白蛋白稳定的二氧化锰纳米材料及制备方法和应用与流程

本发明属于功能仿生纳米药物递送体系的技术领域，具体涉及一种白蛋白稳定的二氧化锰纳米材料及制备方法和应用。

背景技术：

由于肿瘤细胞增殖迅速、糖酵解代谢旺盛及肿瘤血管畸形，缺氧、酸化及高水平过氧化氢(H2O2)是肿瘤微环境普遍存在的三大特征。缺氧不仅可以促进肿瘤的恶性生物学表型(如肿瘤血管生成、进展、侵袭和转移)，而且可以直接引起肿瘤治疗抵抗，尤其是对于需要氧气参与的治疗模态，如光动力治疗和放射治疗等。因此，迫切需要开发新型有效策略以减弱肿瘤缺氧，提高肿瘤治疗响应。在缺氧肿瘤原位生成氧气被认为是一种有效途径。

近年来，由于独特的物理化学性能，二氧化锰(MnO2)纳米组分在生物医学领域受到了极大关注。MnO2纳米片可以通过静电作用强力吸附小分子药物。由于药物装载效率高，MnO2纳米片已被广泛用作药物载体递送脱氧核糖核酸酶、化疗药物、光敏剂等。凭借在酸性pH条件下对内源性H2O2的高反应性和高特异性，MnO2可实现药物在酸性肿瘤微环境中的响应释放。反应释放的二价锰离子(Mn²⁺)可用于磁共振成像(MRI)T1对比增强，促进肿瘤可视化，反应产生的氧气(O2)可有效提高肿瘤氧合，同时消耗H2O2、减弱酸化，从而有效增强肿瘤治疗响应。尽管具有较大潜力，目前文献报道的绝大多数MnO2纳米片需要耗时的合成过程、严苛的反应条件、复杂的配体交换以及繁琐的水相修饰步骤，或者采用高毒性的阳性聚合电解质合成。因此，迫切需要发展简单、温和、经济、快捷的方法在水相中制备具有良好生物相容性的MnO2纳米片作为药物载体进行药物递送及肿瘤治疗。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种白蛋白稳定的二氧化锰纳米材料及制备方法和应用，该材料为生物矿化模板稳定的二氧化锰纳米复合物，所述纳米材料是良好水分散性的多组分纳米复合物(BMnHNCs)，由BSA-MnO2纳米片装载光敏剂HPPH而成。这种生物矿化合成法是利用白蛋白分子上丰富的金属结合位点，与金属离子具有较强的亲和力，从而在原位进行晶体生长过程。反应条件简单温和(生理温度、水相环境)，具有良好的重复再现性。尤其是蛋白支架可以控制纳米晶体形貌和尺寸。凭借MnO2在酸性条件下对内源性H2O2的高反应性和高特异性，BMnHNCs可实现肿瘤微环境响应的NIRF和MRI双模态成像，以及肿瘤微环境响应增强的光动力治疗。本发明所述纳米材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，以及安全、高效的诊疗能力，将为综合调节肿瘤微环境和提高肿瘤诊疗能力提供新思路，在临床转化方面具有较大潜力。

本发明的技术方案是：

白蛋白稳定的二氧化锰纳米材料，该材料为多组分的BMnNSs-HPPH纳米复合物。

所述材料是二氢卟酚类光敏剂HPPH通过物理吸附作用装载在良好水分散性的二氧化锰纳米片BMnNSs上。

白蛋白稳定的二氧化锰纳米材料的制备方法，有以下步骤：

1)35～38℃下将MnCl2·4H2O溶液快速加入到牛血清白蛋白溶液中，剧烈震荡，3分钟后快速加入NaOH溶液，将pH调节至11～12，溶液变成深褐色时，37℃静置6小时，超滤4～5次，再用滤膜过滤，得到分散于超纯水中的BMnNSs溶液；

