内膜癌、造血细胞癌包括白血病和淋巴瘤、肝细胞癌、肾癌、喉癌、肺癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鳞状细胞癌和甲状腺癌。癌症可以是弥漫性的(如，白血病)，可以包括实体瘤(如，肉瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)，或可以是这些的某些组合(如，具有实体瘤和弥散性或弥漫性癌细胞的转移性癌症)。
在本发明的特别优选的实施方案中，癌症是脑肿瘤或颅内赘生物。所有类型的脑肿瘤都可产生症状，所述症状根据所涉及的脑部分而变化。这些可以包括头痛、癫痫、视力问题、呕吐和精神变化。早上经常头痛加重，并且呕吐消失。更具体的问题可能包括行走困难、言语困难和感觉困难。随着疾病的进展，可能会出现无意识。
大多数脑肿瘤的病因尚不清楚。可能偶尔涉及的风险因素包括称为神经纤维瘤病的许多遗传性病况，以及暴露于工业化学品氯乙烯、爱泼斯坦-巴尔病毒和电离辐射。成人中最常见的原发性肿瘤类型是：脑膜瘤(通常为良性的)和星形细胞瘤，如胶质母细胞瘤。在儿童中，最常见的类型是恶性成神经管细胞瘤。通常通过医学检查和计算机断层摄影术或磁共振成像进行诊断。然后通常通过活检对其进行确认。基于研究结果，肿瘤分为不同的严重等级。
治疗可包括手术、放疗和化疗的某种组合。如果癫痫发作，可能需要抗惊厥药物。地塞米松和呋塞米可用于减少肿瘤周围的肿胀。一些肿瘤逐渐生长，仅需要监测并且可能不需要进一步干预。正在研究使用人体免疫系统的治疗。根据肿瘤的类型以及它在诊断时的传播范围，结果会有很大差异。胶质母细胞瘤通常具有差的结果，而脑膜瘤通常有好的结果。在美国，脑癌的平均五年生存率为33％。
a.胶质母细胞瘤
多形性胶质母细胞瘤(gbm)，也被称为胶质母细胞瘤和iv级星形细胞瘤，是从脑开始的最常见且最具侵袭性的癌症。体征和症状最初是非特异性的。它们可以包括头痛、性格改变、恶心和类似于中风的症状。症状的恶化通常很快。这可能会进展到无意识。
大多数病例的病因尚不清楚。不常见的危险因素包括遗传病症，如神经纤维瘤病和利弗劳梅尼综合征(lifraumenisyndrome)以及先前的放疗。胶质母细胞瘤占脑肿瘤的15％。它们可以从正常的脑细胞开始，或可以从已经存在的低级星形细胞瘤发展而来。通常通过ct扫描、mri扫描和组织活检的组合来进行诊断。
没有明确的方法可以预防该疾病。通常，治疗涉及手术，之后使用化疗和放疗。药物替莫唑胺经常用作化疗的一部分。高剂量的类固醇可用于帮助减小肿胀和减轻症状。尚不清楚是否试图去除所有癌症或仅仅是大部分癌症更好。
尽管经过了最大限度的治疗，癌症通常会复发。诊断后最常见的生存时间为12至15个月，不到3至5％的人生存超过5年。没有治疗的情况下，生存期通常是3个月。每100,000人中约有3人每年患上该病。它最通常在64岁左右开始，并且在男性中比在女性中更常见。正在胶质母细胞瘤中研究免疫疗法，结果令人满意。
尽管该疾病的常见症状包括癫痫、恶心和呕吐、头痛、记忆丧失和轻偏瘫，但最常见的单一症状是由于颞叶和额叶受累引起的进行性记忆、性格或神经缺损。相比肿瘤的病理学特性，产生的症状的类型在很大程度上取决于肿瘤的位置。肿瘤可以迅速开始产生症状，但偶尔是无症状病况，直到其达到巨大尺寸。
由于未知原因，gbm在男性中更常见。大多数胶质母细胞瘤肿瘤似乎是散发性的，没有任何遗传倾向。胶质母细胞瘤与吸烟、食用腌肉或电磁场之间未发现任何联系。饮酒可以是一个可能的风险因素。胶质母细胞瘤与病毒sv40、hhv-6和巨细胞病毒有关。在电离辐射和胶质母细胞瘤之间似乎也存在着小的联系。有些人还认为聚氯乙烯(其常用于建筑物中)和胶质母细胞瘤之间可能存在联系。2006年的分析将脑癌与工作场所的铅暴露联系起来。脑肿瘤发病率和疟疾存在关联，这表明疟疾的携带者阿诺菲力滋蚊(anophelesmosquito)可能传播病毒或其他能够导致胶质母细胞瘤的物质，或者与疟疾相关的免疫抑制可增强病毒复制。hhv-6也响应于来自药物和环境化学品的超敏反应而重新激活。其他风险因素包括男性(在男性中比在女性中略微更常见)，50岁以上，白种人、西班牙裔或亚洲人，患有低级星形细胞瘤(脑肿瘤)(其经常在给定的足够时间内发展为更高级的肿瘤)，或患有以下与胶质瘤发病率增加有关的遗传性病症之一：神经纤维瘤病、结节性硬化、希佩尔-林道病(vonhippel-lindaudisease)、李-佛美尼综合症(li-fraumenisyndrome)或turcot综合征。
多形性胶质母细胞瘤肿瘤的特征在于存在由间变性细胞包围的小区域的坏死组织。这种特征以及增生性血管的存在，将肿瘤与3级星形细胞瘤区分开来，所述3级星形细胞瘤没有这些特征。
gbm通常在脑白质中形成，生长迅速，并且在产生症状之前可变得非常大。低级星形细胞瘤或间变性星形细胞瘤变性后，小于10％形成更慢。这些被称为二级gbm，并且在年轻患者中更常见(平均年龄45岁对比62岁)。肿瘤可延伸到脑膜或心室壁中，导致脑脊液(csf)中的高的蛋白含量(>100mg/dl)，以及10至100个细胞的偶尔脑脊液细胞增多，主要是淋巴细胞。csf中携带的恶性细胞可能(很少)扩散至脊髓或引起脑膜胶质瘤病。然而，gbm超出中枢神经系统的转移是极不寻常的。约50％的gbm占据半球的一个以上的叶或是双侧的。这种类型的肿瘤通常来自大脑，并且可能很少表现出穿过胼胝体的典型浸润，从而产生蝴蝶状(双侧)胶质瘤。
根据出血量、坏死或年龄，肿瘤可呈现多种外观。ct扫描通常会显示具有低密度中心和由水肿包围的可变增强环的不均匀团块。来自肿瘤和水肿的质量效应可能压迫心室并引起脑积水。
已经鉴定了四种胶质母细胞瘤亚型：(i)经典型，其包括在'经典'亚型中的百分之九十七的肿瘤携带表皮生长因子受体(egfr)基因的额外拷贝，并且大多数具有比表皮生长因子受体(egfr)的正常表达更高，然而在胶质母细胞瘤中经常突变的基因tp53在该亚型中很少发生突变；(ii)前神经元型，其通常具有高的tp53改变率、pdgfra(编码a型血小板衍生生长因子受体的基因)改变率和idh1(编码异柠檬酸脱氢酶-1的基因)改变率；(iii)间质型，其特征在于编码神经纤维瘤蛋白1的基因nf1的突变率或其他改变率较高，以及较其他类型而言，egfr基因的改变较少且egfr的表达较少；和(iv)神经元型，其特征为神经元标志物如nefl、gabra1、syt1和slc12a5的表达。在胶质母细胞瘤中已经描述了许多其他遗传改变，并且它们中的大多数聚类在三个途径中，即p53、rb和pi3k/akt。胶质母细胞瘤分别在这些途径的64-87％、68-78％和88％中具有改变。
另一个重要的改变是mgmt(一种"自杀"dna修复酶)的甲基化。据描述，甲基化会损害dna转录，因此损害mgmt酶的表达。由于mgmt酶由于其自杀修复机制而仅可修复一个dna烷基化，因此反向容量低并且mgmt基因启动子的甲基化极大地影响了dna修复能力。事实上，mgmt甲基化与对dna损伤化学治疗剂(如替莫唑胺)治疗的反应改善有关。
在胶质母细胞瘤中发现了具有干细胞样特性的癌细胞(这可能是它们对常规治疗具有抗性和高复发率的原因)。这些所谓的胶质母细胞瘤干细胞样细胞位于小动脉周围的小生境中，其通过维持相对缺氧的环境来保护这些细胞免受治疗。胶质母细胞瘤中表现出癌症干细胞特性的细胞的生物标志物，即转录因子hes3，已被证明当置于培养物时可以调控细胞的数量。
idh1基因编码异柠檬酸脱氢酶1，并且经常在胶质母细胞瘤中突变(原发性gbm：5％，继发性gbm>80％)。通过产生非常高浓度的“癌代谢物”d-2-羟基戊二酸和异常调节野生型idh1酶，它诱导idh1-突变的胶质母细胞瘤的代谢发生与idh1野生型胶质母细胞瘤或健康星形胶质细胞相比显著的变化。其中，它增加了胶质母细胞瘤细胞对谷氨酰胺或谷氨酸作为能量来源的依赖性。已经假设idh1-突变的胶质母细胞瘤对谷氨酸的需求非常高，并且使用该氨基酸和神经递质作为趋化信号。由于健康的星形胶质细胞分泌谷氨酸，idh1-突变的胶质母细胞瘤细胞不利于致密的肿瘤结构，而是迁移、侵入和分散到谷氨酸浓度较高的脑的健康部分。这可以解释这些idh1-突变的胶质母细胞瘤的侵入行为。
此外，多形性胶质母细胞瘤在编码离子通道的基因中表现出多种改变，包括gbk钾通道和clc-3氯通道的上调。假设通过上调这些离子通道，胶质母细胞瘤肿瘤细胞可以促进细胞膜上的离子移动增加，从而通过渗透增加h2o移动，这有助于胶质母细胞瘤细胞非常快速地改变细胞体积。这有助于它们极其侵袭性的侵入行为，因为细胞体积的快速适应可以促进通过脑的蜿蜒的胞外基质的移动。
当用mri观察时，胶质母细胞瘤通常表现为环形强化病变。外观不是特定的，然而，其他病变如脓肿、转移、肿瘤性多发性硬化和其他实体可能有类似的外观。ct或mri上疑似gbm的明确诊断需要立体定向活检或颅骨切开术连同肿瘤切除和病理确认。因为肿瘤分级是基于肿瘤的最恶性部分，所以活检或次全肿瘤切除可导致病变等级降低。使用灌注mri对肿瘤血流进行成像并使用mr光谱法测量肿瘤代谢物浓度可以通过分别显示相对脑血容量增加和胆碱峰增加而在选定情况下增加标准mri的价值，但病理学仍然是诊断和分子表征的金标准。
区分原发性胶质母细胞瘤与继发性胶质母细胞瘤是很重要的。这些肿瘤分别自发地(从头)发生或从较低级别的胶质瘤发展。原发性胶质母细胞瘤的预后较差，具有不同的肿瘤生物学，并且可对治疗有不同的反应，其使这成为确定患者预后和治疗的关键评价。超过80％的继发性胶质母细胞瘤携带idh1突变，然而这种突变在原发性胶质母细胞瘤中很少见(5-10％)。因此，idh1突变是一种区分原发性胶质母细胞瘤和继发性胶质母细胞瘤的有用工具，这是因为它们在组织病理学上非常类似，并且没有分子生物标志物的区别是不可靠的。
