用于处理牙科生物膜的牙粉组合物的制作方法

本发明涉及对有助于抑制生物膜形成或有助于破坏生物膜具有改善的功效的牙粉组合物。

背景技术：

牙斑(也称为牙科生物膜)是在牙齿表面上不断形成的粘性、无色的细菌沉积物。牙斑通常由细菌和细胞外聚合物物质(所谓的“eps”)构成。eps是来自微生物的生物聚合物，其中嵌入有生物膜微生物。j.bacteriol.2007,189(22):7945。唾液、食物和流体组合产生这些沉积物，所述沉积物在牙齿和牙龈相遇的位置处聚集。牙斑积聚是口腔健康不良的主要因素，这可导致龋齿和牙周(牙龈)疾病，包括齿龈炎。牙粉组合物有助于预防和控制牙斑的一种方式是通过利用抗菌剂；然而，缺点和制剂挑战是抗菌剂与制剂成分和包含碳酸钙基质的环境的非预期反应性。这可包括氧-氢氧化物物质的氧化降解、水解、吸附或沉淀，其中任一种均可影响抗菌剂的生物利用率。持续需要提供此类制剂，所述制剂有助于预防牙齿上的牙斑形成和/或最小化抗微生物剂的使用，特别是在高水和高碳酸盐牙粉制剂基础结构中。

有助于抑制生物膜形成或有助于破坏生物膜的一种解决方案是使用小苏打(即，碳酸氢钠)。小苏打对生物膜作用机制可能是至少两倍。小苏打可置换钙离子，以便有助于破坏或减少生物膜。钙离子充当牙科生物膜的eps组分的“胶”或“支架”。小苏打也可用作磨料。牙粉中小苏打的一些含量以超过30重量％，并且有时高于50重量％报告。然而，一些使用者报告了令人不悦的味觉体验(可归因于相对较高的小苏打含量)。此外，牙斑在开发市场时尤其成问题。因此，牙粉溶液是最高性价比的(例如，包含相对较高含量的水)。因此，需要包含小苏打的牙粉组合物，其使碳酸氢盐相关的治疗有益效果最大化同时使碳酸氢盐的含量最小化(例如，<26重量％)，以便有助于组合物的风味特征。还需要一种组合物，所述组合物对于开发可以说对此类组合物的需要最大的市场而言是高性价比的。

技术实现要素：

本发明基于令人惊讶的发现，即本发明的口腔护理组合物包含相对较低含量的小苏打，可是还在抑制牙科生物膜形成或有助于破坏牙科生物膜方面优于一些商业化的含小苏打的牙膏。

本发明的优点是结合钙离子以用于抗牙斑有益效果，同时使牙齿表面中的任何脱矿质最小化。

本发明的优点是与至少一些商业化的含小苏打的牙膏，尤其是包含相对较高含量的小苏打的那些相比，本发明的改善的风味体验。

本发明的优点是减少有助于形成牙科生物膜的细菌的生长或存在。

本发明的优点是由于相对较高含量的水和最小化其他成分(诸如湿润剂)的制剂的相对较高性价比。

本发明的优点是相稳定制剂。

本发明的一个方面提供了一种牙粉组合物，所述牙粉组合物包含按所述组合物的重量计，30％至55％的水；按所述组合物的重量计，25％至50％的含钙磨料；按所述组合物的重量计，1％至25％的碳酸氢盐；按所述组合物的重量计，0.0025％至2％的氟化物离子源；按所述组合物的重量计，0％至2％的湿润剂，其中所述湿润剂选自山梨醇、甘油、或/和它们的组合；并且其中所述组合物具有大于7.8的ph。

本发明的另一个方面提供一种处理牙科生物膜的方法，所述方法包括用本发明的组合物刷牙的步骤。

本发明的另一个方面提供一种预防或减轻牙釉上牙斑形成的方法，所述方法包括用本发明的牙粉组合物刷牙的步骤。

对于本领域技术人员来说，通过下面的具体实施方式，本发明的这些和其它的特征、方面和优点将变得显而易见。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“包括”是指可加入除具体提及的那些之外的步骤和成分。该术语包括“由...组成”和“基本上由...组成”。本发明的组合物可包含、由、并基本上由本文所述的本发明基本成分和限制条件、以及本文所述的任何附加的或任选的成分、组分、步骤或限制条件组成。

如本文所用，除非另外指明，术语“牙粉”是指用于清洁口腔表面的糊剂、凝胶、粉末、片剂、或液体制剂。优选地，本发明的牙粉组合物为单相组合物。牙粉的一个示例为牙膏(用于刷牙)。如本文所用，术语“牙齿”是指自然牙齿以及人造牙齿或假牙。

