本发明涉及生物医药领域，进一步涉及水溶性富勒烯衍生物在增强正常细胞活性中的应用，尤其涉及水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品、化妆品中的应用。
背景技术：
富勒烯是由不同数目的碳原子组成的具有封闭结构的原子团簇，其独特的结构和性能倍受人们的重视。通过功能化修饰能够显著提高富勒烯的水溶性和生物相容性，从而拓展富勒烯在生物医学领域的应用研究。目前，水溶性富勒烯衍生物被广泛应用于核磁共振造影、肿瘤治疗、放化疗保护、化妆品添加剂、抗辐射剂及抗氧化剂等诸多领域。我们深入研究了水溶性富勒烯衍生物对细胞活性的影响，对于进一步推动其在生物医学领域的应用研究具有重大意义。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现要素：
发明目的
本发明的目的之一是提供一种水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用。本发明的目的之二是提供一种包含该水溶性富勒烯衍生物的增强正常细胞活性的保健品。本发明的目的之三是提供一种水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用。本发明的目的之四是提供一种包含该水溶性富勒烯衍生物的增强正常细胞活性的化妆品。
解决方案
为实现本发明目的，本发明实施例提供一种水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用，其中所述水溶性富勒烯衍生物包括：氨基修饰的富勒烯衍生物、羟基修饰的富勒烯衍生物中的至少一种；所述增强正常细胞活性包括：增强正常细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶的活性、增强正常细胞内还原性物质活性和加快正常细胞的增殖中的至少一种。
为实现本发明目的，本发明实施例还提供了一种增强正常细胞活性的保健品，其包括水溶性富勒烯衍生物，其中所述水溶性富勒烯衍生物包括：氨基修饰的富勒烯衍生物、羟基修饰的富勒烯衍生物中的至少一种；所述增强正常细胞活性包括：增强正常细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶的活性、增强正常细胞内还原性物质活性和加快正常细胞的增殖中的至少一种；可选的，所述保健品还包括适用于保健品的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
为实现本发明目的，本发明实施例还提供了一种水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用，其中所述水溶性富勒烯衍生物包括：氨基修饰的富勒烯衍生物、羟基修饰的富勒烯衍生物中的至少一种；所述增强正常细胞活性包括：增强正常细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶的活性、增强正常细胞内还原性物质活性和加快正常细胞的增殖中的至少一种。
为实现本发明目的，本发明实施例还提供了一种增强正常细胞活性的化妆品，其包括水溶性富勒烯衍生物，其中所述水溶性富勒烯衍生物包括：氨基修饰的富勒烯衍生物、羟基修饰的富勒烯衍生物中的至少一种；所述增强正常细胞活性包括：增强正常细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶的活性、增强正常细胞内还原性物质活性和加快正常细胞的增殖中的至少一种；可选的，所述化妆品还包括适用于化妆品的辅料。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，所述正常细胞包括：人小神经胶质细胞(hm细胞)和人源肝细胞(hl-7702细胞)中的至少一种。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，所述增强正常细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶的活性包括：提高正常细胞的线粒体内琥珀酸脱氢酶的数量、增强正常细胞的线粒体内单位数量琥珀酸脱氢酶的活性中的至少一种。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，所述增强正常细胞内还原性物质活性包括：提高正常细胞内nadph、fadh、fmnh、nadh中的至少一种的数量、增强正常细胞内nadph、fadh、fmnh、nadh中的至少一种的单位数量的活性或使nadph/nadp,fadh/fad,fmnh/fmn和nadh/nad中的至少一种比值升高。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，所述氨基修饰的富勒烯衍生物包括：c60(eda)9和c70(eda)9中的至少一种，其中eda代表乙二胺基。