本发明属于药物制剂技术和高分子材料领域，更具体涉及一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，还涉及一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统在胶质瘤靶向药物载体中的用途。
背景技术：
胶质瘤是原发性中枢神经系统最常见肿瘤，约占原发性颅内肿瘤的一半。传统疗法包括手术切除、放疗和化疗。然而，由于肿瘤的基因异质性和浸润性增长，手术难以将恶性肿瘤彻底切除。据报道术后化疗联合放疗的5年生存率比单纯放疗增加近4倍，说明化疗是有效的。阿霉素（dox）是广泛应用且具有广谱抗肿瘤活性的蒽环类化疗药物，其红色荧光还能为药物及其载体在细胞内转运起示踪作用。
然而，血脑屏障（bbb）和血脑肿瘤屏障（bbtb）严重限制了药物从血管进入肿瘤细胞，导致临床疗效差，此外大量药物在非肿瘤部位释放又增加了其毒副作用。靶向药物递送系统可因其表面配体与血管内皮细胞和神经胶质瘤细胞上过表达的受体之间发生特异性识别，从而克服上述难题。
低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（lrp-1）受体是一种在脑内皮细胞和神经胶质瘤细胞中高表达的多功能受体。由19个氨基酸组成的多肽angiopep-2（ang-2）是lrp1的特异性配体，其转运效率比转铁蛋白更高。ruan等人制备了一种ang-2修饰的金纳米粒并用于递送dox至神经胶质瘤。研究发现，与游离药物和无靶向配体纳米粒相比，靶向纳米粒在胶质瘤细胞中的累积显著增多，靶向纳米粒治疗后小鼠中位生存时间比生理盐水组延长了2.89倍。前期研究表明ang-2可被用来修饰药物载体并介导其穿越血脑屏障和进入靶向胶质瘤。但是可能存在受体饱和，单配体递送系统的靶向效率可能受限。鉴于肿瘤细胞上有多种过表达受体，近年来双靶向递送系统受到了很多关注。环状rgd（crgd）是另一种多肽配体，与内皮细胞和胶质瘤细胞上过度表达的αvβ3整联蛋白受体有高亲和力。yan等人用crgd和ang-2多肽构建了一种双级靶向的脑肿瘤成像纳米探针。实验结果表明，纳米探针可以有效地穿透血脑屏障并准确显示胶质细胞原位移植瘤的边界。
目前，主客体自组装是利用分子间非共价作用来构建“即插即用”多功能递送系统的一种简便有效的制备方法。环糊精（cd，包括α-cd，β-cd和γ-cd）是常用的外部亲水、内腔疏水的主体分子，可以选择性结合尺寸适宜的客体分子。通常，用于偶联靶向基团的亲水外壳和用于载难溶性药物的疏水内核可以通过环糊精及客体分子间的相互作用而连接在一起。常见的客体分子包括苯，金刚烷（ad），二茂铁，偶氮苯及其衍生物等。chen等人报道了一种新型超分子前药纳米粒子，该纳米粒子的形成是基于两性离子侧链共聚物（poly(mpc-co-ada)）上的金刚烷分子和阿霉素-腙-环糊精（dox-hyd-cd）之间的分子识别。
本发明拟利用β-cd和金刚烷之间的分子识别作用，制备一种携带ang-2和crgd两种配体的双级脑靶向递药系统。迄今为止，尚未见利用主客体分子识别作用制备双级脑靶向胶束及其在胶质瘤治疗中的应用相关报道。
技术实现要素：
本发明的目的是在于提供了一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，即利用β-cd和金刚烷主客体分子识别作用来构建“即插即用”多功能递送系统，操作简便，方法易行，制得的超分子胶束稳定性高。
本发明的另一个目的是在于提供了一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统在制备治疗或预防胶质瘤靶向药物载体中的应用。本发明构建了一种由ang-2和crgd两种靶向肽修饰的超分子胶束，该胶束能够包载抗肿瘤药物或诊断试剂，并通过靶向肽介导的内吞途径穿透血脑屏障进入胶质瘤细胞。靶细胞表面的受体可能存在饱和情况，单配体递送系统的靶向效率可能受限。鉴于肿瘤细胞上有多种过表达受体，因此双靶向递送系统可进一步提高靶向效率。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：
一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，其步骤是：
1、亲水性主体分子的制备：
