本发明属于生物医药技术、纳米医药及可再生材料的应用领域，具体涉及以棒状纤维素纳米晶为载体、以酸性环境敏感的化学键为链接单元的纳米前药系统及制备方法和应用。可再生生物材料纤维素纳米晶体作为构建纳米前药的载体，其优点在于其良好的生物相容性有利于细胞内吞，其棒状的形状有利于增强细胞内吞。病灶处微酸性环境敏感可断裂的化学键的引入能够实现定点的药物控制释放。
背景技术：
随着全球环境问题日益凸显，人类与致癌性相关的行为活动增加，全球肿瘤发病率持续升高。化疗依然是目前治疗肿瘤的主要手段之一，但因自身结构和生理分布等诸多的局限性限制了其疗效的进一步提高，如严重的毒副作用、选择性差、肿瘤细胞易对其产生多药耐药性等。
通过自组装等方法构建的纳米药物载体(例如脂质体，胶束等等)可充分利用实体瘤的高渗透和长滞留效应(epr效应)，使药物富集在肿瘤组织。但该类载体形状难以保持，容易在血液循环中破裂而导致抗肿瘤药物提前释放，无法实现药物定点释放和治疗。同时该类载体还存在对肿瘤组织微酸性环境敏感度不够等缺陷，到达肿瘤组织后不能及时释放抗肿瘤药物，治疗效果有限。
纤维素纳米晶(cnc)是除去天然纤维中非晶区，保留下晶区而得的纤维素纳米材料，属于由纤维素衍生的三大纳米材料之一(纳米纤维素依据制备方法可分为，纤维素纳米晶，微晶纤维素和细菌纤维素)。纤维素纳米晶是棒状纳米颗粒，在动物体内和细胞中可以很好的保持其棒状晶体结构。计算机模拟和理论研究表明：与球形纳米药物比较，棒状纳米药物有利于增强细胞吞噬。
将纤维素纳米晶体用于制备酸性敏感的纳米前药系统，可以发挥其良好的生物相容性、纳米尺寸效应以及棒状晶体的形状效应，增强细胞内吞提高治疗效果。
技术实现要素：
为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供一种棒状纤维素纳米晶作为载体，以对肿瘤组织微酸性环境敏感的酰胺键为连接单元的纳米前药系统。该纳米前药系统凭借其合适的粒径大小，利用肿瘤组织处的高渗透长滞留效应，在病灶处被动靶向富集。同时载体的棒状形貌亦有利于细胞内吞，酸性环境敏感的酰胺键及时释放药物，使得该纳米前药系统具备提高抗肿药物治疗效果并降低其毒副作用的可能。本发明构建了“病灶组织处微酸性环境敏感，细胞内吞增强”的纳米前药系统。本发明制备的纳米前药具备良好的定点及时释放治疗药物的能力，良好的细胞内吞以及细胞增殖抑制能力。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一种纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药系统，其特征在于，该前药系统包括棒状纤维素纳米晶、连接单元及药物，棒状纤维素纳米晶为载体、酸性环境敏感的连接单元连接药物，具有下式结构：
其中，所述药物为阿霉素、丝裂霉素、盐酸吉西他滨、表阿霉素、放线菌素d、吡柔比星；所述连接单元为酸性环境敏感的连接单元，具体为：β-羧基-酰胺键。
所述酸性环境敏感的连接单元是在病灶微环境下可以实现酸性环境敏感降解断裂释放治疗药物。
一种纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感的纳米前药系统的制备方法：该方法包括以下步骤：
(1)纤维素纳米晶表面氨基化(cnc-nh2)
将纤维素纳米晶分散在1m的naoh溶液，纤维素分散液浓度控制在(0.01-0.02)g/ml，超声(30-60)min，逐滴加入环氧氯丙烷(0.01-0.2)mmol/g，温度控制在(55-65)℃范围内，搅拌2h，透析，直到透析内液的ph值在12左右；采用50％(w/v)的naoh溶液调节透析袋内溶液ph值，加入浓氨水，纤维素浓度控制在(0.05-0.2)g/ml；搅拌，透析，直到透析液达到ph值在(7-7.4)后冷冻干燥；低温冷藏；得到表面氨基化的纤维素纳米晶cnc-nh2，其具有下式结构；
(2)药物与连接单元反应
将药物溶于无水二氯甲烷中形成a溶液，浓度控制在(0.5-2)mg/ml，逐滴加入三乙胺避光，氮气保护，搅拌(2-6)h；称取连接单元化合物，溶于无水二氯甲烷，超声(20-60)min，逐滴加入到a溶液中，避光，氮气保护，室温搅拌(8-24)h；减压蒸馏除二氯甲烷，柱层析分离，流动相为醇胺溶液和二氯甲烷；高效液相色谱柱检测纯度为98％，减压蒸馏除二氯甲烷得到纯品cad；其中，药物与三乙胺的摩尔比为1∶16；药物与连接单元的摩尔比为1∶4；流动相体积比为∶甲醇胺∶二氯甲烷＝1∶500；制备得到产物b待用；