除非另外说明，否则所有百分比、份数和比率均基于本发明组合物的总重量计。除非另外指明，否则所有此类涉及所列成分的重量均基于活性物质水平计，并且因此不包括可包含于可商购获得的材料中的溶剂或副产物。本文中，术语“重量百分比”可表示为“重量％”。如本文所用，除非另外指明，所有分子量为重均分子量，其以克/摩尔表示。

如本文所用，当用于权利要求中时，包括“一个”和“一种”的冠词应被理解为是指一种或多种受权利要求书保护或所描述的物质。

如本文所用，单词“优选的”、“优选地”和它们的变体是指在特定环境下能够提供特定有益效果的本发明的实施方案。然而，其它的实施方案在相同或其它环境下也可为优选的。此外，一个或多个优选的实施方案的表述并不表示其它实施方案是不可用的，并且不旨在从本发明的范围中排除其它实施方案。

水

本文中，本发明的牙粉组合物包含按所述组合物的重量计30％至55％的水。例如，牙粉组合物可包含按所述组合物的重量计34％、38％、40％、42％、44％、46％、48％或50％的水。优选地，牙粉组合物包含按所述组合物的重量计，30％至55％，更优选地34％至55％，还更优选地35％至55％，但仍更优选地40％至55％的水。水可被加入制剂中和/或可由包含其他成分而进入组合物中。优选地，水为usp水。

含钙磨料

本发明的组合物包含按所述组合物的重量计25％至50％的含钙磨料，其中优选地所述含钙磨料选自碳酸钙、甘油磷酸钙、磷酸二钙、磷酸三钙、正磷酸钙、偏磷酸钙、聚磷酸钙、钙氧磷灰石、碳酸钠、以及它们的组合；其中，更优选地，所述含钙磨料为碳酸钙。优选地，所述组合物包含按所述组合物的重量计27％至47％，更优选地27％至37％，甚至更优选地28％至34％，或者它们的组合的含钙磨料。

优选地，含钙磨料为碳酸钙。更优选地，含钙磨料选自经精细研磨的天然白垩、经研磨的碳酸钙、沉淀的碳酸钙、以及它们的组合。含钙磨料的重量百分比的非限制性示例包括：按所述组合物的重量计，27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％或37％，优选地其中所述含钙磨料为碳酸钙。

经精细研磨的天然白垩(fgnc)是可用于本发明的更优选的含钙磨料之一。其可获自石灰石或大理石。还可在研磨期间通过涂覆或在研磨之后通过热处理对fgnc进行化学或物理改性。典型的涂覆材料包括硬脂酸镁或油酸镁。还可通过使用不同的研磨技术，例如球磨、空气分级器研磨或螺旋喷射研磨，在研磨过程期间对fgnc的形态进行改变。天然白垩的一个示例描述于wo03/030850中，其具有1μm至15μm的中值粒度和0.5m²/g至3m²/g的bet表面积。天然碳酸钙可具有325目至800目，或者选自325目、400目、600目、800目、或它们的组合的粒度；另选地，粒度为0.1微米至30微米，或0.1微米至20微米，或5微米至20微米。在一个实施方案中，所述组合物包含按所述组合物的重量计，0％至5％，优选地0％至3％，更优选地0％至1％的硅酸盐；还更优选地，所述组合物基本上不含硅酸盐。

碳酸氢盐

本发明的组合物包含按所述组合物的重量计1％至30％的碳酸氢盐，其中优选地，所述碳酸氢盐选自碳酸氢钠或碳酸氢钙，更优选地碳酸氢钠。优选地，所述组合物包含按所述组合物的重量计，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％或13％；更优选地1％至25％，还更优选1％至20％，但仍更优选1％至15％，但仍更优选1％至10％，或者3％至9％、或它们的组合的碳酸氢盐(优选地碳酸氢钠)。

