药物递送系统用胞吞作用增强剂的制作方法

本发明涉及能够在药物递送系统中使用的胞吞作用增强剂。更详细地说，涉及包含碳硅烷树状高分子和荧光蛋白的药物递送系统用的胞吞作用增强剂。

已知含有噻咯基的树状高分子(以下在本说明书中称为“碳硅烷树状高分子”)通常在形成胶束时会进行荧光发光。负载有糖等亲水性化合物的碳硅烷树状高分子在有机溶剂中通过aie(聚集诱导发光，aggregation-inducedemission)而进行发光，但由负载有亲水基的碳硅烷树状高分子形成的胶束的发光具有环境依赖性，强度也较弱。此处，aie是指发光性化合物相互聚集、通过照射特定波长的光而引起高效发光的现象(参见非专利文献1，下文中称为“现有技术1”)。

另外，已知负载有糖的碳硅烷树状高分子(下文中有时称为“scd”)在有机溶剂中会形成溶剂驱动型胶束、但在水溶性溶剂中不形成胶束(参见图1和图2)。与之相对，已知负载有蛋白质的碳硅烷树状高分子(下文中称为“pcd”或“聚集性分子”)在蛋白质朝向外侧的状态下会形成脂质体(下文中有时称为“囊泡”)或胶束(参见图3)。下文中有时将这样形成的囊泡或胶束称为“pcd胶束”。

并且已知，使碳硅烷树状高分子提呈蛋白质时，会通过aie而产生强烈的荧光发光(参见专利文献1，下文中称为“现有技术2”；参见图3)。并且，将所提呈的蛋白质置换成荧光蛋白时，观察到更强的荧光发光。

目前，发出各种荧光的荧光蛋白被广泛用于生物体内的标记。在开始作为荧光标记使用的初期，经常发生因荧光蛋白而产生不希望的缔合、给所期望的观察带来障碍的情况。例如，在肌动蛋白中添加只有为四聚体才会发出荧光的dsred之类的荧光蛋白时，由于dsred的作用，4个肌动蛋白亚单位发生缔合，无法在细胞内进行所期望的观察。

因此进行了下述研究：对天然状态下以四聚体存在的荧光蛋白施加修饰等，进行使其按照即使成为单体也会发出荧光、或者即使为二聚体也不会发生缔合的方式发生突变等操作，使荧光蛋白不发生聚集。其结果，目前的市售品为二聚体或单体(参见非专利文献2)。

另外，在对医药制剂进行给药的情况下，虽然还取决于需要治疗的疾病和药剂的性质，但能够将多少有效成分递送到靶部位这一点会对副作用发生的有无和有效率产生影响。因此，作为用于将医药制剂适当地递送至靶部位的手段，积极地进行了各种药剂递送系统(dds：drugdeliverysystem)的开发。

并且，作为用于dds的载体，例如已知有脂质体、合成树脂粒子、树状高分子等，为了预防和/或治疗因病毒或细菌的感染而产生的疾病，进行了例如利用树状高分子的载体的开发(参见专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5629888号公报

专利文献2：wo2016/084979

非专利文献

非专利文献1：chemcommun(camb).2009aug7；(29):4332-53.doi:10.1039/b904665h.epub2009may13

非专利文献2：https://pdbj.org/mom/174

技术实现要素：

发明所要解决的课题

所给药的药剂之中，90％以上以原形药物形式在未被生物体代谢的情况下排出，因而给药量需要为一定量以上。另外，在以抗体、肽等被称为下一代药物的生物高分子作为有效成分的药物的情况下，以原状态会在递送至靶部位之前失活，因此需要包封在上述cd胶束等胶束中(参照图4)。

另一方面，为了使像这样包封在胶束中的药物发挥出药理效果，需要将其摄入到细胞内。并且，像这样包封在胶束中的药剂的摄入大多通过胞吞作用来进行，因此需要提高胞吞作用。

另外，为了增强胞吞作用，需要某种增强剂，但这样的增强剂必须其本身具有生物相容性且不损害上述cd胶束的稳定性。但是，到目前为止，尚未得知具有这样的特性/性质的胞吞作用增强剂，对于具有这样的特性/性质的胞吞作用增强剂有强烈的社会需求。

另外，胞吞作用增强时，会导致给药量的减少。并且，这还能够减少原形药物的排出量，因而可减轻因化学物质向环境中的释放所致的环境负荷。此外，根据药剂的不同，还有可能实现副作用的减轻。

因此，对于下述可增强胶束的胞吞作用的增强剂有强烈的社会需求，该增强剂可减少给药量，能够作为确认向靶组织的递送或药剂的释放并估计药剂的有效给药量的工具使用。

用于解决课题的手段

本发明人发现，利用硫醇与卤代烷烃的反应性，将含噻咯的碳硅烷树状高分子与标记蛋白(例如绿色荧光蛋白，下文中有时将后述的发出绿色以外的荧光的荧光蛋白包括在内，统称为“gfp”)在水性溶剂中、或者在上述水性溶剂与有机溶剂的混合溶剂中进行混合，结果可形成作为上述树状高分子与蛋白质的复合物的聚集性分子(提呈gfp的碳硅烷树状高分子)；生成gfp本身的缔合物；以及该缔合特性成为生成cd胶束的动力。

之后，进一步反复进行了研究，结果，本发明的发明人发现，上述聚集性分子的制作过程中生成的gfp本身的缔合物显著增强上述cd胶束向细胞内的胞吞作用。并且还发现，使靶向结合性的肽与gfp结合时，可改变gfp的缔合容易性，从而完成了本发明。

本发明是在上述状况下完成的，其目的在于提供一种包含碳硅烷树状高分子和荧光蛋白的药物递送系统用的胞吞作用增强剂。

本发明包括下述方式。

本发明的一个实施方式中涉及一种胞吞作用增强剂，其包含由荧光蛋白形成的缔合物。此处，上述荧光蛋白优选为选自由白色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白以及绿色荧光蛋白组成的组中的任一种荧光蛋白。

另外，上述缔合物优选为2～10分子的上述荧光蛋白聚集而成的。上述荧光蛋白优选进一步具备靶向识别序列，优选上述缔合物还增强上述缔合物本身向细胞内的摄入。靶向识别序列优选为能够调节上述荧光蛋白的缔合物形成的序列。

上述靶向识别序列优选由功能性肽构成，上述功能性肽优选与靶组织中表达的选自由表面抗原、受体、门、转运蛋白和通道组成的组中的任一种靶蛋白特异地结合。上述靶向识别序列优选按照调节上述荧光蛋白的缔合物形成的方式起作用，上述靶向识别序列优选为具有选自由序列表的序列号1～3组成的组中的任一序列的肽。

dmpgtvlpgg(序列表的序列号1)

vptdtdysgg(序列表的序列号2)

dmpgtvlpgggggsegewqqqqhqwakqe(序列表的序列号3)

另外，上述胞吞作用增强剂优选使由具有下述式(i)所表示的骨架结构的聚集性分子构成的胶束基于胞吞作用的摄入增强。式中，n表示1～6的整数。

[化1]

上述式(i)所表示的聚集性分子优选为具有下述式(ii)所表示的骨架的化合物。

[化2]

上述聚集性分子优选为选自由下述式(iii)～(vi)组成的组中的任一式所表示的分子。下述式中，gfp表示荧光蛋白。

[化3]

[化4]

[化5]

[化6]

本发明的胞吞作用增强剂优选增强由上述聚集性分子形成的胶束的胞吞作用。此处，上述胶束是在水性溶剂中使蛋白质位于外侧而形成的，发出基于fret而产生的荧光，直径为50～500nm。

另外，上述胶束优选可包封选自由分子量20万以下的蛋白质、核酸以及疏水性分子组成的组中的任一种分子，上述分子量20万以下的蛋白质优选选自由免疫球蛋白g、凝集素以及肽激素组成的组。

发明的效果

根据本发明，能够提供一种胞吞作用增强剂，本发明的增强剂能够增强由上述聚集性分子构成的胶束向细胞中的胞吞作用。此处，本发明的胞吞作用增强剂具有在生物体内也能够检测/观察的强荧光强度。

附图说明

图1是示出噻咯哑铃形(1)6-lac的基本形态(a)和胶束形成(b)的示意图。

图2是示出在丙酮/水的混合溶剂中噻咯哑铃形(1)6-lac所形成的胶束的粒径与荧光强度的关系(a)和荧光波长的变化(b)的图。

图3(a)是示出与gfp结合的碳硅烷树状高分子的示意图。图中，荧光蛋白由黑色长方形表示，在标注框中示意性地示出了详细结构。图3(b)是示出提呈了gfp的碳硅烷树状高分子(聚集分子)发生聚集前的状态的图。图3(c)是示出上述聚集性分子发生了聚集的状态的图。