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，所述氨基修饰的富勒烯衍生物通过包括以下步骤的方法制备：将富勒烯与乙二胺混合进行反应，之后进行后处理获得氨基修饰的富勒烯衍生物；其中所述富勒烯为c60和c70中的至少一种，所述富勒烯与乙二胺的质量比为50:45-100。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，所述羟基修饰的富勒烯衍生物包括：c60(o)5(oh)12和c70(o)5(oh)12中的至少一种。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，所述羟基修饰的富勒烯衍生物通过包括以下步骤的方法制备：将富勒烯与过氧化氢溶液以及碱溶液混合并在50～80℃的条件下反应；其中所述富勒烯为c60和c70中的至少一种，所述碱溶液为氢氧化钠水溶液和氢氧化钾水溶液中的至少一种。
上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的保健品中的应用、上述保健品、上述水溶性富勒烯衍生物在制备增强正常细胞活性的化妆品中的应用、上述化妆品在一种可能的实现方式中，基于所述碱溶液的总质量，所述碱溶液中碱的含量为8～50wt％；基于所述过氧化氢溶液的总质量，所述过氧化氢溶液中过氧化氢的含量为20～40wt％；所述富勒烯与过氧化氢溶液以及碱溶液的质量体积比为30～200mg：5～10ml：1～4ml。
上述应用中的保健品或上述保健品在另一种实施方式中，可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分水溶性富勒烯衍生物制备成保健品，使其在施用于受试者后可以速释、缓释或延迟释放有效成分即可，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。
上述应用中的保健品或上述保健品在另一种实施方式中，适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(watersyrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。
上述应用中的保健品或上述保健品在另一种实施方式中，还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。
上述应用中的保健品或上述保健品在另一种实施方式中，当保健品以液体形式存在时，有效成分水溶性富勒烯衍生物在所述保健品中的浓度为0.01-50mg/ml，可选的为0.01-10mg/ml，10-20mg/ml，10-50mg/ml；当所述保健品以固体形式存在时，有效成分水溶性富勒烯衍生物在所述保健品或所述保健品组合物中的浓度为0.01-50mg/g，可选的为0.01-10mg/g，10-20mg/g，10-50mg/g。
上述应用中的化妆品或上述化妆品在另一种实施方式中，适用于化妆品的辅料包括发泡剂、泡沫稳定剂、表面活性剂、调理剂、湿润剂、香味剂、增粘剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂和防晒剂等。
有益效果
(1)本发明使用了两类水溶性富勒烯衍生物：氨基修饰的富勒烯衍生物、羟基修饰的富勒烯衍生物，这两类富勒烯衍生物具有优异的水溶性，且分子粒径较小，易于进入细胞内部。其中，氨基修饰的富勒烯衍生物的表面带有正电荷，羟基修饰的富勒烯衍生物的表面带负电荷，都具有优异的溶液稳定性。
(2)将两类富勒烯衍生物分别与人小神经胶质细胞(hm细胞)和人源肝细胞(hl-7702细胞)这两种人源正常细胞共同孵育，通过cellcountingkit-8(cck-8)和alamarblue两种检测试剂分别检测正常细胞线粒体中还原性酶的活性和正常细胞中还原性物质的活性。研究结果证明，不同的水溶性富勒烯衍生物表现出共性和特性，如：共性表现在这两类水溶性富勒烯衍生物与hm细胞和hl-7702细胞孵育24小时后，即使在低浓度下仍能显著增强人源hm细胞和hl-7702细胞的线粒体活性及细胞整体活性；特性表现在随着水溶性富勒烯衍生物浓度的增加，有些水溶性富勒烯衍生物的效果表现出了浓度抑制，即随着浓度的增加，其增强线粒体活性和细胞活性的效果反而下降，而有些水溶性富勒烯的效果则随着浓度的增加不断增加。
(3)同时，这两类水溶性富勒烯衍生物在500μm(μmol/l)的高浓度下没有出现明显的细胞毒性，证明了其在细胞水平的生物安全性，能够被广泛应用于生物医学领域。
附图说明
根据下面参考附图对示例性实施例的详细说明，本发明的其它特征及方面将变得清楚。