2)避光条件下，将步骤1)所得BMnNSs溶液与溶于DMSO的二氢卟酚类光敏剂HPPH混合，室温搅拌过夜，超滤，得到多组分的BMnNSs-HPPH纳米复合物。

步骤1)所述MnCl2·4H2O溶液的浓度为100mM。

步骤1)所述牛血清白蛋白溶液浓度为10mg/mL。

步骤2)所述二氢卟酚类光敏剂HPPH溶液的浓度为20mg/mL。

步骤2)BMnNSs溶液的浓度为5mM Mn。

白蛋白稳定的二氧化锰纳米材料在制备肿瘤微环境响应的NIRF/MRI双模态成像制剂中的应用

白蛋白稳定的二氧化锰纳米材料在用于肿瘤微环境响应增强的光动力治疗中的应用。

本发明以牛血清白蛋白(BSA)为生物矿化模板，在水相中成功合成BSA-MnO2纳米片(BMnNSs)，所获得的BMnNSs具有合适的尺寸，良好的水分散性和生物相容性。随后，将二氢卟酚类光敏剂HPPH通过物理吸附作用装载在BMnNSs上，获得BMnNSs-HPPH多组分纳米复合物。利用MnO2在酸性条件下对内源性H2O2的高反应性和高特异性，实现肿瘤微环境响应的NIRF和MRI双模态成像。由于BMnHNCs可通过实体瘤的高通透性和滞留(EPR)效应在肿瘤区域富集，随后与肿瘤微环境的H2O2反应释放出O2，BMnHNCs可显著提升630nm激光下HPPH的光动力治疗效果，因此，BMnHNCs具有比HPPH更优异的光动力治疗效果。此外，BMnHNCs(BMnNSs-HPPH)还可显著改善缺氧状况，下调肿瘤区域的VEGF表达。

申请人的实验证实，BMnHNCs经尾静脉注射健康小鼠后，显示出良好的生物相容性，为综合调节肿瘤微环境和提高肿瘤诊疗能力提供新思路。

本发明所述纳米复合物的各组分均具有良好的生物相容性，在临床转化方面具有较大的潜力。

附图说明

图1为BMnNSs和BMnHNCs的表征；其中，图1a为BMnNSs的冻干粉照片(左)和TEM图像(右)，标尺，100nm；1b为BMnNSs的原子力显微镜图像，标尺，100nm；1c为BSA和BMnNSs的圆二色光谱图；1d为BMnNSs的X线光电子能谱图；1e为BMnNSs的高分辨率Mn2p3/2和Mn2p1/2X线光电子能谱图；1f为紫外-可见光吸收光谱，插图分别为BMnHNCs、BMnNSs和HPPH溶液的大体照片；1g为BMnNSs和BMnHNCs的水合尺寸；1h为傅立叶变换红外光谱；

图2为酸性pH/H2O2响应的MnO2分解试验；其中，图2a为溶解氧生成情况；2b为pH值变化；2c为H2O2消耗试验；2d为BMnNSs分散于不同缓冲溶液的照片，H2O2、HCl和BMnNSs的终浓度分别为250μM，500μM和250μM；2e为r1弛豫率，插图为分散在无H2O2的pH＝7.4溶液(上)和含H2O2的pH＝6.2溶液(下)相应的T1加权磁共振图像；2f为r2弛豫率，插图为分散在无H2O2的pH＝7.4溶液(上)和含H2O2的pH＝6.2溶液(下)相应的T2加权磁共振图像；

图3为体外细胞实验；其中，图3a为U87MG细胞与不同浓度BMnHNCs孵育6小时后的T1弛豫时间，插图为相应的T1加权图像。图3b为U87MG细胞与不同浓度BMnHNCs孵育6小时后的T2弛豫时间；插图为相应的T2加权图像。3c为U87MG细胞与HPPH或BMnHNCs(相当于2μg HPPH/mL)孵育6小时后的荧光图像；3d为U87MG细胞与不同浓度HPPH、BMnNSs或BMnHNCs孵育24小时后的细胞活性；3e为U87MG细胞与不同浓度HPPH或BMnHNCs孵育后并经630nm激光照射后的细胞活性；3f为不同治疗组的U87MG细胞经钙黄绿素-乙酰羟甲基酯染色的荧光图像(绿色，活细胞)；