由于几个复杂因素，治疗胶质母细胞瘤非常困难。例如，肿瘤细胞对常规疗法非常有抵抗力，脑很容易因常规疗法而受损，脑自身修复的能力非常有限，许多药物不能穿过血脑屏障来作用于肿瘤，以及原发性脑肿瘤和脑转移瘤的治疗由症状性疗法和姑息性疗法组成。
支持性治疗重在缓解症状和改善患者的神经功能。主要的支持剂是抗惊厥药和皮质类固醇。
从历史上看，大约90％的胶质母细胞瘤患者经历抗惊厥药治疗，尽管据估计只有约40％的患者需要这种治疗。最近，有人建议神经外科医生不预防性施用抗惊厥药，并且应该等到出现癫痫之后再开这种药物。那些接受苯妥英同时接受放射的患者可能会具有严重的皮肤反应，如多形性红斑和史蒂文斯-约翰逊综合征(stevens–johnsonsyndrome)。
皮质类固醇，通常每4至6小时给予4至8mg的地塞米松，可减少瘤周水肿(通过血脑屏障的重排)，从而减少质量效应并降低颅内压，减少头痛或嗜睡。
通常进行姑息治疗来改善生活质量并实现更长的生存时间。它包括手术、放疗和化疗。通常与外部射束放射和化疗一起进行最大无肿瘤边缘的最大限度地可行性切除。肿瘤的完全切除与较好的预后相关。
手术是胶质母细胞瘤治疗的第一阶段。平均gbm肿瘤含有1011个细胞，其在手术后平均减少至109个细胞(减少99％)。手术的益处包括切除用于病理诊断、减轻与质量效应相关的症状以及可能在对放疗和化疗的继发性抗性发生之前消除疾病。
肿瘤切除程度越大越好。与如果在回顾性分析中去除小于98％的肿瘤相比，去除98％或更多的肿瘤与显著更长的健康时间相关。如果手术由称为5-氨基乙酰丙酸的荧光染料引导，则可以增加几乎完全初始切除肿瘤的可能性。gbm细胞在诊断时通过脑广泛浸润，因此尽管所有明显的肿瘤都"全切除"，但大多数患有gbm的人后来在脑内原始位点附近或更远的位置处发展复发性肿瘤。在手术后使用其他方式，通常是放射和化疗，以试图阻抑和减缓复发性疾病。
手术后，放疗成为治疗胶质母细胞瘤患者的主要方案。它通常与给予替莫唑胺(tmz)一起进行。在20世纪70年代早期进行的一项关键性临床试验表明，在随机接受放疗或未放疗的303名gbm患者中，接受放射的患者的中位生存期是不接受放射的患者的两倍多。随后的临床研究试图建立在手术的基础上，然后是放射。平均而言，术后放疗可将肿瘤大小减少至107个细胞。当与更精确和靶向的的三维适形放疗相比时，全脑放疗没有改善。已经发现60–65gy的总放射剂量对于治疗是最佳的。
众所周知，gbm肿瘤含有表现出缺氧的组织区域，其对放疗具有高度抗性。已经采用各种化疗放射致敏剂方法，但取得了有限的成功。截至2010年，更新的研究方法包括使用诸如反式藏红花酸钠(tsc)的氧扩散增强化合物作为放射致敏剂的临床前和临床研究，并且截至2015年正在进行临床试验。
已将硼中子捕获疗法作为多形性胶质母细胞瘤的替代治疗进行了测试，但尚未得到普遍使用。
大多数研究表明，添加化疗没有任何益处。然而，针对随机化至标准放射对比放射和替莫唑胺化疗的575名参与者的大型临床试验表明，接受替莫唑胺的群组生存的中位数为14.6个月，相较而言接受单独的放射的群组生存的中位数为12.1个月。该治疗方案现在对于在临床试验中未登记的人的大多数胶质母细胞瘤病例是标准的。替莫唑胺似乎通过使肿瘤细胞对放射敏感而起作用。
高剂量的替莫唑胺在高级别胶质瘤中产生低毒性，但结果与标准剂量相当。用药物如贝伐珠单抗进行的抗血管生成疗法控制症状但不影响总生存期。
交替电场疗法是fda批准的用于新诊断和复发的胶质母细胞瘤的疗法。在2015年，在新诊断的胶质母细胞瘤中进行交替电场疗法和替莫唑胺的三期随机临床试验的初步结果报告了，与单独的替莫唑胺疗法相比，无进展生存期提高3个月以及总生存期提高5个月，代表了十年来的第一次大型试验以显示这种情况下的生活期提高。尽管有这些结果，但这种方法的疗效在医学专家中仍然存在争议。
从没有任何治疗的诊断时间起的中位生存时间是3个月，但在治疗的情况下，生存1–2年是常见的。年龄增加(>60岁)的预后风险较差。死亡通常是由于广泛的肿瘤浸润伴脑水肿和颅内压增高所致。
一个良好的初始karnofsky体能状况评分(kps)和mgmt甲基化与更长的生存期有关。可以对胶质母细胞瘤进行dna测试，以确定mgmt基因的启动子是否是甲基化的。具有甲基化的mgmt启动子的患者比具有未甲基化的mgmt启动子的患者具有更长的生存期，部分原因是由于对替莫唑胺的敏感性增加。这种dna特征是患者固有的，并且目前不能在外部改变。胶质母细胞瘤患者的另一种阳性预后标志物是idh1基因的突变，这可以通过基于dna的方法或通过免疫组织化学使用针对最常见突变即idh1-r132h的抗体进行测试。
通过将idh1的突变状态和mgmt的甲基化状态组合成双基因预测因子，可以获得更多的预后能力。具有idh1突变和mgmt甲基化的患者具有最长的生存期，具有idh1突变或mgmt甲基化的患者具有中间生存期，没有遗传事件的患者具有最短的生存期。
长期益处也与接受手术、放疗和替莫唑胺化疗的那些患者有关。然而，为什么有些胶质母细胞瘤患者生存更长时间还存在许多未知数。年龄小于50岁与多形性胶质母细胞瘤中的生存期更长有关，98％+的切除和使用替莫唑胺化疗及较好的karnofsky体能状况评分也是如此。最近的一项研究证实较小的年龄与好得多的预后相关，其中小部分的年龄在40岁以下的患者达到基于群体的治愈。基于群体的治愈被认为是在群体死亡风险恢复到正常群体的死亡风险时发生的，并且在gbm中，这被认为是在10年后发生的。
b.胶质肉瘤
胶质肉瘤是一种罕见类型的胶质瘤，是一种来自与神经脑细胞相对的胶质或支持性脑细胞的脑癌。胶质肉瘤是一种恶性癌症，并且被定义为由胶质瘤组分和肉瘤组分组成的胶质母细胞瘤。
据估计，所有胶质母细胞瘤的约2.1％是胶质肉瘤。虽然大多数胶质瘤很少显示在大脑外的转移，但胶质肉瘤有这样的倾向，最常见的是通过血液扩散到肺脏以及还有肝脏和淋巴结。
关于这个实体的知识仅限于小型回顾性病例系列和病例报告。通常，gsm的流行病学和自然史似乎与胶质母细胞瘤(gbm)类似。没有明确鉴定区分gsm结果和gbm结果的患者或治疗因素。胶质肉瘤的流行病学与胶质母细胞瘤的流行病学类似，其平均发病年龄为54岁，并且男性患病率是女性的两倍。它们最常出现在颞叶中。
由于患者数量较少，可用的病例系列不足以精确地表征gsm。gsm和gbm之间的适度但具有临床意义的差异可能会出现在检查较大系列的情况下。为了完善我们对gsm的理解，我们使用监测、流行病学和最终结果(seer)数据库来鉴定和分析300多名成年gsm患者，并将其与成年gbm患者进行比较。
ii.活性剂
a.溶瘤腺病毒
“腺病毒”(ad)是指一种感染人类但也显示出广泛宿主范围的大型(约36kb)dna病毒。在物理上，腺病毒是含有双链线性dna基因组的二十面体病毒。大约有50种人腺病毒血清型，基于分子标准、免疫学标准和功能标准将其分为6个家族。到了成年期，几乎每个人都感染了较为常见的腺病毒血清型，主要影响是感冒样症状。
宿主细胞的腺病毒感染导致腺病毒dna保持游离，这降低了与整合载体相关的潜在遗传毒性。此外，腺病毒在结构上是稳定的，并且在大量扩增后未检测到基因组重排。腺病毒可感染大多数上皮细胞，无论其细胞周期阶段如何。到目前为止，腺病毒感染似乎只与人类的轻度疾病如急性呼吸道疾病有关。
57种人腺病毒血清型(hadv-1至57)中任一种的成员可以掺入编码根据本发明的免疫细胞刺激性受体激动剂的异源核酸。人ad5在遗传和生物方面表征良好(genbankm73260；ac000008)。因此，在一个优选的实施方案中，溶瘤腺病毒是具有复制能力的ad5血清型或包含ad5组分的混合血清型。腺病毒可以是野生型菌株，但是优选经遗传修饰以例如通过减弱病毒在正常静止细胞内复制的能力而不影响病毒在肿瘤细胞中复制的能力来增强肿瘤选择性。由本发明涵盖的具有复制能力的溶瘤腺病毒的非限制实例包括δ-24、δ-24-rgd、icovir-5、icovir-7、onyx-015、coload1、h101和ad5/3-d24-gmcsf。onyx-015是在elb-55k和e3b区域中具有缺失以增强癌症选择性的病毒血清型ad2和ad5的杂合物。h101是onyx-015的改良形式。icovir-5和icovir-7包含e1a的rb-结合位点缺失和用e2f启动子替代e1a启动子。coload1是嵌合性add11p/ad3血清型。ad5/3-d24-gmcsf(cgtg-102)是编码gm-csf的血清型5/3衣壳修饰的腺病毒(ad5衣壳蛋白knob被来自血清型3的knob结构域替代)。
注入肿瘤中的溶瘤腺病毒诱导细胞死亡并释放新的腺病毒后代，其通过感染邻近细胞来产生治疗波，所述治疗波如果不停止可能导致肿瘤完全破坏。δ-24的显著抗肿瘤作用已经显示在细胞培养系统和恶性胶质瘤异种移植物模型中。δ-24-rgd在i期临床试验中显示出令人惊讶的抗肿瘤作用，并且目前是另外临床试验的主题。尽管肿瘤细胞裂解是针对δ-24-rgd溶瘤腺病毒提出的主要抗癌机制，但来自复发性胶质瘤患者的ⅰ期临床试验的数据和其他观察结果表明直接溶瘤效应可通过腺病毒介导的抗肿瘤免疫应答的触发来增强。
腺病毒的感染周期分两步进行：早期阶段，其在腺病毒基因组复制开始之前，并允许产生调控蛋白和参与病毒dna复制和转录的蛋白质；和导致结构蛋白合成的晚期阶段。早期基因分布在4个区域中，所述区域分散于腺病毒基因组中，命名为e1至e4(“e”表示“早期”)。早期区域包括至少六个转录单元，每个转录单元具有其自身的启动子。早期基因的表达本身受到调控，一些基因在其他基因之前表达。e1、e2和e4三个区域对于病毒的复制至关重要。因此，如果腺病毒在这些功能中的一种具有缺陷，则该蛋白必须以反式提供，否则病毒无法复制。
