本发明属生物
技术领域：
：，涉及干细胞移植和局部免疫抑制剂，具体涉及一种锚定纳米药物载体的水凝胶体系及其在干细胞移植和免疫抑制剂递送系统中的用途，所述的递药系统通过锚定纳米药物载体于水凝胶内部，实现局部缓释免疫抑制药物，降低局部免疫排斥反应、提高水凝胶内干细胞的存活，从而提高干细胞移植治疗疾病的效果。
背景技术：
：：资料显示干细胞治疗是当今再生医学领域的研究热点之一，其治疗基础是利用干细胞增殖速度快，多向分化的潜能，从而促进组织的修复和再生(laflamme,m.a.andc.e.murry,regeneratingtheheart.naturebiotechnology,2005.23(7):p.845-856)；然而，研究显示，干细胞移植在临床上依然存在许多问题(ratanatharathorn,v.,etal.,phaseiiistudycomparingmethotrexateandtacrolimus(prograf,fk506)withmethotrexateandcyclosporineforgraft-versus-hostdiseaseprophylaxisafterhla-identicalsiblingbonemarrowtransplantation.blood,1998.92(7):p.2303-14)，其主要原因在于：①干细胞移植存活率较低，且机体缺乏特定生长因子促进干细胞的增殖分化；②移植干细胞普遍存在免疫原性，免疫排斥反应不仅影响了干细胞的存活，还会诱发严重的移植物抗宿主病，威胁病人生命；因此，如何提高移植干细胞存活率，减少机体免疫排斥反应，是干细胞移植研究领域急需攻克的难题。目前认为，递送免疫抑制药物是一种最通用的抑制移植物免疫排斥反应的方法。然而系统给予免疫抑制药物容易引发严重副作用，如感染，肾衰竭等等，局部缓释免疫抑制药物可以减少其副作用，且通过缓释可以实现长期的免疫抑制效果(saundersrn,metcalfems,nicholsonml.rapamycinintransplantation:areviewoftheevidence.kidneyint,2001；59:3-16.)，因此，利用递药系统实现免疫抑制剂的局部缓释将有利于减少免疫抑制药物的副作用，降低移植物免疫排斥反应的发生。有研究利用聚合物纳米粒包载药物并实现药物缓释的策略(zhu,g.,s.r.malleryands.p.schwendeman,stabilizationofproteinsencapsulatedininjectablepoly(lactide-co-glycolide).natbiotechnol,2000.18(1):p.52-7.)，然而，研究发现，载药纳米粒在病灶部位容易吸收流失，导致局部缓释药物的损失(nance,e.a.,etal.,adensepoly(ethyleneglycol)coatingimprovespenetrationoflargepolymericnanoparticleswithinbraintissue.scitranslmed,2012.4(149):p.149ra119.)。此外，如何高效的包载免疫抑制剂，减少局部纳米粒的流失，提高免疫抑制剂向病灶部位的递送是研究难点。目前尚无通过锚定方法固定载药纳米粒在病灶部位的相关研究，亦无利用水凝胶锚定纳米药物储库递送免疫抑制剂疗的相关专利申请。基于现有技术的基础，以及局部缓释免疫抑制剂在干细胞移植过程中的重要作用，本发明拟提供一种锚定纳米药物载体的水凝胶体系及其在干细胞移植和免疫抑制剂递送系统中的用途。