(1)称取单-(6-对甲苯磺酰基)-β-环糊精（6-ots-β-cd），溶于无水乙二胺中，配制成浓度为1~1000mmol/l的溶液，在惰性气体保护下40~90oc反应1~48小时，将反应溶液滴入沉淀剂中得到白色固体，即单-6-乙二胺-β-环糊精（m6-β-cd），所述的沉淀剂为乙醇、丙酮中的任一种；
(2)称取单-6-乙二胺-β-环糊精（m6-β-cd）和马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯（mal-peg-nhs），分别溶于蒸馏水中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。将两份溶液混合后搅拌过夜，然后转移至透析袋内对蒸馏水透析，每12~36h更换一次蒸馏水，共1~4次。所述的透析袋的截留分子量为3000。最后冻干透析液得到马来酰亚胺-聚乙二醇-β-环糊精（mal-peg-β-cd）。
(3)称取马来酰亚胺-聚乙二醇-β-环糊精（mal-peg-β-cd）和ang-2多肽，分别溶于蒸馏水中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。将两种溶液混合后搅拌，然后转移至透析袋内对蒸馏水透析，每12~36h更换一次蒸馏水，共1~4次。最后冻干透析液得到ang-2-聚乙二醇-β-环糊精（ang-2-peg-β-cd）。
(4)按照步骤(3)的方法，称取马来酰亚胺-聚乙二醇-β-环糊精（mal-peg-β-cd）和crgd多肽，分别溶于蒸馏水中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。将两种溶液混合后搅拌，然后转移至透析袋内对蒸馏水透析，每12~36h更换一次蒸馏水，共1~4次。最后冻干透析液得到crgd-聚乙二醇-β-环糊精（crgd-peg-β-cd）。
(5)按照步骤(3)的方法，称取马来酰亚胺-聚乙二醇-β-环糊精（mal-peg-β-cd）和巯基乙醇，分别溶于蒸馏水中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。将两种溶液混合后搅拌，然后转移至透析袋内对蒸馏水透析，每12~36h更换一次蒸馏水，共1~4次。最后冻干透析液得到巯基乙醇-聚乙二醇-β-环糊精（ho-peg-β-cd）。
2、疏水性客体分子的制备：
(1)称取1-金刚烷醇（1~1000mg）、ε-已内酯（0.1~10g）和辛酸亚锡（0.1~100mg），置于含磁子的硅烷化长颈玻璃瓶中。真空密封后在20~150°c反应1~48h，将反应液滴入沉淀剂中得到白色沉淀，即金刚烷-聚已内酯（ad-pcl），所述的沉淀剂为甲醇、乙醚中的任一种；
(2)称取金刚烷-聚已内酯（ad-pcl）溶于20ml二甲基亚砜溶液（dmso）中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液，再加入异硫氰酸荧光素（fitc）（0.1~100mg），在避光处搅拌后转移至透析袋内，然后置于蒸馏水中透析。冻干透析液得到金刚烷-聚已内酯-异硫氰酸荧光素（ad-pcl-fitc）。
3、空白胶束和载药胶束的制备：
(1)空白双靶向胶束（bd-t胶束）：分别称取ang-2-聚乙二醇-β-环糊精（ang-2-peg-β-cd）和crgd-聚乙二醇-β-环糊精（crgd-peg-β-cd），分别溶于3ml蒸馏水中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液；另称取金刚烷-聚已内酯-异硫氰酸荧光素（ad-pcl-fitc）溶于1ml二甲基亚砜溶液（dmso）中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。室温（20~25°c，以下相同）下将二甲基亚砜溶液（dmso）逐滴滴入水溶液中，边滴边搅拌。将混合溶液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，最后冻干透析液得到一种空白双级脑靶向胶束（bd-t胶束）。所述的透析袋的截留分子量为8000~14000。