氟化物离子源

所述组合物可包含有效量的抗龋齿剂。在一个示例中，抗龋齿剂是氟化物离子源。氟化物离子可以以一定量存在，该量足以在25℃下在组合物中提供一定的氟化物离子浓度，和/或在一个实施方案中可以以按所述组合物的重量计0.0025％至5％，或者按所述组合物的重量计0.005％至2.0％的含量使用，以提供抗龋齿效果。代表性氟化物离子源包括：氟化亚锡、氟化钠、氟化钾、氟化胺、单氟磷酸钠、和氟化锌。在一个示例中，所述牙粉组合物包含氟化物源，所述氟化物源选自氟化亚锡、氟化钠、以及它们的组合。在一个实施方案中，所述氟化物离子源为单氟磷酸钠，并且其中所述组合物包含按所述组合物的重量计0.0025％至2％，或者0.5％至1.5％，或者0.6％至1.7％，或它们的组合的单氟磷酸钠。在另一示例中，所述组合物包含按所述组合物的重量计0.0025％至2％的氟化物离子源。在一个示例中，本发明的牙粉组合物可具有双氟化物离子源，具体地讲单氟磷酸钠和碱性金属氟化物。不受理论的束缚，此类方案可提供平均氟化物吸收的改善。

ph

牙粉组合物的ph可大于ph7.8，优选地大于ph8，更优选地从大于ph8.0至ph11，还更优选地从ph8.5至ph11，但仍更优选地处于或大于ph9至ph10.5。另选地，该ph为ph9至ph10。本发明组合物的相对较高ph用于氟化物稳定性。不受理论的束缚，在低于ph8时，钙离子可与氟化物结合。因此，期望具有牙粉组合物，该牙粉组合物具有大于ph8.0，以使氟化物离子源的稳定性最大化。用于评估牙粉的ph的方法描述于下文中。出于说明的目的，尽管分析方法描述了在新鲜制备时测试牙粉组合物，但出于本发明的要求，可在产品的合理寿命期间的任何时间下(包括但不限于从商店购买产品并带到使用者家中的时间)获取ph。

ph调节剂

本文的牙粉组合物可包含有效量的ph调节剂，另选地其中所述ph调节剂为ph缓冲剂。如本文所用，ph调节剂是指可用于将所述牙粉组合物的ph调节至上述ph范围的试剂。所述ph调节剂可包括碱金属氢氧化物、氢氧化铵、有机铵化合物、碳酸盐、倍半碳酸盐、硼酸盐、硅酸盐、磷酸盐、咪唑、以及它们的混合物。具体的ph试剂包括磷酸一钠(磷酸二氢钠或“msp”)、磷酸三钠(磷酸三钠十二水合物或“tsp”)、苯甲酸钠、苯甲酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碱金属碳酸盐、碳酸钠、咪唑、焦磷酸盐、葡萄糖酸钠、乳酸、乳酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸。在一个实施方案中，使用按所述组合物的重量计0.01％至3％，优选地0.1％至1％的tsp，以及按所述组合物的重量计0.001％至2％，优选地0.01％至0.3％的磷酸一钠。不受理论的束缚，tsp和磷酸一钠也可具有钙离子螯合活性，从而提供一定的单氟磷酸盐稳定性(在包含单氟磷酸盐的那些制剂中)。

本发明描述了一种用于评估牙粉的ph的方法。通过具有自动温度补偿(atc)探针的ph计来测量ph。所述ph计能够读至0.001ph单位。ph电极可选自下列中的一种：(i)orionrosssure-flow组合：玻璃主体-vwr#34104-834/orion#8172bn或vwr#10010-772/orion#8172bnwp；环氧树脂主体-vwr#34104-830/orion#8165bn或vwr#10010-770/orion#8165bnwp；半微量环氧树脂主体-vwr#34104-837/orion#8175bn或vwr#10010-774/orion#3175bnwp；或者(ii)orionperphect组合：vwr#34104-843/orion#8203bn半微量玻璃主体；或者(iii)合适的等同物。自动温度补偿探针为fisherscientific，目录号13-620-16。

采用去离子水制备按重量计25％的牙粉浆液，然后使用sorvallrc28s离心机和ss-34转子(或等效重力，在24149g力下)以15000转每分钟离心10分钟。在一分钟之后或获取的读数稳定之后，评估上清液中的ph。在每次ph评估之后，用去离子水清洗电极。用实验室级薄纸擦拭任何多余的水。当不使用时，使电极保持浸没在ph7缓冲液或适当电极储存液中。

低含量或不含湿润剂

本文的组合物包含相对较低量，或甚至基本上不含或不含湿润剂。按所述口腔护理组合物的重量计，湿润剂含量的非限制性示例包括0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％或0％。不受理论的束缚，湿润剂(例如山梨醇/甘油)的存在可对本发明的包含高水和高碳酸盐的牙粉制剂中牙斑中的氟化物吸收具有不利作用。这些牙粉组合物中含量降低的山梨醇/甘油提供优异的氟化物吸收结果。优选地，本发明的牙粉组合物包含按所述组合物的重量计0％至2％的湿润剂，其中所述湿润剂选自山梨糖醇、甘油、以及它们的组合；更优选地，所述组合物包含按所述组合物的重量计0％至1.5％，还更优选0％至1％，但仍更优选0％至0.5％；或者0％至0.1％的湿润剂；另选地，所述组合物基本上不含本发明湿润剂。