图4为BMnHNCs的在体诊疗能力评价；其中，图4a为U87MG荷瘤小鼠在经尾静脉注射HPPH(上)或BMnHNCs(下)之前和注射后不同时间点的体内荧光图像；4b为注射24小时后的肿瘤和主要脏器的体外荧光图像；4c为注射后不同时间点的小鼠肿瘤区域在荧光信号强度分析；4d为在注射24小时后肿瘤和主要脏器的荧光信号强度分析；4e为治疗15天内的小鼠体重变化趋势；4f肿瘤生长曲线；4g为治疗24小时后的肿瘤缺氧和VEGF的代表性免疫荧光图像；4h为缺氧及VEGF的荧光强度分析；

图5为治疗15天后，不同分组荷瘤小鼠的主要脏器的伊红-苏木精染色图；

图6为健康小鼠经尾静脉注射BMnHNCs后不同时间点的血清生化分析结果；

图7为BMnHNCs的肿瘤诊疗应用示意图。

具体实施方式

注：所有实验中配置溶液的水为18.2MΩ·cm^-1超纯水，由Milli-Q纯化系统获得。

实施例1

1.BSA-MnO2纳米片(BMnNSs)的制备

通过生物矿化法在生理温度条件下以BSA作为稳定剂和反应支架合成BMnNSs。在37℃条件下将100mM，500μL的MnCl2·4H2O快速加入到10mL，10mg/mL的BSA溶液中，涡流混合器剧烈震荡。3分钟后，快速加入250μL 1M NaOH溶液，将pH调节至12左右。加入NaOH后，浑浊溶液立刻变成透明淡黄色，此后，随着反应的进行，溶液逐渐变成深褐色。37℃静置6小时，以促进晶体生长。用MWCO＝30KDa超滤管超滤4～5次用来终止反应，3250转/分钟，15分钟，去除过量的反应物。用0.22μm滤膜过滤，将获得的BMnNSs(BSA-MnO2纳米片)溶液分散于超纯水中，储存在4℃冰箱，备用。

不加BSA，做上述相同的合成步骤，作为对照组。

2.BMnHNCs(BMnNSs-HPPH纳米复合物)的制备：

在避光条件下将400μL BMnNSs溶液(5mM Mn)与溶于DMSO的HPPH(10μL，20mg/mL)混合，室温搅拌过夜。超滤4～5次后，获得去除残留HPPH的BMnHNCs溶液。根据HPPH在666nm的特性吸收峰计算HPPH的浓度。将获得的BMnHNCs分散在水中，备用。

采用电感耦合等离子质谱仪(ICP-MS，Agilent，Palo Alto，USA)检测BMnNSs中的锰含量。采用透射电子显微镜(TEM，Hitachi H-7500，东京，日本)在200kV条件下观察BMnNSs的形貌。采用扫描电镜(SEM，Hitachi SU-70，东京，日本)的X射线能谱分析对BMnNSs的元素构成进行分析。采用X射线光电子能谱仪(XPS)分析BMnNSs中各元素的价态。采用动态光散射仪(DLS，Malvern Instruments，英国)检测表面电位和水合尺寸。采用分光偏振计系统(BioLogic，MOS-450，美国)记录圆二色(CD)光谱。采用傅立叶变换红外光谱(FT-IR，布鲁克，Karlsruhe，德国)对化学官能团进行表征。