图4是能够包封在上述聚集性分子中的生物高分子的示意图(a)和示出蛋白质驱动型的聚集的示意图(b)。图4(b)中，与图3同样地在标注框内示意性地示出gfp，并且同样示意性地示出免疫球蛋白g。

图5是示出本发明的聚集性分子和本发明的胞吞作用增强剂的制造以及与其相伴的荧光波长的变化的示意图。

图6是示出使碳硅烷树状高分子提呈上述荧光蛋白后的胶束的形成和荧光蛋白的缔合物(gfp残余量)的量不同的组分的荧光检测的结果。(a)表示荧光蛋白的缔合物的含量少者、(b)表示该含量为中等程度者、(c)表示该含量多者。

图7是示出由本发明的聚集性分子形成的胶束粒子的形状的扫描型电子显微镜照片(a)、示出其粒径分布和发光特性的变化的图((b)和(c))。图7(b)中，tps表示无包封分子的粒子，另外gds胶束表示有包封分子的胶束。

图8是利用低温低真空扫描型电子显微镜，为了判断所形成的粒子是胶束还是囊泡而进行观察时的电子显微镜图像。图中，白色圆和白色箭头所示的结构物被认为是盐的结晶。另外，黑色圆和黑色箭头所示的结构物被认为是囊泡样物质。

图9是示出对所使用的靶向肽中包含的缔合物进行研究的凝胶电泳结果的图。(a)是示出荧光检测结果的图，另外，(b)是示出cbb(考马斯亮蓝)染色结果的图。

图10是示出对所形成的缔合物进行研究的凝胶电泳图像的图。(a)和(b)为fitc染色结果(激光475和pmt500)。另外，(c)和(d)是在cbb染色后进行脱色的结果(之一)。

图11是示出对所形成的缔合物进行研究的凝胶电泳图像的图。(a)和(b)为fitc染色结果(激光475和pmt500)。另外，(c)和(d)是在cbb染色后进行脱色的结果(之二)。

图12是示出通过所使用的缔合物中包含的靶向肽如何改变胶束向细胞中的摄入的结果的图(之一)。

图13是示出通过所使用的缔合物中包含的靶向肽如何改变胶束向细胞中的摄入的结果的图(之二)。

图14是示出通过所使用的缔合物中包含的靶向肽如何改变胶束向细胞中的摄入的结果的图(之三)。

图15是示出通过所使用的缔合物中包含的靶向肽如何改变胶束向细胞中的摄入的结果的图(之四)。

图16是示出使用50mm的tris-hcl缓冲液(ph8.0)时所形成的胶束的粒度分布的图。(a)为胶束组分液、(b)为未反应胶束组分液。

图17是示出使用50mm的hepes缓冲液(ph7.6)时所形成的胶束的粒度分布的图。(a)为胶束组分液、(b)为未反应胶束组分液。

图18是示出使用50mm的柠檬酸钠缓冲液(ph7.6)时所形成的胶束的粒度分布的图。(a)为胶束组分液、(b)为未反应胶束组分液。

图19是示出使用50mm的碳酸-碳酸氢钠缓冲液(ph8.36)时所形成的胶束的粒度分布的图。(a)为胶束组分液、(b)为未反应胶束组分液。

图20是示出使用50mm的tris-hcl缓冲液(ph8.0)时所形成的胶束的荧光特性的图(刚制备后)。

图21是示出使用50mm的hepes缓冲液(ph7.6)时所形成的胶束的荧光特性的图。(a)表示刚制备后的荧光特性、(b)表示1天后的荧光特性。

图22是示出使用50mm的柠檬酸缓冲液(ph7.6)时所形成的胶束的荧光特性的图。(a)表示刚制备后的荧光特性、(b)表示1天后的荧光特性。

图23是示出使用50mm的碳酸钠缓冲液(ph8.36)时所形成的胶束的荧光特性的图。(a)表示刚制备后的荧光特性、(b)表示1天后的荧光特性。

具体实施方式

下面进一步详细说明本发明。本发明涉及如上所述的包含由荧光蛋白形成的缔合物的胞吞作用增强剂。构成本发明的胞吞作用增强剂的荧光蛋白没有特别限定，但优选为包含绿色荧光蛋白及其突变体的荧光蛋白。这是由于，上述gfp缔合而形成缔合物时会发出强烈的荧光，并且所形成的缔合物发挥出增强胞吞作用(将细胞表面附近存在的物质摄入到细胞内)的效果。另外，与此同时，该缔合物本身也被大量摄入到细胞内。

作为可以在本发明中使用的gfp，上述蛋白质可以举出白色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白以及绿色荧光蛋白等，只要可形成缔合物就没有特别限定。例如可以举出序列表的序列号7所示的gfp、序列号8所示的gfp、序列表的序列号9所示的bfp(蓝色荧光蛋白)、序列表的序列号10所示的tfp等，以及由clontech公司等销售的cfp、rfp和其他gfp衍生物。

另外，除这些以外，也可以使用序列表的序列号5所示的来源于辐盘海葵的荧光蛋白等。此外，从结构特性上可以想到还可以优选使用由mbl公司销售的azami-green或其他颜色突变体。这样的荧光蛋白由于可检测的波长范围广、荧光强度高而能够优选地使用。此处，上述蓝色荧光蛋白包括呈现出蓝色或蓝绿色的荧光的荧光蛋白中的任一种。

如上所述，本发明中使用的gfp优选具有容易形成二聚体以上的缔合物的性质，出于荧光的强度和容易形成缔合物的原因，优选使用序列表的序列号7所示的gfp。

这样的gfp可以使用公知的方法(例如参考biochim.biophys.acta1679(2004)222-229；biochem.biophys.res.commun.330(2005)454-460等)来产生，也可以使用委托于进行这样的gfp的制造的企业而制作的gfp。

另外，作为具体的缔合度，出于胞吞作用增强效果高的原因，优选2～10分子的上述荧光蛋白进行聚集，更优选为四聚体以上。这是由于，本发明的胞吞作用增强剂中，上述荧光蛋白的缔合度越高，胞吞作用增强效果则越高，并且上述缔合物还会增强上述缔合物本身向细胞内的摄入。

为了容易形成上述荧光蛋白的缔合物，上述荧光蛋白优选进一步具备靶向识别序列。作为这样的靶向识别序列，可以举出与各种组织中表达的选自由表面抗原、受体、门、转运蛋白和通道组成的组中的任一种靶蛋白特异性结合的序列等。这是由于，与不具有这样的靶向识别序列的荧光蛋白比较时，上述荧光蛋白更容易缔合。

更具体地说，上述功能性肽可以举出具有选自由序列表的序列号1～3组成的组中的任一序列的肽。这是由于，通过在gfp上附加这些肽，可调节上述gfp的缔合物的形成。

dmpgtvlpgg(序列表的序列号1)

vptdtdysgg(序列表的序列号2)

dmpgtvlpgggggsegewqqqqhqwakqe(序列表的序列号3)

具体而言，具有上述肽的gfp可以举出具有选自由序列表的序列号4～6组成的组中的任一者中记载的序列的肽等。

masmtggqqmgrdmpgtvlpggmskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkfisttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkrhdffksampegyvqertisfkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyitadkqrngikanfktrhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsallkdpnekrdhmvllefvtaagsgitdevdgtelykgghhhhhh(序列表的序列号4)

masmtggqqmgrvptdtdysggmskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkfisttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkrhdffksampegyvqertisfnddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyitadkqrngikanfktrhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsallkdpndkrdhmvllefvtaagsgitdevdgtelykgghhhhhh(序列表的序列号5)

masmtggqqmgrdmpgtvlpgggggsegewqqqqhqwakqemskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkfisttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkrhdffksampegyvqertisfkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyitadkqrngikanfktrhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsallkdpnekrdhmvllefvtaagsgitdevdgtcelykgghhhhhh(序列表的序列号6)

本发明的胞吞作用增强剂可以通过使所期望的gfp在生理盐水等蛋白质不会发生变性的水性溶剂中溶解并缔合而得到。另外，可以在通过图5所表示的反应使具有下述式(ii)所表示的骨架的化合物与gfp结合时的同时进行制造。

[化7]