e1早期区位于腺病毒基因组的5'末端，并且含有2个病毒转录单元e1a和e1b。这个区域编码参与病毒周期的极早期并且对于腺病毒的几乎所有其他基因的表达必需的蛋白质。特别地，e1a转录单元编码反式激活其他病毒基因的转录的蛋白，从而诱导从e1b、e2a、e2b、e3和e4区域的启动子和晚期基因的转录。
在本发明的一个实施方案中，一条或多条异源序列可以掺入腺病毒的非必需区域。在本发明的一个特别优选的实施方案中，可以整合一条或多条异源序列来代替e3区域的全部或部分。代表性实例包括细胞因子、趋化因子和检查点抑制剂。在一个实施方案中，异源序列编码ox40激动剂(如，ox40l)、gitr、抗-pd-1和/或抗-ctla-3。在另一个实施方案中，异源核酸序列编码选自以下的免疫检查点蛋白的抑制剂：ctla4、pid-i、pd-li、pd-l2、b7-h3、b7-h4、tim3、gal9、lag3、vista、kir和/或btla。在又一个实施方案中，异源核酸序列编码选自以下的免疫共刺激受体的激动剂：cd28、ox40(cd134)、糖皮质激素诱导的tnf-受体(gitr)、cd137(4-1bb)、疱疹病毒进入介质a(hvem)、可诱导的t细胞共刺激分子(icos或cd278)、cd27、cl)40和/或cd226。在2016年5月27日提交的pct/us2014/066920和美国临时第62/342482号中更详细地公开了代表性实例，这两项专利均通过引用整体并入。
腺病毒经由细胞表面受体进入允许宿主细胞，然后对其进行内化。与复制周期的第一步所需的某些病毒蛋白相关的病毒dna进入启动转录的受感染细胞的细胞核。腺病毒dna的复制发生在受感染细胞的细胞核中，并不需要细胞复制。组装新的病毒颗粒或病毒体，之后它们从受感染细胞中释放出来，并且可以感染其他允许细胞。
腺病毒是一种有吸引力的递送系统。本发明的实施方案可以利用每个细胞的最大产量为1x105个病毒颗粒的制造工艺。该工艺可以不含或基本上不含蛋白质、血清和动物来源的组分，使其适用于广泛的预防性和治疗性疫苗产品。
有几个因素有利于使用溶瘤腺病毒来治疗脑肿瘤。第一，胶质瘤通常是局部的，因此有效的局部方法应足以治愈疾病，而不会对身体的其他部分产生任何不利影响。第二，胶质瘤有表达不同遗传异常的几种细胞群。因此，对单一治疗性基因向癌细胞的转移敏感的肿瘤谱可能是有限的。第三，有复制能力的腺病毒可以感染和破坏阻滞在g0的癌细胞。由于胶质瘤总是包括非循环细胞，因此这一特性非常重要。最后，p16-rb途径在大多数胶质瘤中是异常的，从而使得δ-24腺病毒对治疗这些肿瘤特别有效，尽管视网膜母细胞瘤肿瘤抑制基因功能的丧失与各种类型的肿瘤的病因有关，并且不限于胶质瘤的治疗。本发明的溶瘤腺病毒在具有突变型rb途径的细胞中具有复制能力。
如果腺病毒已经突变以使其具有条件复制性(在某些条件下具有复制能力)，则病毒复制可能需要辅助细胞。当需要时，辅助细胞系可以来源于人细胞，如人胚胎肾细胞、肌细胞、造血细胞或其他人胚胎间充质或上皮细胞。可选地，辅助细胞可以来源于对于人腺病毒允许的其他哺乳动物物种的细胞。此类细胞包括例如vero细胞或其他猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。在某些方面，辅助细胞系是293。培养宿主和辅助细胞的各种方法可以在本领域中找到，例如(racher,a.j.,fooks,a.r.&griffiths,j.b.biotechnoltech(1995)9:169.)。
可以使用不同的方法分离腺病毒。通常来说，在转染ad基因组后，从琼脂糖覆盖的细胞中分离出腺病毒空斑，并扩增病毒颗粒用于分析。对于详细的方案，本领域技术人员可以参考(graham,f.l.和prevec,l.(1991).manipulationofadenovirusvectors.methodsmolbiol7,109-128.)。
用于生成腺病毒载体的替代技术包括利用细菌人工染色体(bac)系统，利用含有互补腺病毒序列的两个质粒在reca+细菌菌株中进行的体内细菌重组，以及酵母人工染色体(yac)系统(pct公布95/27071和96/33280，将其通过引用并入本文)。
适用于本发明的腺病毒载体的代表性实例包括美国公布号2009/0175830、2014/0377221、2014/0377294、2015/0306160、2016/0289645和2016/0143967及美国专利第6,210,946号、第6,284,742号、第6,312,699号、第6,555,368号、第6,649,396号、第6,815,200号、第6,824,771号、第6,841,540号、第6,955,808号、第7,045,348号、第7,297,542号、第8,168,168号和第9,061,055号中所述的那些，所有这些都通过引用整体并入。
iii.dnx-2401
在一个特别优选的实施方案中，具有复制能力的溶瘤腺病毒是δ-24或δ-24-rgd。δ-24描述于美国专利申请公布号20030138405和20060147420，其每一个通过引用并入本文(也参见，，，，，)。δ-24腺病毒来源于腺病毒5型(ad-5)，并在e1a基因的cr2部分内含有24碱基对缺失，其涵盖负责结合对应于编码的e1a蛋白中的氨基酸122至129的rb蛋白的区域(核苷酸923-946)(fueyoj等人,oncogene,19:2-12(2000))。δ-24-rgd还包含插入rgd-4c序列(其与αvβ3和αvβ5整联蛋白强烈结合)至纤维蛋白knob的hi环(pasqualinir.等人,natbiotechnol,15:542-546(1997))。e1a缺失增加了病毒对癌细胞的选择性；rgd-4c序列增加了病毒对胶质瘤和其他几种表达低水平的腺病毒受体的肿瘤的感染性。
a.治疗性用途
立体定向或图像引导的注射装置引导dnx-2401通过头骨中的小孔递送进入肿瘤。该病毒通过在肿瘤细胞中复制并以高效力和特异性杀死肿瘤细胞来建立活动性感染。来自i期临床研究的结果表明dnx-2401：(i)可在人肿瘤中复制数周至数月，(ii)可在注射后数周内引发肿瘤坏死，(iii)可触发肿瘤内免疫细胞浸润，以及(iv)可导致通过mri检测到的长期肿瘤破坏。
dnx-2401耐受性良好。迄今为止，它与有限的毒性有关，如在研究dnx-2401作为单一药剂或与其他药剂一起用于复发性疾病的的几项已完成或正在进行的i期临床研究中所述。在复发性胶质瘤对象的首次人体i期试验中评价的最大剂量为3e10个vp，未报告任何剂量限制性毒性(研究id01-310)。根据研究者评估的mri，在研究的肿瘤内注射组(a组)中登记的52％(n＝13)的对象(n＝25)中观察到临床益处(cr+pr+sd)。总的来说，28％的对象获得了cr(n＝3)或pr(n＝4)。对于任何应答对象，在最低剂量水平(1e8个vp)获得完全应答的对象在dnx-2401治疗后4.2年保持生存。在对象的子集中，在肿瘤消退之前观察到mri上记录的假性进展，类似于用若干其他免疫疗法观察到的客观应答动力学。无论dnx-2401剂量如何，该组的1年生存率为32％(n＝8)。令人鼓舞的是，这8名对象中有4名(总共20％)生存至少3年，包括4名获得pr(n＝1)或cr(n＝3)的对象。截至2016年2月，3名对象在治疗后3.8年、4.1年和4.3年保持生存。(对于进一步更新，参考当前的研究者手册)
dnx-2401在腺病毒dsdna基因组中含有两个稳定的遗传变化，所述遗传变化使其(1)在缺乏rb-途径的细胞中选择性复制，和(2)更有效地感染表达rgd结合类整联蛋白的细胞。在e1a基因中缺失24个碱基并且在纤维的h1环中插入整联蛋白结合基序(rgd)实现了这一点。因为几乎所有肿瘤细胞，包括gbm，都在rb途径中具有缺陷或已经在细胞周期中，所以dnx-2401在这些肿瘤细胞中复制并选择性且有效地杀死这些肿瘤细胞。dnx-2401在快速生长的肿瘤细胞中的复制方面优于野生型腺病毒，这是一种前所未有的溶瘤病毒特性。xvii,sviii,xxiv
b.胶质瘤的临床经验
研究id01-310.在单中心(德克萨斯大学md安德森癌症中心(theuniversityoftexasmdandersoncancercenter))，在患有复发性高级别恶性胶质瘤的37名对象中在首次人体两组剂量递增的i期研究(研究id01-310)中评价了dnx2401。a组研究了dnx-2401单次直接肿瘤内注射到复发性肿瘤中，无进一步切除(n＝25)。b组研究了生物学终点，该终点是为了证明肿瘤内病毒复制，并且仅包括具有可切除肿瘤的对象(n＝12)。这些对象接受了两次注射：在第0天初始肿瘤内注射到活检证实的胶质瘤中，14天后肿瘤切除并随后将分开剂量的dnx-2401注射到切除后肿瘤床中。
安全性.在包括评价的最高剂量(3e10个vp)在内的任何剂量水平的临床研究id01-310期间均未报告剂量限制性毒性(dlt)，并且迄今为止在用3e10个vp正在进行的i期研究中未观察到临床上显著的意想不到的dnx-2401相关的安全性问题。因此，在研究完成之前未达到最大耐受剂量(mtd)。不良事件的严重程度通常为轻度至中度，并且在两种类型的施用(即肿瘤内和壁内)之后与病毒无关。对象血清、唾液、鼻咽分泌物和尿液的分析没有表现出任何明显的病毒脱落。只有一例1级头疼/头痛、1级意识模糊和2级发热的严重不良事件报告被认为可能与针对一名对象的病毒有关。所有死亡均被认为与dnx-2401无关。
疗效.尽管研究id01-310是一项经设计以评价跨越四个数量级的dnx-2401的剂量浓度的剂量递增研究，但所有对象均被包括在次要疗效分析中。