本发明拟通过构建锚定纳米药物载体的水凝胶体系，采用纳米药物载体包载免疫抑制剂他克莫司，再利用自组装多肽rada16的修饰纳米粒，将纳米粒锚定在rada16水凝胶内部，通过注射水凝胶，实现纳米药物储库在局部病灶部位长期的释放药物；以及通过缓释的免疫抑制剂，降低内皮祖细胞(epcs)移植后的免疫反应，从而减少宿主对epcs的清除。技术实现要素：本发明的目的在于基于现有技术的基础，提供局部长期免疫抑制剂缓释递送系统，涉及免疫抑制剂和纳米药物递送系统的药物组合物及其用途，以及纳米药物递送系统和水凝胶的组合物及其用途，尤其涉及一种锚定纳米药物载体的水凝胶体系及其在干细胞移植和免疫抑制剂递送系统中的用途；该锚定纳米药物载体的水凝胶体系以定位缓释免疫抑制来调控干细胞移植过程的免疫排斥反应。本发明通过构建锚定纳米药物载体的水凝胶体系，采用纳米药物载体包载免疫抑制剂他克莫司，再利用自组装多肽rada16的修饰纳米粒，将纳米粒锚定在rada16水凝胶内部，通过注射水凝胶，实现纳米药物储库在局部病灶部位长期的释放药物；以及通过缓释的免疫抑制剂，降低内皮祖细胞(epcs)移植后的免疫反应，从而减少宿主对epcs的清除。本发明中，不局限于聚乳酸-乙醇酸(plga)聚合物材料，其他材料亦可通过rada16修饰来锚定于水凝胶内部；也不仅局限于包载他克莫司，其他免疫抑制药物亦可利用该系统递送。具体的，本发明所述的锚定纳米药物载体的水凝胶体系由自组装多肽修饰的纳米药物载体和多肽水凝胶组成，其中通过共价连接自组装多肽在纳米药物载体表面实现其与自组装水凝胶的锚定。本发明中，水凝胶材料为rada16自组装多肽；锚定的纳米药物载体为载免疫抑制剂的纳米递药系统；该递药系统中免疫抑制药物为小分子免疫抑制剂，锚定的纳米制剂为rada16多肽修饰的脂质体、纳米粒、聚合物泡囊、聚合物胶束、固体脂质纳米粒，药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米载体内，所述的纳米递药系统粒径为10-300nm。所述水凝胶材料rada16多肽是按acn-radaradaradarada-conh2序列合成，该多肽能在电解质的作用下通过静电引力，自组装形成纳米纤维并最终形成水凝胶；该凝胶含水量高，可在生理环境下自组装，并且可以给干细胞提供三维的培养环境从而促进干细胞的移植分化(参见文献holmestc,delacalles,sux,etal.extensiveneuriteoutgrowthandactivesynapseformationonself-assemblingpeptidescaffolds.pnatlacadsciusa.2000；97:6728-33.)，本发明的实施例中，更优选radaradaradaradaggc序列作为合成材料来修饰纳米药物载体。优选的，本发明中纳米药物为载免疫抑制剂物的纳米递药系统，其中，药物以包裹或共价连接的方式包载在纳米载体内，所述的纳米递药系统粒径为10-300nm；纳米递药系统表面可以连接锚定分子rada16多肽，通过与其他多肽的自组装作用来锚定纳米粒于水凝胶内部。本发明中，纳米载体为脂质体、纳米粒、聚合物泡囊、聚合物胶束、固体脂质纳米粒；其中优选的纳米载体为表面聚乙二醇修饰的脂质体、纳米粒和聚合物胶束。本发明中，制备纳米载体的材料为白蛋白、聚乳酸(pla)、聚乳酸-羟基乙酸(plga)、聚己内酯(pcl)、磷脂、聚乙二醇聚乳酸共聚物(peg-pla)、聚乙二醇聚乳酸-羟基乙酸共聚物(peg-plga)、聚乙二醇聚己内酯共聚物(peg-pcl)、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)中的一种和几种。