例如，上述的反应可以在适当的溶剂(例如磷酸缓冲生理盐水(pbs)、生理盐水、tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、碳酸-碳酸氢钠缓冲液等水溶性溶剂)中进行。这种情况下的反应条件根据所使用的蛋白质而不同，但只要反应温度低于所使用的蛋白质的变性温度即可，例如可以为0～50℃、优选为30℃～45℃、更优选为37℃左右。使用gfp时，最高至42℃可以温度依赖性地提高反应性。

另外，在形成胶束时使用如上所述的缓冲液并对所形成的胶束进行分离时，例如使用1×pbs时，能够得到包封在胶束中的缓冲液与将胶束悬浮的缓冲液不同的胶束组分液。通过这样操作，能够制作出更适于包封在胶束中的药剂的溶解等的胶束。

gfp优选预先利用dtt等还原剂进行处理而预先形成-sh基未被氧化的状态。关于荧光蛋白与树状高分子的混合比例(摩尔比)，将蛋白质设为1，树状高分子例如可以为1～20、优选为1：5～1：15、更优选为1：10左右。但是，该比例依赖于浓度，最佳值会发生变动。

另外，反应时间根据反应温度而不同，优选为例如1小时～24小时、优选10小时～19小时、更优选15小时～18小时左右。这是由于，通过设定为这种程度的反应时间，在所使用的具有巯基的gfp与上述噻咯树状高分子结合(以下有时称为“gfp-tps”)的同时可形成作为本发明的胞吞作用增强剂的gfp缔合物。利用该反应，可将1分子以上的gfp引入到上述噻咯树状高分子中。

之后，通过按照常规方法生成，可得到包含上述gfp-tps的组分。此处，包含上述gfp-tps的组分中包含一定范围浓度的gfp缔合物。gfp缔合物的浓度根据上述的靶向肽的有无和种类而不同，大致分为gfp缔合物的含量少者(胶束a)、含量为中等程度者(胶束b)以及含量多者(胶束c)这3种(参见图6的(a)～(c))。

关于包含上述胶束的组分中的gfp的含量，可以通过使激发波长为488nm、检测波长为510nm来进行测定，关于gfp-tps，可以以激发波长370nm、检测波长510nm进行测定。

由于胶束崩解时胶束的fret消失，因而可以以fret的变化作为指标对上述载体(胶束)在生物体内的状态进行监测。进而，由于能够进行这样的监测，因而能够对这样的胶束是存在于水性溶剂中还是被摄入到细胞内、以及胶束是否崩解等状态进行追踪。另一方面，由于缔合物的fret残留，因而即使胶束消光，也能够对缔合物在水性溶剂中是否存在、例如在细胞膜上是否存在等进行追踪。

根据本发明，能够提供如上所述的药物递送用胞吞作用增强剂。

实施例

下述实施例只不过是例示，并不限定本发明的范围。

(实施例1)本发明的胞吞作用增强剂的制作

本实施例中，作为胞吞作用增强剂制作用的蛋白质以及gfp-tps制作用的蛋白质，使用序列表的序列号7所示的gfp，另外，作为树状高分子，使用噻咯树状高分子。关于此处所使用的gfp(序列表的序列号7)，根据发明人已经报道的方法(参见biochim.biophys.acta1679(2004)222-229；biochem.biophys.res.commun.330(2005)454-460)，将序列号7所示的gfp的氨基酸序列的c末端区域的第251位氨基酸置换为半胱氨酸，并且将原本存在的半胱氨酸(第48位和第70位)分别置换为丝氨酸和缬氨酸。

(1)dds用聚集性分子的制作

本实施例中，作为具有卤素基的树状高分子，使用下述化学式(i)所示的化合物，作为具有巯基的蛋白质，使用gfp(绿色荧光蛋白)(序列号7)。

[化8]

首先，在浓度20μm的gfp溶液(pbs中)中加入dtt使最终浓度为1mm，在室温下处理10分钟，对存在于gfp表面的半胱氨酸进行还原。在将半胱氨酸还原后的400～450μl的20μmgfp溶液(pbs中)中加入200μm的上述式(vi)所示的噻咯树状高分子溶液(dmso溶剂)10μl，使最终浓度为10倍摩尔当量，利用涡旋混合器进行混合。

混合后，在37℃下静置，以该状态温育过夜，使gfp与上述噻咯树状高分子结合，继而形成胶束。此时的温育时间为约16～18小时。利用动态光散射法(dls：dynamiclightscattering)对所得到的包含胶束的溶液中的胶束粒子的特性进行。将结果示于表1。

[表1]

25℃、pbs中的原料和产物的5次测定的平均粒径[nm]

另外，对于上述反应液，使用zetasizernano-s(malvern公司制造)，将激光波长设定为532nm，在25℃下测定粒径。将结果示于图7。图7(a)是gds胶束的电子显微镜图像。图7(b)中示出了仅用gfp进行温育并对所得到的产物的粒径分布进行调查的结果、仅用噻咯树状高分子进行温育并对所得到的产物的粒径分布进行调查的结果、以及将gfp与式(vi)的噻咯树状高分子混合进行温育并对所得到的产物(gfp-tps)的粒径分布进行调查的结果。横轴表示所得到的产物的粒径(nm)，纵轴表示各产物在整体中所占的％(出现频率)。

另外，图7(c)是示出上述3种产物的荧光检测结果的图。横轴表示波长(nm)，纵轴表示各产物在整体中所占的％(出现频率)。

在将gfp与上述噻咯树状高分子进行温育的情况下(上述表1中，表示为“仅gfp-噻咯”)，所得到的胶束的粒径约为150nm。与之相对，在仅对gfp进行温育的情况下观察到的粒径约为4nm，在仅用上述噻咯树状高分子进行温育的情况下观察到的粒径约为650nm。

接着，利用扫描型电子显微镜(sem：scanningelectronmicroscope)对所得到的胶束的粒子进行观察，结果确认到大量的粒径约为100～500nm的粒子和少量的粒径为500nm左右的粒子(参见图8(a)～(c))。

由以上结果可知，使用本发明的dds用聚集性载体形成的胶束的粒径约为100～500nm，且粒径约100～200nm左右的胶束多。另外，由使用sem的电子显微镜照片的图像还确认到形成了球状的胶束结构(参见图7(a))。

(2)荧光共振能量转移的确认

本实施例中使用的噻咯树状高分子具有当疏水性的噻咯的核部分聚集时会发光(发挥出aie效果)的性质，因此确认了在形成胶束结构的情况下也发光。于是，对于在制作由使gfp结合到噻咯树状高分子上而成的gfp-噻咯树状高分子构成的胶束的情况下，在噻咯与gfp之间是否发生荧光共振能量转移(fret：fluorescenceresonanceenergytransfer)进行了研究。

仅用噻咯树状高分子温育的产物在370nm的波长下激发(点划线)，仅用gfp温育的产物在488nm的波长下激发(虚线)，使用gfp和噻咯树状高分子温育的产物在370nm的波长激发(实线)，对各自的发光波长的特性进行了调查(参见图7(c))。关于由gfp-噻咯树状高分子复合物构成的胶束(利用gfp和式(x)的噻咯树状高分子进行温育而得到的产物)，在510nm附近观察到由噻咯向gfp的fret所致的发光。

如图7(c)所示，关于gfp的发光，在510nm附近观察到尖锐的峰，认为这是由于从上述噻咯树状高分子向gfp的fret所致的。在480nm附近观察到噻咯树状高分子的发光的峰。另外，关于gfp与噻咯树状高分子的结合体的发光，未确认到尖锐的峰，在510nm附近显示出最高值。与之相对，在胶束崩解时，被认为是由fret引起的发光也消失。

即，制作使具有aie效果的树状高分子与荧光蛋白等缔合性蛋白质结合而成的分子(gfp-tps)，使用这样的分子形成胶束时确认到，即使在胶束状态下也会在树状高分子与荧光蛋白之间产生fret；fret随着胶束的崩解而消失。另外确认到，作为本发明的胞吞作用增强剂的gfp缔合物也发光。

由以上表明，使用本发明的胞吞作用增强剂时，能够确认被递送到细胞内的gfp-tps和gfp缔合物。另外表明，即使在被递送到靶组织、器官中的胶束崩解后，也能够追踪荧光蛋白的荧光，由此也能够感知荧光蛋白被递送的细胞内的环境等。