在a组(n＝25，肿瘤内注射)中，将对象登记至8个剂量群组中(1e7至3e10个vp)。52％的对象(n＝13)中观察到临床益处(如通过cr+pr+sd测量的)，包括获得pr(n＝4)或cr(n＝3)的最佳应答的28％的对象。对于任何应答对象，在最低剂量水平(1e8个vp)获得完全应答的对象在dnx-2401治疗后4.2年保持生存。在对象的子集中，在肿瘤消退之前观察到mri上记录的假性进展，类似于用若干其他免疫疗法观察到的客观应答动力学。xxi无论dnx-2401剂量如何，该组的1年生存率为32％(n＝8)。这8名对象中有4名(总共20％)生存至少3年，包括4名获得pr(n＝1)或cr(n＝3)的对象。截至2016年2月，3名对象在治疗后3.8年、4.1年和4.3年保持生存。
在b组(n＝12，肿瘤内(在肿瘤内)和壁内(肿瘤床)注射；生物学终点臂)中，将对象登记在4个剂量群组中(1e7至3e8个vp；两次注射后的总暴露：2e7至6e8个vp)。对象(n＝12)成功完成治疗。因为肿瘤切除是b组治疗计划的一部分，所以只有有限数量的对象(25％，12名中有3名)在肿瘤内注射后14天具有可测量的疾病，这对于按照研究者评估来评价肿瘤负荷的变化和反应至关重要。在这3名对象中，1名对象(33％)实现了pr的最佳应答，2名对象(67％)实现了sd。9名对象(75％)因手术而无可测量的疾病，并不被认为可评价临床反应。
对dnx-2401的免疫应答.基于肿瘤可用性，对对象的子集进行dnx-2401治疗后切除的肿瘤的免疫学评价。在dnx2401施用后数月，响应于似乎是肿瘤进展或假性进展，切除来自登记在a组(肿瘤内注射)的对象的两个肿瘤。在两种情况下，病理学家报告肿瘤坏死80％和90％，其余肿瘤被包括cd4和cd8t细胞在内的免疫细胞浸润。来自登记在b组(肿瘤内和壁内注射)的对象的切除肿瘤的分析提供了两周时巨噬细胞浸润肿瘤的进一步证据，随后数月后t细胞涌入。总的来说，这种动态免疫应答可能解释了本研究中观察到的抗胶质瘤效应的持续性以及延迟治疗效应。
研究d24gbm：研究d24gbm是一项在纳瓦拉大学诊所(universityclinicofnavarra,spain)进行的正在进行的单中心i期研究者发起的研究。该研究研究了在首次复发胶质母细胞瘤的对象中施用单剂量3e10个vp的dnx-2401，两周后施用剂量密集的替莫唑胺，持续8周。对象接受1)在活检期间单次肿瘤内注射，无进一步切除，2)肿瘤切除后壁内注射并注射到切除的腔内，或3)肿瘤内注射部分切除的肿瘤并注射到切除的腔内。截至2015年11月，所有31名计划的对象均已接受dnx-2401。根据初步数据，未观察到与dnx-2401相关的显著安全性发现。
研究2401bt-ifn-001：研究2401bt-ifn-001(目标i(targeti))是一项正在进行的随机、多中心ib期试验，旨在研究在患有复发性胶质母细胞瘤或胶质肉瘤的对象中将3e10个vpdnx-2401施用至复发性肿瘤中，2周后用干扰素γ进行治疗的安全性。以2:1的方式将登记的对象随机分配到用dnx-2401和干扰素γ或单独的dnx-2401。截至2016年3月，已经登记了24-36名可评价的对象中的26名。修改方案以包括通过插管将剂量为5e10个vp的dnx-2401递送到对象的子集中。初步数据尚不可获得。
c.其他适应症中的临床经验
研究0643.还在阿拉巴马大学(universityofalabama,birmingham)作为研究者发起的研究进行的一项完整的单中心i期研究中在患有复发性恶性妇科疾病的对象(n＝21)中系统性评价了dnx2401。该研究评价了腹膜内递递dnx-2401对患有复发性上皮卵巢癌的对象的可行性和实用性，所述对象在减积术(debulking)和紫杉醇/基于铂的化疗后患有持续性或复发性疾病。将符合条件的对象群组用经由腹膜内导管施用的病毒治疗三天，以确定mtd。没有观察到dlt，并且在持续3天的测试的最高dnx-2401剂量1e12个vp/天时未达到mtd。未报告载体相关的3级或4级毒性，并且未注意到临床上显著的实验室异常。不良事件仅限于1/2级发烧、疲劳或腹痛。总的来说，ae被认为不太可能或与病毒无关，并被认为与潜在疾病或递送途径有关。病毒脱落研究显示血清、唾液和尿液中无明显脱落。未达到最大耐受剂量。经过一个月的随访，15名(71％)患者病情稳定，6名(29％)患有进行性疾病。7名患者的ca-125减少；四名的ca-125下降>20％。
d.dnx-2401给药
在i期研究中未达到mtd。肿瘤内dnx-2401，然后静脉内帕博利珠单抗治疗的潜在累加效应尚不清楚。因此，剂量递增的初始阶段由3个群组(5e8个vp、5e9个vp和5e10个vp；最多12名对象，总计)组成，以确定与帕博利珠单抗相关的dnx-2401的安全肿瘤内剂量是合理的。dnx-2401的单次和重复施用在多种动物毒性研究(如棉鼠中icb7.5e10个vp的mtd)和早期人研究(id01-310，d24gbm；初步2401bt-ifn-001)中具有良好的耐受性。此外，已经显示以高达1e12个vp/天的剂量连续3天施用的腹膜内dnx-2401在人类中具有良好的耐受性。在某些情况下，可能需要对声明的剂量、体积、时间进行修改；然而，在实施之前，变化将需要获得医疗监查员或指定人员的批准。
e.递送方法
dnx2401是一种能够在肿瘤细胞中复制的条件复制型病毒；然而，载体不会在周围的正常脑组织中复制。经验表明，dnx-2401的直接肿瘤内注射对于将dnx-2401递送到靶肿瘤中是安全且有效的，并增加肿瘤细胞暴露于病毒的潜力。基于该证据，选择经由alcyonemems插管(amctm)直接肿瘤内施用dnx-2401以用于该ii期研究，以优化病毒递送并提供标准化技术。
在一个特定方面，有复制能力的腺病毒经由肿瘤内注射至脑中来递送。直接注射至脑中可以通过细导管或插管完成。利用某些实施方案，可以在mr程序内引导下通过微机电(mems)系统递送有复制能力的溶瘤腺病毒。特别地，肿瘤内注射至脑中通过使用插管，如alcyonelifesciences的alcyonemems插管(amc)完成而没有明显的回流或逆流。装置的代表性实例描述于美国专利8,992,458和美国专利公开2013/0035660、2013/0035574和2013/0035560中，其各自通过引用整体并入本文。
f.抗pd-1治疗剂
肿瘤细胞上的pd-l1与活化的效应t细胞上的pd-1的结合导致pi3激酶信号传导级联的活化，其继而阻断杀死肿瘤细胞所需的细胞毒性介质的产生。如本文所用，pd-l1或pd-1拮抗剂是破坏pd-l1和pd-1之间相互作用的分子。在一方面，抗pd-1治疗剂是抗体。代表性实例包括抗pd-l1抗体mpdl3280a，或抗pd-1抗体如纳武单抗(opdivo–bristolmyerssquibb)，或派姆单抗(lambrolizumab)。在另一个实施方案中，抗pd-1治疗剂是帕博利珠单抗(如下面更详细论述的)。靶向pd-1受体的早期发育中的其他药物(检查点抑制剂)是pidilizumab(ct-011,curetech)和bms-936559(bristolmyerssquibb)。阿特珠单抗(mpdl3280a,roche)和阿维鲁单抗(avelumab)(merckkgaa,darmstadt,germany&pfizer)均靶向类似的pd-l1受体。
可以被递送的其他抗pd-1治疗剂包括美国专利申请公开号2009/0217401、20110195068和20120251537及美国专利第8,217,149号中描述的那些，其各自的内容通过引用并入本文。
iv.帕博利珠单抗
帕博利珠单抗
在具有多种肿瘤类型的对象中进行单臂单一疗法试验证明了帕博利珠单抗的最初临床疗效，如通过应答率确定的。正在进行的临床试验正在许多其他晚期实体瘤适应症和血液恶性肿瘤中进行。
a.药物和治疗背景
几十年来，已知完整的免疫监视在控制肿瘤转化生长中的重要性。越来越多的证据表明癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞(til)与各种恶性肿瘤中的预后之间存在相关性。error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.特别地，cd8+t细胞的存在和cd8+效应t细胞/foxp3+调控性t细胞的比例增加好像与许多实体瘤中改善的预后和长期生存有关。xxvii,xxvii,xxix,xxx,xxxi,xxxii
