miR-144-3p及其靶基因在制备调节人心脏成纤维细胞功能的药物中的应用的制作方法

本发明属生物技术microrna的研究领域，更具体地说，本发明涉及mir-144-3p及其靶基因pten在制备调节人心脏成纤维细胞功能的药物中的应用。

背景技术

急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)是冠状动脉闭塞、血流中断而引起的心肌局部坏死，在中国，每年有超过100万的病人死于急性心肌梗死，因此这个疾病被认为是：“人类健康的第一杀手”。

心肌纤维化是心肌梗死后，心肌完成自我修复的过程，当心肌由于缺血、缺氧引起心肌梗死时，梗死区心肌细胞凋亡，取而代之的是心脏成纤维细胞增殖和以胶原纤维为主的细胞外基质增多，心肌纤维化发生。心肌纤维化的特征为心脏成纤维细胞大量增殖，随后分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞分泌大量胶原等成分聚积于心肌间，导致心肌组织中胶原纤维过度沉积、各型胶原比例失衡和间质与血管周围的蛋白积累过度。

微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类内源性非编码单链小分子rna，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(messengerribonucleicacid，mrna)的3’非翻译区(untranslatedregion，utr)不同程度的互补配对，诱导靶基因mrna降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。

目前国内外尚无关于mir-144-3p对人心脏成纤维细胞功能的调节的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于：确定mir-144-3p及其靶基因对人心脏成纤维细胞功能的调节作用

mir-144-3p在制备调节人心脏成纤维细胞功能的药物中的应用，所述mir-144-3p的核苷酸序列如seqidno:1所示。

首先，本发明通过合成hsa-mir-144-3p模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)检测转染效率。与阴性对照组(inhibitornc组)相比，转染mir-144-3pinhibitor的心脏成纤维细胞(inhibitor组)中的mir-144-3p表达量显著下调；与阴性对照组(mimicsnc组)相比，转染mir-144-3pmimics的心脏成纤维细胞(mimics组)中的mir-144-3p表达量显著上调。

本发明所述mir-144-3p可以来自被分离细胞，或者通过人工合成的方式获得。

本发明通过实验证实，mir-144-3p具有如下功能：促进心脏成纤维细胞的增殖、提高心脏成纤维细胞的迁移能力、促进细胞分化标志基因平滑肌肌动蛋白-α(α-sma)的表达、促进细胞胶原合成标志基因i型胶原(col1a1)和iii型胶原(col3a1)的表达。

本发明还通过targetscan、miranda、rnahybrid3个生物信息学软件预测mir-144-3p靶基因，发现其靶向pten，pten的3’utr区含有mir-144-3p种子区序列结合位点。将pten的野生型3’utr与含有种子序列突变的3’utr区序列连接到真核表达载体pmriglo上，通过双荧光素酶报告基因检测结果发现，野生型pten3’utr上游报告基因受到mir-144-3p调控，而突变型不受调控。另外，采用qrt-pcr与westernblotting在转录水平和翻译水平验证mir-144-3p调控pten的表达，发现mir-144-3p在转录及翻译水平均下调pten的表达。

再合成3对靶基因pten干扰小片段/对照(si-pten-1、si-pten-2、si-pten-3/sirna-nc)，检测其干扰效率。转染干扰小片段到成纤维细胞中，利用qrt-pcr检测干扰rna的干扰效率，筛选干扰效果最好的si-pten-2小片段进行后续实验。

本发明还进行了mir-144-3p及其靶基因pten功能回复验证。检测在成纤维细胞中补充外源sirna-pten后，能否回复由mir-144-3p引起的细胞功能改变。成纤维细胞中共转染mir-144-3pmimic/inhibitor/nc和pten干扰小片段(si-pten-2)，利用edu检测成纤维细胞增殖情况，利用transwell检测成纤维细胞迁移，利用qrt-pcr和westernblotting检测细胞分化标志基因α-sma与胶原合成标志基因col1a1、col3a1的表达情况，发现由mir-144-3p引起的成纤维细胞功能改变可以被pten回复。

因此，mir-144-3p的靶基因pten也可用于制备调节人心脏成纤维细胞功能的药物。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

成纤维细胞的增殖、迁移、分化、胶原合成是心肌纤维化过程中的重要表型变化，本发明第一次证实mir-144-3p、pten对人心脏成纤维细胞的功能调控作用，以及在人心脏成纤维细胞中mir-144-3p与基因pten之间的靶向关系。