(实施例2)结合有靶向肽序列的荧光蛋白的制备

结合有靶向肽序列的荧光蛋白如下制备，该荧光蛋白在c末端与本发明的胶束结合，并且在n末端与靶向肽结合，该靶向肽与在癌细胞表面表达的受体结合。

(1)反向pcr

(1-1)肽序列的选择

将所选择的引入到靶结合部位的肽的氨基酸序列记载于下述表2中。mcf7-1为包含下述表2所示的序列的人乳腺癌来源细胞mcf7(下文中有时称为“靶向型1型”)，mcf-2为包含下述表2所示的序列的mcf-1的突变体(下文中有时称为“靶向型2型”)。另外，如下述表2所示，mcf7-1+αstrand为具有将α螺旋结构的短肽(下文中称为“αstrand”)连接到上述mcf7-1上而成的结构的mcf7-1的另一突变体(下文中有时称为“1型增强型”)。

[表2]

(1-2)引物的制作

下述表3中记载了用于对表2中所示的上述肽序列进行反向pcr的引物。这些引物以如下方式设计：对于序列表的序列号1和3，从上述肽序列的dm和pgtvlp之间开始延伸反应，对于序列号2，从上述肽序列的vp和tdtdysgg之间开始延伸反应。这是鉴于最佳地进行反向pcr的原因。

[表3]

(1-3)反向pcr用模板质粒的制备

反向pcr用模板质粒利用下述论文中记载的方法制备。

“protease-sensitivesignallingbychemicallyengineeredintramolecularfluorescentresonanceenergytransfermutantsofgreenfluorescentprotein.-mihosuzuki,etal.biochimicaetbiophysicaacta(bba)-genestructureandexpression

volume1679,issue3,17september2004,pages222-229”

(1-3-1)gfpuv5突变体的质粒构建

gfpuv5如下由pgfpgcn4得到。首先，利用i167t突变+使用了正向引物5’cattgaagatggctccgttcaa(序列号18)和反向引物5’ttgtggcgagttttgaagttag(序列号19)的反向pcr，得到产生了基因操作用的同义突变的pcr产物，接着对该pcr产物进行环化处理，由此进行制作。将如上得到的构建体命名为pgfpgcn5。

之后，将gfpuv5的cdna克隆到pet21a(novagen公司制造)中，使蛋白进行表达。将此处表达的蛋白质进行纯化，命名为gfpuv5tag。对于其编码区，利用引物5’ctcgaccat[atggctagcatgactggtggacagcaaatgggt]cgcatgagtaaaggagaagaacttttca(序列号20)(与gfpuv5系列的朝向n末端的t7基因的10个蛋白质用的最初的11个氨基酸的表位标签粘着，粘着的标签用[]表示)以及对gfpuv5系列的c末端提供his标签的5’tgacgtgaattcatta[gtgatggtgatggtgatg]tttgtagagctcatccatgc(序列号21)(his标签用[]表示)进行扩增。

将序列号1～3所示的碱基序列插入到pet21a中，用ndei和ecori消化。将该pgfpgcn质粒用于基因操作，将pet21a质粒用于t7启动子控制下的蛋白质表达。通过dna测序确认了gfpuv5的基因及其突变体的基因的碱基序列(abiprism3100geneticanalyser公司制造)。实验中发现了另外3个同义突变(ser-30agt突变为agc，his-78cat突变为cac，gln-183caa突变为cag)。

这些突变对于荧光蛋白来说并不是有害的，因此在包含这些突变的状态下继续实验。经纯化的gfpuv5tag的荧光强度为gfpuv4tag的约1.9倍。之后，通过使用pgfpgcn5的反向pcr将48位或70位的任一半胱氨酸残基(下文中称为“半胱氨酸48”或“半胱氨酸70”)置换为随机氨基酸。

将作为寡核苷酸的5’cttaaatttattnnkactggaaaac(序列号22)和5’ggtaagttttccgtatgttg(序列号23)用于半胱氨酸48的突变，将5’gtgttcaannkttttcccgttatccg(序列号24)和5’catacgtcagagtagtgacaag(序列号25)用于半胱氨酸70的突变。用所得到的质粒对大肠杆菌bl21(de3)的培养物进行转化，在日光激发下对强荧光进行筛选，在琼脂培养基上选择。在48位的情况下，得到了几个发出强荧光的突变体(ala、asp、glu、gly、ile、leu、asn、pro、ser、thr、val和tyr置换)。但是，在置换了70位的氨基酸的突变体的情况下，仅c70v半胱氨酸突变体提供了适当的荧光。

为了制作具有强荧光强度的双半胱氨酸突变gfpuv5，将具有单突变的质粒用ncoi和ecori消化，再次连接到各区域中。利用单突变体进行选择。uv5c0tag(c48s/c70v)在全部重组体中显示出最高的荧光强度。

接着，分别通过反向pcr将半胱氨酸引入到6位和229位。该引入中，将具有c48s突变的质粒和下述引物组用于各自的突变。

glu置换用：5’tgtcttttcactggagttgtccc(序列号26)和5’ttctcctttactcattttttc(序列号27)

ile置换用：5’tgcacacatggcatggatgagctc(序列号28)和5’cccagcagcagttacaaactc(序列号29)

包含胰蛋白酶靶向序列(gln-gly-arg)的3个蛋白酶标签具有各种间隔子序列(无间隔子、thr间隔子或gly-thr间隔子)，在his-231与asp-234之间进行了必要的半胱氨酸的置换。该构建体使用puvc48stag、所得到的质粒(模板)和下述表4所示的引物获得。

[表4]

(1-3-2)gfpuv5tag突变体的纯化

用全部质粒转化大肠杆菌bl21(de3)。将培养过夜后处于静止期的大肠杆菌(12ml)接种于添加有氨苄青霉素(50μg/ml)和iptg(0.5mm)的lb培养基(38ml)中，在37℃温育8小时。以2,500xg离心20分钟，收集细胞，重悬浮于10ml的pbs中。将细胞团在包含50mmtris和8m尿素的10ml溶解缓冲液(ph8.0)中于室温下溶解15分钟，进行涡旋混合。以1,200xg离心15分钟，将上清与悬浮在pbs中的ni2+nta树脂(qiagenco.ltd.制造)混合。用pbs和20mm咪唑依次清洗该树脂后，用250mm的咪唑溶液洗脱所结合的gfpuv5tag突变体。

为了更换缓冲液，将洗脱物施加到用10倍稀释的pbs平衡的pd-10凝胶电泳过滤柱(amershambioscienceco.ltd.制造)上。收集洗脱的gfpuv5tag突变体蛋白，利用考马斯蛋白检测试剂(pierce公司制造)对它们的浓度进行定量。通过15％sds-page对纯化的gfpuv5tag突变体进行分析。

将反向pcr用模板质粒的碱基序列示于序列号26。

(1-4)pcr的条件

制备下述表5所示的反应液，在下述表6的条件下进行反向pcr。

[表5]

[表6]

(1-5)通过电泳进行的确认

取一部分上述pcr反应液，利用0.8％page在电压100v下进行加压时间30分钟的凝胶电泳，对各样品中所扩增的肽进行确认。将电泳结果示于图9。

(2)非依赖性a序列的去除和pcr产物的纯化

制备下述表7的反应液，在120℃反应30分钟，去除通过上述pcr产生的非依赖性a序列。之后，使用qiaquick(注册商标)pcr纯化试剂盒(qiagen公司制造)，按照试剂盒附带的说明书对上述pcr产物进行纯化。

[表7]

(3)连接反应

接着，制备下述表8所示的反应液，在16℃反应3小时以上，制作后述的大肠杆菌dh5α的转化用环状质粒。根据突变体，分别使用25℃、37℃等。

[表8]

(4)大肠杆菌dh5α的转化

将10μl大肠杆菌dh5α的感受态细胞(biodynamicslaboratory公司制造)在即将使用前在冰上解冻，制备感受态细胞溶液。将1μl连接反应液加入到该感受态细胞溶液中，在冰上放置30分钟。之后，在42℃温育30秒后，在冰上冷却2分钟。向其中加入soc(东洋纺株式会社制造)培养基90μl，在37℃在振荡器上反应1小时。之后，接种到含氨苄青霉素的lb选择培养基(东洋纺株式会社制造)上，在37℃静置一晩。

(5)菌落pcr

由通过上述转化得到的菌落进行菌落pcr，确认了假定的插入物。

(5-1)pcr用反应液溶液的制备

制备下述表9的菌落pcr用反应液。

[表9]

将上述菌落pcr用反应液装入到pcr用管中，采集在上述含氨苄青霉素的lb培养基中增殖的大肠杆菌，将其加入。pcr按照下述表10所示的程序进行。

[表10]