本发明中所述的免疫抑制剂，包括他克莫司tacrolimus(fk506)及其衍生物，环孢菌素csa类，雷帕霉素rapamycin(rpm)及其衍生物sdzrad、mizoribine等。进一步，本发明通过以下技术方案实现针对干细胞移植的免疫抑制剂递药干预策略研究：1)合成rada16修饰的纳米药物载体，对其理化性质进行表征，如采用zeta/激光粒度仪测定纳米粒的平均粒径和电位，透射电镜观察其形态；2)采用荧光标记的方法标记纳米药物载体，通过研究其从rada16水凝胶中的泄漏情况来评价锚定效果；3)采用nta纳米追踪系统研究锚定纳米粒在水凝胶中的布朗运动；4)采用红外染料dir标记纳米药物后，通过小动物活体成像仪评价该锚定纳米药物载体的水凝胶体系给药后，纳米药物在实验组和对照组的局部滞留时间的差异；5)通过与epcs和外周血单个核细胞(pbmcs)共培养评价该锚定纳米药物载体的水凝胶体系体外抑制免疫反应的效果；6)通过考察epcs移植后体内的存活来评价该锚定纳米药物载体的水凝胶体系内抑制局部免疫排斥反应的效果；7)考察epcs移植后促进血管新生的作用来评价该锚定纳米药物载体的水凝胶体系抑制免疫反应的药效；8)考察局部cd4，cd8细胞及igg，igm抗体的聚集进一步确认局部免疫抑制效果。本发明提供了一种锚定纳米药物载体的水凝胶体系及其用途，该系统以免疫抑制剂为药物用于抑制免疫排斥反应；进一步，本发明为临床实践提供了一种针对干细胞移植的干预策略，该策略包括在水凝胶上锚定纳米药物载体，增加纳米药物在干细胞移植的局部的滞留时间，并减弱纳米药物在局部的扩散流失，从而提高免疫抑制剂的局部长期缓释。本发明优点有，通过锚定纳米药物载体增加纳米药物在局部的滞留和蓄积，实现长期的定位的缓释药物，从而提高免疫抑制剂对干细胞移植的存活和治疗效果，降低其副作用。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。附图说明图1，以他克莫司为模型药物，锚定纳米药物载体的水凝胶体系递送免疫抑制剂干预机体对epcs干细胞免疫排斥反应的示意图：其中，他克莫司被包载在纳米载体中，纳米药物通过自组装多肽rada16的修饰锚定于rada16水凝胶内；epcs作为模型细胞可以3d培养在rada16水凝胶内；通过缓释他克莫司来抑制免疫系统对epcs的攻击。图2，纳米药物载体的表征结果，图a为电镜结果(rnps为rada16多肽修饰的纳米药物载体，t-rnps为载他克莫司药物的rnps)，图b为粒径分布，图c为zeta电位和粒径数值。图3，rada16修饰的纳米药物载体(rnps)在rada16水凝胶中的泄漏，未修饰的纳米载体nps为对照。图4，rnps在水凝胶内部的锚定效果评价，图a为不同纳米载体布朗运动轨迹，图b为不同纳米载体漂移速率，图c为rnps水凝胶体系在小鼠体内的滞留评价。图5，锚定纳米药物载体的水凝胶体系(rnps水凝胶体系)的表征，图a为扫描电镜观察rnps锚定于rada16水凝胶内的形貌，图b该rnps水凝胶体系体外释放他克莫司的释放曲线。图6，该锚定纳米药物载体的水凝胶体系体外抑制免疫反应，图a为rnps水凝胶体系体外抑制pbmcs细胞增殖的效果，图b～d为该rnps水凝胶体系抑制免疫因子释放的结果。对照组为epcs+凝胶组，epcs+载游离药物凝胶组。图7，rnps水凝胶体系对epcs的毒性影响，图a为游离他克莫司对epcs的mtt试验。图b为正常epcs细胞形貌，图c为游离药三维培养epcs的形貌，图d为rnps水凝胶体系三维培养epcs的形貌，图e为epcs凋亡定量结果。