(3)制备纤维素纳米晶为载休的酸性环境敏感纳米前药
将步骤(2)中的产物b溶于无水dmso中，加入草酰氯，避光室温搅拌1h后，加入氨基化的纤维素纳米晶，超声(20-60)min，避光，氮气保护，室温搅拌；高速离心，除上清后，dsmo洗涤并离心三次，弃上清，保留下层沉积物，冷冻干燥得所述纤维素纳米晶为载休的酸性环境敏感纳米前药；其中，产物b和草酰氯的摩尔比为1∶1；产物b和氨基化的纤维素纳米晶的质量比为1∶3。
上述纤维素纳米晶为载休的酸性环境敏感纳米前药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明制备纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感的纳米前药，凭借纤维素纳米晶的纳米尺寸效应，具有良好的被动靶向能力；同时利用荧光成像实时检测细胞内吞和药物分布的能力；并在病灶内微环境下敏感降解及时解释放治疗药物，具备了环境响应释放药物的能力；以及棒状效应增强的细胞内吞和良好的肿瘤细胞增殖抑制能力。
附图说明
图1为纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感释药的纳米前药系统结构示意图。
图2为cnc-cad制备路线图；
图3为cad的质谱图；
图4为cad的高效液相色谱图；
图5为cnc-cad的x射线衍射图；
图6cnc-cad和cnc在纯水中分散稳定性图；左图：从左到右依次为1mg/ml的cnc-cad；cnc和diwater；右图为：由左到右分别为1mg/ml的cnc-cad和cnc；
图7cnc，cnc-nh2，cnc-cad的透射电镜图；
a：cnc的长度在(200-400)nm范围，宽度在(10-20)nm范围；b：cnc-nh2的长度约为200nm，宽度为5-10nm；c：cnc-cad的长度约为200nm，宽度为5-10nm；
图8为盐酸阿霉素标准工作曲线图；
图9为cnc-cad在不同ph值下的代谢曲线图；
图10为dox，cnc-cad，cnc的kb细胞增值抑制实验结果曲线图；
图11为nh4cl预孵育后，cnc-cad作用kb细胞2h后的激光共聚焦电子显微镜照片；
从左到右，图片依此为：白光，dox，hoechst，叠加(白光，dox和hoechst图叠加)；
图12为cnc-cad作用kb细胞2h后的激光共聚焦电子显微镜照片；
从左到右，图片依此为：白光，dox，hoechst，叠加(白光，dox和hoechst叠加)；
图13为流式细胞术结果，dox和cnc-cad在kb细胞株上的内吞效果对比图；
图14为cnc-cad的结构示意图和溶酶体内低ph控制的dox细胞内释放过程示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
本发明是一种以纤维素纳米晶为载体的、酸性环境敏感释药的纳米前药。天然生物纳米材料纤维素纳米晶作为载体可以使得该纳米前药被动靶向富集于病灶处(肿瘤组织)；同时凭借纤维素纳米晶良好的生物相容性和棒状形貌的形状效应，能够显著增强细胞内吞，进入细胞后酸性环境敏感的酰胺键在溶酶体酸性环境中可断裂释放出游离的药物阿霉素；药物阿霉素进入细胞核后干扰核酸复制、阻断细胞增殖。所述纳米前药结构如下式：
其中，酸性环境敏感的连接单元的结构如下式：
本发明同时提出了一种纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感的纳米前药系统的制备方法：所述方法包括以下步骤：(1)制备氨基修饰的纤维素纳米晶；(2)药物阿霉素和顺式乌头酸酐反应得到中间产物cad；(3)cad和氨基化的纤维素纳米晶经缩合反应制备了纳米前药cnc-cad。
具体实施步骤如下：
第一步：纤维素纳米晶表面氨基化(cnc-nh2)
