相关申请的交叉引用
本申请要求在2013年5月14提交的u.s.s.n.61/823,169的优先权和权益，该案的全部内容通过引用结合在此。
本发明涉及化合物、制备这些化合物的方法以及包含这些化合物的药物组合物。
发明背景
fxr为配体激活的转录因子的核受体家族中的一员，其包括类固醇、类视黄醇以及甲状腺激素的受体(dj.曼格斯多夫(dj.mangelsdorf)等人,细胞(cell)83:841-850(1995))。rna印迹杂交分析和原位分析显示fxr在肝脏、肠、肾、以及肾上腺中大量表达(b.m.福尔曼(b.m.forman)等人,细胞81:687-693(1995)和w.森鸥罗(w.seol)等人,分子内分泌学(mol.endocrinnol.)9:72-85(1995))。fxr与9-顺式视黄酸受体(rxr)一起作为异源二聚体结合dna。大鼠fxr被微摩尔浓度的法尼醇类如法尼醇和保幼激素激活(b.m.福尔曼等人,细胞81:687-693(1995))。然而，这些化合物无法激活小鼠和人fxr，使得内源性fxr配体的性质仍然不能肯定。一些天然存在的胆汁酸(例如，鹅去氧胆酸(cdca)、去氧胆酸(dca)、石胆酸(lca)、以及它们的牛磺酸和甘氨酸共轭物)充当fxr配体并且在生理浓度下结合并激活fxr(wo00/37077)。
胆汁酸为形成于肝脏并分泌到肠的十二指肠中的胆固醇代谢物，在十二指肠中胆汁酸在膳食脂质和维生素的溶解和吸收中具有重要作用。大部分胆汁酸(约95％)随后在回肠中再吸收并且通过肠肝循环系统返回到肝脏。肝脏中胆固醇至胆汁酸的转化受反馈调节：胆汁酸下调细胞色素p4507a(cyp7a)的转录，cyp7a编码催化胆汁酸生物合成中的限速步骤的酶。据表明，fxr参与胆酸对cyp7a表达的抑制(d.w.拉塞尔(d.w.russell),细胞97:539-542(1999))。在回肠中，胆汁酸诱导肠胆汁酸结合蛋白(ibabp)的表达，该肠胆汁酸结合蛋白以高亲和性结合胆汁酸并可能参与它们的细胞摄取和运输。经证明，胆汁酸通过fxr激活介导它们对ibabp表达的作用，fxr结合在人、大鼠以及小鼠的ibabp基因启动子中保守的ir-1型应答元件。因此，fxr参与胆汁酸与胆固醇体内平衡所涉及的靶基因的刺激(ibabp)和抑制(cyp7a)两者。因此，需要适合于药物开发的fxr调节剂。本发明满足了这种需要。
发明概述
本发明提供化合物以及制备这些化合物的方法。
确切地，本发明提供一种具有式i的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物，其中r1、r2、r3、r4、r5以及r6是如在此所描述的。本发明的化合物在治疗和预防疾病及病状中是有用的。
本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物、以及一种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供一种用于治疗或预防疾病和病状的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，该疾病或病状是fxr介导的。
本发明还提供对一种用于治疗或预防疾病或病状(例如，由fxr介导的一种疾病和病状)的药物的生产，其中该药物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
本发明还提供一种在用于治疗或预防疾病或病状(例如，由fxr介导的一种疾病和病状)的方法中使用的组合物，其中该组合物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在本说明书中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式也包括复数。尽管可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等效于在此所述的方法和材料的方法和材料，但适合的方法和材料描述如下。在此提及的所有公开、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用结合。不承认在此所引用的参考文献是所要求的发明的现有技术。在发生冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，材料、方法以及实例仅仅是示意性的并且并不打算是限制性的。
本发明的其他特征和优点从以下详细说明和权利要求书将是清楚的。
附图说明
图1是示出了在hek293t细胞中的反式激活测定中本发明的化合物和一种比较化合物的活性的图。