(2)载药双靶向胶束（d-t胶束）：称取脱盐阿霉素dox），溶于0.5ml二甲基亚砜溶液（dmso），配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。室温（20~25°c）下将该溶液逐滴滴入上述步骤(1)的bd-t胶束水溶液中，边滴边搅拌。搅拌1~48h后，将混合溶液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，最后冻干透析液得到一种载药双级脑靶向胶束递药系统（d-t胶束）。
(3)载药无靶向胶束（n-t胶束）：
称取巯基乙醇-聚乙二醇-β-环糊精（ho-peg-β-cd），溶于5ml蒸馏水中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液；另称取金刚烷-聚已内酯-异硫氰酸荧光素（ad-pcl-fitc）溶于1ml二甲基亚砜溶液（dmso）中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。室温（20~25°c）下将二甲基亚砜溶液（dmso）逐滴滴入水溶液中，边滴边搅拌。将混合液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，得到空白无靶向胶束水溶液。
称取脱盐阿霉素（dox），溶于0.5ml二甲基亚砜溶液（dmso）中，配制成浓度为0.1~100mmol/l的溶液。将该二甲基亚砜溶液逐滴滴入空白无靶向胶束水溶液中，边滴边搅拌。搅拌1~48h后，将混合溶液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，最后冻干透析液得到一种载药无靶向胶束（n-t胶束）。
4、超分子胶束的形貌与粒径：
用透射电子显微镜(tem)观察超分子胶束的形貌，用光散射粒径分析仪测定其粒径及分布。
通过上述步骤成功制备了一种基于β-cd和金刚烷主客体分子识别作用自组装形成的超分子胶束，其中peg为亲水外壳、其表面用ang-2和crgd两种靶向肽修饰，pcl为疏水内核、可包载水难溶性化疗药物dox。由于制备过程中是分别合成亲水性主体分子和疏水性客体分子，因此可以精确控制亲水、疏水链段的长度和比例；通过调节两种亲水性主体分子之间的投料比，还可以灵活调控胶束表面靶向基团的比例，获得不同靶向性能的双级靶向胶束。
一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统在制备治疗或预防胶质瘤靶向药物载体中的应用，实验结果如下：
1、体外抗瘤活性研究：
(1)细胞摄取实验：利用荧光显微镜和流式细胞仪，测定小鼠脑微血管内皮细胞（bend.3细胞）和胶质瘤细胞（c6细胞）对游离dox，n-t胶束和d-t胶束的摄取情况。结果显示bend.3细胞和c6细胞对d-t胶束的摄取量明显高于游离dox和n-t胶束，说明d-t胶束能通过胶束表面靶向肽介导的内吞途径穿透bbb并进入肿瘤细胞。
(2)细胞毒性实验：用mmt法检测bd-t胶束、游离dox溶液、d-t胶束、n-t胶束对bend.3细胞和c6细胞的生长抑制作用。结果显示bd-t胶束在浓度较高时细胞毒性仍然很低，说明超分子胶束作为载体材料的生物相容性好、安全性高。d-t胶束对bend.3和c6两种细胞的抑制作用明显强于游离dox组和n-t胶束组，这与细胞摄取实验结果一致。
2、体内抗瘤活性研究：
将c6细胞悬液接种于裸鼠侧腹皮下，建立皮下移植瘤动物模型。然后将模型动物随机分为4组（n≥5），每隔两天尾静脉注射生理盐水、游离dox、n-t胶束和d-t胶束进行治疗，共治疗21天。实验结果显示，d-t胶束组疗效明显优于游离dox组和n-t胶束组，经d-t胶束治疗后的动物肿瘤体积最小，抑瘤率最高，动物体重变化最小，主要脏器损害最小。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：
1.本发明中的递药系统是亲水性主体分子和疏水性客体分子之间通过主客体相互作用构筑超分子胶束。由于制备过程中是分别合成亲水性主体分子和疏水性客体分子，因此可以精确控制亲水、疏水链段的长度和比例；因β-cd与金刚烷在水溶液中的包结络合常数高达5×104m-1，制备的超分子胶束稳定性高。
2.超分子胶束表面具有lrp-1受体靶向肽ang-2和αvβ3整联蛋白受体靶向肽crgd，通过调节两种亲水性主体分子之间的投料比，可以灵活调控胶束表面靶向基团的比例，获得不同靶向性能的双级靶向胶束。由于靶细胞表面的受体可能存在饱和情况，单配体递送系统的靶向效率可能受限。鉴于肿瘤细胞上有多种过表达受体，因此双靶向递送系统可进一步提高靶向效率。