酸性pH/H2O2响应的BMnNSs分解实验：在H2O2溶液(250μM)和H2O2/H⁺混合溶液(250μM H2O2和500μM H⁺)中，分别加入BMnNSs(250μM)，分别采用便携式溶解氧测定仪(JPBJ-608，雷克斯，上海，中国)和pH计测量反应生成的氧气和pH值变化。在不同pH条件下(7.4或6.2)将BMnNSs(250μM)和H2O2(250μM)混合，采用过氧化氢试剂盒测量580nm处吸光度值来反映H2O2随着时间推移的消耗情况。

在室温条件下采用7.0T小动物磁共振成像仪对BMnNSs溶液进行T1加权和T2加权图像采集，参数如下：(1)T1RARE序列：重复时间/回波时间：1500/8ms；回波间隔：8ms；激励次数：4；层厚：1mm，视野：2.5×2.5cm；矩阵：256×256；(2)T1-map序列：重复时间：447ms-5500ms；回波间隔：8.5ms；回波间隔：8.5ms；回波图像：10；层厚：1mm；视野：2.5×2.5cm；矩阵：256×256；(3)Turbo RARE-T2序列：重复时间/回波时间：2500/35ms；回波间隔：11.5ms；激励次数：4；层厚：1mm，视野：2.5×2.5cm；矩阵：256×256；(4)T2-map MSME序列：重复时间：4500ms；回波时间：9.5-237.5ms；回波时间：9.5ms；回波图像：25；层厚：1mm；视野：2.5×2.5cm；矩阵：256×256。分别通过分析1/弛豫时间(s^-1)和金属离子浓度(mM)之间的线性关系获得r1和r2弛豫率。

3.BMnHNCs的合成和理化表征

以BSA为生物矿化模板，在生理温度下和水相中合成BMnNSs。Mn²⁺离子首先被锚定到BSA上丰富的活性巯基和羧基上，与BSA形成BSA-Mn²⁺复合物。加入NaOH后，混合溶液迅速变为透明黄色，这归因于BSA的构象转变为未折叠状态。随后，在BSA上反应2MnCl2+4NaOH+O2→MnO2+4NaCl+4H2O被原位触发，使晶体得以生长。随着反应时间的延长，溶液颜色逐渐变成深棕色。随着时间的推移，反应溶液的光学吸收逐渐增强，并在反应6小时时达到最大值。冻干后，获得的粉末呈暗金色棉花状(图1a，左)，并可重新分散在水相。TEM显示BMnNSs呈不规则的片状结构(图1a，右)，与AFM结果一致(图1b)。圆二色光谱显示，与BSA相比，BMnNSs的特征峰轻微蓝移(图1c)，提示不规则卷曲的二级结构，这被认为有利于金属纳米晶体的生长。采用XPS光谱进行元素价态分析(图1d)。以652.38eV和640.68eV为中心的特征峰值分别代表Mn 2p1/2和Mn 2p3/2(图1e)，源于MnO2的自选轨道峰。这些结果共同表明成功合成BMnNSs。

通过将HPPH物理吸附到BMnNSs上，获得BMnHNCs。BMnNSs的片状结构为锚定HPPH提供了很大的表面积。通过超滤除去未装载的HPPH后，HPPH的所有特征吸收峰值均可在BMnHNCs上观察到(图1f)。BMnNSs和BMnHNCs的平均水合尺寸分别为51.9±18.6nm和60.52±25.61nm(图1g)，表明在一个纳米晶体上包被有多个BSA分子。装载HPPH后，BMnHNCs的表面电势为-25.6±4.37mV。FTIR光谱显示，在BMnHNCs中可同时观察到HPPH和BMnNSs的特征峰值(图1h)。这些结果表明HPPH被成功装载在BMnNSs上。在水、PBS缓冲液、DMEM细胞培养基和血清等多种生理介质中孵育24小时后，BMnHNCs溶液均未观察到明显的聚集或沉淀，因此，BMnHNCs具有优异的分散稳定性。