(5-2)电泳

对于上述pcr反应液，利用1.2％琼脂糖凝胶在施加电压100v下进行时间30分钟的电泳，将可确认到扩增的菌落移植到装有lb液体培养基(东洋纺株式会社制造)的培养瓶中，在37℃下温育。

(6)质粒的纯化

对于在上述lb液体培养基中培养的大肠杆菌中的上述质粒，利用wizardplussvminipreps.dna纯化系统(promega公司制造)，按照产品附带的说明书进行纯化。之后，委托eurofingenomics株式会社对纯化后的质粒的序列进行分析。

(7)大肠杆菌bl21(de3)的转化

将大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(biodynamicslaboratory公司制造)10μl在即将使用前在冰上解冻，制备感受态细胞溶液。向该感受态细胞溶液中加入通过上述测序可确认到含有目标序列的质粒液1μl，在冰上放置30分钟。

之后，在42℃温育30秒后，在冰上冷却2分钟。向其中加入soc(东洋纺株式会社制造)培养基90μl，在37℃下在振荡器上反应1小时。之后，接种到含氨苄青霉素的lb选择培养基中，在37℃静置一晩。第二天，采集被转化而发出绿色荧光的菌落，加入到装有含氨苄青霉素的lb液体培养基1ml的培养瓶中，在37℃静置一晩，进行预培养。

(8)结合有靶向肽序列的荧光蛋白的纯化

(8-1)菌落的培养

向50ml管中加入含氨苄青霉素的lb液体培养基4ml，向其中加入上述预培养液290μl，以此作为试样，准备4个这样的试样，在28℃下在振荡器上培养4小时。之后，加入100mm的iptg(异丙基-β-硫代半乳糖苷)43μl，在28℃下在振荡器上培养一晩。

(8-2)蛋白质的回收

第二天，将上述4根管的培养液汇集到1根管中。分别用1ml的pbs(-)缓冲液(和光纯药工业株式会社制造)清洗转移内容物后的3根管，将该清洗液也加入到汇集管中。将如上汇集有培养物的管在室温下以5,000rpm(离心机名：kubota3740、转子号kubotaaf2018、久保田商事株式会社制造)离心5分钟。

之后，(i)弃去上清，向沉淀的团块中加入pbs(-)缓冲液3ml，(ii)充分搅拌后，以5,000rpm离心5分钟。重复2次上述(i)和(ii)。向沉淀的团块中加入b-per裂解缓冲液(reagent公司制造)4ml，盖上盖子在室温下用振荡器搅拌一晩。

(8-3)利用his标签进行的纯化

取ni-nta琼脂糖(qlagen公司制造)2ml到15ml管中，(i)以1,000rpm离心1分钟，(ii)弃去上清，加入1ml1×pbs缓冲液并充分搅拌。重复3次上述(i)和(ii)，制备ni-nta树脂。

将装有上述b-per裂解缓冲液的管以12,000rpm在室温下离心10分钟后，将上清转移到15ml的falcon管中。向其中加入充分搅拌的上述ni-nta树脂400μl，并用旋转振荡器在室温下搅拌10分钟。之后，以1,000rpm在室温下离心1分钟，弃去上清。向其中(iii)加入1×pbs缓冲液4ml并充分搅拌，(iv)以1,000rpm在室温下离心1分钟，弃去上清。重复2次(iii)和(iv)。

之后，(v)加入20mm的咪唑(和光纯药工业株式会社制造)4ml并充分搅拌，(vi)以1,000rpm在室温下离心1分钟，弃去上清。重复2次(v)和(vi)。向其中加入250mm的咪唑500μl，用旋转振荡器在室温下搅拌10分钟。之后以1,000rpm离心1分钟，将发出绿色荧光的上清装入新的15ml的falcon管中，作为接下来的凝胶过滤用蛋白质纯化溶液。

(8-4)通过凝胶过滤进行的纯化

将上述蛋白质纯化溶液中的咪唑与pbs缓冲液进行置换，纯化得到作为目标的结合有靶向肽序列的荧光蛋白。在以上操作中使用geheathcarejapan株式会社的nap5柱，按照产品附带的说明书进行纯化。

(9)结合有靶向肽序列的荧光蛋白的选择

根据常规方法测量通过上述纯化操作得到的结合有靶向肽序列的荧光蛋白浓度的吸光度(280nm)以及发色团浓度(形成能力)的吸光度(488nm)，选择a488/a280的值超过1.5的荧光蛋白作为目标的结合有靶向肽序列的荧光蛋白。将结果示于表11。

[表11]

(实施例3)结合有靶向肽序列的胶束(荧光蛋白缔合驱动型胶束)的制作

使用实施例2中制备的结合有靶向肽序列的gfp来代替未修饰gfp，利用与实施例1相同的方法制备结合有靶向肽序列的聚集性分子。接着，利用与实施例1相同的方法制作胶束(荧光蛋白缔合驱动型胶束)，调查胶束组分溶液中存在的缔合物的量。

(1)发光特性

与实施例1同样地对于如上反应后的胶束组分中的聚集体的量如何根据靶向肽而有所不同进行测定(参见图6(a)～(c))。图6(a)～(c)中，缔合物用虚线表示，另外，gfp-tps用实线表示。纵轴表示观察到荧光的粒子数/50,000个、横轴表示检测波长(nm)。结合有靶向肽序列的胶束的情况下，也与实施例1同样地在510nm附近观察到发光的峰。

(2)缔合物的存在的确认

接着，针对使用下述4种类型的情况，确认胶束组分中存在的本发明的胞吞作用增强剂(缔合物)的量，该4种类型为：无靶向肽序列(mcf7-0：非靶向型)、有靶向肽(mcf7-1(靶向型1型)和mcf7-2(靶向型2型))、以及靶向肽+αstrand(mcf7-1+α(靶向型1型增强型))。

(3)与靶向肽结合的gfp行为的确认

(3-1)使用上述4种类型的聚集性分子的情况下的组分的分类

将如上制造的gfp分别与tps以摩尔比10：1混合，在37℃静置一夜，得到带有靶向肽的gfp(靶向肽为mcf7-0、mcf7-1、mcf7-2、mcf7-1+α这4种)的缔合物和gfp-tps。

之后，根据激发波长370nm-测定波长510nm的荧光强度与激发波长488nm-测定波长510nm的荧光强度之比(i0)，将缔合物的含量(以下有时称为“残余gfp量”)分类成a(i0≤1.0(gfp残余量少))、b(1<i0≤2.0(gfp残余量中等程度)和(ci0≤2.0(gfp残余量多)这3个等级(参见图6(a)～(c))。

这样的分类基于下述理由进行。首先，如上所述使碳硅烷树状高分子与gfp如图6所示反应一夜时，可得到提呈了蛋白质的聚集性分子，但可知在上述聚集性分子中以部件形式引入的蛋白质(gfp)的量存在差异。这是因为，由上述式(ii)可知，噻咯与gfp的可结合部位存在6处。

此处，由于在激发波长370nm下激发的荧光波形为胶束的fret效率，因此该波形内的480nm(噻咯骨架聚集诱导发光体的荧光)与510nm(gfp的荧光)的强度比升高表示gfp侧的荧光强度上升、fret效率良好。

另外，激发波长488nm的荧光测量的是与胶束内的gfp无关地存在的gfp的总量。这是由于，该荧光量呈现出与如上所述的fret效率无关的行为；设想其为残余的gfp；并且实际上在对胶束的成分进行电泳时能够确认到缔合的gfp的存在。其结果表明，根据所使用的靶向肽的不同，属于上述3个等级的缔合物的量存在差异。

[表12]

*1：在488nm下激发的情况下的发光强度与在370nm下激发的情况下的发光强度之比

*2：a≤1.0、1.0<b<3、3.0≤c

如上述表12所示，具有mcf7-2和mcf7-1+α这两种靶向序列时的缔合物的生成率显著高于具有其他序列时的缔合物的生成率。

(3-2)由靶向肽所致的gfp缔合物形成的差异-1

对于如上得到的包含聚集性分子的各溶液不进行任何处理，将蛋白质浓度为5μm的溶液10μl供于凝胶电泳，确认所含有的缔合物。将结果示于图9(a)～(b)。(a)为荧光检测结果、(b)为cbb染色结果。

根据上述确认到，作为缔合物，存在有二聚体、四聚体和八聚体。

(实施例4)dds脂质体或胶束的细胞摄入实验-2(缔合物共存时)