就本发明目的而言，术语“湿润剂”包括可食用多元醇如甘油、山梨醇、木糖醇、丁二醇、丙二醇、以及它们的组合。在一个示例中，湿润剂为多元醇，优选地其中所述多元醇选自山梨醇、甘油、以及它们的组合。在另一个示例中，所述湿润剂为山梨醇。不受理论的束缚，具有包含低含量湿润剂(即，为或小于2重量％)的牙粉组合物的潜在优点是，与具有高含量的此类湿润剂的那些组合物相比，不含湿润剂诸如甘油或山梨醇的那些牙粉组合物可提供更好的氟化物吸收。在一个示例中，本发明的牙粉组合物包含按所述组合物的重量计0％至2％，优选地0％至1％，更优选地0％至0.5％；或者0重量％至0.1重量％、或它们的组合的甘油、山梨醇；还更优选地，所述组合物基本上不含甘油和山梨醇两者。

增稠体系

本发明的牙粉组合物可包含增稠体系。优选地，所述牙粉组合物包含按所述组合物的重量计0.5％至4％，优选地0.8％至3.5％，更优选地1％至3％，但仍更优选地1.3％至2.6％的增稠体系。更优选地，增稠体系包含增稠聚合物、增稠二氧化硅、或它们的组合。还更优选地，当增稠体系包含增稠聚合物时，所述增稠聚合物选自羧甲基纤维素、直链硫酸化多糖、天然树胶、以及它们的组合。但仍更优选地，当增稠体系包含增稠聚合物时，所述增稠聚合物选自：(a)按所述组合物的重量计，0.01％至3％羧甲基纤维素(“cmc”)，优选地按所述组合物的重量计0.1％至2.5％，更优选地0.2％至1.5％的cmc；(b)按所述组合物的重量计，0.01％至2.5％，优选地0.05％至2％，更优选地0.1％至1.5％的直链硫酸化多糖，优选地其中所述直链硫酸化多糖为角叉菜胶；(c)按所述组合物的重量计，0.01％至7％，优选地0.1％至4％，更优选地0.1％至2％，还更优选地0.2％至1.8％的天然树胶；(d)它们的组合。优选地，当增稠体系包含增稠二氧化硅时，所述增稠二氧化硅为按所述组合物的重量计，0.01％至10％，更优选地0.1％至9％，还更优选地1％至8％。

优选地，直链硫酸化多糖为角叉菜胶(也称为角叉胶)。角叉菜胶的示例包括κ-角叉菜胶、ι-角叉菜胶、λ-角叉菜胶、以及它们的组合。

在一个示例中，所述增稠二氧化硅由硅酸钠溶液通过用酸去稳定化以获得非常精细的颗粒来获得。一个可商购获得的示例为得自huberengineeredmaterials的品牌二氧化硅(例如103、124、113、115、163、165、167)。

在一个示例中，cmc通过用碱和单氯乙酸或其钠盐处理而由纤维素制得。不同种类在商业上由粘度表征。一个可商购获得示例是aqualontm品牌cmc，其得自ashlandspecialingredients(例如，aqualontm7h3sf；aqualontm9m3sfaqualontmtm9a；aqualontmtm12a)。

优选地，天然树胶选自刺梧桐树胶、阿拉伯树胶(也称为金合欢树胶)、黄蓍胶、黄原胶、以及它们的组合。更优选地，所述天然树胶为黄原胶。黄原胶是由细菌野油菜黄单胞菌分泌的多糖。一般来讲，黄原胶由五糖重复单元组成，其分别包含摩尔比为2:2:1的葡萄糖、甘露糖和葡糖醛酸。(单体的)化学式为c35h49o29。在一个示例中，黄原胶得自cpkelcoinc(okmulgee，us)。