图2是示出了本发明的化合物在以生理水平表达tgr5的人肠内分泌细胞中(a)以及在过表达tgr5的人中国仓鼠卵巢(cho)细胞中(b)的tgr5活性缺乏的一系列图。
图3是示出了本发明的化合物和其他比较化合物在调控ostα(a)、οsτβ(b)、bsep(c)、mrp2(d)、cyp7a1(e)、shp(f)、fgf-19(g)以及ugt2b4(h)的表达中的活性的一系列的图。
图4是示出了本发明的化合物和其他比较化合物在调控参与脂质代谢(a)、srebp-1c(b)、apocii(c)、以及pparγ(d)的pltp中的活性的一系列图。
图5是示出了本发明的化合物和其他比较化合物对pepck基因的调控的图。
图6是示出了用指定浓度的本发明的化合物处理4h的hepg2细胞中atp的测量结果的图。
图7是示出了针对id和iv给药化合物100的利胆作用(a)、针对id和iv给药化合物100随时间变化的分泌(b)、以及化合物100随时间变化的血浆浓度(c)的一系列图。
具体实施方式
本发明的化合物
本发明涉及一种具有式i的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物，其中：
r1为羟基；
r2为氢、羟基、烷基、或卤素，其中所述烷基为未被取代的或被一个或多个ra取代的；
r3为氢、羟基、烷基、或卤素，其中所述烷基为未被取代的或被一个或多个rb取代的；
r4为氢、烷基、烯基、炔基或卤素，其中所述烷基为未被取代的或被一个或多个rc取代的；
ra、rb以及rc各自独立地为卤素或羟基；
r5为羟基、oso3h、oso3-、ococh3、opo3h、opo32-、或氢；并且
r6为羟基、oso3h、oso3-、ococh3、opo3h、opo32-、或氢；
或者r5和r6与它们所连接的碳原子一起形成羰基。
在一个方面，本发明涉及一种具有式ii的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种具有式iii的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种具有式iv的化合物：
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物为化合物(例如，天然化合物，或为非盐、非溶剂化以及非共轭形式的化合物)。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物为药学上可接受的盐。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物为氨基酸共轭物。在一个方面，氨基酸共轭物为甘氨酸共轭物。在一个方面，氨基酸共轭物为牛磺酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i的化合物，其中r2或r3中之一为羟基或卤素，并且剩下的r2或r3为氢或未被取代的烷基。在一个方面，r2或r3中之一为羟基并且剩下的r2或r3为氢。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i的化合物，其中r5或r6中之一为羟基，并且剩下的r5或r6为氢。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r2为羟基或卤素。在一个方面，r2为羟基。在另一方面，r2为卤素。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r3为氢或未被取代的烷基。在一个方面，r3为氢。在另一方面，r3为甲基。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r2为羟基并且r3为氢。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r5为羟基。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r6为氢。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r2和r5各自为羟基并且r3和r6各自为氢。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r4为烷基或氢。在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中r4为未被取代的烷基。在一个方面，r4为甲基、乙基、丙基或丁基。在一个方面，r4为甲基或乙基。在一个方面，r4为甲基。在一个方面，r4为乙基。