在中性条件下MnO2可催化H2O2分解产生O2(MnO2+2H2O2→2H2O+O2↑)，而在酸性条件下，MnO2可与H⁺和H2O2反应，生成O2，并释放出Mn²⁺离子(MnO2+H2O2+2H⁺→Mn²⁺+2H2O+O2↑)。考虑到MnO2对酸性pH/H2O2的高反应性，申请人探讨了BMnNSs在不同缓冲溶液中的分解情况。与仅有H2O2时相比，在H2O2和H⁺同时存在的情况下，BMnNSs可产生更多的溶解氧和更显著的pH值升高(图2a，2b)。相比之下，在仅有H2O2或BMnNSs溶液时，无明显的O2生成和明显的pH值变化。结果表明，所生成的O2和pH值升高是由BMnNSs与H⁺和H2O2反应所产生的。此外，随着时间的推移，在pH＝6.2和pH＝7.4溶液中均可观察到H2O2的消耗(图2c)。在pH＝6.2溶液中加入H2O2后，BMnNSs的溶液中观察到大量的氧气泡产生，表明BMnNSs与H⁺和H2O2反应可产生O2(图2d)。

尽管在中性条件下BMnNSs的T1和T2MRI对比增强性能较低，但BMnNSs与H⁺和H2O2反应可释放大量顺磁性Mn²⁺离子，显著提高对比性能。这表明H2O2可以很容易地扩散到MnO2的活性位点。与H2O2反应后，BMnNSs在7.0T场强下的纵向(r1)和横向(r2)弛豫率分别为6.35mM^-1s^-1和187.5mM^-1s^-1(图2e，2f)，分别是与H2O2反应前的6.5倍和6.2倍(r1＝0.98mM^-1s^-1，r2＝30.40mM^-1s^-1)。与H2O2反应后的BMnNSs的r1和r2弛豫率均高于游离的Mn²⁺离子，这归因于Mn²⁺离子和BSA的相互作用。BMnNSs的这些响应特性提示其具有较大的生物医学应用潜力。

实施例2体外细胞实验

人源性胶质母细胞瘤细胞(U87MG)由中国上海科学院提供。细胞在含有10％(v/v)血清，1％青霉素和链霉素的DMEM培养基中培养，置于37℃，5％的二氧化碳培养箱中培养。

体外细胞荧光成像：将U87MG细胞分别和HPPH或BMnHNCs(相当于2μg/mL HPPH)避光孵育6小时，然后用PBS缓冲液洗涤细胞三次，DAPI染色，激光共聚焦显微镜(CLSM，奥林巴斯FV1200，日本)进行观察、拍照。

细胞MRI成像：将U87MG细胞接种于6cm细胞培养皿，待细胞融合至85％左右时，加入不同浓度的BMnHNCs，孵育6小时。用PBS缓冲液洗涤细胞三次，消化、离心、收集细胞。将细胞分散于200μL 1％低熔点琼脂糖，用7.0T小动物磁共振成像仪进行体外细胞MRI成像，参数与上文一致。比较不同分组细胞的T1、T2弛豫时间，未进行处理的细胞作为对照。

细胞活性实验：将5000个U87MG细胞接种在96孔细胞培养板中，37℃培养。待细胞贴壁后，分别加入不同浓度梯度的HPPH，BMnNSs或BMnHNCs(HPPH最高浓度为10μg/mL，Mn 100μM)，与细胞共孵育24小时。采用标准MTT实验检测细胞活性。

荧光显微镜观察光动力细胞毒性：将50000个U87MG细胞接种在12孔培养板中，37℃培养过夜。分别加入不同浓度梯度的HPPH或BMnHNCs(相当于5μg/mL HPPH)，与细胞共孵育6小时。用PBS缓冲液清洗三次，加入新鲜培养基，采用630nm激光器以10mW/cm²的功率照射细胞1分钟。对照组包括未处理组、仅加入NCs组和仅激光辐照组。照射完成后，细胞继续孵育4小时，用2μM钙黄绿素-乙酰羟甲基酯染色30分钟，荧光显微镜观察，发出绿色荧光代表活细胞。