将纤维素纳米晶分散在1m的naoh溶液，逐滴加入环氧氯丙烷，温度控制在(55-65)℃范围内，搅拌后，透析，直到透析内液的ph值在12左右；采用50％(w/v)的naoh溶液调节透析袋内溶液ph值，加入浓氨水，搅拌，透析，直到透析液达到ph值在(7-7.4)后冷冻干燥；低温冷藏；得到表面氨基化的纤维素纳米晶。
第二步：药物阿霉素开环顺式乌头酸酐制备cad及其表征
阿霉素3号位氨基与顺式乌头酸酐发生开环反应，生成酸性环境中可断裂的β-羧基-酰胺键，质谱(ms)去监测和表征，结果见图附图3；利用高效液相色谱法(hplc)制备纯净的cad，结果见附图4。
第三步：纤维素纳米为载体的酸性环境敏感的纳米前药的制备和表征
cnc-nh2与cad羧基通过碳化二亚胺缩合反应制备酸敏感前药，以酶标仪测定其载药量；用透射电子显微镜(tem)观测并确定其棒状形貌；用倒置荧光显微镜检测阿霉素的荧光成像效果；用激光共聚焦显微镜检测了其细胞内吞。
综合第一到第三步得到纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感释药的纳米前药结构示意图见附图1。
第四步：纤维素纳米为载体的酸性环境敏感的纳米前药的降解及控制释放性能
用酶标仪监测阿纳米前药cnc-cad在微酸性环境下(ph＝6.5，6.0，5.0；模拟肿瘤组织以及细胞内溶酶体微环境)及微碱性环境下(ph＝7.4模拟正常血液环境)的降解释药性能。
第五步：纤维素纳米为载体的酸性环境敏感的纳米前药的细胞毒性研究
噻唑蓝(mtt)比色法检测纤维素纳米晶，酸敏感纳米前药cnc-cad及dox在ph＝7.4和ph＝5.0培养条件下kb细胞毒性。
第六步：纤维素纳米为载体的酸性环境敏感的纳米前药的细胞内吞
研究了mcf-7细胞在不同浓度及作用不同时间的细胞内吞行为，用流式细胞仪，倒置荧光显微镜以及激光共聚焦显微镜检测其吞噬效果。
实施例1药物与顺式乌头酸酐反应
1.1药物阿霉素-3-nh2与顺式乌头酸酐制备cad
称取盐酸阿霉素10mg，溶于3ml无水二氯甲烷(dcm)中，逐滴加入三乙胺40μl避光，氮气保护，搅拌2h。称取顺式乌头酸酐10mg，溶于3ml无水二氯甲烷，超声20min。将顺式乌头酸酐溶液逐滴加入到阿霉素的dcm溶液中，避光，氮气保护，室温搅拌8h。减压蒸馏除二氯甲烷，柱层析分离，流动相为醇胺溶液和二氯甲烷。(流动相比例为甲醇胺∶二氯甲烷＝1∶500)，高效液相色谱住检测纯度为98％，减压蒸馏除二氯甲烷得到纯品。合成路线示意图见附图2中第一步。cad的化学表征采用了，质谱(结果见附图3cad的ms图)，高效液相色谱(结果见附图4cad的hplc)。
1.2药物吡柔比星与顺式乌头酸酐制备pad
称取吡柔比星10mg，溶于3ml无水二氯甲烷中，逐滴加入三乙胺40μl，避光，氮气保护，搅拌2h。称取顺式乌头酸酐10mg，溶于3ml无水二氯甲烷，超声30min。将顺式乌头酸酐溶液逐滴加入到吡柔比星的dcm溶液中。避光，氮气保护，室温搅拌10h。减压蒸馏除二氯甲烷，柱层析分离，流动相为醇胺溶液和二氯甲烷。(流动相比例为甲醇胺∶二氯甲烷＝1∶500)，高效液相色谱住检测纯度为97％，减压蒸馏除二氯甲烷得到纯品。
1.3药物丝裂霉素与顺式乌头酸酐制备mad
称取丝裂霉素10mg，溶于3ml无水二氯甲烷中，逐滴加入三乙胺40μl，避光，氮气保护，搅拌2h。称取顺式乌头酸酐10mg，溶于3ml无水二氯甲烷，超声30min。将顺式乌头酸酐溶液逐滴加入到吡柔比星的二氯甲烷溶液中。避光，氮气保护，室温搅拌(8-24)h。减压蒸馏除二氯甲烷，柱层析分离，流动相为醇胺溶液和二氯甲烷。(流动相比例为甲醇胺∶二氯甲烷＝1∶500)，高效液相色谱住检测纯度为98％，减压蒸馏除二氯甲烷得到纯品。
1.4吉西他滨与顺式乌头酸酐制备gad
称取吉西他滨10mg，溶于3ml无水二氯甲烷中，逐滴加入三乙胺40μl，避光，氮气保护，搅拌2h。称取顺式乌头酸酐10mg，溶于3ml无水二氯甲烷，超声(20-60)min。将顺式乌头酸酐溶液逐滴加入到吉西他滨的二氯甲烷溶液中。避光，氮气保扩，室温搅拌(8-24)h。减压蒸馏除二氯甲烷，柱层析分离，流动相为醇胺溶液和二氯甲烷。(流动相比例为甲醇胺∶二氯甲烷＝1∶500)，高效液相色谱住检测纯度为98％，减压蒸馏除二氯甲烷得到纯品
实施例2纤维素纳米晶表面的氨基化