pd-1受体-配体相互作用是肿瘤阻抑免疫控制的主要强行控制途径。在健康条件下在活化的t细胞的细胞表面上表达的pd-1的正常功能是下调不需要的或过度的免疫应答，包括自身免疫反应。pd-1(由基因pdcd1编码)是与cd28和ctla-4相关的ig超家族成员，已显示其在配体(pd-l1和/或pd-l2)接合后负调控抗原受体信号传导。首先解析了单独的鼠pd-1和与其配体复合的鼠pd-1的结构，并且最近也报告了人pd-1胞外区的基于nmr的结构及其与其配体的相互作用的分析。pd-1和家族成员是i型跨膜糖蛋白，其含有负责配体结合的ig可变型(v型)结构域和负责信号传导分子结合的胞质尾。pd-1的胞质尾含有2个基于酪氨酸的信号传导基序，即基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)和基于免疫受体酪氨酸的开关基序(itsm)。在t细胞刺激后，pd-1将酪氨酸磷酸酶shp-1和shp-2募集至其胞质尾内的itsm基序，导致参与cd3t细胞信号传导级联的效应分子，如cd3ζ、pkcθ和zap70的去磷酸化。pd-1下调t细胞应答的机制与ctla-4的机制类似，但不同。显示pd-1在活化的淋巴细胞(包括外周cd4+和cd8+t细胞、b细胞、treg和自然杀伤细胞)上表达。在胸腺发育期间在cd4-cd8-(双阴性)t细胞以及巨噬细胞和树突细胞的亚群上也显示表达。pd-1的配体(pd-l1和pd-l2)是组成型表达的或可以在多种细胞类型中被诱导。pd-l1在各种非造血组织上以低水平表达，最显著地是在血管内皮上，然而pd-l2蛋白仅在淋巴组织或慢性炎症环境中存在的抗原呈递细胞上可检测地表达。error！bookmarknotdefined.两种配体均是i型跨膜受体，其含有在胞外区中的igv-和igc样结构域以及没有已知信号传导基序的短胞质区。pd-1配体与pd-1的结合抑制通过t细胞受体触发的t细胞活化。pd-l2被认为控制淋巴器官中的免疫t细胞活化，然而pd-l1用于抑制外周组织中的不必要的t细胞功能。虽然健康的器官表达很少的(如果有的话)pd-l1，但是已经证明多种癌症表达丰富水平的这种t细胞抑制剂，其经由与肿瘤特异性t细胞上的pd-1受体相互作用在肿瘤免疫逃避中发挥关键作用。因此，pd-1/pd-l1途径是癌症的治疗性干预的有吸引力的靶标。
b.用帕博利珠单抗进行的非临床研究
小鼠模型中的治疗研究表明，阻断pd-1/pd-l1相互作用的抗体的施用，无论是作为单一疗法还是与其他治疗方式相结合，都增强了肿瘤特异性cd8+t细胞的浸润，最终导致肿瘤排斥。xlix,l,li,lii,liii,liv,lv抗小鼠pd-1或抗小鼠pd-l1抗体在鳞状细胞癌、胰腺癌、黑色素瘤、急性髓样白血病和结直肠癌的模型中均显示抗肿瘤反应。error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.在此类研究中，观察到cd8+t细胞浸润肿瘤及ifn-γ、颗粒酶b和穿孔素表达增加，表明pd-1检查点抑制的抗肿瘤活性的基本机制涉及局部浸润和活化体内效应t细胞功能。error！bookmarknotdefined.实验证实了在同源小鼠肿瘤模型中抗小鼠pd-1抗体作为单一疗法以及与化疗相组合的体内疗效。
c.帕博利珠单抗剂量选择
在该试验中待研究的帕博利珠单抗的剂量为每3周(q3w)静脉内给予200mg。最近在美国和其他几个国家批准用于治疗黑色素瘤对象的剂量为2mg/kgq3w。关于选择200mgq3w的原理的信息总结如下。
在keynote-001中，进行了开放标签的i期研究，以评价帕博利珠单抗作为单一疗法施用时的安全性、耐受性、药代动力学(pk)、药效动力学(pd)和抗肿瘤活性。在患有晚期实体瘤的对象中，该试验的剂量递增部分评价了每2周施用一次(q2w)的3个剂量水平，1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg，剂量扩展群组评价了2mg/kgq3w和10mg/kgq3w。所有剂量水平均耐受性良好，并未观察到剂量限制性毒性。帕博利珠单抗的首次人体研究显示了在所有剂量水平下靶向接合的证据和肿瘤尺寸减少的客观证据。尚未确定最大耐受剂量(mtd)。此外，接受2mg/kg对比10mg/kgq3w的剂量的帕博利珠单抗的黑色素瘤对象的两个随机化群组的评价已经完成，评价10mg/kgq3w对比10mg/kgq2w的一个随机化群组也已完成。临床疗效和安全性数据表明在各剂量的疗效或安全性特征方面缺乏重要差异。
完整的证据体系表明，预计每3周(q3w)200mg提供与2mg/kgq3w、10mg/kgq3w和10mg/kgq2w的类似的反应。此前，在患有黑色素瘤的对象中，在2mg/kg至10mg/kg的剂量范围内，已发现针对疗效和安全性的平坦的帕博利珠单抗暴露-应答关系。预计对200mgq3w的暴露将在该范围内，并接近用2mg/kgq3w剂量获得的暴露。
已经开发出一种群体药代动力学(pk)模型，其表征了体重和其他患者协变量对暴露的影响。帕博利珠单抗的pk特征与其他人源化单克隆抗体的pk特征一致，其通常具有低清除率和有限的分布体积。预测200mg固定剂量的暴露分布与用2mg/kg剂量获得的暴露分布明显重叠，并且重要的是，将个体患者暴露维持在黑色素瘤中建立的与最大临床应答相关的暴露范围内。帕博利珠单抗的药代动力学特性，并且特别是清除率和分布体积的体重依赖性与基于体重的给药相对于固定给药没有有意义的优势是一致的。
在转化成其他肿瘤适应症时，可以预计如在患有黑色素瘤的对象中观察到的针对疗效和安全性的类似平坦的暴露-应答关系，这是因为帕博利珠单抗的抗肿瘤效应是通过免疫系统活化而非通过与肿瘤细胞的直接相互作用来驱动的，从而使其不依赖于特定的肿瘤类型。此外，在患有黑色素瘤、nsclc和其他肿瘤类型的对象中获得的pk结果支持在肿瘤类型中在测试剂量下获得的药代动力学暴露缺乏有意义的差异。因此，200mgq3w固定剂量方案也被认为是针对其他肿瘤适应症合适的固定剂量。
固定剂量方案将简化给药方案，对于医生更方便并减少给药错误的可能性。固定剂量方案还将降低处理设施物流链的复杂性并减少浪费。现有数据表明，200mgq3w是帕博利珠单抗的合适剂量。
d.商业剂型
目前有两种
v.对象
可评价的对象被定义为接受至少一剂或一剂的一部分的研究药物(dnx-2401和帕博利珠单抗)，并且完成第28天的研究访问的符合条件的对象。
在完成第28天的研究访问之前因任何原因(除了进行性疾病或研究治疗相关的毒性之外)而终止研究参与的对象将无法评价并将被替换，但将继续监测安全性和生存率。
对象一般应符合以下治疗纳入标准。
●知情同意当天年龄≥18岁
●具有组织病理学确认的单一胶质母细胞瘤或胶质肉瘤肿瘤(如果先前的诊断存在如间变性星形细胞瘤，或其他已进展至gbm的肿瘤类型，则可在与医学监查员或指定人员讨论后允许纳入)
●具有连续肿瘤的对象可以有资格获得批准
●在同意时第一次或呈现第二次胶质母细胞瘤或胶质肉瘤复发
●无法或计划进行全部或部分肿瘤切除，包括肿瘤减积术
●单个可测量的肿瘤，至少具有10.0mm最长直径(ldi)×10.0mm×最短直径(sdi)，并且该肿瘤的ldi或sdi不超过40.0mm。
●肿瘤的可测量区为实体/结节状，并且不是囊性的(大多数肿瘤将具有囊性组分，并且具有部分囊性肿瘤的对象可以在获得批准的情况下有资格进行研究，或者如果外科医生可以在可测量的肿瘤实体部分内进行注射)
●愿意从存档的载玻片或新获得的立体定向核芯活检中提供肿瘤组织样品用于生物标志物分析和突变状态
●肿瘤必须易于立体定向注射
●在计划的开始时间之前15天至-72小时(包括)在筛选mri上有肿瘤复发(如，最后一次治疗后的进展)的确定证据
●肿瘤位置不会有将病毒递送至心室系统中的风险
●先前手术切除、化疗和/或放射失败后记录的肿瘤复发或进展
●最近的先前化疗对1级或更低的毒性作用(神经病和脱发除外)消退
●注意：≤2级神经病和/或脱发的对象是该标准的一个例外，并且不会仅因这些原因而将他们排除在外。
●显示如下定义的足够的器官功能：
○血液学的
■嗜中性粒细胞绝对计数(anc)≥1,500/mcl
■wbc≥2.5x103/mm3
■血小板≥100,000/mcl
■血红蛋白≥10g/dl或≥5.6mmol/l
○肾的
■肌酸酐≤1.5xuln
■bun≤1.5xuln
○肝的
■总胆红素≤1.5xuln，或对于总胆红素水平>1.5xuln的对象，直接胆红素≤uln
■ast(sgot)和alt(sgpt)≤2.5xuln
○凝血
■国际标准化比值(inr)≤1.5xuln
■凝血酶原时间(pt)≤1.5xuln
■活化部分凝血活酶时间(aptt)≤1.5xuln
○足够的静脉通路
○karnofsky体能状况≥70％
○在dnx-2401施用之前基线/第0天无发烧(即<38.0℃)
先前的抗肿瘤疗法必须在dnx-2401注射之前的以下时间段内完成：
●亚硝基脲后4周
●长春新碱后2周
●丙卡巴肼或替莫唑胺后3周
●贝伐珠单抗、其他抗体疗法或其他抗血管生成疗法以治疗胶质母细胞瘤后4周
●包括研究药剂在内的其他抗癌剂的5个半衰期(或半寿期未知时最后一个剂量后2周)。在确定资格之前，将与医疗监查员或指定人员讨论这些药剂。
●对于可适用的筛选候选者，外部射束放疗(>5000cgy)必须在dnx-2401施用之前至少12周完成
女性不应该怀孕，并且应该采取措施保持非怀孕，如通过使用两倍的正常避孕保护(即双重屏障)，即通过使用避孕套和杀精凝胶或泡沫，或子宫帽和杀精凝胶或泡沫。除了屏障方法(如，避孕套或子宫帽)之外，还应使用杀精凝胶或泡沫。男性对象应从dnx-2401施用开始直至单剂量的dnx-2401后180天和最后一剂帕博利珠单抗后120天在整个研究期间使用可接受的避孕方法。
患者必须愿意并且能够提供知情同意书，经受并依从所有研究评估并遵守方案时间表，并同意在病毒施用后不捐献血液或配子。
vi.实施例
包括以下实施例以证明本公开内容的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为它们是构成其实践的优选模式。然而，鉴于本申请的公开内容，本领域技术人员应该理解在公开的具体实施方案中可以进行许多改变，并且在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下仍然可以获得相同或类似的结果。
实施例
实施例1
研究参数