图8，rnps水凝胶体系对移植的epcs的存活的影响，图a为活体成像图片，图b为荧光半定量结果。对照组为epcs+凝胶组，epcs+载游离药物凝胶组。图9，rnps水凝胶体系对移植的epcs药效的影响，图a为激光多普勒灌流考察不同组对血流灌注的效果，图b为缺血侧/健康灌注比例定量结果。对照组为模型鼠，epcs+凝胶组，epcs+载游离药物凝胶组。图10，rnps水凝胶体系抑制细胞免疫的效果，图a为cd4细胞免疫荧光照片，图b为cd8细胞免疫荧光照片。对照组为健康鼠，epcs+凝胶组，epcs加载游离药凝胶组。图11，rnps水凝胶体系抑制体液免疫的效果，图a为igg抗体免疫荧光照片，图b为igm抗体免疫荧光照片。对照组为健康鼠，epcs+凝胶组，epcs+载游离药凝胶组。图12，rnps水凝胶体系减少因缺血造成的炎症和纤维化，对照组为模型鼠，epcs+凝胶组，epcs+载游离药凝胶组。图13，利用巯基与马来酰亚胺的迈克加成反应，合成plga-peg-rada16材料。具体实施方式：本实验例选择他克莫司作为免疫抑制剂的代表，探讨锚定纳米载体的水凝胶体系(rnps水凝胶体系)缓释他克莫司对epcs移植后局部免疫反应的调控作用(如图1所示)；以下实施例采用的实验数据统计方法：多组比较采用一步anova法，两组比较采用双侧t检验法。实施例1：合成rada16修饰的纳米药物载体本实施例采用常见的可生物降解聚合物之一plga，通过修饰获得马来酰亚胺-聚乙二醇(mal-peg)修饰的plga材料，利用巯基与马来酰亚胺的迈克加成反应，合成了plga-peg-rada16材料，具体操作如下：5mgrada16ggc多肽溶于5ml水中；50mgplga-peg-maleimide溶于5mldmf中；两者混合后500rpm搅拌过夜，透析去除游离的rada16多肽后，合成产物用氯仿萃取后，氮气吹干去除溶剂后获得，通过核磁氢谱分析，马来酰亚胺特征峰消失，证明合成成功(如图13所示)；载他克莫司的plga纳米粒(t-rnps)制备方法为单次乳化溶酶蒸发法；具体操作如下：2mgplga-peg-rada16，18mgplga和1mg他克莫司用1ml二氯甲烷溶解后加入到3ml0.5％的胆酸钠溶液中，然后冰水浴1s/1s脉冲超声30次，功率为200w。旋转蒸发除去二氯甲烷后即得未修饰纳米粒(np)，电镜下纳米粒子大小均一，分散性好，表面光滑呈规则圆球形(如图2a所示)，粒度/电位测定仪结果显示纳米粒粒径为130.1±9.4nm(如图2b所示)，电位为-20.1±1.8mv，适合药物均匀分布；荧光标记的纳米药物(rnps)制备方法同上，只需要将一定量的荧光素替代他克莫司用二氯甲烷溶解后同法制备纳米药物；通过离心测定纳米沉淀中的药物含量确定该plga纳米粒的包封率及载药量，包封率高达98.5％，载药量为4.6％。实施例2：rnps在rada16凝胶中锚定效果评价100μl的rnps与900μl的rada16溶液(0.2％w/v)混合后注入nanosight仪器中，通过nanosight观察其布朗运动，并计算其漂移速率，以未修饰的plga纳米粒(nps)作为对照。结果表明未修饰的nps在凝胶中的布朗运动(1245±153nm/s)显著快于rnps(478±94nm/s)，说明rnps的扩散速度较慢，在rada16凝胶中有较强的滞留作用(如图4所示)；rnps在rada16凝胶中的泄露结果表明，rnps的泄露也显著低于未修饰的nps，进一步说明rnps在rada16凝胶中有较好的锚定效果(如图3所示)，将rnps与rada16凝胶注射入裸鼠腿部肌肉，通过ivis小动物活体成像系统于不同时间点观察rnps的在注射部位的滞留情况，结果表明rnps在体内的局部的滞留时间也显著长于nps(如图4c所示)，最后通过扫描电镜观察rnps在rada16凝胶中的形貌，结果表明有大量的纳米粒锚定在水凝胶内部(如图5a所示)；结果表明rnps可以锚定于rada16凝胶中，rnps水凝胶体系有局部长期递送药物的可能性。