称取纤维素纳米晶(100-200)mg，分散在1m的naoh溶液(100-200)ml/g纤维素纳米晶，超声(30-60)min，逐滴加入环氧氯丙烷(6-20)mmol/g纤维素纳米晶，(55-65)℃搅拌2h，透析(mwco＝1000-3500)透析直到透析内液的ph值低于12。采用50％(w/vnaoh)溶液将透析袋内溶液ph值调节到(11-13)，加入浓氨水，(5-10)ml/gcellulose，(55-65)℃搅拌(1-4)h，透析，直到透析液的ph值为(7-7.4)。冷冻干燥。低温冷藏。(合成路线示意图见附图2中第二步)。
实施例3纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药的制备
3.1纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药cnc-cad的制备
称取cad25mg溶于(5-10)ml无水二甲基亚砜(dmso)中，草酰氯(10-50)μl，避光，室温搅拌1h。称取(100-200)mg氨基化的纤维素纳米晶，分散于(3-10)ml的无水dmso中，超声(20-60)min，逐滴加入到酰氯溶液中，避光，氮气保护，室温搅拌(8-24)h。高速离心除上清液后，dmso洗涤并离心三次，弃上清液，保留下层沉积物。沉积物透析(ph＝7.4的pbs中透析，mwco＝1000--3500)，冷冻干燥得到纯品。(合成路线示意图见附图2中第三步)。
3.2纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药cnc-pad的制备
称取pad(25-50)mg溶于(5-10)ml无水二甲基亚砜(dmso)中，草酰氯(10-50)μl，避光，室温搅拌1h。称取(100-200)mg氨基化的纤维素纳米晶，分散于(3-10)ml的无水dmso中，超声(20-60)min，逐滴加入到酰氯溶液中，避光，氮气保护，室温搅拌(8-24)h。高速离心除上清液后，dmso洗涤并离心三次，弃上清液，保留下层沉积物。沉积物透析(ph＝7.4的pbs中透析，mwco＝1000--3500)，冷冻干燥得到纯品。
3.3纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药cnc-mad的制备
称取mad(25-50)mg溶于(5-10)ml无水二甲基亚砜(dmso)中，草酰氯(10-50)μl，避光，室温搅拌1h。称取(100-200)mg氨基化的纤维素纳米晶，分散于(3-10)ml的无水dmso中，超声(20-60)min，逐滴加入到酰氯溶液中，避光，氮气保护，室温搅拌(8-24)h。高速离心除上清液后，dmso洗涤并离心三次，弃上清液，保留下层沉积物。沉积物透析(ph＝7.4的pbs中透析，mwco＝1000--3500)，冷冻干燥得到纯品。
3.4纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药cnc-gad的制备
称取gad(25-50)mg溶于(5-10)ml无水二甲基亚砜(dmso)中，草酰氯(10-50)μl，避光，室温搅拌1h。称取(100-200)mg氨基化的纤维素纳米晶，分散于(3-10)ml的无水dmso中，超声(20-60)min，逐滴加入到酰氯溶液中，避光，氮气保护，室温搅拌(8-24)h。高速离心除上清液后，dmso洗涤并离心三次，弃上清液，保留下层沉积物。沉积物透析(ph＝7.4的pbs中透析，mwco＝1000--3500)，冷冻干燥得到纯品。
实施例4分散性、稳定性和晶体结构考察
将cnc-cad、cnc分散在纯水中，并调节浓度使其分散浓度在1mg/ml，静置存放并观察拍照；结果见附图6。
用x-射线粉末衍射(xrd)(brukerd8advance)对粉末状纤维素纳米晶cnc，氨基化的纤维素纳米晶cnc-nh2和酸敏感棒状阿霉素前药cnc-cad进行晶体结构测定。xrd结果见附图7。
实施例5纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药载药量的测定
称取1mg盐酸阿霉素溶于1mlpbs中采用梯度稀释法配制一系列不同浓度的溶液，浓度分别如下(μg/ml)：