目标.主要目标是评价在之后进行帕博利珠单抗的依序静脉内施用时递增剂量的dnx-2401的安全性以及肿瘤内dnx-2401的声明剂量的总体安全性，并确定客观应答率(orr)。次要目标是根据rano标准和经修改以考虑假性进展的rano标准(如，irano)来确定总生存期(os-12)以及确定临床获益率(cbr；被定义为cr+pr+sd)。探索性目标是根据rano标准和经修改以考虑假性进展的rano标准(如，irano)来评价总生存期(os)、os-8、无进展生存期(pfs)、六个月时的无进展生存期(pfs-6)、肿瘤反应时间、反应持续时间；评价karnofsky体能状况(kps)和神经系统状况的变化以及评价细胞因子、淋巴细胞亚型和其他潜在的生物标志物(如，pd-1、pd-l1表达、遗传突变)。
对象：上文示出了纳入标准。排除标准如下：
●具有多种(≥2)不同的增强肿瘤(可测量或不可测量的)的复发性gbm
●肿瘤形状为双叶或多灶的
●肿瘤介入将需要心室、脑干或后颅窝注射或者通过心室进入或者心室穿透的风险为了递送dnx-2401
●肿瘤涉及两个半球或涉及室管膜下或者疑似脑脊液(csf)散播(肿瘤跨过胼胝体中线延伸与被禁止的对侧半球(双半球)受累一致)
●记录的颅外转移
●需要在帕博利珠单抗开始2周内用高剂量全身皮质类固醇(被定义为地塞米松>4mg/天或生物等效物)治疗至少连续3天(事先考虑之后，可考虑替代管理策略)
●在2次单独测量中被定义为hba1c>7％的不受控制的血糖水平
●在过去2年内需要或已经需要全身治疗(即使用疾病调节剂、皮质类固醇或免疫抑制药物)或替代疗法(如，用于肾上腺或垂体功能不全等的甲状腺素、胰岛素或生理学皮质类固醇替代疗法)的活动性自身免疫性疾病不被认为是全身治疗的形式
●先前使用抗pd1或pdl1药剂(包括帕博利珠单抗)治疗
●活动性非感染性肺炎的证据
●间质性肺病的病史
●在dnx-2401施用前4周内治疗全血细胞减少症或其他血液病况的输注或药物(如，g-csf)
●先前的基因转移疗法或先前的使用任何类型的细胞裂解病毒的疗法
●在dnx-2401施用前45天内任何种类的活疫苗，并同时参加研究，注射用季节性流感杀死病毒疫苗除外
●dnx-2401施用后4周内进行大手术和2周内进行小手术(如果对象接受大手术，他们必须在接受dnx-2401之前完全从干预的毒性和/或并发症中恢复)
●在dnx-2401施用前30天内，目前参与并接受一种或多种研究药剂，或者已参与一种或多种研究药剂的研究，并已接受一种或多种研究药剂或使用研究装置
●任何进行mri的禁忌症
●从筛选访问开始直至单剂量的dnx-2401后180天和最后一剂帕博利珠单抗后120天，在研究期间怀孕或哺乳，或想要怀孕或当父亲
●有需要治疗和/或排除手术的不受控制的活动性感染或者不稳定的或严重的间发性医学病况的证据
●既往恶性肿瘤病史，除了治愈性治疗的皮肤基底或鳞状细胞癌(非黑色素瘤皮肤癌)、宫颈或阴道上皮内瘤形成、原位非侵入性乳腺癌或当前的前列腺特异性抗原(psa)<4.0ng/ml(mcg/l)的局限性前列腺癌(无转移性疾病证据且具有>2年无病间期的患有其他治愈性治疗的恶性肿瘤的对象可在批准后被登记)
●阻止肿瘤内注射至脑肿瘤的任何医学病况
●免疫受损的对象或者患有自身免疫病况、活动性肝炎(hav、hbv、hcv)、已知有活动性tb(结核分支杆菌)病史或人类免疫缺陷病毒(hiv)血清阳性的对象(最近暴露于患有活动性结核病的人或最近曾到过tb流行地区的人的对象需要进行tb测试)
●活动性乙型肝炎被定义为抗hbc核心抗体和hbsag表面抗原阳性
●出血性素质或使用抗凝药物或任何可能增加在手术前超过一周内无法停止的出血风险的药物的证据(低重量肝素和抗凝类药物(如，允许lovenox(依诺肝素)在临时、有限的基础上施用，以用于术后深静脉血栓形成(dvt)预防)
●会干扰对象评价的脑炎、多发性硬化或其他中枢神经系统(cns)感染或原发性cns疾病
●李-佛美尼综合症或在视网膜母细胞瘤基因或其相关途径中具有已知的种系缺陷
●严重的全身或重大疾病，包括但不限于：充血性心脏衰竭、缺血性心脏病、肾病或肾衰竭或器官移植
●在筛选前12个月内有效的导致健康问题的酒精或药物滥用或酒精依赖，
●研究者认为任何医学或心理学病况的历史或当前诊断可能干扰对象参与研究的能力或者由于认知、精神或复杂的医学问题而无法获得知情同意书
研究持续时间：长达105周的治疗(约24个月)以及最后剂量的帕博利珠单抗后90天的随访。此后，对于反应、生存、研究药物相关的不良事件和导致死亡的不良事件，将每16周进行一次长期生存随访。
研究设计：方案涉及对全部或部分切除是不可能或没有计划的具有第一次或第二次胶质母细胞瘤或胶质肉瘤复发的对象进行单次肿瘤内施用dnx-2401，以及依序施用静脉内帕博利珠单抗。在研究的初始阶段，总共多达12名合格的对象将参与剂量递增过程，并将在如下剂量递增群组中使用3+3研究设计进行登记，：
群组1：肿瘤内递送单剂量dnx-2401(5x108个vp)，然后依序静脉内帕博利珠单抗，每3周一次(q3w)
群组2：肿瘤内递送单剂量dnx-2401(5x109个vp)，然后依序静脉内帕博利珠单抗，每3周一次(q3w)
群组3：肿瘤内递送单剂量dnx-2401(5x1010个vp)，然后依序静脉内帕博利珠单抗，每3周一次(q3w)。
将三(3)名对象登记在群组1中，并且在初始剂量的帕博利珠单抗之后将跟踪21天以评价剂量限制性毒性(dlt)。如果没有观察到dlt，并且在审查临床数据(如，实验室结果、不良事件)之后，将登记下一个群组。如果在任何群组中，在最初的3名对象中观察到1例dlt，则将3名另外的对象添加到同一群组中。剂量递增将继续直至至少2名对象经历dlt或完成5x1010个vp的最高剂量群组，并且在第7天施用第一剂量的帕博利珠单抗后，对所有对象的安全性密切监测21天。如果2名或更多名对象有dlt，则先前的剂量将被视为已声明的第2阶段剂量。如果在对所有给药群组进行安全性审查后，在前3名对象中没有dlt或者在6名对象的扩展群组中没有<2例dlt，则该群组将被认为是安全和可容忍的。
在初始登记和剂量确定阶段之后，登记将在声明的剂量下对多达36名另外的合格对象继续进行。这些对象将在第0天经由插管或经由针接受单个肿瘤内dnx-2401剂量，并根据机构的术后护理标准政策进行管理。所有登记的对象也将在施用dnx-2401后7-9天开始帕博利珠单抗输注。
在病毒递送之前，将获得肿瘤的立体定向引导的活检，并经由冷冻切片对其进行分析以确认在计划的肿瘤内注射靶标处存在复发肿瘤。除了组织病理学分析之外，将分析组织的突变状态、其他潜在的生物标志物，并存档。
从第7天(+2天窗口)开始并持续长达105周或直至确认进行性疾病，每3周一次经30分钟以200mg的剂量静脉内输注帕博利珠单抗。在第7天，如果对象在第0天的dnx-2401施用程序后经历任何ae，则ae必须≤1级或在接受第一剂量的静脉内帕博利珠单抗之前返回到基线状态。
随后将监测完成治疗阶段和研究结束访问的对象直至第115周(即第103周最后剂量的帕博利珠单抗后12周或90天)。研究结束，帕博利珠单抗后间隔安全性状态将在第一次长期生存随访(第119周)进行审查。此后，将每16周追踪一次对象的反应、生存、研究药物相关的不良事件以及导致死亡(不论关系如何)的不良事件。
如果开始抗癌疗法，则早期退出或终止研究的对象将在研究药物施用后90天或研究药物施用后30天评估不良事件和严重不良事件(包括临床目标事件(eci))。此后，将每8周追踪一次对象的反应、生存、研究药物相关的不良事件以及导致死亡(不论关系如何)的不良事件。
在整个研究期间将进行安全监测。监测将包括不良事件和严重不良事件(包括临床目标事件(eci))、实验室评价、身体和神经系统检查、生命体征测量和mri，包括dnx-2401注射程序后mri(dnx-2401施用后36小时内)以评估血肿。
另外，其他探索性评估可以包括细胞因子、淋巴细胞亚型和其他潜在的生物标志物(如，pd-1和pd-l1)的变化。还将评价kps和神经系统状况的变化。
将通过每4周一次直至第28周进行的mri确定肿瘤反应。第28周访问对应于dnx-2401施用后大约6个月，并且可以在第0天之后不早于182天进行。为了支持这一点，第28周(第10周期)访问在dnx-2401施用后的194天至198天进行。在第28周(第6个月)之后，每8周用mri追踪一次肿瘤反应，直至dnx-2401后第105周(约24个月)，此后每16周一次(长期生存随访)。因为dnx-2401似乎至少通过引发抗肿瘤免疫反应而部分起作用，所以将通过rano标准和经修改以考虑假性进展的rano标准(如，irano)来评价客观反应。
除了研究者评估之外，还将收集mr图像以进行独立的中心审查。通过重复mri在至少4周后(28天+3天窗口)确认部分应答和完全应答。在通过mri检查疑似进行性疾病的情况下，将在至少4周后(28天+3天窗口)进行确认性mri。神经放射学家或其他有资格的pi指定人员将进行临床治疗决定所需的肿瘤测量和评估。在临床稳定的对象中通过mri确定的进行性疾病的情况下，研究者可以通过使对象处于研究中来行使自由裁量权。因为已经证实>5个月或更久肿瘤消退，所以在dnx-2401的肿瘤内递送之后，应该尽一切努力在开始替代疗法之前管理临床体征和症状。
必要时，每名对象应在dnx-2401施用前接受最低可能的稳定类固剂剂量7天，并在任何反应/疾病评估mri之前接受最低可能的稳定类固剂剂量3天。对于疑似自身免疫事件或病况和假性进展和/或肿瘤肿胀(如，出现中枢神经系统(cns)症状或其恶化)，推荐类固醇的脉冲给药(如，4mgbidx3天，然后每天4mgx2天，然后停用)。
在第一剂量的帕博利珠单抗之前的两周期间，类固醇将受到限制，并且根据方案资格排除标准，在研究第7天(+2天窗口)，在第一剂量的帕博利珠单抗之前的2周内，连续3天每天不得超过4mg地塞米松。完成第4周(第28天)研究访问后，在类固醇的脉冲给药对控制肿瘤肿胀/水肿无效的情况下，低剂量(3-5mg/kg，每2周x3)的贝伐珠单抗