定量检测BMnHNCs的细胞光动力细胞毒性：将5000个U87MG细胞接种在96孔培养板中，37℃培养过夜。分别加入不同浓度梯度的HPPH或BMnHNCs，与细胞共孵育6小时。采用630nm激光器以10mW/cm²的功率照射细胞1分钟。用PBS缓冲液清洗三次，加入新鲜培养基继续培养24小时，采用标准MTT实验检测光动力治疗对细胞活性的影响。

BMnHNCs的体外细胞摄取和诊疗能力评价

与不同浓度的BMnHNCs共孵育6小时后，随着孵育浓度的升高，收集到的U87MG细胞在T1和T2加权图像上分别表现出显著的正性和负性对比增强效应。正如预期的那样，用BMnHNCs处理的细胞T1和T2的弛豫时间均呈浓度依赖性降低(图3a，3b)，提示有效的细胞摄取和MnO2分解。在相同HPPH浓度下，经BMnHNCs处理的细胞荧光信号比游离的HPPH要强得多(图3c)。其原因是细胞摄取效率提高，并从纳米复合物中释放出了HPPH。细胞MRI/CLSM结果表明，经共孵育和细胞内化后，BMnNSs可提高肿瘤细胞可视化程度。

理想的诊疗试剂应该是低毒或无毒的。细胞活性实验显示，在测试浓度范围内，HPPH、BMnNSs和BMnHNCs对U87MG细胞的细胞毒性可以忽略不计(图3d)。在同等HPPH浓度下，经BMnHNCs处理的细胞活性要比经HPPH处理的细胞活性稍高一些，其原因是由于BMnNSs对HPPH的封装和保护所致。BMnHNCs的优异的生物相容性使它们在纳米医学应用方面具有良好的前景。

在细胞经HPPH或BMnHNCs孵育和630nm激光照射后，细胞的生存活性显著低于无激光照射组(图3e)。在激光照射后，经BMnHNCs处理的细胞活性低于经HPPH处理的细胞活性。这可以用细胞内化效率增高来解释，细胞CLSM结果证实了这一点。由于单线态氧参与光动力治疗介导的细胞杀伤效应，从MnO2和胞内H2O2反应产生的的O2可提高光动力治疗效果。随后，申请人采用钙黄绿素-乙酰羟甲基酯染色法对HPPH或BMnHNCs对U87MG细胞的光动力杀伤效果进行了观察。如图3f所示，经仅HPPH或仅BMnHNCs处理的U87MG细胞显示出与对照组细胞相同的绿色荧光。而经BMnHNCs加激光照射处理后的细胞几乎没有任何绿色荧光显示，这表明BMnHNCs可高效杀死肿瘤细胞。实施例3BMnHNCs的体内诊疗效果评估

构建荷瘤鼠模型：从厦门大学实验动物中心购买雌性Balb/c裸小鼠(20±2g，4-5周)，所有动物实验均遵照厦门大学动物管理委员会相关协议。在小鼠左后背部皮下接种80μL 10⁶个U87MG细胞，大约在肿瘤接种2-3周后，肿瘤达到100mm³，取移植瘤模型用于活体实验。

体内NIRF成像：分别将200μL HPPH或BMnHNCs(相当于2mg HPPH/kg小鼠体重)经尾静脉注入U87MG荷瘤鼠。分别在注射前及注射后不同时间点，采用小动物荧光成像系统对小鼠进行荧光成像(Ex/Em＝610/700nm)，比较不同时间点荧光信号变化情况。在注射24小时后，麻醉处死小鼠，收集主要器官和肿瘤，进行离体荧光成像。通过测量感兴趣区域的信号，定量分析荧光信号强度变化情况。