实施例3：t-rnps在rada16水凝胶中缓释他克莫司实验将420μg的t-rnps与0.3ml的rada16水凝胶混合，置于1.5ml离心管中，加入1ml的含0.5％(v/v)吐温80的pbs作为释放介质，将该离心管置于37℃，100rpm条件下，于取样时间点取样1ml后补偿1ml释放介质。测定释放介质中的他克莫司量，即为释放量，并计算累积释放率，结果表明，t-rnps组28天累积释放了77％的他克莫司，相比较游离他克莫司组，该释放更持久和缓慢(如图5b所示)。实施例4：rnps水凝胶体系体外抑制免疫反应实验采用pbmcs细胞联合培养模型考察rnps水凝胶体系抑制免疫反应的效果。将模型细胞epcs三维培养在rada16溶液中，然后加入t-rnps，胶凝后，3天换液一次。epcs三维培养7天，14天，21天后，该凝胶系统与1x106pbmcs共培养5天，测定pbmcs的细胞数量考察其增殖情况；同时提取培养液上清，测定其中il-2，il-6，ifn-r的含量来评价免疫反应(如图6所示)；结果表明t-rnps组相比于游离药物组，可以长期的抑制pbmcs的增殖，并可以长期抑制il-2，il-6，ifn-r的分泌，说明其有长期免疫抑制的功能。实施例5：rnps水凝胶体系降低他克莫司对epcs细胞毒性实验首先通过mtt试验，考察不同浓度他克莫司对epcs干细胞的毒性，结果表明50μg/ml的他克莫司会显著印象epcs的活性；然而通过t-rnps的包载并锚定在水凝胶体系内缓释，三维培养的epcs的形态与正常细胞一致，且凋亡显著低于游离药组，说明t-rnps不仅可以通过缓释他克莫司来长期抑制免疫反应，还可以通过缓释来降低他克莫司对正常细胞的毒性(如图7所示)。实施例6，rnps水凝胶体系凝胶体内抑制免疫反应实验首先通过转染luciferase荧光素酶来标记epcs，将1x106荧光素酶标记的epcs联合420μg的t-rnps和200μl的rada16水凝胶移植进小鼠体内后，通过小动物活体成像观察epcs的存活来评价rnps水凝胶体系在体内免疫抑制效果，结果表明，游离药物组的细胞信号强度3天后仅为(6.53±3.1×107p/s/cm2/sr，～15.2％)，而t-rnps组的细胞信号高达(37.4±4.2×107p/s/cm2/sr，～105.1％)，说明t-rnps可以通过长期抑制免疫排斥作用而提高epcs移植后的存活(如图8所示)；通过结扎股动脉，建立小鼠下肢缺血模型，然后移植1x106epcs干细胞联合420μg的t-rnps和200μl的rada16水凝胶移植进小鼠体内后，考察epcs促进血管新生的作用，结果表明，t-rnps组在治疗21天后，可以显著增加血流灌注，受损侧灌注恢复高达0.91±0.03，相比于模型组(0.36±0.07)，游离药组(0.56±0.09)，t-rnps组可以显著增加epcs的修复效果(如图9所示)；通过免疫荧光染色，进一步表明rnps水凝胶体系凝胶可以抑制cd4细胞、cd8细胞免疫聚集；并抑制体液免疫中igg抗体，igm抗体的分泌；通过cd31新生血管的染色和he染色，masson染色表明该系统可以减少引缺血造成的炎症和纤维化(如图10-12所示)。当前第1页12当前第1页12