如果贝伐珠单抗
也可以施用抗惊厥药以管理和预防已有癫痫病史的对象的癫痫，否则不应预防性施用抗惊厥药。
安全性评估：安全性评估将包括：收集不良事件和严重不良事件数据(包括临床目标事件(eci))、身体和神经系统检查、实验室检查、生命体征测量和mri(包括dnx-2401施用后36小时内获得的用以评估可能的术后血肿的mri)。安全性报告期开始于sae和第0天的ae的知情同意，并且在最后一剂研究药物后持续直至12周(90天)。研究药物相关的不良事件和导致死亡(不论关系如何)的不良事件将从第0天报告，并且直至每16周进行一次的长期生存随访(对于提前终止的情况，每8周一次)。
统计方法.样品大小：可以登记多达总计48名的可评价对象。在初始剂量递增期，将总结对于每个群组而言在第一次输注帕博利珠单抗后的21天内出现的安全性和剂量限制毒性(dlt)的发生率。
被定义为完全应答(cr)或部分应答(pr)的主要终点[客观应答率(orr)]将在单臂(组)设计中进行测试。样品大小估计基于等于5％的历史对照应答率。error！bookmarknotdefined.,error！bookmarknotdefined.待测试的零假设是dnx-2401处理的群体具有与历史对照率相同的orr。对于orr＝18％的替代假设，α＝0.05和n为36(声明的2期剂量)的单侧检验将产生80％的疗效。
分析集：安全性分析集(sas)：该集将包括接受至少一剂(或一剂的一部分)研究药物(dnx-2401和/或帕博利珠单抗)的对象。通常，sas将包括在基线时没有可测量肿瘤的对象；然而，为了有资格参加研究，所有对象都必须患有可测量的疾病。
可评价的分析集(eas)：基于意向治疗原则，该集将包括接受至少一剂(或一剂的一部分)的dnx-2401和帕博利珠单抗并且在基线时具有可测量肿瘤的对象。
安全性分析：所有安全性分析都将对安全性分析集进行。不良事件(ae)将根据美国国家癌症研究所-不良事件通用术语标准(nci-ctcae)4.03版(2010年6月14日)，或根据由研究者确定的未列入ctcae中的事件的方案限定的严重程度量表进行分级。dnx-2401治疗出现的ae是被定义为在dnx-2401施用开始后发作并持续到第105周(约24个月)或提前终止(以首先发生者为准)的那些。帕博利珠单抗治疗出现的ae是被定义为在第一剂量的帕博利珠单抗后发作直至最后一个剂量的帕博利珠单抗后90天或提前终止(以首先发生者为准)的那些。dnx-2401和帕博利珠单抗治疗出现的ae将使用根据研究者报告的逐字术语分类的系统器官分类(soc)和首选术语(pt)的最新版本的监管活动医学词典(medicaldictionaryforregulatoryactivities，meddra)进行分别总结。根据使用5点量表(1-5级)的最严重等级，将总结至少出现一次首选术语的对象的数量和百分比。还将总结每个首选术语的事件数量。将分别总结最大严重程度和因果关系(与研究药物的关系)。
报告ae、sae、相关ae、相关sae、≥3级ae、相关的≥3级ae和导致退出或治疗中止的ae的数量和百分比将根据soc和首选术语按照剂量进行总结。ae也将呈现在对象列表中。将确定ae的持续时间，并将ae的持续时间和所采取的行动和结果一起包含在列表中。还将为sae、导致中止和死亡的ae提供对象列表和叙述。
将总结病史和并发疾病，可以将其作为治疗-反应关系中的潜在混杂因素进行检查。先前和伴随的药物和疗法将使用最新版本的世界卫生组织药物词典(who-dd)进行编码，并对其进行总结。
实验室结果将根据nci-ctcae进行分类，并按照参数和时间点进行总结。不对应于编码术语的实验室结果将不被分级。将总结实验室异常的发生率。将总结dnx-2401施用后和帕博利珠单抗之后的最差研究中等级。还将显示≥3级实验室异常的发生率以及从基线到基线后最高级的毒性分级的变化。实验室值将由对象列出，并且标记正常参考范围之外的值。将单独列出妊娠测试结果。
通过使用描述性统计数据访问来总结生命体征测量值。体检结果将按访问进行总结，并且也将呈现在对象列表中。
疗效分析：将对可评价的分析集(eas)进行所有疗效分析。主要疗效终点将是客观应答率(orr)，被定义为具有作为从治疗开始直至进行性疾病或在获得的最新时间点记录的最佳总体应答的完全应答(cr)或部分应答(pr)的那些对象的总和(和百分比)。
通过mri检查确定的客观应答将基于rano标准和经修改以考虑假性进展的rano标准(如，irano)，其中主要分析基于rano标准(由核心读者评估)。orr将按对象的数量和百分比来总结。相应的95％和90％置信区间(ci)将基于二项式精确方法。
将确认完全应答、部分应答和疑似进展。mri上记录的任何部分或完全应答将通过重复mri在至少4周(28天+3天窗口)后确认。在通过mri确认的疑似肿瘤进展并且如由研究者确定没有恶化的临床状态的情况下，如果可能的话，将在至少4周(28天，+3天窗口)后进行重复mri，来试图确认进行性疾病。在疑似进行性疾病的情况下，强烈推荐通过肿瘤活检进行确认。另外，如果在开始替代癌症疗法之前切除肿瘤，则还应收集组织用于组织病理学、分子测定(如，测序、基因表达、免疫组织化学)，并存档用于与该研究相关的未来分析。
次要疗效端点将包括os-12和cbr。将使用kaplan-meier(km)方法总结os-12；所有估计值将以95％置信区间呈现。cbr将被总结为具有临床益处的对象的数量和比例，连同基于二项式精确方法的具有临床益处的对象的比例的95％ci。
将基于eas总结另外的疗效端点。其他探索性疗效端点将包括：os、os-8、pfs、pfs-6、反应时间、根据rano标准和经修改以考虑假性进展的rano标准(如，irano)的反应持续时间。将使用kaplan-meier方法总结所有此类终点，其中估计值与95％ci一起呈现。
os-8和os-12将作为8个月和12个月的生存估计值连同95％ci呈现。os终点被定义为所有对象在研究中时的总生存期特性，并将用km生存曲线以及四分位估计值(25％，中位数，75％)和相关的95％ci进行总结。
可以确定群体亚组分析(如，细胞因子、淋巴细胞亚型，如果进行)并进行亚组分析。此外，还可以进行基于参数如免疫效应的相关性分析。
kps和神经系统状况的相对于基线的变化也将在每个时间点按对象总结。
根据本公开内容，可以制备和实施本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法而无需过多的实验。尽管已经按照优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序应用变化而不脱离本公开内容的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文所述的试剂，同时将获得相同或类似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本公开内容的精神、范围和概念内。
以下是本文公开的系统和方法的一些具体编号的实施方案。这些实施方案仅为示例性的。应当理解，本发明不限于本文示出的用于说明的实施方案，而是包括落入上述公开内容范围内的其所有此类形式。
1)治疗患有脑肿瘤的对象的方法，其包括：
(a)向所述对象施用溶瘤腺病毒；和
(b)向所述对象施用抗pd-1抗体。
2)如实施方案1所述的方法，其中所述溶瘤腺病毒是腺病毒血清型5株系，在缺乏rb/p16肿瘤抑制途径的细胞中有选择性复制能力，含有编码腺病毒e1a蛋白的氨基酸122至129的24个核苷酸的缺失，和/或含有整联蛋白结合rgd-4c基序。
3)如实施方案1-2所述的方法，其中所述溶瘤腺病毒是dnx-2401。
4)如实施方案1-3所述的方法，其中所述抗pd1抗体是人源化抗体。
5)如实施方案1-4所述的方法，其中所述抗pd1抗体是帕博利珠单抗。
6)如实施方案1-5所述的方法，其中经肿瘤内递送所述溶瘤腺病毒。
7)如实施方案6所述的方法，其中经由插管或针递送所述溶瘤腺病毒。
8)如实施方案1-7所述的方法，其中以5x108个病毒颗粒/剂量、5x109个病毒颗粒/剂量或5x1010个病毒颗粒/剂量递送所述溶瘤腺病毒。
9)如实施方案1-8所述的方法，其中通过静脉内输注递送所述抗pd1抗体。
10)如实施方案1-9所述的方法，其中以200mg/剂量递送所述抗pd1抗体。
11)如实施方案10所述的方法，其中历经30分钟施用所述剂量。
12)如实施方案1-11所述的方法，其中在连续三个剂量的所述抗pd1抗体之前提供单剂量的所述溶瘤腺病毒。
13)如实施方案12所述的方法，其中溶瘤腺病毒施用和所述抗pd1抗体的第一施用之间的时间是约7-9天。
14)如实施方案12-13所述的方法，其中所述抗pd1抗体的依序施用之间的时间是约三周。
15)如实施方案1-14所述的方法，其还包括向所述对象施用类固醇、抗惊厥药或抑制血管内皮生长因子a的抗体中的一种或多种。
16)如实施方案12所述的方法，其中治疗还包括自溶瘤腺病毒施用之日起另外施用所述抗pd1抗体长达105周或24个月。
17)如实施方案1-16所述的方法，其中评价所述对象的总生存期、肿瘤反应、临床获益率、karnofsky体能状况、神经系统状况、细胞因子水平、淋巴细胞水平或生物标志物中的一种或多种。
18)如实施方案17所述的方法，其中所述生物标志物是pd-1水平或pdl-1水平。
19)如实施方案18所述的方法，其中通过mri测量肿瘤反应。
20)如实施方案1-19所述的方法，其还包括所述脑肿瘤的立体定向引导的活检。
21)如实施方案1-20所述的方法，其中所述脑肿瘤是多形性胶质母细胞瘤。