在一个方面，本发明涉及化合物
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物为一种fxr激动剂。在一个方面，本发明的化合物为一种高度有效的fxr激动剂。例如，与cdca的15μμ相比，本发明的化合物激活fxr的浓度低于1μμ、低于0.8μμ、低于0.6μμ、低于0.4μμ、或低于0.2μμ(例如，如通过alphascreen测定测量的)。例如，本发明的化合物激活fxr的浓度低于0.2μμ(例如，如通过alphascreen测定测量的)。例如，与cdca的8.9μμ相比，本发明的化合物激活fxr的ec50低于1μμ、低于0.8μμ、低于0.6μμ、低于0.4μμ、或低于0.2μμ(例如，如通过alphascreen测定所测量的)。例如，本发明的化合物激活fxr的ec50低于0.2μμ(例如，如通过alphascreen测定所测量的)。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物对其他核受体没有活性。在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物不激活tgr5(例如，如通过htr-frettgr5测定所测量的，其中tgr5在生理水平下表达，或过表达)。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物诱导细胞凋亡。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物对人hepg2肝细胞没有表现出细胞毒性效应(例如，如通过ldh释放测定或细胞内atp分析所测量的)。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物不抑制选自以下各项的一种或多种cyp450亚型：cyp1a2、cyp3a4(绿色底物)、cyp3a4(蓝色底物)、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6以及cyp2e1。例如，本发明的化合物具有大于10μμ的ic50，如通过cpy450抑制测定所测量的。
在一个方面，本发明涉及一种具有式i、ii、iii或iv的化合物，其中该化合物不抑制人erg钾通道。
在一个方面，本发明涉及一种合成本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物的方法。
在一个方面，本发明涉及一种含有一种或多种本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物的试剂盒。在一个方面，该试剂盒进一步含有一种药学上可接受的成分。
在一个方面，本发明涉及一种包含本发明的化合物和一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
有待通过本发明解决的一个技术问题是对为核激素法尼醇x受体(fxr)的激动剂的新型化合物的鉴定，该核激素法尼醇x受体代表治疗代谢和慢性肝病的有吸引力的靶标。众所周知的是，天然胆汁酸不仅调节若干核激素受体，而且还是用于g蛋白偶联受体(gpcr)tgr5的激动剂。对于旨在调节核激素受体的药物化合物而言，选择性可能成问题。因此，本发明的一个目的是提供一种为特异性fxr激动剂的化合物，例如，一种对其他核受体不表现活性的化合物，或一种不激活胆汁酸gpcrtgr5的化合物。药物化合物开发中的其他问题包括不适合的药物代谢动力学曲线、安全问题如毒性(例如，肝脏)以及不良的药物-药物相互作用。因此，本发明的另外的目的是提供不受制于上述技术问题的化合物，即一种具有适合的药物代谢动力学曲线的化合物、一种对细胞不产生细胞毒性效应的化合物、一种不抑制细胞色素p450酶的化合物，和/或一种不抑制herg的化合物。
在此提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员能够获得的知识。在此引用的已授权专利、申请以及文献通过引用结合在此，达到如同每个被确切并单独地表明而通过引用结合的相同程度。在出现不一致的情况下，以本披露为准。
出于本发明的目的，将使用以下定义(除非另外明确说明)。