3.超分子胶束的疏水内核可以包载水难溶性抗肿瘤药物，通过胶束表面靶向肽介导的内吞途径穿透bbb并进入胶质瘤细胞，增强化疗药物的治疗效果、降低毒副作用。
4.本发明提供了双级脑靶向超分子胶束中主客体分子的制备及其组合方式，其制备方法简单，易于操作，便于后续开发和产业化。
附图说明
图1(a)为一种ang-2-peg-β-cd在重水中的核磁图谱。
图1(b)为一种crgd-peg-β-cd在重水中的核磁图谱。
图1(c)为一种ad-pcl在氘仿中的核磁图谱。
图2为一种d-t胶束的透射电镜(a)及粒径(b)分布图。
图3(a1-c3)为一种游离dox(a)，n-t胶束(b)和d-t胶束(c)在bend.3细胞中的定性分布图
图3(d1-f3)为一种游离dox(a)，n-t胶束(b)和d-t胶束(c)在c6细胞中的定性分布图
图4为一种游离dox，n-t胶束和d-t胶束分别在bend.3细胞(a-c)和c6细胞(d-f)中的定量分布图
图5(a)为一种bd-t胶束在bend.3和c6细胞中的细胞毒性评价图。
图5(b)为一种游离dox，n-t胶束和d-t胶束在bend.3细胞中的细胞毒性评价图。
图5(c)为一种游离dox，n-t胶束和d-t胶束在c6细胞中的细胞毒性评价图。
图6为一种生理盐水、游离dox、n-t胶束和d-t胶束治疗皮下移植瘤模型动物的体内抗瘤效率图：(a)治疗期间肿瘤体积变化；(b)治疗终点肿瘤照片；（c）治疗终点肿瘤重量和抑瘤率；（d）治疗期间动物体重变化。
图7为一种治疗终点动物心、肝、脾等主要脏器的组织切片图。
具体实施方式
通过以下实施例描述将有助于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
实施例1：
一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统的制备方法，其步骤是：
a、亲水性主体分子的制备：
(1)称取单-(6-对甲苯磺酰基)-环糊精（6-ots-β-cd）3g，溶于20ml无水乙二胺中，将混合溶液倒入圆底烧瓶后置于油浴中反应。反应温度在40或50或60或70或80或90oc，反应时间为1或5或8或15或22或30或36或42或48h。反应结束后，将反应溶液滴入500ml丙酮中得到沉淀，抽滤收集沉淀并真空干燥。沉淀经过两次溶解/再沉淀纯化后，真空干燥得到单-6-乙二胺-β-环糊精（m6-β-cd）。
(2)称取单-6-乙二胺-β-环糊精（m6-β-cd）68.8mg和马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯（mal-peg-nhs）400mg，分别溶于2ml和20ml的蒸馏水中。将两份水溶液混合搅拌过夜后转移至透析袋内，然后置于蒸馏水中透析（截留分子量为3000），每12或18或24或30或36h更换一次蒸馏水，共1或2或3或4次。冻干透析液得到马来酰亚胺-聚乙二醇-β-环糊精（mal-peg-β-cd）。
(3)称取mal-peg-β-cd（370mg）和ang-2多肽（104mg），分别溶于20ml和2ml的蒸馏水中。将两种水溶液混合后搅拌24小时后转移至透析袋内，然后置于蒸馏水中透析，每12或18或24或30或36h更换一次蒸馏水，共1或2或3或4次。冻干透析液得到ang-2-聚乙二醇-β-环糊精（ang-2-peg-β-cd）。
(4)按照步骤(3)的方法，称取mal-peg-β-cd（370mg）和crgd多肽（25.2mg），分别溶于20ml和2ml蒸馏水中。将两种水溶液混合搅拌24小时后转移至透析袋内，然后置于蒸馏水中透析，每12或18或24或30或36h更换一次蒸馏水，共1或2或3或4次。最后冻干透析液得到crgd-聚乙二醇-β-环糊精（crgd-peg-β-cd）。
(5)称取mal-peg-β-cd（370mg）和巯基乙醇（3.4mg），分别溶于20ml和2ml蒸馏水中。将两种水溶液混合搅拌12或17或21或26或29或32或36h小时后转移至透析袋内，然后置于蒸馏水中透析，每12或18或24或30或36h更换一次蒸馏水，共1或2或3或4次。最后冻干透析液得到巯基乙醇-聚乙二醇-β-环糊精（ho-peg-β-cd）。