粘度

优选地，本发明的牙粉组合物具有150,000厘泊至850,000厘泊(“cp”)的粘度范围。本发明描述了一种用于评估粘度的方法。粘度计为粘度计，型号为dv-iprime，具有brookfield“helipath”支架。将粘度计放置在helipath支架上，并且经由水准器调平。将e心轴附接，并且将粘度计设定为2.5rpm。拆卸心轴，将粘度计归零并安装e心轴。然后，在开始测量之前，降低芯轴，直至横档部件部分地浸没在浆料中。同时开启粘度计和升降架上的电源开关，以开始心轴向下的旋转。将定时器设置为48秒，并将定时器与马达和升降架同时打开。在48秒后读取读数。读数以cp为单位。

peg

本发明的组合物可任选地但优选地包含聚乙二醇(peg)，其具有占所述组合物的不同重量百分比以及不同平均分子量范围。在本发明的一个方面，所述组合物具有按所述组合物的重量计，0.1％至5％，优选地0.5％至4％，更优选地1％至3％的peg。在本发明的另一个方面，peg为具有100道尔顿至1600道尔顿，优选200至1000，或者400至800，或者500至700道尔顿，或者它们的组合的平均分子量范围的peg。peg是通过环氧乙烷与具有以下通式的乙二醇等同物的加成反应形成的水溶性线型聚合物：h-(och2ch2)n-oh。peg的一个供应商是以carbowax^tm品牌的dowchemicalcompany。不受理论的束缚，在牙粉组合物中具有一些peg可有助于物理稳定性。

甜味剂

本文的口腔护理组合物可包含甜味剂。这些甜味剂可包括：糖精、右旋糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、左旋糖、天冬甜素、环己氨基磺酸钠、d-色氨酸、二氢查耳酮、丁磺氨、三氯蔗糖、纽甜、以及它们的混合物。甜味剂在口腔组合物中的用量按所述组合物的重量计一般为0.005％至5％，或者0.01％至1％，或者0.1％至0.5％，或者它们的组合。

抗牙结石剂

所述牙粉组合物可包含有效量的抗牙结石剂，在一个实施方案中，其含量可以为按所述组合物的重量计0.05％至50％，或者按所述组合物的重量计0.05％至25％，或者0.1％至15％。非限制性示例包括us2011/0104081a1第64段中所述的那些，和us2012/0014883a1第63至68段中所述的那些，以及其中引用的参考文献中所述的那些。一个示例是作为焦磷酸根离子源的焦磷酸盐。在一个实施方案中，所述组合物包含焦磷酸四钠(tspp)或焦磷酸二钠，或它们的组合，优选地按所述组合物的重量计，0.01％至2％，更优选地0.1％至1％的焦磷酸盐。不受理论的束缚，tspp不仅可提供钙螯合作用，从而减少牙斑形成，而且还可提供单氟磷酸盐稳定的附加有益效果(在包含单氟磷酸盐的那些制剂中)。

表面活性剂

本文牙粉组合物可包含表面活性剂。所述表面活性剂可选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、或它们的混合物。所述组合物可包含含量按总组合物的重量计为0.01％至10％，0.025％至9％，0.05％至5％，0.1％至2.5％，0.5％至2％，或0.1％至1％的表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性示例可包括描述于us2012/0082630a1第32、33、34、和35段中的那些。两性离子或两性表面活性剂的非限制性示例可包括us2012/0082630a1第36段中所述的那些；阳离子表面活性剂可包括在参考文献第37段中所述的那些；并且非离子表面活性剂可包括在参考文献第38段中所述的那些。在一个实施方案中，所述组合物包含按所述组合物的重量计0.1％至5％，优选地0.1％至3％，或者0.3％至3％，或者1.2％至2.4％，或者1.2％至1.8％，或者1.5％至1.8％，或者它们的组合的阴离子表面活性剂月桂基硫酸钠(sls)。

着色剂

本文组合物可包含着色剂。二氧化钛是着色剂的一个示例。二氧化钛是给组合物增加不透明度的白色粉末。按所述组合物的重量计，二氧化钛一般可占0.25％至5％。

风味剂

本文的组合物可包含按所述组合物的重量计0.001％至5％，或者0.01％至4％，或者0.1％至3％，或者0.5％至2％，或者1％至1.5％，或者0.5％至1％，或者它们的组合的风味剂组合物。在最广泛的意义上，使用术语风味剂组合物以包括风味剂成分、或感觉剂、或感觉试剂、或它们的组合。风味剂成分可包括us2012/0082630a1第39段中所述的那些；感觉剂和感觉试剂可包括以引用方式并入本文的第40至45段中所述的那些。不包括在风味剂组合物定义中的是“甜味剂”(如上所述)。

