一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法与流程

技术特征：

1.一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体制备方法，其特征在于：所述的外泌体内部载有可用于肿瘤示踪和成像的纳米四氧化三铁以及可用于肿瘤治疗的姜黄素；其中纳米四氧化三铁为水溶液，姜黄素为二甲基亚砜DMSO溶液，其具体制备步骤如下：

1)从小鼠巨噬细胞Raw264.7培养液中提取该细胞分泌的外泌体，采用经典的差速超速离心法，得到的外泌体重悬于含50mM海藻糖的PBS溶液中，-80℃保存备用；

2)将制备好的纳米四氧化三铁水溶液、姜黄素DMSO溶液及外泌体混悬液加入所述的海藻糖PBS溶液中，震荡混匀，得到样品；

3)按电穿孔仪要求及电穿孔皿规格加入相应体积的上述样品，放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；

4)穿孔后立即取样，在紫外可见光分光光度计上检测样品在260nm处的吸光值，并与未穿孔样品对比，判断穿孔是否成功；

5)其余穿孔后样品立即放入细胞培养箱中孵育1个小时，以促进外泌体膜修复；

6)1小时后，将上述液体以10万-14万g RCF离心力超速离心70-100min，弃尽上清，沉淀物即为同时负载纳米四氧化三铁和姜黄素的外泌体，称之为复合外泌体；

7)上述复合外泌体加入共聚焦培养皿中，荧光显微镜下观察姜黄素自发绿色荧光证明包载姜黄素成功，上述外泌体制备铜网样品，于电镜下观察外泌体内铁颗粒，证明纳米四氧化三铁负载成功；

8)PBS重悬复合外泌体，用菲啰啉分光光度法测定铁含量，用可见光分光光度计测定姜黄素含量，以蛋白计，用BCA法测外泌体含量；

9)取复合外泌体混悬液进行纳米颗粒跟踪分析检测NTA或动态光反射分析DLS测定其粒径大小及分布范围，并在透射电镜TEM下观察其大小及形貌特征，western blot检测外泌体膜表面特征性蛋白表达；

10)将上述复合外泌体混悬液分装放于-80℃冰箱中，每隔一周取样一次测定上述浓度及外泌体特征，评价复合外泌体的稳定性。

2.根据权利要求1所述的同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，其特征在于:所述小鼠巨噬细胞Raw264.7培养液为含无外泌体血清或不含血清。

3.根据权利要求1所述的同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中,1ml含50mM海藻糖的磷酸缓冲盐溶液PBS溶液中分别加入100μg-300ug外泌体、5-20μl纳米四氧化三铁水溶液和10-30μl姜黄素DMSO溶液组成混合反应体系。

4.根据权利要求2所述的同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，其特征在于:所述外泌体以其蛋白含量计，姜黄素DMSO溶液的浓度为10-30mg/ml，纳米四氧化三铁水溶液的浓度为1-10mg/ml。

5.根据权利要求1所述的同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中，电穿孔条件为：电压100-700v，电容125-500μF，放电时间1-5ms，放电次数：1次。

6.根据权利要求1所述的同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，其特征在于:所述8)中，测定铁浓度和姜黄素浓度均采用紫外-可见光分光光度法。