图1a和图1b分别是ang-2-peg-β-cd和crgd-peg-β-cd的核磁图谱。图上可以看到ang-2或crgd肽的特征峰在6.5-7.3ppm(a,f,ar-h),β-cd的特征峰在4.9ppm(b,-o-ch-ch(oh)-)，3.8ppm(c,-o-ch-ch(oh)-ch(oh)-ch-,-ch-ch-ch2(oh))，3.4ppm(e,-o-ch-ch(oh)-ch(oh)-ch-)，peg的特征峰在3.6ppm(d,-ch2-ch2-)（图1a、1b所示），这表明亲水性主体分子被成功制备。
b、疏水性客体分子的制备：
(1)称取1-金刚烷醇（195mg）、ε-cl（1.2g）和辛酸亚锡（20.5mg），置于含磁子的硅烷化长颈玻璃瓶中。将玻璃瓶抽真空，用氮气吹扫，然后在真空下密封。将玻璃瓶置于油浴中反应，反应温度在20或50或80或110或130或150oc，反应时间为1或6或10或16或24或30或38或44或48h。将反应溶液滴入500ml乙醚中得到白色沉淀，抽滤收集沉淀并真空干燥。沉淀经过两次溶解/再沉淀纯化后，真空干燥得到金刚烷-聚已内酯（ad-pcl）。
图1c是ad-pcl的核磁图谱。图上可以看到pcl的特征峰在4.1ppm(g,-ch2-o-),2.2ppm(h,-co-ch2-),1.6ppm(i+j,-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-),1.2ppm(k,-ch2-ch2-ch2-ch2-ch2-)（图1c所示），这表明疏水性客体分子被成功制备。
(2)称取金刚烷-聚已内酯ad-pcl（201mg）溶于20mldmso中，再加入异硫氰酸荧光素fitc（5mg），在避光处搅拌12或24或36或48或60h后转移至透析袋内，然后置于蒸馏水中透析，每12或18或26或34或42或48h更换一次蒸馏水，共1或3或6或9或12次。冻干透析液得到金刚烷-聚已内酯-异硫氰酸荧光素（ad-pcl-fitc）。
c、双级脑靶向超分子胶束的制备：
(1)空白双靶向胶束（bd-t胶束）：分别称取ang-2-peg-β-cd（8mg）和crgd-peg-β-cd（8mg），溶于5ml水溶液中，另称取ad-pcl-fitc（9mg）溶于1ml二甲基亚砜溶液（dmso）中。室温下将dmso溶液逐滴滴入水溶液中，边滴边搅拌。将混合溶液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，最后冻干透析液得到一种空白双级脑靶向胶束（bd-t胶束）。所述透析袋的截留分子量为8000~14000。
(2)载药双靶向胶束（d-t胶束）：称取脱盐阿霉素（1.4mg），溶于0.5mldmso中。室温下将该溶液逐滴滴入上述步骤(1)的空白双靶向胶束水溶液中，边滴边搅拌。搅拌1或6或10或17或24或32或40或48h后，将混合溶液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，最后冻干透析液得到一种载药双级脑靶向胶束递药系统（d-t胶束）。
(3)载药无靶向胶束（n-t胶束）：
称取ho-peg-β-cd（14mg），溶于5ml水溶液中，另称取ad-pcl-fitc（9mg）溶于1mldmso中。室温下将dmso溶液逐滴滴入水溶液中，边滴边搅拌。将混合液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，得到空白无靶向胶束水溶液。
称取脱盐阿霉素（1.4mg），溶于0.5mldmso中，将该溶液逐滴滴入空白无靶向胶束水溶液中，边滴边搅拌。搅拌1或7或11或19或28或36或43或48h后，将混合溶液装入透析袋内并置于蒸馏水中透析，最后冻干透析液得到一种载药无靶向胶束（n-t胶束）。
d、双级脑靶向超分子胶束的形貌和粒径分布：
取一滴d-t胶束水溶液滴于覆有碳膜的铜网上，经0.2%(w/v)磷钨酸染色后室温晾干，在透射电子显微镜(tem)下观察其形貌。取1ml胶束水溶液置于样品池中，用光散射粒径分析仪测定胶束在水溶液中的粒径及其分布。
透射电镜（图2a）显示这种基于主客体相互作用形成的胶束呈均匀分布的圆球形结构，粒径仪结果显示胶束的平均粒径为243nm（图2b），表明成功制备了一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统。