22)如实施方案1-20所述的方法，其中所述脑肿瘤是胶质肉瘤。
23)如实施方案1-22所述的方法，其中所述对象表现出至少9个月、12个月、15个月、18个月、24个月、36个月或48个月、其间的任何间隔的总生存期。
24)如实施方案1-22所述的方法，其中与未治疗的对照对象相比，所述对象表现出至少6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、24个月、36个月或48个月、其间的任何间隔的总生存期的增加。
25)如实施方案1-22所述的方法，其中在治疗开始后，所述肿瘤表现出降低的生长、无生长、肿瘤团块减小10％、肿瘤团块减小20％、肿瘤团块减小30％、肿瘤团块减小40％、肿瘤团块减小50％、肿瘤团块减小60％、肿瘤团块减小70％、肿瘤团块减小80％、肿瘤团块减小90％或肿瘤团块减小100％。
26)如实施方案1-22所述的方法，其中所述karnofsky体能状况在步骤(b)后改善或保持不变。
27)如实施方案1-22所述的方法，其中存在统计上可测量的临床益处。
28)如实施方案1-27所述的方法，其中所述对象在先前的治疗后表现出复发性或进行性脑肿瘤。
29)如实施方案1-28所述的方法，其中所述先前的治疗是化疗、放疗或抗体疗法。
30)如实施方案1-29所述的方法，其中所述对象是人类。
31)组合物，其包含：
(a)溶瘤腺病毒；和
(b)抗pd-1抗体。
32)如实施方案31所述的组合物，其中所述溶瘤腺病毒是腺病毒血清型5株系，和/或其中所述溶瘤腺病毒在缺乏rb/p16肿瘤抑制途径的细胞中有选择性复制能力，和/或其中所述溶瘤腺病毒包含编码腺病毒e1a蛋白的氨基酸122至129的24个核苷酸的缺失，和/或其中所述溶瘤腺病毒包含整联蛋白结合rgd-4c基序。
33)如实施方案31-32所述的组合物，其中所述溶瘤腺病毒是dnx-2401。
34)如实施方案31-33所述的组合物，其中所述抗pd1抗体是人源化抗体。
35)如实施方案31-34所述的组合物，其中所述抗pd1抗体是帕博利珠单抗。
36)如实施方案31-35所述的组合物，其中所述组合物经配制以用于肿瘤内递送。
37)如实施方案31-35所述的组合物，其中所述组合物经配制以用于静脉内输注。
38)如实施方案31-37所述的组合物，其中所述溶瘤腺病毒包含在5x108个病毒颗粒/剂量、5x109个病毒颗粒/剂量或5x1010个病毒颗粒/剂量的单位剂量中。
39)如实施方案31-38所述的组合物，其中所述抗pd1抗体包含在200mg的单位剂量中。
40)如实施方案31-39所述的组合物，其还包含类固醇、抗惊厥药或抑制血管内皮生长因子a的抗体中的一种或多种。
41)组合物，其包含腺病毒血清型5株系的溶瘤腺病毒，其中所述溶瘤腺病毒在缺乏rb/p16肿瘤抑制途径的细胞中有选择性复制能力，其中所述溶瘤腺病毒包含编码腺病毒e1a蛋白的氨基酸122至129的24个核苷酸的缺失，并且其中所述溶瘤腺病毒包含整联蛋白结合rgd-4c基序。
42)如实施方案41所述的组合物，其中所述溶瘤腺病毒是dnx-2401。
43)如实施方案41-42所述的组合物，其中所述溶瘤腺病毒包含在5x108个病毒颗粒/剂量的单位剂量中。
44)如实施方案41-42所述的组合物，其中所述溶瘤腺病毒包含在5x109个病毒颗粒/剂量的单位剂量中。
45)如实施方案41-42所述的组合物，其中所述溶瘤腺病毒包含在5x1010个病毒颗粒/剂量的单位剂量中。
可以组合上述各种实施方案中的任一种以提供另外的实施方案。本申请说明书中提及的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、pct申请公布、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。如果有必要，可以修改实施方案的各方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供另外的实施方案。根据以上详述，可以对实施方案进行这些和其他改变。通常，在所附权利要求书中，所用术语不应被解释为将权利要求限制在说明书和权利要求中公开的具体实施方案中，而应被解释为包括所有可能的实施方案连同权利要求所赋予的等效物的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。
本文参考或提及的所有专利、出版物、科学论文、网站以及其他文献和材料表示本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且每个此类参考文献和材料在此通过引用并入本文，其程度如同其单独地通过引用整体并入本文或在本文中以其整体示出。申请人保留将来自任何此类专利、出版物、科学论文、网站、可以电子形式获得的信息以及其他参考材料或文件的任何和所有材料及信息实际并入本申请说明书的权利。
该专利的书面描述部分包括所有权利要求。此外，所有权利要求，包括所有原始权利要求以及来自任何和所有优先权文件的所有权利要求，均在此通过引用整体并入说明书的书面描述部分，并且申请人保留将任何和所有此类权利要求实际并入本申请的书面描述或任何其他部分的权利。因此，例如，在任何情况下，该专利均不得被解释为基于以下主张据称未提供权利要求的书面描述：权利要求的精确措辞未示于该专利的书面描述部分的用语中。
将依法解释权利要求。然而并且尽管声称的或感知到容易或难以解释任何权利要求或其一部分，但在任何情况下，在产生该专利的一个或多个申请的审查过程中，对权利要求或其任何部分的任何调整或修改，均不得被解释为丧失对不构成现有技术的一部分的任何及其所有等效物的任何权利。
本申请说明书中公开的所有特征可以任何组合方式组合。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是等效或类似特征的通用系列中的实例。
应该理解，虽然已经结合本发明的详述描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。因此，从前述内容可以理解，尽管在本文中出于说明的目的已经描述了本发明的具体非限制性实施方案，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内，并且除了所附权利要求之外，本发明不受限制。
本文描述的具体方法和组合物是优选的非限制性实施方案的代表，是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本申请说明书后将想到其他目的、方面和实施方案，并且所述其他目的、方面和实施方案被涵盖在由权利要求的范围限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文说明性描述的发明可以在不存在任一个或多个要素或一个或多个限制的情况下适当地实施，所述一个或多个要素或限制在本文中没有具体公开为必要的。因此，例如，在本文的每种情况下，在本发明的非限制性实施方案或实施例中，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被广泛地理解而不受限制。本文说明性描述的方法和过程可以适当地以不同的步骤顺序实施，并且它们不必限于本文或权利要求中指出的步骤的顺序。
已经使用的术语和表达用作描述的术语而非限制，并且不意图使用此类术语和表达来排除示出和描述的特征的任何等效物或其部分，但是应当认识到，在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应该理解，尽管已经通过各种非限制性实施方案和/或优选的非限制性实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用的本文公开的概念的任何和所有修改和变化都被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。
本文广泛和一般性地描述了本发明。落入一般公开内容中的较窄物种和亚属群组中的每一种也形成本发明的部分。这包括从属中去除任何主题的附带条件或否定限制的本发明的一般描述，不管切除的材料是否在本文具体列举。
还应理解，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定，术语“x和/或y”意指“x”或“y”或“x”和“y”两者，并且名词后面的字母“s”表示此名词的复数形式和单数形式。此外，当本发明的特征或方面以马库什组描述时，其意在并且本领域技术人员将认识到，本发明包含并且因此也按照马库什组的任何单个成员和任何亚组成员描述，并且申请人保留修改申请或权利要求的权利，以特别指代马库什组的任何单个成员或任何亚组成员。
其他非限制性实施方案在所附权利要求中。该专利可以不被解释为限于本文具体和/或明确公开的具体实施例或非限制性实施方案或方法。在任何情况下，专利都不得被解释为受专利商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员所作的任何陈述的限制，除非申请人在意见陈述中明确地以及在没有资格或保留的情况下清楚地采用此类陈述。vii.参考文献
以下参考文献通过引用明确地并入本文，其程度为它们对本文中所阐述的那些提供示例性、程序性或其他细节性补充。
美国专利8,992,458
美国专利公布2013/0035660
美国专利公布2013/0035574
美国专利公布2013/0035560
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