通篇使用的通用化学术语具有它们常用的含义。例如，术语烷基是指支链的或非支链的饱和烃基。术语“正烷基”是指非支链烷基基团。术语“cx-cy烷基”是指支链或非支链烃基中具有x与y之间(包含端值)个碳原子的烷基基团。以实例说明但非限制，术语“c1-c8烷基”是指具有1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的直链或支链烃部分。“c1-c6”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链烃部分。“c1-c4烷基”是指具有1、2、3或4个碳原子的直链或支链烃部分，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、以及叔丁基。术语“c1-c4正烷基”是指具有1、2、3或4个碳原子的直链烃部分，包括甲基、乙基、正丙基、以及正丁基。术语“c3-c6环烷基”是指环丙基、环丁基、环戊基、以及环己基。术语“c3-c7环烷基”还包括环庚基。术语“c3-c8环烷基”还包括环辛基。环烷基烷基是指通过烷基接头链连接的环烷基部分，如例如但非限制，环丙基甲基、环丙基乙基、环丙基丙基、环丙基丁基、环丁基甲基、环丁基乙基、环丁基丙基、环戊基甲基、环戊基乙基、环戊基丙基、环己基甲基、环己基乙基、以及环己基丙基。每个烷基、环烷基以及环烷基烷基基团可以如在此所指明的被任选地取代。
术语“c4-c8环烯基”是指具有一个或多个不饱和位点(例如，一个或多个双键)的环丁烯基、环戊基、环己烯基、环庚烯基、以及环辛烯基环。
术语“卤素”是指氟、氯、溴、或碘。
术语“羟基”意指oh。
应理解，“取代”或“被…取代”包括隐含条件，即这种取代与被取代原子及取代基的许可化合价一致，并且该取代产生一种稳定的化合物，该化合物例如不会通过如重排、环化、消去等而自发进行转变。如在此所使用的，除非另外指明，否则认为术语“取代的”包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广义方面，可允许的取代基包括有机化合物的无环和有环的、支链和非支链的、碳环和杂环的、芳族和非芳族的取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个并且相同或不同。出于本发明目的，杂原子如氮可以具有氢取代基和/或在此所述的满足杂原子化合价的有机化合物的任何可允许的取代基。本发明不意图以任何方式限制于有机化合物的可允许的取代基。
在此作为形容词使用的术语“药用”或“药学上可接受的”意指基本上无毒并且对受者基本上无害。
“药用配制品”进一步意指载体、溶剂、赋形剂以及盐必须与配制品中的活性成分(例如，本发明的化合物)相容。本领域的技术人员理解的是，术语“药用配制品”和“药物组合物”通常可互换，并且出于本申请的目的它们被如此使用。
根据本发明的适合的药学上可接受的盐可由本领域的技术人员容易地确定，并且将包括：例如碱盐，如由铝、钙、锂、镁、钾、钠以及锌制成的碱金属或碱土金属盐；或由ν,ν'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(n-甲基葡糖胺)以及普鲁卡因制成的有机盐。也可以使用具有药学上可接受的胺，如赖氨酸、精氨酸、缓血酸胺、三乙胺等等的盐。本发明的化合物的此类盐可以使用常规技术由本发明的化合物，例如通过使适当的碱与本发明的化合物发生反应来制备。
当在药品中使用时，本发明的化合物的盐应该是药学上可接受的，但是药学上不可接受的盐可以方便地用于制备游离碱或其药学上可接受的盐。
如在此所使用的，术语“氨基酸共轭物”是指本发明的化合物与任何适合的氨基酸的共轭物。在一个方面，本发明的化合物的这种适合的氨基酸共轭物将具有在胆汁或肠液中完整性增强的附加优点。本发明涵盖任何本发明化合物的甘氨酸和牛磺酸共轭物。例如，一种具有式i的化合物的甘氨酸和牛磺酸共轭物具有以下式：
在一个方面，本发明的化合物的甘氨酸和牛磺酸共轭物可以是其药学上可接受的盐。可以根据本领域已知的方法制备本发明的化合物的氨基酸共轭物。例如，可以使用标准肽偶联条件将游离酸偶联到甘氨酸或牛磺酸氨基酸。
在一个方面，化合物100的牛磺酸共轭物的钠盐可以如下制备。
在一种极性质子性溶剂(例如，etoh)中使用一种碱(例如，et3n)和牛磺酸来处理化合物100。所得混合物可以用一种偶联试剂(例如，dmt-mm(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物))处理。可以将反应混合物浓缩并溶解在一种碱(例如，3％w/v的naoh水性溶液)中。所得反应混合物可以用一种有机溶剂(例如，acoet)来萃取。可以将水相浓缩并在一个硅垫上过滤，首先用例如h2o洗脱(直到到达中性ph)，然后用例如80:20v/v的h2o/meoh洗脱，以获得化合物100的牛磺酸共轭物。适合的氨基酸包括但不限于甘氨酸和牛磺酸。
本发明的化合物中的一些可以呈非溶剂化形式以及溶剂化形式(例如像水合物)存在。