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1为本发明实施例1.4中的c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh的表面电位(即:zeta电位)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合一个或多个实施例以及与之对应的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的示例性说明。
显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
这些实施例并不构成对保护范围的限定。除非另有说明，这里的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件、通常按照常规条件以及手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件的实验方法未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规可由商业途径获得的。
本发明实施例中所用cck-8检测试剂盒购买自日本东仁化学科技(上海)有限公司，货号：ck04；alamarblue检测试剂盒购买自北京素兰宝科技有限公司，货号：a7631。
本发明实施例中使用的人源正常细胞是hm细胞(购买于北纳生物科技公司)，它是中枢神经系统中除神经元以及星形胶质细胞外的第三类细胞，在中枢神经系统中起到清除凋亡细胞以及病原体等作用。
本发明实施例中使用的人源正常细胞是hl-7702细胞(购买于北纳生物科技公司)，是人正常肝细胞系，与组织内的肝细胞具有极其相似的生物学特性。
实施例1、水溶性富勒烯衍生物的合成及其水合粒径和zeta电位表征
1.1氨基修饰的富勒烯衍生物c60-eda和c70-eda的合成。
(a)将50ml乙二胺(分析纯，国药试剂，密度0.9mg/ml)加入100ml具塞锥形瓶，加入50mg固体富勒烯c60(纯度：99％，厦门福纳新材料科技有限公司)，再加入磁力搅拌子，使用磁力搅拌器搅拌24h(温度：室温，转速：1000r/min)，使用溶剂过滤器(容积：1l，滤膜孔径：200nm，津腾公司)将反应物抽滤后得到棕红色溶液。溶液的成分主要是未参加反应的乙二胺和c60(eda)9。
(b)将(a)步骤得到的溶液加入250ml的圆底烧瓶中，再使用旋转蒸发仪(型号：ikarv10basic)将滤液旋转干燥完全(温度：70摄氏度，转速：80r/min)。将盐酸(浓度：1mol/l)加入到圆底烧瓶中，振荡烧瓶使其内壁上的蒸干物溶解在稀盐酸中，得到棕红色澄清溶液。
(c)将(b)步骤得到的溶液中和至ph试纸检测为弱酸性(ph为5左右)，以保证过量的乙二胺以氯化盐形式存在，能够在后续的透析步骤充分除去。将中和后溶液装入透析袋(截止分子量为3500)放入超纯水中透析，透析至超纯水的电导率小于1μs/cm即可。
(d)将(c)步骤透析后的溶液流经装有阴离子交换树脂(ambersep900(oh)，伊诺凯试剂公司)的层析柱，重复3次。将离子交换后溶液装入透析袋(截止分子量为3500)放入超纯水中透析，透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，得c60(eda)9，本申请中简称c60-eda。溶液呈澄清的棕红色。
采用与1.1部分相同的反应步骤和条件，有所不同的是采用50mgc70固体(纯度：99％，厦门福纳新材料科技有限公司)替代c60，得c70(eda)9，本申请中简称c70-eda。
其他对上述结构的表征参见专利申请cn201610514134.4。
1.2羟基修饰的富勒烯衍生物c60-oh和c70-oh的合成。
(a)将7ml质量百分含量为30％的过氧化氢(分析纯，购于国药试剂)水溶液和3ml质量百分含量为40％的氢氧化钠(分析纯，国药试剂)水溶液加入100ml圆底烧瓶，加入200mg富勒烯c60固体(纯度：99％，厦门福纳新材料科技有限公司)，再加入磁力搅拌子(型号：b200)，使用磁力搅拌器搅拌24h(温度：70℃，转速：1000r/min)，使用溶剂过滤器(容积：1l，滤膜孔径：200nm，津腾公司)过滤得到棕黄色溶液。
(b)将(a)步骤得到的溶液加入50ml的离心管中，再加入过量的浓度为95％的乙醇(分析纯，国药试剂)。经过离心(转速：10000r/min，时间：4min)后去除上层无色溶液，将收集的沉淀溶于超纯水中，得到黄色澄清溶液。
(c)将(b)步骤得到的溶液装入透析袋(截止分子量为3500)放入超纯水中透析，透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，得到黄色溶液。
(d)将(c)步骤透析后的溶液装入50ml塑料离心管中，使用液氮冷冻后放入冷冻干燥机中冷冻干燥(温度：-29℃，真空度：55pa，时间：48h)，得到的黄色固体，即c60(o)5(oh)12，本申请中简称c60-oh。