实施例2：
一种双级脑靶向聚合物胶束递药系统在制备治疗或预防胶质瘤靶向药物载体中的应用（体内外抗瘤活性的研究），其步骤是：
a、体外抗瘤活性研究：
（1）细胞摄取实验
将c6细胞以5.0×104个细胞/孔的密度接种到24孔板中，将细胞在含有10％fbs的1mldmem中孵育24小时。随后加入游离dox溶液、n-t胶束溶液、d-t胶束溶液（dox含量为5μg/ml）的新鲜培养基后孵育4小时。用pbs洗涤细胞3次后，在荧光显微镜下拍摄c6细胞的荧光照片。同时将细胞用胰酶消化后在pbs中重悬，用流式细胞仪测定c6细胞对三种材料的摄取效率。
同法检测bend.3细胞对三种材料的摄取效率。
荧光显微照片显示在bend.3细胞和c6细胞中，d-t胶束组的荧光强度比n-t胶束组和游离dox组要高，表明ang-2肽和crgd肽能提高两种细胞对d-t胶束的摄取（图3所示）。流式细胞术结果表明，与游离dox和n-t胶束组相比，d-t胶束组在bend.3细胞中的摄取量分别提高了2.50倍和1.37倍，在c6细胞中摄取量分别提高了9.59倍和3.11倍（图4所示），表明bend.3细胞和c6细胞对d-t胶束的摄取量明显高于游离dox和n-t胶束。
（2）细胞毒性实验：
用mmt法检测bd-t胶束、游离dox溶液、d-t胶束、n-t胶束对bend.3细胞和c6细胞的生长抑制作用。将bend.3细胞（或c6细胞）以6.0×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，加入1ml含有10％fbs的dmem中孵育24小时，然后加入200μlbd-t胶束溶液培养48小时，之后加入20μlmtt溶液继续培养4小时。弃去mtt溶液后加入dmso溶液使mtt-甲瓒结晶溶解，测定570nm处的吸光度值。
同法测定游离dox溶液、n-t胶束溶液、d-t胶束溶液的细胞毒性。
mtt结果表明bd-t胶束几乎无细胞毒性，当其浓度达到8mg/ml时，两种细胞的存活率仍有80%左右（图5a所示）。相比之下，d-t胶束对两种细胞的抑制作用明显增强。在bend3细胞中，d-t胶束组的细胞毒性是最强的，当所含dox浓度为0.4μg/ml时，d-t胶束组的细胞存活率为11.1%，游离dox组和n-t胶束组的细胞存活率分别为22.5%和18.8%。在c6细胞中，n-t胶束的细胞毒性略强于游离dox，当dox的浓度为0.4μg/ml时，游离dox组和n-t胶束组的细胞存活率分别为52.9%和45.1%，而相同条件下，d-t胶束组的细胞毒性则显著增加，细胞存活率仅为12.0%（图5b、5c所示）。
以上结果表明d-t胶束可通过ang-2和crgd介导途径穿透bbb并进入胶质瘤细胞内，显著提高游离化疗药物的疗效。
b、体内抗瘤活性研究：
取对数生长期的c6细胞消化计数后用适量pbs缓冲液悬浮，以每只雌性裸鼠侧腹接种1×107个细胞。当皮下移植瘤体积达到50-100mm3后开始治疗。将模型动物随机分为4组（n≥5），分别在第3、6、9、12、15、18、21天尾静脉注射生理盐水、游离dox、n-t胶束和d-t胶束治疗，dox剂量为2.5mg/kg/3d。
如图6所示，生理盐水组的肿瘤生长非常迅速，平均瘤重为2.81±0.45g，游离dox组、n-t胶束组和d-t胶束组治疗后的平均瘤重分别为0.80±0.11g，0.53±0.06g，0.31±0.12g，三组的抑瘤率分别是71.5%，81.1%和88.9%，皮下移植瘤动物实验结果表明d-t胶束因靶向效率高，其疗效要优于游离dox和n-t胶束（图6a、6b、6c所示）。
通过测量治疗后动物体重变化来初步评估不同制剂的体内安全性和耐受性。游离dox组的动物体重下降最明显，表现出最严重的毒副作用。和游离dox组、n-t胶束组相比，d-t胶束组体重变化最小（图6d），这可能是d-t胶束因靶向肿瘤组织而降低化疗药物的毒副作用。
组织学检查结果表明，游离dox组有明显的肝、脾损害，包括肝细胞灶状坏死，脾白髓淋巴细胞减少，脾小体体积缩小，脾窦扩张。而d-t胶束组对主要器官如心、肝、脾等无明显损害（图7）。
综上所述，本发明的d-t胶束组的治疗效果和体内安全性、耐受性等均优于游离dox组和n-t胶束组。经d-t胶束治疗后动物体内肿瘤体积最小，抑瘤率最高，动物体重变化最小，主要脏器损害最小。