附图说明

图1为qrt-pcr检测mir-144-3pmimic和mir-144-3pinhibitor转染效率的结果图，其中a表示mir-144-3pmimic的转染效率，b表示mir-144-3pinhibitor转染效率。

图2是验证mir-144-3p靶向pten，其中，图2a、图2b、图2c分别表示双荧光素酶活性验证，qrt-pcr验证、westernblotting验证。

图3是edu法pten回复mir-144-3p促进成纤维细胞增殖的结果。

图4是transwell分析验证pten回复mir-144-3p促进成纤维细胞迁移的结果。

图5是qrt-pcr、westernblotting验证pten回复mir-144-3p促进成纤维细胞分化与胶原合成的结果，其中，col1a1、col3a1是成纤维细胞胶原合成标志基因；α-sma是细胞分化标志基因。图5a、图5b、图5c分别是col1a1、col3a1、α-sma的qrt-pcr检测结果；图5d、图5e、图5f分别是col1a1、col3a1、α-sma的westernblotting检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例

人心脏成纤维细胞的培养

本实验所用的细胞模型人心脏成纤维细胞来自来自美国sciencellresearchlaboratories。所用培养基为美国sciencellresearchlaboratories提供的心脏成纤维细胞培养基(fibroblastmedium-2)。

(1)实验前准备：a.打开水浴锅，调节温度35.8～37℃；b.超净台开紫外灭菌30min。

(2)从液氮中取出冻存管，迅速浸入37℃水浴锅中，并不时摇动使其尽快融化。

(3)从37℃水浴锅中取出冻存管，外部喷洒75％酒精后转移到超净台，小心打开盖子，用移液枪吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

(4)1000rpm离心5min。

(5)弃上清，加入完全培养基重悬细胞，接种细胞培养瓶，37℃5％co2培养箱静置培养。

(6)24h后更换新的完全培养基，继续培养。

人心脏成纤维细胞的接种和转染

(1)镜下观察心脏成纤维细胞汇合度达到90％时，弃培养基，用预热的含1％双抗(双抗为青霉素和链霉素)的pbs清洗细胞两次；

(2)预热的0.25％胰酶加入培养瓶，放入培养箱中静置2min,显微镜下观察到细胞大部分细胞飘起时，加入终止液(10％fbs的dmem)终止消化。

(3)用枪头轻轻吹打细胞，制成细胞悬液，转移至15ml离心管,1000rpm离心5min。

(4)适量pbs清洗细胞两次。

(5)适量完全培养基重悬细胞沉淀，细胞计数后，均匀分布到每一个孔中，补足完全培养基至推荐的体积，放入培养箱中继续培养。

(6)24h左右观察细胞形态及汇合度，细胞形态良好且汇合度达到70％-90％时，可以用于转染。本发明取第3或第四代传代的心脏成纤维细胞进行转染，转染步骤参照invitrogen公司的3000试剂盒说明书进行；每组设置3个重复；

(7)转染后，细胞在37℃，5％co2培养箱中继续培养；

(8)根据实验目的，在转染后的2-4天收集细胞。

qrt-pcr

细胞中总rna的提取

(1)冷pbs清洗贴壁细胞2-3次，倾斜细胞培养皿，吸净pbs，加入1mltrizol，静置5min，直至镜下观察到细胞全部裂解后，用枪头吹打均匀并转移到1.5mlrnase-freeep管。

(2)每管加入200ul预冷氯仿(trizol组织液:氯仿为5:1)，剧烈震荡15-30s，冰上放置5min后，12000rpm，4℃，离心15min；液体分三层：上层为无色的rna，中层为含有酚-氯仿的白色水相，下层为浅红色。小心吸取上层无色液相(避免触及中间相)。将上层液相(约300ul)移入新的1.5m1ep管中，加入等量异丙醇溶液(300ul)，轻轻上下颠倒摇匀10次，冰上静置10min。12000rpm，4℃，离心10min。