采用与1.2部分相同的反应步骤和条件，有所不同的是采用等质量的c70替代c60，得c70(o)5(oh)12，本申请中简称c70-oh。
其他对上述结构的表征参见专利申请201610515403.9
1.3c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh的水合粒径测试。
将上述水溶性富勒烯衍生物配制成浓度为10μm水溶液(经多次检测，水溶液的浓度对水合粒径的影响很小，选择浓度为10μm进行检测)，通过滤膜(截止粒径为0.22μm)过滤后，取1毫升溶液加入到四面透光的塑料样品池中，使用动态光散射仪(dls,nano-zs90,英国马尔文有限公司)分别测试其水合粒径的大小。测试结果如表1所示，c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh的水合粒径都主要分布在150nm以下，其粒径较小容易被吞噬进入细胞内部。
表1水溶性富勒烯衍生物的水合粒径分布
1.4c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh的zeta电位测试。
将上述水溶性富勒烯衍生物配制成浓度为10μm水溶液，通过滤膜(截止粒径为0.22μm)过滤后，使用注射器取1毫升溶液注入专用测试池内，然后使用电位分析仪(nano-zs90,英国马尔文有限公司)测试其zeta电位的大小。测试结果如图1所示，c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh的zeta电位分布集中在25mv、40mv、-23mv和-28mv。zeta电位的符号能够反映富勒烯衍生物所带表面电荷的类型，其绝对值越大表示富勒烯衍生物溶液稳定性越好。从而可以证明c60-eda和c70-eda表面带正电荷，而c60-oh、c70-oh表面带负电荷，它们的zeta电位绝对值都较大，证明其具有较好的溶液稳定性。
实施例2、水溶性富勒烯衍生物增强正常细胞活性的实验
2.1cck-8检测正常细胞活性
cck-8细胞活性检测试剂是2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐]。cck-8被细胞线粒体中的琥珀脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(formazan)，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，通过检测细胞线粒体中还原性酶的活性进而间接反映细胞活性。
使用含10％牛胚胎血清的低糖dmem培养基和rpmi-1640培养基分别对hm细胞和hl-7702细胞进行孵育传代；使用胰蛋白酶消化得到hm细胞和hl-7702的细胞悬液，以5×104个/孔的细胞密度接种于透明的96孔培养板中，每孔加入200μl细胞悬液(hm细胞或hl-7702细胞)，在37℃和5％co2的细胞培养箱内培养24小时，细胞贴在96孔板底部生长；几个实验组移除上层培养基，分别加入200μl含有浓度为2.5、5、10、20、40、50、100、200、500μm的c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh的新鲜培养基，每组6复孔，而空白对照组只需更换成新鲜培养基，将96孔培养板置于细胞培养箱中孵育24小时；移除上层培养基，更换为90μl无色的培养基和10μl的cck-8，孵育60分钟至培养基颜色由橙红色变成亮黄色时，用酶标仪在450nm处测试96孔板上每个孔的吸光度，按说明书要求计算其相对的细胞活性，hm细胞和hl-7702细胞的检测结果分别见表2和表3。
表2不同浓度的富勒烯衍生物对hm细胞活性的提高比例
如表2所示，对于hm细胞，氨基修饰的富勒烯衍生物和羟基修饰的富勒烯衍生物在2.5μm的低浓度下均能够有效提高hm细胞线粒体中琥珀脱氢酶活性。在2.5-500μm浓度范围内，hm细胞线粒体中琥珀脱氢酶活性随c60-eda、c70-eda或c60-oh的浓度增大而提高，具有明显的量效关系，但提高时的特点不同。c60-eda、c70-eda在2.5-40μm浓度范围内，活性提高的速度要慢于c60-oh，但二者对活性的增强作用能持续增加，在高浓度500μm时，对活性的增强作用最大；而c60-oh在2.5-40μm浓度范围内，活性提高的速度更快，在40μm时其活性增强的百分比是2.5μm时8倍多，但在40-500μm的浓度范围内，活性增强作用不明显。而c70-oh则是在一定浓度对活性增强作用达到峰值，之后则开始下降。氨基修饰的富勒烯衍生物c60-eda能够更为显著地将琥珀脱氢酶活性活性提高40％。
表3不同浓度的富勒烯衍生物对hl-7702细胞活性的增强效果