(1)由靶向肽所致的包含聚集性分子的胶束溶液的差异-1

将上述实施例3中得到的无靶向序列的gfp缔合物分为缔合物的含量多者(胶束c)、含量中等程度者(胶束b)、含量少者(胶束a)而制成样品溶液，进行凝胶电泳，对于所形成的缔合物是几聚体进行研究。在12％分离胶-4％浓缩胶中添加sds(终浓度0.1％)，关于各样品的荧光测定的条件，将分光光度计的灵敏度设为3x3、使荧光强度的max对应于500，设胶束c为1时，对于胶束a施加其2倍量、对于gfp分别施加5倍量，在20ma、2小时的条件下进行凝胶电泳。该实验中，胶束和gfp全部施加原液。

将结果示于图10(a)～(d)。此处，(a)和(b)为fitc染色结果(激光475和pmt500)。另外，(c)和(d)为cbb染色后进行脱色的结果(激光635(cy5)和pmt500)。

如图10(a)和(b)所示，在使用了聚集性分子的缔合物的含量高的试样的情况下，除了单体和二聚体以外，还确认到四聚体、八聚体的含量多。此时，在mcf7-0中仅得到上述缔合物的浓度低的胶束，因而胶束c无法供于凝胶电泳。另外，mcf7-0的胶束a中，观察到与对仅gfp者进行电泳的情况下同等程度的四聚体和八聚体。图10(c)和(d)中确认到单体和二聚体的存在，但未能确认到四聚体和八聚体。

(2)由靶向肽所致的包含聚集性分子的胶束溶液的差异-2

接着，在与上述实施例2相同的凝胶电泳条件下，将利用amikon100k浓缩并发生了缔合的gfp与mcf7-1和mcf7-进行比较。关于各样品的荧光测定的条件，将分光光度计的灵敏度设定为3x3。mcf7-1的胶束c·蛋白质(300μm)施加5μl或20μl。mcf7-2的胶束c·蛋白质(300μm)也以相同量施加。荧光检测和染色也按照上述(1)进行。

将结果示于图11(a)～(d)。图11(a)和(b)为荧光检测的结果(fitc(激光635)和pmt400)。另外，(c)和(d)为cbb染色结果(fitc(激光635(cy5))和pmt600)。结果与上述(1)相同。

(3)蛋白质的混合物的摄入量与缔合蛋白质的量的相关关系

将上述无靶向肽和有靶向肽的胶束分别以50μl的量添加到mcf-7细胞的培养孔中，对于各胶束向细胞内的摄入量与相同组分中存在的缔合物的量的关系进行研究。

对于1x10⁹个/孔的细胞，以50μl的量添加上述的包含胶束和聚集性分子的缔合物的试样，在37℃温育9小时后，利用facs检测荧光。

将横轴设定为表示残余蛋白质的分级的荧光蛋白的发光强度比(胶束和综合)、将纵轴设定为facs数据的50,000个细胞中具有明显荧光强度的细胞数的比例(％)，对facs数据进行汇总。将结果示于图12～15。

图12和13中，黑色圆表示向胶束a(缔合物的量少者)中加入gfp的情况下的摄入量、黑色四边形表示向胶束b(缔合物的含量为中等程度者)中加入gfp的情况下的摄入量、黑色三角形表示向胶束c(缔合物的含量多者)中加入gfp的情况下的摄入量、白色空心四边形表示向胶束中加入gfp的情况下的摄入量。确认到，聚集性分子的缔合物的含量越多则胶束向细胞内的摄入量越增加，即它们之间存在相关性。

图14和15中示出与gfp结合的靶向肽的有无以及由靶向肽所致的差异。由该结果确认到，结合有靶向肽时摄入量更多。基于荧光寿命进行本领域技术人员荧光蛋白处理所得到的结果也支持该倾向。

根据以上结果表明，本发明的胞吞作用增强剂显著增强由提呈gfp的碳硅烷树状高分子形成的胶束(或囊泡)向细胞内的摄入。

(实施例5)胶束制作用缓冲液的研究

截止目前的mcf-7胶束的制备仅在1×pbs这一种缓冲液中进行。由于在实施药物的包封实验时需要考虑所包封的各种药剂的溶解性、稳定性，因而对于可否使用1×pbs以外的缓冲液进行mcf-7胶束的制备进行了研究。

(1)所使用的缓冲液的研究

制备在分子生物学领域中与pbs相近的在ph7附近最广泛应用的tris-hcl缓冲液、作为good缓冲液(是指在1966年由normangood等人提出的12种缓冲剂)之一的hepes缓冲液、作为有机酸缓冲液的柠檬酸缓冲液以及作为无机酸缓冲液的碳酸缓冲液这4种缓冲液，在各缓冲液中形成胶束并进行分离，得到胶束内侧为上述4种中的任一种缓冲液、胶束外侧为pbs的胶束组分，测定荧光和粒度，确认了短期稳定性(胶束制作后1～2天的稳定性)。

(2)在50mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)中的胶束形成

(2-1)现有的胶束制作法

截至目前，在1xpbs中制作胶束，该1xpbs由与生物体内相同的离子种类构成且为等渗，因而被认为更接近生物体条件。

但是，由于胶束内部被形成该胶束的缓冲液所充满，因此决定对在与药剂的亲和性好的缓冲液中的胶束制作进行研究。作为通常使用的缓冲液，可以举出tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、chaps缓冲液等，首先对50mmtris-hcl(ph8.0)(以下有时仅称为“tris缓冲液”)中的胶束形成进行了研究。

(2-2)胶束制作法的变更

使所使用的缓冲液全部为50mm的tris-hcl(ph8.0)，利用该缓冲液将nick柱预先清洗5次，将nick柱用上述tris缓冲液平衡。

(2-3)胶束的制作

使用amicon10k过滤器，以14,000×g离心15分钟，对219.2μl的mcf-7胶束用荧光蛋白进行浓缩。用tris缓冲液定容至99μl，加入100mm的dtt1μl，静置10分钟，制成试样混合液。

将上述试样混合液施加到如上所述用tris缓冲液平衡后的nick柱上，添加365μl的tris缓冲液，之后用380μl的tris缓冲液洗脱。之后向洗脱的溶液中添加10.28μl的tps，进行10分钟涡旋混合，在37℃静置一夜，得到胶束反应液。该反应液中包含所形成的胶束(以下称为“mcf-7胶束”)和mcf-7胶束用荧光蛋白的缔合物。

关于所使用的tris缓冲液，制备1m的tris-hcl(ph8.0)作为储备溶液，将其用milliq(merkmillipore)稀释20倍进行使用。

(2-4)胶束的分离

将如上得到的胶束反应液施加到amicon100k过滤器上，以14,000×g离心10分钟，分离成过滤器上液和过滤器下液。

在装有上液的过滤器中加入100μl的1×pbs，以14,000×g离心10分钟，将该清洗操作重复3次，将tris缓冲液更换为1×pbs。将更换了缓冲液的上液(胶束组分液)利用台式离心机进行离心而回收。接着，在空过滤器中加入适量的1xpbs并放置10分钟，将过滤器上下颠倒，进一步进行回收。将回收液用1×pbs定容为160μl。取该溶液5μl，加入1×pbs95μl，进行20倍稀释(2.5μm)，测定粒度；取该溶液8μl，加入1×pbs392μl，进行50倍稀释(1μm)，测定荧光。

取下液(胶束未反应组分)5μl，进行20倍稀释而成为100μl，测定粒度(参见图16(a))。另外，取下液16μl并稀释至400μl，测定荧光(参见图20)。

粒度测定中使用zetasizer(malvern制、样品池(cell)：zen0040)。另外，荧光测定中使用荧光光度计rf-5300pc(株式会社岛津制作所制)，使激发波长为370nm，在488nm下进行测定。

(3)在50mmhepes缓冲液(ph7.6)中的胶束形成

制作50μm×160μl胶束组分液。经过浓度为20μm、终浓度为50μm。除了将50mm的hepes缓冲液(ph7.6)用作胶束制作用途这一点以外，与使用tris缓冲液的情况下同样地制作胶束。胶束分离时，使用amicon100k过滤器，与tris缓冲液的情况下同样地对1×pbs进行缓冲液更换，得到胶束组分液。

取胶束组分液和胶束未反应组分液各5μl，加入1×pbs95μl进行20倍稀释(2.5μm)，测定粒度(参见图17)。

向8μl的胶束组分液中添加392μl的1×pbs进行50倍稀释(1μm)，测定荧光。向16μl的未反应组分液中添加384μl的1×pbs进行25倍稀释，测定荧光(参见图21(a))。