荷瘤小鼠光动力治疗：当小鼠肿瘤体积达到100mm³时，将小鼠随机分为5组，最大程度降低肿瘤大小和体重差异。每组4只，包括PBS组(I组)，仅HPPH组(Ⅱ组)，仅BMnHNCs组(Ⅲ组)，HPPH+激光辐照组(Ⅳ组)，BMnHNCs+激光辐照组(Ⅴ组)。Ⅱ-Ⅴ组小鼠经尾静脉注射HPPH或BMnHNCs(相当于2mg HPPH/kg小鼠体重)。IV组和V组小鼠在注射后24小时采用630nm激光(200mW/cm²，10分钟)照射肿瘤部位。观察体内治疗效果：在小鼠接受治疗前后的不同时间点，每隔一天称量一次小鼠体重，采用游标卡尺测量肿瘤体积。肿瘤体积按以下公式计算:肿瘤体积＝宽径*宽径*长径/2。分别在治疗前和治疗后第15天对小鼠进行大体拍照。

免疫荧光染色：在注射HPPH或BMnHNCs(相当于2mg HPPH/kg小鼠体重)24小时后，麻醉处死小鼠。在处死前1小时，经小鼠腹腔注射盐酸哌莫硝唑(30mg/kg小鼠体重)。在乏氧环境下，哌莫硝唑会被巯基还原活化产生稳定的络合物，并被异硫氰酸荧光素标记的抗哌莫硝唑抗体染色。在注射24小时后，用标准免疫荧光染色法检测肿瘤区域的VEGF表达情况。用荧光显微镜拍照，对荧光信号强度进行分析。

BMnHNCs的在体诊疗能力评价

对U87MG肿瘤荷瘤小鼠进行了活体荧光成像，图4a-b显示了在注射前和注射后不同时间点的代表性荷瘤小鼠荧光图像。在注射HPPH或BMnHNCs后的较早时间点，体内荧光信号均呈非特异性分布。随后，HPPH和BMnHNCs均在肿瘤区域展示出较强的荧光信号。然而，在注射24小时后(图4c)，BMnHNCs组的小鼠肿瘤区域的信号强度是HPPH组的1.9倍，表明BMnHNCs在肿瘤区域的富集效果优于HPPH。图4d为注射24小时后小鼠主要脏器和肿瘤的离体荧光成像结果。肝脏和脾脏的荧光较弱，原因是HPPH对肿瘤具有较高的选择性。BMnHNCs组的小鼠的肿瘤区域信号强于HPPH组，原因是由于EPR效应和肿瘤内增强的细胞摄取效应所致。此外，在BMnHNCs中，HPPH与蛋白支架的结合可减弱BMnHNCs中HPPH的释放，因而具有良好的化学稳定性，有助于进一步在肿瘤部位富集，产生荧光信号。

由于BMnHNCs高效的光动力细胞毒性和肿瘤区域富集能力，申请人探索了BMnHNCs在荷瘤小鼠上的抗肿瘤效果。对肿瘤生长情况监测15天，以评估治疗效果。图4e显示，仅用BMnHNCs或HPPH治疗的小鼠肿瘤迅速增长，与对照组类似，肿瘤抑制效果几乎可以忽略。HPPH加激光辐照组的小鼠表现出轻微的肿瘤生长抑制效应，BMnHNCs加激光照射组的小鼠显示出有效的肿瘤生长抑制甚至完全根除的效果。以上结果表明，注射BMnHNCs的小鼠光动力治疗效果显著提高，其原因是由于BMnHNCs在肿瘤区域高效富集和肿瘤微环境响应性生成氧气所致。图4f显示，监测过程中小鼠的体重保持相对稳定，未见明显减轻，表明BMnHNCs加激光辐照治疗无明显的系统性副作用。