如表3所示，对于hl-7702细胞，氨基修饰的富勒烯衍生物和羟基修饰的富勒烯衍生物在40μm的浓度下，水溶性富勒烯衍生物均能将细胞活性提高20％以上。但c60-eda、c60-oh、c70-oh均是在达到一定浓度后开始出现活性增强作用的下降，只有c70-eda在100-500μm的范围内，对hl-7702细胞线粒体中琥珀脱氢酶活性能继续增强，最终达到43％的增强作用。说明不同的水溶性富勒烯对hl-7702细胞的增强效果不同。
上述实验结果可以证明氨基修饰的富勒烯衍生物和羟基修饰的富勒烯衍生物能够显著增强hm和hl-7702的细胞线粒体中琥珀脱氢酶活性，并且cck-8检测的线粒体中琥珀酸脱氢酶活性能够反映细胞的活性。另外，在500μm的高浓度下，所有实验组的细胞线粒体中琥珀脱氢酶活活性都高于空白对照组，说明这三类富勒烯衍生物没有明显的细胞毒性。
线粒体是细胞的能量工厂，线粒体酶主要是催化细胞内能量物质代谢，为细胞、组织和生物体正常的生理活动提供能量；线粒体酶活性能够反映其新成代谢能力，酶活性增强也就意味着线粒体具有更高的供能效率，对于维持正常的生理功能和抵御外源性损伤和刺激都具有重要意义。
2.2alamarblue检测正常细胞活性
alamarblue细胞活性检测试剂在还原状态下转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，其激发光波长在530-560nm之间，本发明优选激发波长为550nm，发射光波长为590nm。在细胞增殖过程中，细胞内nadph/nadp,fadh/fad,fmnh/fmn和nadh/nad的比值升高，摄入细胞内的alamarblue被这些代谢中间体及细胞色素类还原后释放到细胞外并溶于培养基中，通过荧光光度计进行检测，其荧光强度能够反映细胞的总体活性状态。
nadph、nadp、fadh、fad、fmnh、fmn、nadh、nad都是细胞内重要的辅酶，都参与了糖、脂、蛋白质三大物质代谢的绝大部分氧化还原反应，在糖代谢产生atp的过程中发挥重要作用；适当的比值升高意味着细胞内的整体代谢能力提高，并且细胞内还原水平提高、具有更强的抗氧化损伤能力、让生物机体具有更强的活力和适用能力。
使用含10％牛胚胎血清的低糖dmem培养基和rpmi-1640培养基分别对hm细胞和hl-7702细胞进行孵育传代；使用胰蛋白酶消化得到hm细胞和hl-7702的细胞悬液，以5×104个/孔的细胞密度接种于黑色的96孔培养板中，每孔加入200μl细胞悬液(hm细胞或hl-7702细胞)，在37℃和5％co2的细胞培养箱内培养24小时，细胞贴在96孔板底部生长；移除上层培养基，各实验组分别加入200μl含有浓度为2.5、5、10、20、40μm的c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh的新鲜培养基，每组6复孔，而以添加了磷酸盐缓冲溶液(pbs)的新鲜培养基作为空白对照组，实验组和空白对照组均置于细胞培养箱中孵育24小时；移除上层培养基，更换为90μl无色的培养基和10μl的alamarblue(浓度：0.01mg/ml)，孵育60分钟至培养基颜色由紫色变成粉红色时，使用多功能酶标仪在550nm激发波长和590nm检测波长处测试96孔板上每个孔的荧光强度，以说明书要求来表示其相对的细胞活性。
表4不同浓度的富勒烯衍生物对hm细胞活性的增强效果
alamarblue是检测细胞内参与代谢的还原性物质的活性，能够从侧面反映细胞的活性。如表4所示，对于hm细胞，c60-eda、c70-eda、c60-oh在2.5μm的低浓度下对细胞活性的增强效果不明显，只有在10μm以上的高浓度下才能够显著提高细胞活性。c70-oh在2.5μm的低浓度下对细胞活性的增强效果能达到10％，但提高c70-oh的浓度后，其对细胞活性的增强效果并没有显著增强。
表5不同浓度的富勒烯衍生物对hl-7702细胞活性的增强效果
如表5所示，对于hl-7702细胞，c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh在2.5μm浓度下可以有效地增强细胞活性，在更高的浓度下对细胞活性的增强效果更为显著。
总之，c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh均能够显著增强人源细胞的线粒体活性(cck-8检测)，同时较为明显地提高人源细胞内涉及代谢的还原性物质的活性(alamarblue检测)。同时，c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh在500μm的高浓度下均没有出现明显的细胞毒性，证明这三类水溶性富勒烯衍生物在细胞水平上都具有显著的生物安全性，能够被广泛应用于生物医学领域。
实施例3、水溶性富勒烯衍生物加快正常细胞的增殖
应用5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(edu)和流式细胞仪检测c60-eda，c70-eda，c60-oh，c70-oh几种水溶性富勒烯衍生物孵育hm细胞和hl-7702细胞24h后，对细胞增殖产生的影响。检测方法如下：