实施例

首先描述了方法，然后提供口腔护理组合物，并且最后讨论结果。由口腔护理组合物处理生物膜。这些口腔护理组合物包括比较例和本发明组合物(表1)。术语“生物膜”是指附接到表面的一个或多个细胞层。生物膜可以是细菌生物膜，其包括活的和生长的微生物细胞以及死亡的微生物细胞两者。生物膜可以由一种细胞类型组成，或者它可以由两种或更多种细胞类型组成，例如，作为多物种细菌群落的生物膜复合物。特定类型的生物膜是“牙科生物膜”(也称为“牙斑生物膜”，本文可互换使用)，其是通常在人类口腔中的牙齿表面上形成的生物膜。牙斑生物膜中的细菌具有显著不同的生理特征，例如，对洗涤剂和抗生素的抗性增加，从而使生物膜研究变得非常重要。口腔细菌物种的非限制性列表描述于美国专利6,309,835b1，第7栏，第12行至30行。在很多情况下这些粘附的微生物细胞嵌入细胞自身产生的细胞外聚合物物质(“eps”)基质内。eps是来自微生物的生物聚合物，其中嵌入有生物膜微生物。j.bacteriol.2007,189(22):7945。生物膜细胞外聚合物物质是一般由钙、细胞外dna、蛋白质和多糖构成的聚合物聚集体。

本发明描述了用于牙科生物膜生长的物质。羟基磷灰石(ha)盘用于生物膜的原位生长。ha盘被设计成在每个盘中具有三个平行的凹槽(两侧凹槽是300um宽，300um深，然而中间凹槽是500um宽，500um深)。在将盘附接到受试者的口腔时，保持这些凹槽竖直，以模仿牙齿之间的邻间间隙，这是牙斑积聚的难以清洁的区域。该模型允许从凹槽中收集未受干扰的自然生长的牙斑生物膜。ha盘由shanghaibei'erkangbiomedicinelimitedcompany制造。

本发明描述了佩戴夹板的人类受试者。每个受试者在夹板上至多佩戴12个ha盘，以确保48小时后至少9个ha盘可用。图1中示出了此类夹板和ha盘的非限制性示例。装置(1)保持多个ha盘(2a至2d)。尽管未在图1中示出，但是盘可被定位成使得后退位于牙齿之间的牙间空间中(因为该位置易于形成牙斑(鉴于清洁困难等))。受试者仅在进餐期间取出夹板(夹板储存在潮湿条件下的不透明容器中)并执行口腔卫生程序。紧接着，夹板再次磨损。要求受试者在饮用时使用吸管。

描述了原位生物膜从ha盘释放的程序。所有ha盘在48小时时通过镊子从夹板移除。使用镊子来保持ha薄片的边缘并将ha盘转移到容纳pbs(磷酸盐缓冲盐水)溶液的2ml离心管中。在每次盘转移之前将镊子彻底清洗(水；75％酒精；以及然后去离子水)。

本发明描述了pbs溶液的制备。将一种磷酸盐缓冲盐水片剂(购自sigma-aldrichcorp.，mo,usa)加入到250ml烧杯中的200克去离子水中。充分搅拌后，在使用前将溶液在4℃下储存长达30天。

本发明描述了口腔护理组合物(例如，牙膏)上清液的制备。在100ml烧杯中将15克去离子水加入到5克牙膏中。充分搅拌后，将混合物以11,000×g离心20分钟。上清液在使用前立即制备或在使用前最多一天制备并在4℃下储存。

在从夹板移除ha盘之后，将该盘用于通过pbs和/或不同的口腔护理组合物的体外处理。在用pbs和/或口腔护理组合物(例如，牙膏)上清液处理并用eps荧光探针和钙荧光探针标记后，通过共聚焦激光扫描显微术(clsm)测量凹槽中的生物膜。

描述了盘的制备。ha盘在pbs溶液中冲洗，并且将每个ha盘通过镊子分成两半。此后，将每个半盘样品静态置于500ul至1000ul的pbs溶液中1分钟。通过pbs溶液或牙膏上清液处理每个样品两分钟。通过用镊子保持每个盘来清洗每个样品，在1ml的pbs溶液中来回摇动十轮。重复该洗涤循环。然后将每个样品静态浸入500ul至1000ulpbs溶液中5分钟。