(4)在50mm柠檬酸缓冲液(ph7.6)中的胶束形成

使用柠檬酸钠制备50mm的柠檬酸缓冲液(ph7.6)。制作50μm×160μl胶束组分液。经过浓度为20μm、终浓度为50μm。除了将胶束制作用缓冲液替换为50mm柠檬酸缓冲液这一点以外，与使用tris缓冲液的情况下同样地形成胶束，并进行分离。在5μl的胶束组分液中加入95μl的1×pbs而制成试样(2.5μm)，另外在5μl的胶束未反应组分中加入95μl的1×pbs进行20倍稀释，分别测定粒度(参见图18)。

取胶束组分液和胶束未反应组分液各5μl，加入1×pbs95μl进行20倍稀释(2.5μm)，测定粒度(参见图18)。

向8μl的胶束组分液中添加392μl的1×pbs进行50倍稀释(1μm)，测定荧光。向16μl的未反应组分液中添加384μl的1×pbs进行25倍稀释，测定荧光(参见图22(a))。

(5)在50mm碳酸-重碳酸缓冲液(ph8.36)中的胶束形成

使用碳酸氢钠制备50mm的碳酸-重碳酸缓冲液(ph8.36)。制作50μm×160μl胶束组分液。经过浓度为20μm、终浓度为50μm。除了将缓冲液替换为50mm碳酸-重碳酸缓冲液(ph8.36)作为胶束制作用途这一点以外，与使用tris缓冲液的情况下同样地制作胶束。胶束分离时，使用amicon100k过滤器，与使用tris缓冲液的情况下同样地进行缓冲液更换，得到胶束组分液。

取胶束组分液和胶束未反应组分液各5μl，加入1×pbs95μl进行20倍稀释(2.5μm)，测定粒度(参见图19)。

在8μl的胶束组分液中添加392μl的1×pbs进行50倍稀释(1μm)，测定荧光。在16μl的未反应组分液中添加384μl的1×pbs进行25倍稀释，测定荧光(参见图23(a))。

(6)结果

如上所述，使用4种缓冲液制备了终浓度为50μm的mcf-7胶束。在各mcf-7胶束的粒度测定中，在任一情况下均与1×pbs同样地在100～200nm附近确认到粒度分布(图16～图19)。另外，在使激发波长为370nm、使用荧光波长488nm的荧光光度计的测定中，也在所有的缓冲液中观测到与1×pbs同样的荧光光谱(图20～23)。这表明，在使用tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、碳酸缓冲液以及柠檬酸缓冲液中的任一种的情况下，也能够与1×pbs同样地进行mcf-7胶束的制备。

另外，将使用各缓冲液制作的mcf-7胶束溶液在4℃保存，在胶束制作后1～4天后，在与上述同样的条件下进行荧光分析。在使用任一种缓冲液的情况下，荧光强度均大致持平地推移，确认到短期稳定性(图20(b)～图23(b))。

工业实用性

本发明在医药制剂领域、特别是药剂递送领域中是有用的。

序列表自由文本

序列号1：引入gfp中的靶向识别序列肽(mcf7-1)

序列号2：引入gfp中的靶向识别序列肽(mcf7-2)

序列号3：引入gfp中的靶向识别序列肽(mcf7-1+αstrand)

序列号4：引入了mcf7-1的gfp

序列号5：引入了mcf7-2的gfp

序列号6：引入了mcf7-1+αstrand的gfp

序列号7：gfp的氨基酸序列

序列号8：gfp的氨基酸序列

序列号9：bfp的氨基酸序列

序列号10：yfp的氨基酸序列

序列号11：来源于辐盘海葵的荧光蛋白的氨基酸序列

序列号12：mcf7-1的扩增用正向引物

序列号13：mcf7-1的扩增用反向引物

序列号14：mcf7-2扩增用正向引物

序列号15：mcf7-2扩增用反向引物

序列号16：mcf7-1+αstrand扩增用正向引物

序列号17：mcf7-1+αstrand扩增用反向引物

序列号18：反向pcr用正向引物

序列号19：反向pcr用反向引物

序列号20：反向pcr用正向引物

序列号21：反向pcr用反向引物

序列号22：寡核苷酸

序列号23：寡核苷酸

序列号24：寡核苷酸

序列号25：寡核苷酸

序列号26：反向pcr用正向引物

序列号27：反向pcr用反向引物

序列号28：反向pcr用正向引物

序列号29：反向pcr用反向引物

序列号30：反向pcr用正向引物

序列号31：反向pcr用反向引物

序列号32：反向pcr用正向引物

序列号33：反向pcr用反向引物

序列号34：反向pcr用正向引物

序列表

<110>国立大学法人埼玉大学(saitamauniversity)

石匠株式会社(quarrymen&co.inc.)

<120>药物递送系统用胞吞作用增强剂(endocitosisenhancerfordds)

<130>p17su011pct

<150>2016-234547

<151>2016-12-01

<160>34

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>10

<212>prt

<213>人类(homosapiens)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(10)

<223>mcf7-1

<400>1

aspmetproglythrvalleuproglygly

1510

<210>2

<211>10

<212>prt

<213>人类(homosapiens)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(10)

<223>mcf7-2

<400>2

valprothraspthrasptyrserglygly

1510

<210>3

<211>29

<212>prt

<213>人类(homosapiens)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(29)

<223>mcf7-1+αstand肽(mcf7-1+αstandpeptide)

<400>3

aspmetproglythrvalleuproglyglyglyglyglyserglugly

151015

glutrpglnglnglnglnhisglntrpalalysglnglu

2025

<210>4

<211>272

<212>prt

<213>维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(272)

<400>4

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargaspmetprogly

151015

thrvalleuproglyglymetserlysglyglugluleuphethrgly

202530

valvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhislys

354045

pheservalserglygluglygluglyaspalathrtyrglylysleu

505560

thrleulyspheileserthrthrglylysleuprovalprotrppro

65707580

thrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncyspheserargtyr

859095

proasphismetlysarghisaspphephelysseralametproglu

100105110

glytyrvalglngluargthrileserphelysaspaspglyasntyr

115120125

lysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasnarg

130135140

ilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleugly

145150155160

hislysleuglutyrasntyrasnserhisasnvaltyrilethrala

165170175

asplysglnargasnglyilelysalaasnphelysthrarghisasn

180185190

ilegluaspglyservalglnleualaasphistyrglnglnasnthr

195200205

proileglyaspglyprovalleuleuproaspasnhistyrleuser

210215220

thrglnseralaleuleulysaspproasnglulysargasphismet

225230235240

valleuleugluphevalthralaalaglyserglyilethraspglu

245250255

valaspglythrgluleutyrlysglyglyhishishishishishis

260265270

<210>5

<211>272

<212>prt

<213>维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(272)

<400>5

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargvalprothrasp

151015

thrasptyrserglyglymetserlysglyglugluleuphethrgly

202530

valvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasnglyhislys

354045

pheservalserglygluglygluglyaspalathrtyrglylysleu

505560

thrleulyspheileserthrthrglylysleuprovalprotrppro

65707580

thrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncyspheserargtyr

859095

proasphismetlysarghisaspphephelysseralametproglu

100105110

glytyrvalglngluargthrileserpheasnaspaspglyasntyr

115120125

lysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleuvalasnarg

130135140

ilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasnileleugly

145150155160

hislysleuglutyrasntyrasnserhisasnvaltyrilethrala

165170175

asplysglnargasnglyilelysalaasnphelysthrarghisasn

180185190

ilegluaspglyservalglnleualaasphistyrglnglnasnthr

195200205

proileglyaspglyprovalleuleuproaspasnhistyrleuser

210215220

thrglnseralaleuleulysaspproasnasplysargasphismet

225230235240

valleuleugluphevalthralaalaglyserglyilethraspglu

245250255

valaspglythrgluleutyrlysglyglyhishishishishishis

260265270

<210>6

<211>292

<212>prt

<213>维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(292)