1、荧光染料的配制：
a、10mm的edu溶液的配制：取4ml的二甲基亚砜加入10mg的edu试剂瓶中，用1ml的移液枪吹打均匀，然后将储存液置于-20℃的冰箱中保存，试剂可保存1年；
b、alexafluor488叠氮化物的配制：取130μl的二甲基亚砜加入alexafluor488叠氮化物的试剂瓶中，用200μl的移液枪吹打均匀，然后将储存液置于-20℃的冰箱中保存，试剂可保存1年；
c、1％的牛血清蛋白的配制：使用分析天平称取1g的牛血清蛋白于100ml的培养瓶中，加入100ml的1x的pbs，混合均匀，然后将储存液置于4-8℃的冰箱中保存；
d、1xclick-it渗透液和洗涤溶液的配制：取5ml的1xclick-it渗透液和洗涤溶液于50ml的培养瓶中，加入1％的牛血清蛋白至pbs缓冲溶液中，混合均匀，然后将储存液置于4-8℃的冰箱中保存；
e、10x的click-itedu缓冲添加剂的配制：取2ml的超纯水置于10x的click-itedu缓冲添加剂的试剂瓶中，混合均匀，然后将储存液置于-20℃的冰箱中保存，试剂可保存1年；
2、具体步骤：
a、edu标记细胞：
使用含10％牛胚胎血清的低糖dmem培养基和rpmi-1640培养基分别对hm细胞和hl-7702细胞进行孵育传代；将hm细胞或hl-7702细胞用胰酶消化后用培养基制备成细胞悬液，以1×105的细胞密度将细胞种于96孔板，每种细胞针对每种水溶性富勒烯衍生物(例如hm细胞针对c60-eda)为1组，每组分别种三个孔1，2，3，其中：1孔为空白对照孔，2孔为阴性对照孔，3孔为实验孔，共设置8组(2种细胞、4种水溶性富勒烯)。每组中：每个孔加入2ml的细胞悬液(hm细胞或hl-7702细胞)，孵育24h后，1，2号孔更换培养基，3号孔加入用培养基配制的终浓度为40μm的对应水溶性富勒烯(即：c60-eda、c70-eda、c60-oh或c70-oh)孵育24h，然后去掉2,3孔的培养液，然后用1x的pbs洗涤两次，随后在2，3号孔加入用培养基配制的终浓度为10μm的edu染料溶液(注：原液浓度为10mm,因此先取100μl的edu原液，再加900μl的超纯水稀释，绕后再用培养基稀释成终浓度为10μm)，孵育3h。
b、细胞固定与渗透
用胰酶消化2，3号孔的细胞，用培养液制备成1ml的细胞悬液置于10ml离心管中，离心去掉上清液，然后加入3ml的1％的牛血清蛋白洗涤两次，去掉上清液，在每个离心管中加入100μl的click-it固定液，用200μl的移液枪吹打均匀，室温避光条件下孵育15min，然后加入3ml的1％的牛血清蛋白洗涤两次，去掉上清液，在每个离心管中加入100μl的1xclick-it反应渗透液和洗涤液，用200μl的移液枪吹打均匀，室温避光条件下孵育15min，然后加入3ml的1％的bsa洗涤两次；
c、click-it反应：
1x的click-itedu缓冲添加剂的制备：按1:10的比例用超纯水稀释10x的click-itedu缓冲添加剂；
click-itreationcocktails
制备click-it反应溶液可参考下表
在步骤b的每个离心管中加入500μl的click-itreationcocktails，混合均匀，室温避光条件下孵育15min，然后加入3ml的1xclick-it反应渗透液和洗涤液洗涤一次，去掉上清液，每管加入1ml的1xclick-it反应渗透液和洗涤液制备细胞悬液；然后将1号孔用胰酶消化，用1xclick-it反应渗透液和洗涤液的制备成1ml的细胞悬液，然后上流式检测，其激发波长488nm的，发射波长：530-560nm。
实验结果显示：
对于hm细胞，对照组细胞孵育24h后，出现分裂增殖(通过“dna复制的s期细胞在总细胞中占比”表示)，其处在dna复制的s期细胞和分裂完成的子细胞占细胞总量的30.66％；在相同条件下，浓度为40μm的c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh孵育hm细胞24h后，其处在dna复制的s期细胞和分裂完成的子细胞占比分别为40.69％、44.26％、39.11％、44.68％，其细胞相对增殖率分别提高了10.03％、13.60％、8.45％、14.02％；
对于hl-7702细胞，对照组的处在dna复制的s期细胞和分裂完成的子细胞占细胞总量的为21.53％，浓度为40μm的c60-eda、c70-eda、c60-oh、c70-oh孵育24h后，处在dna复制的s期细胞和分裂完成的子细胞占细胞总量的比例分别提高至34.76％、34.86％、31.85％、36.90％，其细胞增殖率分别增加了13.23％、13.33％、10.32％、15.37％。
从而证明水溶性富勒烯衍生物能够加快hm细胞和hl-7702细胞增殖，将增殖速率提高了10％左右，没有导致恶性增殖。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。