描述了荧光染色和显微镜法。荧光标记的钙探针是在结合ca2+时表现出荧光增加的分子。fluo-3^tm用于对ca2+信号传导的空间动态进行成像。可通过将溶解的探针直接加入生物膜中，用am^tm酯形式的钙探针处理生物膜。fluo-3^tm、am^tm、细胞渗透性荧光探针用于使用共聚焦显微术、流式细胞术和微板筛选应用来进行细胞内和细胞外钙染色(吸收/发射最大值～506/526nm)。据报道，concanavalina^tm(cona)，alexa594缀合物是生物膜的染色eps的可靠替代形式。cona的alexa594缀合物表现出alexa594染料的明亮的红色荧光(吸收/发射最大值～590/617nm)。concanavalina^tm、alexa594缀合物选择性结合到富集于生物膜的eps部分中的α-吡喃甘露糖苷基残基和α-吡喃葡糖基残基。在处理和浸没之后，每种半盘样品用fluo-3^tm、am^tm、细胞渗透性荧光探针连同concanavalina^tm、alexa594缀合物探针(包含5umfluo-3^tm+5umcon-a^tm)的染料混合物溶液在暗处染色30分钟。染色后，将每个样品静态浸入500ul至1000ulpbs溶液中并持续2分钟。通过用镊子保持每个盘，在1mlpbs溶液中来回摇动五轮来再次洗涤样品，并重复。对于fluo-3/con-a染料共染色样品，使用以下参数：分别为λex＝488nm/561nm，λem＝526/617nm，20x物镜，并且从盘表面细菌的底部扫描60um深，其中步长为3um。另一个半盘样品用l7012live/染料溶液(包含5umsyto-9+30um碘化丙啶)在暗处染色15分钟以评估杀菌功效。对于l7012live/染料染色的样品，使用以下参数：分别为λex＝488nm，λem＝500/635nm，20x物镜，并且从表面细菌的底部扫描60um深，其中步长为3um。

描述了共聚焦激光扫描显微术(clsm)。使用leica^tmtcssp8aobs光谱共聚焦显微镜(购自leicamikroskopiegmbh(wetzlar,germany))。共聚焦系统由leica^tmdm6000b直立式显微镜和leica^tmdmire2倒置式显微镜组成。直立式支架用于涉及滑动安装样品的应用；而具有37℃温育室和co2富集附件的倒置式支架提供活细胞应用。显微镜共用一个可更换的激光扫描头，并且除了它们自己的电动机驱动平台外，还有一个电流计驱动的高精度z平台，这有利于在焦平面(z)中快速成像。除了辐射荧光外，显微镜还支持多种透射光对比度方法，包括明视场、偏振光和微分干涉对比度，并配备有5x、20x、40x、63x(油和干)和100x(油)leica^tm物镜镜头。

描述了激光扫描和检测系统。tcssp8aobs共聚焦激光扫描系统(购自leicalasertechnikgmbh(heidelberg,germany))供应有四个激光器(一个二极管、一个氩气和两个氦氖激光器)，因此允许激发电磁波谱的uv、可见和远红外范围内的各种荧光染料。激光扫描头的设计(包括声光可调谐滤波器(aotf)、声光分束器(aobs)和四棱镜分光光度计探测器)允许同时激发和检测三种荧光染料。直立式显微镜还具有透射光检测器，使得可在荧光记录时覆盖透射光图像。

使用leica^tm共聚焦软件lasaf3.3.0。共聚焦经由配备有双监视器和运行leica^tm共聚焦软件的标准pentiumpc进行控制。leica共聚焦软件lasaf3.3.0(购自leicalasertechnikgmbh(heidelberg,germany))为多维图像系列采集、处理和分析提供界面，包括3d重建和测量、生理记录和分析、延时、荧光染料共定位、光漂白技术诸如frap和fret、光谱混合和多色修复。关于图像分析，对于fluo-3^tm/con-a^tm染色样品而言，选择两个荧光通道以量化绿色像素(钙)与红色像素(eps)的荧光强度比，并且选择con-a^tm荧光通道以测量生物膜厚度。选择l7012live/染料染色的样品以通过量化所有像素(所有细菌，无论活的还是死的)的绿色像素(活细菌)的荧光强度百分比来评估细菌活力。

表1描述了四种口腔护理组合物。一般来讲，实施例1和2是比较例，然而实施例3和4是本发明实施例。实施例1显然不包含任何碳酸氢钠。实施例2也是比较例，其通过显然不包含任何碳酸氢钠(并且用附加的水补偿)用作对照(与实施例3和4相比)。实施例3和4是本发明组合物，其显然包含碳酸氢钠。实施例3具有按所述组合物的重量计9％的碳酸氢钠，然而实施例4包含20％的碳酸氢钠。