<400>6

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargaspmetprogly

151015

thrvalleuproglyglyglyglyglysergluglyglutrpglngln

202530

glnglnhisglntrpalalysglnglumetserlysglyglugluleu

354045

phethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspglyaspvalasn

505560

glyhislyspheservalserglygluglygluglyaspalathrtyr

65707580

glylysleuthrleulyspheileserthrthrglylysleuproval

859095

protrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyvalglncysphe

100105110

serargtyrproasphismetlysarghisaspphephelysserala

115120125

metprogluglytyrvalglngluargthrileserphelysaspasp

130135140

glyasntyrlysthrargalagluvallysphegluglyaspthrleu

145150155160

valasnargilegluleulysglyileaspphelysgluaspglyasn

165170175

ileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhisasnvaltyr

180185190

ilethralaasplysglnargasnglyilelysalaasnphelysthr

195200205

arghisasnilegluaspglyservalglnleualaasphistyrgln

210215220

glnasnthrproileglyaspglyprovalleuleuproaspasnhis

225230235240

tyrleuserthrglnseralaleuleulysaspproasnglulysarg

245250255

asphismetvalleuleugluphevalthralaalaglyserglyile

260265270

thraspgluvalaspglythrcysgluleutyrlysglyglyhishis

275280285

hishishishis

290

<210>7

<211>263

<212>prt

<213>维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(263)

<223>gfp

<400>7

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargmetserlysgly

151015

glugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspgly

202530

aspvalasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyasp

354045

alathrtyrglylysleuthrleulyspheileserthrthrglylys

505560

leuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyval

65707580

glncyspheserargtyrproasphismetlysarghisaspphephe

859095

lysseralametprogluglytyrvalglngluargthrileserphe

100105110

lysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglugly

115120125

aspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysglu

130135140

aspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhis

145150155160

asnvaltyrilethralaasplysglnlysasnglyilelysalaasn

165170175

phelysthrarghisasnilegluaspglyservalglnleualaasp

180185190

histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro

195200205

aspasnhistyrleuserthrglnseralaleuleulysaspproasn

210215220

glulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalagly

225230235240

serglyilethraspgluvalaspglythrcysgluleutyrlysgly

245250255

glyhishishishishishis

260

<210>8

<211>258

<212>prt

<213>维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(258)

<223>gfp

<400>8

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargmetserlysgly

151015

glugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuaspgly

202530

aspvalasnglyhislyspheservalserglygluglygluglyasp

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alathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrglylys

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leuprovalprotrpprothrleuvalthrthrleuthrtyrglyval

65707580

glncyspheserargtyrproasphismetlysarghisaspphephe

859095

lysseralametprogluglytyrvalglngluargthrileserphe

100105110

lysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglugly

115120125

aspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelysglu

130135140

aspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnserhis

145150155160

asnvaltyrilethralaasplysglnlysasnglyilelysalaasn

165170175

phelysthrarghisasnilegluaspglyservalglnleualaasp

180185190

histyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleupro

195200205

aspasnhistyrleuserthrglnseralaleuleulysaspproasn

210215220

glulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaalagly

225230235240

ilethrhisglymetaspgluleutyrlysglyglyhishishishis

245250255

hishis

<210>9

<211>259

<212>prt

<213>维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(259)

<223>gfp

<400>9

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargmetvalserlys

151015

glyglugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuasp

202530

glyaspvalasnglyhislyspheservalserglygluglyglugly

354045

aspalathrtyrglylysleuthrleulyspheilecysthrthrgly

505560

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65707580

valglncyspheserargtyrproasphismetlysglnhisaspphe

859095

phelysseralametprogluglytyrvalglngluargthrilephe

100105110

phelysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglu

115120125

glyaspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelys

130135140

gluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasnpheasnser

145150155160

hisasnvaltyrilemetalaasplysglnlysasnglyilelysval

165170175

asnphelysilearghisasnilegluaspglyservalglnleuala

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asphistyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleu

195200205

proaspasnhistyrleuserthrglnseralaleuserlysasppro

210215220

asnglulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaala

225230235240

glyilethrleuglymetaspgluleutyrlysglyglyhishishis

245250255

hishishis

<210>10

<211>259

<212>prt

<213>维多利亚多管发光水母(aequoreavictoria)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(259)

<400>10

metalasermetthrglyglyglnglnmetglyargmetvalserlys

151015

glyglugluleuphethrglyvalvalproileleuvalgluleuasp

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354045

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100105110

phelysaspaspglyasntyrlysthrargalagluvallyspheglu

115120125

glyaspthrleuvalasnargilegluleulysglyileaspphelys

130135140

gluaspglyasnileleuglyhislysleuglutyrasntyrasnser

145150155160

hisasnvaltyrilemetalaasplysglnlysasnglyilelysval

165170175

asnphelysilearghisasnilegluaspglyservalglnleuala

180185190

asphistyrglnglnasnthrproileglyaspglyprovalleuleu

195200205

proaspasnhistyrleusertyrglnseralaleuserlysasppro

210215220

asnglulysargasphismetvalleuleugluphevalthralaala

225230235240

glyilethrleuglymetaspgluleutyrlysglyglyhishishis

245250255

hishishis

<210>11

<211>236

<212>prt

<213>等指海葵(actiniaequina)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(236)

<220>

<221>肽(peptide)

<222>(1)..(236)

<223>gfp

<400>11

metalasersergluaspvalilelysgluphemetargphelysval

151015

argmetgluglyservalasnglyhisgluphegluilegluglyglu

202530

glygluglyargprotyrgluglythrglnthralalysleulysval

354045

thrlysglyglyproleuprophealatrpaspileleuserprogln

505560

pheglntyrglyserlysvaltyrvallyshisproalaaspilepro

65707580

asptyrlyslysleuserpheprogluglyphelystrpgluargval

859095

metasnphegluaspglyglyvalvalthrvalthrglnaspserser

100105110

leuglnaspglycyspheiletyrlysvallyspheileglyvalasn

115120125

pheproseraspglyprovalmetglnlyslysthrmetglytrpglu

130135140

proserthrgluargleutyrproargaspglyvalleulysglyglu

145150155160

ilehislysalaleulysleulysaspglyglyhistyrleuvalglu

165170175

phelysseriletyrmetalalyslysprovalglnleuproglytyr

180185190

tyrtyrvalaspserlysleuaspilethrserhisasngluasptyr

195200205

thrilevalgluglntyrgluargthrgluglyarghishisleuphe

210215220

leuglythrcysglyglyhishishishishishis

225230235

<210>12

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

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<222>(1)..(45)

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<211>27

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<222>(1)..(27)

<223>引物(primer)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

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<222>(1)..(45)

<223>用于mcf7-1的引物(primerformcf7-1)

<400>14

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<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(27)

<223>用于mcf7-1的引物(primerformcf7-1)

<400>15

aggaacgcgacccatttgctgtccacc27

<210>16

<211>51

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(51)

<223>用于mcf7-2的引物(primerformcf7-2)

<400>16

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(42)

<223>用于mcf7-2的引物(primerformcf7-2)

<400>17

ccattcaccttcactaccaccaccaccaccaggaagaacagt42

<210>18

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(22)

<223>用于mcf7-1+αstand肽的引物(primerformcf7-1+αstandpeptide)

<400>18

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(22)

<223>用于mcf7-1+αstand肽的引物(primerformcf7-1+αstandpeptide)

<400>19

ttgtggcgagttttgaagttag22

<210>20

<211>70

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(70)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>20

ctcgaccatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcatgagtaaaggagaa60

gaacttttca70

<210>21

<211>54

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(54)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>21

tgacgtgaattcattagtgatggtgatggtgatgtttgtagagctcatccatgc54

<210>22

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(25)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(14)

<223>nisa,c,g,ort

<400>22

cttaaatttattnnkactggaaaac25

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(20)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>23

ggtaagttttccgtatgttg20

<210>24

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>寡核苷酸(oligonucleotide)

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(26)

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(10)

<223>nisa,c,g,ort

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gtgttcaannkttttcccgttatccg26

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>寡核苷酸(oligonucleotide)

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(22)

<400>25

catacgtcagagtagtgacaag22

<210>26

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>寡核苷酸(oligonucleotide)

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(23)

<400>26

tgtcttttcactggagttgtccc23

<210>27

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>寡核苷酸(oligonucleotide)

<220>

<221>misc_binding

<222>(1)..(21)

<400>27

ttctcctttactcattttttc21

<210>28

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(24)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>28

tgcacacatggcatggatgagctc24

<210>29

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(21)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>29

cccagcagcagttacaaactc21

<210>30

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(33)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>30

cagcgccgttgtgagctctacaaataatgaatt33

<210>31

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(21)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>31

tgtaatcccagcagcagttac21

<210>32

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(21)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>32

acatgtgagctctacaaataa21

<210>33

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(18)

<400>33

acggccctgtgtaatccc18

<210>34

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>引物(primer)

<220>

<221>prim_transcript

<222>(1)..(21)

<223>用于反式pcr的引物(primerforinversepcr)

<400>34

ggaacatgtgagctctacaaa21