0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，4.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0。
取1mg纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药cnc-cad分散于1ml的pbs中，梯度稀释法配置一系列不同浓度的cnc-cad分散液，浓度分别如下(μg/ml)：
500.0，300.0，250.0，200.0，150.0，100.0，90.0，80.0，70.0，60.0，50.0，40.0，30.0，20.0，10.0。
用酶标仪定量荧光法测定其载药量(dlc)和包封率(dle)，将阿霉素的溶液和纳米前药的pbs分散液，加入黑板中，每孔20μl，激发波长为490nm，发射波波长为580nm根据荧光强度值绘制dox的标准工作曲线，载药量和包封率分别为0.057％和8.0％。
载药量(dlc％)＝(纳米前药上dox的质量/纳米前药的总质量)×100％
包封率(dle％)＝(纳米前药上连接的dox质量/dox投料的质量)×100％。
实施例6纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药在不同ph介质中的释药行为
用酶标仪定量荧光法测定纳米前药在不同ph缓冲液中的释药性能。取25ml纳米前药cnc-cad(1mg/ml)分别置于ph＝7.4，6.5，5.5，5.0缓冲液中透析24h(mwco＝3500)，用酶标仪定量荧光法测定透析后各组的吸光度，依据已经绘制好的dox标准曲线(见附图8)，绘制成代谢曲线结果见附图9。
实施例7纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药的细胞毒性研究
为研究该纳米前药cnc-cad的体外毒性，选取了kb细胞的mtt实验进行验证研究。选取棒状cnc，dox，为对照实验组。考察了cnc，dox和cnc-cad对人口腔表皮样癌细胞(kb细胞)的增殖抑制情况。
细胞培养方法为：将处于对数生长期的kb细胞接种于96孔板每孔180μl，恒温孵育箱中培养过夜后，每组分别加入20μl含有一系列浓度梯度的cnc，dox和cnc-cad，dox浓度(或者相同当量的dox浓度)为(μg/ml)：0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，恒温孵育箱孵育24h；吸去培养基80μl，加入10μlmtt溶液(5mg/ml)后继续培养4h，加入100μl三联液裂解细胞溶解甲赞，用酶标仪测定570nm波长处吸光度并计算细胞存活率。细胞存活率计算公式如下：
细胞存活率(％)＝(od实验组-od空白组/od对照组-od空白组)×100％
结果见附图10。
实施例8、纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药的细胞吞噬行为
将kb细胞在培养皿(greiner，四分格)中预孵育24h(1.0×105个细胞/孔)后，分别加入完全培养基和含有10mm的nh4cl的培养基预孵育30min，四分格中分别加入含有cnc-cad(浓度为250μg/ml)的培养基，继续孵育2h后，弃去培养基，pbs(ph＝7.4)洗涤三次，hoechst染色10min，pbs(ph＝7.4)洗涤三次，加入2mlpbs，置入冰盒，激光共聚焦电子显微镜拍照。结果见附图11和12。
将kb细胞在六孔板中预孵育24h(1.0×105个细胞/孔)，分别加入正常完全培养基和含有10mm的nh4cl的培养基，30min后将培养基换成含有cnc-cad(浓度为250μg/ml)的培养基。继续培养2h后，pbs(ph＝7.4)洗涤三次，消化后离心并洗涤三次后收集细胞，用pbs(ph＝7.4)分散于ep管中，用流式细胞仪检测各组细胞荧光强度，结果见附图13。
综上，纤维素纳米晶为载体的酸性环境敏感纳米前药的细胞吞噬行为可以通过附图14得到具体的诠释。
本发明的保护内容包括但不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。