表1：提供比较例1和2以及本发明实施例3和4的组成组分。

对数据进行讨论。参见表2，提供了原位牙斑生物膜内的钙/eps的荧光强度比和针对各种实施例(1至4)和牙膏制剂(商业化实施例)测量的平均生物膜厚度。表2的第一列标识了产品。继而，每种产品包括上表1中所述的实施例(即实施例1至4)以及两种商业化产品实施例a和b。值得注意的是，实施例a和b分别包含67重量％和9重量％小苏打。表2的第二列指示每个实施例中的小苏打(即，碳酸钠)的量。第三列指示钙/eps的荧光比。最后，第四列指示牙科生物膜厚度。使用如先前描述的程序。简而言之，首先用本发明口腔护理组合物处理生物膜，并且然后用eps和钙探针标记经处理的生物膜。使用软件，给出绿色像素(染色钙离子)和红色像素(染色eps)的平均荧光强度。然后计算绿色像素与红色像素的荧光强度比。关于生物膜厚度评估，评价每个样品的con-a^tm荧光通道的六个选定场。这些场在观察者的一般检查之后被认为是整个样品的代表。距离从生物膜的表面到其底部测量，测量场的厚度，并且随后计算相应样品的生物膜的平均厚度。荧光比越低，组合物就越有效。生物膜厚度越小，组合物就越有效。

仍然参见表2，将实施例1(“ex1”)磷酸盐缓冲溶液(“pbs”)用作阴性对照。因此，实施例1在钙(“ca”)/eps的荧光比以及对牙科生物膜厚度的影响这两者中效果最小(相比于其他组合物)。实施例a(“exa”)是parodontax^tm牙膏(“parodontax”，lot#14042610，其包含67重量％碳酸氢钠)，一种可商购获得的牙膏组合物。与阴性对照(即，实施例1)相比，实施例a示出显著降低的ca/eps荧光比和生物膜厚度。然而，值得注意的是，在实施例a和实施例3(“ex3”)之间没有显著差异。实施例3是本发明组合物，其包含按所述组合物的重量计9％碳酸钠。这显著小于实施例a的67重量％。实施例b(“exb”)是bakingsoda&peroxidewhitening(lot:632232expoct19)；其包含约9重量％的小苏打。与实施例1的阴性对照相比，实施例b也示出显著降低的ca/eps荧光比和生物膜厚度。然而，值得注意的是，考虑到误差范围，本发明组合物实施例3比实施例b显著更有效。实施例4在降低ca/eps荧光比和生物膜厚度方面是最有效的。

表2：提供关于生物膜中钙/eps的荧光强度比以及各种比较的和本发明牙粉产品/制剂的平均生物膜厚度的数据。

1实施例a：parodontax^tm(lot:14042610exp24april17)；包含约67重量/重量％小苏打。

2实施例b：bakingsoda&peroxidewhitening(lot:632232expoct19)；包含约9重量/重量％小苏打。

表3通过前述口腔护理组合物实施例1至4和实施例a和b观察这些碳酸氢钠处理剂的同时杀菌效果。提供上述相同处理剂的原位牙斑生物膜内的活细菌的荧光强度百分比。使用如先前描述的程序。简而言之，首先用本发明口腔护理组合物处理生物膜，并且然后用l7012live/染料标记经处理的生物膜。使用软件，给出绿色像素(染色活细菌)和红色像素(染色死细菌)的平均荧光强度，然后计算绿色像素的荧光强度百分比。平均细菌活力百分比越低，组合物就越有效。

仍然参见表3，将实施例1(pbs)用作阴性对照。因此，实施例1在平均细菌活力百分比(为91％)方面效果最小(相比于其他组合物)。实施例a是parodontax^tm牙膏(“parodontax”，lot#14042610，其包含67重量％碳酸氢钠)，一种可商购获得的牙膏组合物。与阴性对照(即，实施例1)相比，实施例a示出显著降低的平均细菌活力百分比。然而，值得注意的是，在实施例a和实施例3之间没有显著差异。实施例3是本发明组合物，其包含按所述组合物的重量计9％的碳酸钠。这显著小于实施例a的67重量％。实施例b是bakingsoda&peroxidewhitening(lot:632232expoct19)；其包含约9重量％的小苏打。与实施例1的阴性对照相比，实施例b还示出显著降低的平均细菌活力百分比。然而，值得注意的是，考虑到误差范围，本发明组合物实施例3比实施例b显著更有效。实施例4在提供为43％的降低的平均细菌活力百分比方面是最有效的。

表3：提供关于各种比较的和本发明牙粉产品/制剂的细菌活力的数据。

1对照a：parodontax^tm(lot:14042610exp24april17)；包含约67重量/重量％小苏打

2对照b：crestbakingsoda&peroxidewhitening(lot:632232expoct19)；包含约9重量/重量％小苏打

本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。

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