(3)弃上清、留沉淀，沿管壁加入预冷的1ml75％乙醇-depc以洗涤rna，12000rpm，4℃，离心5min后尽量去上清。

(4)将液体吸干，室温自然干燥5-10min，同时避免rna沉淀干燥过度。

(5)根据沉淀量，加入30-50微升depc水以溶解rna沉淀。分光光度计测定rna浓度和纯度。

mrna与mirna逆转录反应分别采用takaraprimescript^tmrtmastermix(perfectrealtime)kit与toyoborevertraaceqpcrrtkit。

mrna与mirna的qrt-pcr分别采用thermothermoscientificmaximasybrgreenqrt-pcrmastermix(2x)，roxsolutionprovidedmix和toyobothunderbirdsybrqpcrmix。。以2^-△△ct法计算mrna与mirna的相对表达量。

westernblotting

(1)人心脏成纤维细胞总蛋白的提取：细胞转染后48h，用pbs清洗细胞3次，6孔板细胞每孔加入100～200μl蛋白裂解液进行蛋白质裂解，细胞裂解液转移到1.5mlep管中。12000rpm，4℃离心15min，取上清至新的1.5mlep管中，低温保存防止蛋白降解。

(2)sds-page电泳：sds-page电泳：bca法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5:1混合，煮沸5min。sds-page电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。

(3)转膜

甲醛浸泡聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)5min，清水冲洗后与吸附滤纸一起用转膜液浸泡。从正极开始依次按照吸附滤纸(4张)——凝胶——pvdf膜——吸附滤纸(4张)顺序叠放，合上负极。装入电泳槽中。转膜过程在冰上进行，恒流300ma，根据目的蛋白不同选择转膜时间。

(4)蛋白检测与结果分析

转膜完成后，将膜放入1×tbst中漂洗，用5％脱脂奶粉室温下封闭2h。1×tbst洗膜，用抗体稀释液稀释所需抗体，4℃孵育过夜。回收一抗(pten一抗：α-sma一抗：col1a1一抗：col3a1一抗：)，1×tbst洗膜。孵育二抗(二抗：)，室温孵育2h。1×tbst洗膜。用ecl化学发光法进行检测，用bio-rad曝光系统曝光并采集图片。使用imagej进行电泳条带灰度值测定。

实验例1心脏成纤维细胞增殖实验

本发明中edu细胞增殖实验参照广州市锐博生物科技有限公司的cell-lighttmeduapollo567invitrokit进行。具体步骤如下(以96孔板为例)：

(1)用细胞培养基按1000:1的比例稀释edu溶液，制备适量50umedu培养基；

(2)每孔加入100ul50umedu培养基孵育2小时，弃培养基；

(3)pbs清洗细胞1～2次，每次5分钟；

(4)每孔加入50ul细胞固定液(含4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30分钟，弃固定液；

(5)每孔加入50ul2mg/ml甘氨酸,脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

(6)每孔加入100ulpbs，脱色摇床清洗5分钟，弃pbs；

(7)每孔加入100ul的1×apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

(8)加入100ul渗透剂(0.5％tritonx的pbs)脱色摇床清洗2～3次，每次5分钟，弃渗透剂；

(9)用去离子水岸100:1的比例稀释试剂f，制备适量1×hoechst3342反应液，避光保存；

(10)每孔加入100ul1×hoechst3342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

(11)每孔加入150ulpbs清洗1～3次；

(12)每孔加入100ulpbs保存待用；

(13)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。

实验例2心脏成纤维细胞迁移实验

本发明使用试剂耗材：transwell细胞培养板(bd,ref353097)

(1)将细胞培养板放置于室温，pbs润洗培养板内细胞2次，去除培养板内pbs；

(2)加入不含edta的胰酶消化细胞，用100ul无血清细胞培养基重悬细胞，计数1×10⁵个细胞，加入transwell细胞培养板的小室上室，下室加入600ul完全培养基；

(3)在37℃，5％co2孵育12-48h，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定20min，pbs洗涤一次，结晶紫染色10min，pbs洗涤一次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔，并拍照统计。

实验例3荧光素酶报告基因活性检测

按照promega公司的dual-reporterassaysystem(e1960)试剂盒说明书在荧光化学发光微孔板检测仪上操作，具体步骤如下：

(1)5×plb室温解冻后，使用ddh2o按1:4的比例将其稀释成1×plb；

(2)移液枪吸出培养基。沿孔壁慢慢地加入200ulpbs，轻轻晃动培养板，吸除pbs，此pbs清洗步骤重复两遍，全程注意动作轻柔，防止将细胞吸走；

(3)每孔加入100ul1×plb；摇床上孵育10min，使细胞充分裂解；

(4)将裂解的细胞取75ul转移到96孔酶标板中，每孔加入75ullarⅱ溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测fireflyluciferase荧光强度；