注射BMnHNCs 24小时后，用哌莫硝唑乏氧探针试剂盒评价小鼠肿瘤区域的缺氧情况(图4g)。图4h显示，与HPPH组相比，经BMnHNCs处理的小鼠肿瘤区域绿色荧光明显减弱，提示肿瘤乏氧有所缓解，原因是因为BMnHNCs和内源性H2O2在酸性肿瘤微环境中反应产生O2。这种在肿瘤内部改善的氧合状态有助于克服缺氧相关的光动力治疗抵抗。缺氧引起的低氧诱导因子(HIF-1α)可以促进VEGF基因的转录，从而导致血管生成和肿瘤恶性表型。如图4g所示，注射BMnHNCs 24小时后，通过免疫荧光染色检测BMnHNCs对VEGF表达的影响。图4h显示，与HPPH组相比，经BMnHNCs处理的小鼠的肿瘤区域荧光强度要弱得多，表明BMnHNCs改善氧合状态可有效下调VEGF表达，其有助于抑制肿瘤生长。

实施例4生物相容性研究

组织切片伊红-苏木精染色：在治疗后第15天，10％水合氯醛麻醉小鼠。先用50mL生理盐水经心脏灌注，再用50mL 4％多聚甲醛灌注。迅速分离并获取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，浸泡于10％福尔马林中。24小时后进行石蜡包埋。以5μm层厚进行切片，脱蜡。组织切片浸入苏木精染液中10分钟，伊红染色5分钟，倒置显微镜观察、拍照。

血清生化检测：将BMnHNCs以2mg HPPH/kg小鼠体重剂量经尾静脉注入健康小鼠，生理盐水作为对照。在注射后不同时间点，通过摘除眼球摘取血样(每只小鼠0.8-1.0mL)，离心三次(3000转/分，10分钟)，获得血清。采用血清生化检测仪对血清生化指标进行定量检测。检测指标包括白蛋白、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、血肌酐、尿酸、尿素氮等。

生物相容性检测

在接受不同治疗方案后，各组小鼠均未观察到任何副作用或行为异常。图5是用苏木精-伊红(H&E)染色评估治疗引起的潜在组织损伤结果。与对照组相比，接受不同治疗的小鼠主要脏器没有发现明显的细胞坏死和炎性浸润等病理异常。图6为健康小鼠经尾静脉注射BMnHNCs后的血清生化分析结果，在注射BMnHNCs后的不同时间点，小鼠的肝肾功能指标均未见明显异常，提示BMnHNCs对肝肾功能无明显影响。静脉注射后的BMnHNCs将逐渐分解为生物相容的BSA和Mn²⁺离子，它们可以在体内直接代谢，不会长期滞留体内，引发毒性问题。因此，由生物相容性和可生物降解组分组成的BMnHNCs是一种可临床转化的安全诊疗纳米体系。

BMnHNCs用于肿瘤的诊疗

参见图7，当BMnHNCs经内吞作用进入肿瘤细胞后，在肿瘤细胞内弱酸性和高H2O2的条件下，BMnHNCs分解释放出Mn²⁺用于肿瘤微环境响应的MRI对比增强，响应释放出的HPPH用于NIRF成像，从而促进肿瘤可视化。

反应产生的O2可有效提高肿瘤氧合，同时消耗H2O2、减弱酸化，从而实现肿瘤微环境响应增强的光动力治疗。

结论：

本发明构建了一种新型的诊疗一体化智能纳米复合物BMnHNCs，用于肿瘤微环境响应的NIRF/MRI双模态成像和增强的光动力治疗。BMnHNCs可显著提高HPPH的细胞摄取效率。与HPPH相比，由于BMnHNCs可通过EPR效应在肿瘤部位有效富集，以及MnO2在酸性肿瘤微环境中与内源性H2O2反应，改善肿瘤部位乏氧，BMnHNCs可显著抑制肿瘤生长，这表明其可高效克服缺氧相关的治疗抵抗。本发明所述纳米复合物BMnHNCs具有良好的生物相容性和生物可降解性，以及安全、高效的诊疗能力，将为综合调节肿瘤微环境和提高肿瘤诊疗能力提供新思路，在临床转化方面具有较大潜力。