(5)再加入75ulstop&glo溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测ranillaluciferase荧光强度；

(6)fireflyluciferase与ranillaluciferase的比值即为萤火虫荧光素酶相对活性。(每个组4个重复)。

结果分析：

1、合成hsa-mir-144-3p模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)检测转染效率。与阴性对照组(inhibitornc组)相比，转染mir-144-3pinhibitor的心脏成纤维细胞(inhibitor组)中的mir-144-3p表达量显著下调；于阴性对照组(mimicsnc组)相比，转染mir-144-3pmimics的心脏成纤维细胞(mimics组)中的mir-144-3p表达量显著上调，结果如图1所示。上述mirna产品由广州市锐博生物科技有限公司合成。

2、生物信息学软件预测hsa-mir-144-3p的靶基因，实验验证其靶基因为pten。mirbase、targetscan、pitar、rnahybrid等生物信息学软件预测mir-144-3p的靶基因，发现其靶向pten。pten的3’utr区域含有mir-144-3p的结合位点，将pten野生型3’utr和含有种子区碱基突变的3’utr连接到真核表达载体pmirglo中，通过双荧光素酶活性检测，发现野生型pten(wt-pten)3’utr上游报告基因受到mir-144-3p调控，而突变型pten(mut-pten)不受mir-144-3p调控。还利用qrt-pcr与westernblotting验证mir-144-3p在转录及翻译水平调控pten的表达，发现mir-144-3p在转录及翻译水平均下调pten表达。结果如图2所示。

3、制备3对靶基因pten干扰小片段/对照(sirna-pten),检测其干扰效率。转染干扰小片段到成纤维细胞中，采用qrt-pcr手段，筛选干扰效果较好的sirna-pten-1进行后续实验。上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成。

4、mir-144-3p与靶基因pten对细胞增殖的影响。在成纤维细胞中补充外源pten后，能否回复mir-144-3p对细胞增殖的影响。成纤维细胞中共转染mir-144-3pmimic/nc/inhibitor和sirna-pten，通过edu法检测细胞增殖情况，发现与空白对照组和nc组相比，mir-144-3pmimic组心脏成纤维细胞的增殖能力明显增强，mir-144-3pinhibitor组细胞增殖能力明显降低，mir-144-3pinhibitor+sirna-pten组细胞增殖能力无明显变化，sirna-pten组与mir-144-3pmimic组一样，细胞增殖能力增强，这说明mir-144-3p引起的促进细胞增殖功能能够被pten回复。结果如图3。实验分组为：(1)blank、(2)nc、(3)mir-144-3pmimic、(4)mir-144-3pinhibitor、(5)mir-144-3pinhibitor+sirna-pten、(6)sirna-pten。

5、mir-144-3p与靶基因pten对细胞迁移的影响。与空白对照组和nc组相比，mir-144-3pmimic组心脏成纤维细胞的迁移能力明显增强，mir-144-3pinhibitor组细胞迁移能力明显降低，mir-144-3pinhibitor+sirna-pten组细胞迁移能力无明显变化，sirna-pten组细胞迁移能力增强，这说明mir-144-3p能促进成纤维迁移，由mir-144-3p引起的促进细胞迁移功能能够被pten回复。结果如图4。

6、mir-144-3p与靶基因pten对细胞分化的影响。通过qrt-pcr与westernblotting技术，检测细胞分化标志基因平滑肌肌动蛋白-α(α-sma)的表达情况，发现过表达mir-144-3p(mir-144-3p组)促进了α-sma的表达，且mir-144-3p引起的α-sma表达上调能够被pten回复；结果如图5所示。

7、mir-144-3p与靶基因pten对细胞胶原合成的影响。通过qrt-pcr与westernblotting技术，检测细胞胶原合成标志基因ⅰ型胶原(col1a1)、ⅲ型胶原(col3a1)的表达情况，发现过表达mir-144-3p(mir-144-3p组)促进了col1a1、col3a1的表达，且mir-144-3p引起的col1a1、col3a1表达上调能够被pten回复，结果如图5所示。

根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110>广东省实验动物监测所

华南农业大学

<120>mir-144-3p及其靶基因在制备调节人心脏成纤维细胞功能的药物中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna/rna

<213>mir-144-3p(mir-144-3p)

<400>1

uacaguauagaugauguacu20