本发明提供用于合成在此描述的本发明化合物的方法。本发明还提供用于根据以下实例中所示出的方案来合成本发明的不同所披露化合物的详细方法。
本发明的合成方法可以容许各种各样的官能团，因此可以使用各种取代的起始材料。该方法在整个过程结束时或接近结束时基本上提供所希望的最终化合物，但是在某些情况下可能需要进一步使该化合物转化成其药学上可接受的盐、酯或前药。
本发明的化合物可以使用商业上可获得的起始材料、文献中已知或来自容易制备的中间体的化合物，通过采用本领域技术人员已知的或鉴于在此的教导对熟练的技术人员将是显而易见的标准合成方法和步骤，以各种方式来制备。用于有机分子制备以及官能团转化和操控的标准合成方法和程序可以从相关科学文献或从本领域中的标准教科书中获得。虽然不局限于任何一种或多种来源，但是通过引用结合在此的以下经典文献是有用的，并且是本领域的技术人员已知的公认的有机合成参考教科书：如史密斯m.b.(smith,m.b.)、马奇j.(march,j.)、马奇的高等有机化学：反应、机理和结构(advancedorganicchemistry:reactions,mechanisms,andstructure),第5版,约翰威立父子公司(johnwiley&sons)：纽约，2001；以及格林t.w.(greene,t.w.)、伍兹p.g.m.(wuts,p.g.m.),有机合成中的保护基(protectivegroupsinorganicsynthesis),第3版,约翰威立父子公司：纽约，1999。合成方法的以下描述是为说明而设计的，而非限制用于制备本发明的化合物的通用程序。
在此申请中使用的所有缩写见于由约翰威立父子公司出版的“有机合成中的保护基”、或由默克公司(merck&co.,inc)出版的默克索引(merckindex)、或由化学品供应商如奥德里奇(aldrich)或根据本领域的使用技术提供的其他化学书或化学品目录。
方案1
试剂和条件：a)1)meoh，p-tsa，超声，3h，定量的；2)ac2o，nahco3，thf，回流12h，85％；b)pcc，ch2cl2，6h，62％；c)ac2o，bi(otf)3，ch2cl2，1h，91％；d)br2，苯，30℃过夜，74％；e)nabh4，naoac，pyr，室温2天，80％；f)hi57％，acoh，室温30min；g)cro3，acoh，室温45min；h)zn粉，naoac，回流20min；i)naoh2m，meoh，室温过夜，65％，自化合物5计；l)nabh4，thf/h2o4:1，70％；m)na(s)，sec-buoh，50℃，70％。
该合成是基于使用6α-乙基-胆酸(6-eca，1)作为起始材料，该6α-乙基-胆酸是使用本领域已知的方法制备的。将6-eca(1)在超声辐射下在meoh中用p-tsa处理以获得相应的甲酯，通过在nahco3存在下在thf中用ac2o回流而使该甲酯在c3位置处受到选择性保护，从而得到化合物2。在室温下在ch2cl2中用pcc处理化合物2，然后在室温下在ch2cl2中用ac2o、bi(otf)3处理得到中间体3α,7α-二乙酰氧基-12-氧代-5β-胆烷-24-酸甲酯(化合物3；约48％，自化合物2计)。
在苯中用br2处理化合物3，持续例如12h，产生化合物4。在新蒸馏的吡啶中使化合物4与nabh4和naoac反应，获得相应的11β-12β环氧化物(化合物5)，在硅胶纯化后收率为约59％。在室温下在acoh中使化合物5与hi反应，得到卤代醇中间体，然后在acoh中用cro3对该卤代醇中间体的c11位置进行氧化，产生化合物6。在沸腾的acoh中使化合物6与zn粉反应并且进行碱性水解(naoh/meoh)，得到3α,7α-羟基-12-酮基-5β-胆烷-24-羧酸(化合物7；约65％收率，自化合物5计)。
在混合物thf/h2o＝(4:1，v/v)中使用nabh4对化合物7的c11-羰基进行立体选择性还原，获得3α,7α,11β-三羟基-6α-乙基-5β-胆烷-24-羧酸(化合物100；约27％，自化合物3计)，色谱纯化后得到化合物100。可替代地，在50℃下在sec-buoh中用钠还原化合物7，纯化后获得化合物101(约70％收率)。
“溶剂化物”意指含有化学计算量或非化学计算量的溶剂的溶剂加成形式。一些化合物在结晶固体状态下具有捕获固定摩尔比的溶剂分子、从而形成溶剂化物的倾向。如果溶剂是水，则形成的溶剂化物是水合物；当溶剂是醇时，则形成的溶剂化物是醇化物。水合物是通过一个或多个水分子与一种物质的结合而形成的，其中水保持其分子状态为h2o，这种结合能形成一种或多种水合物。
术语“适合的溶剂”是指对将要进行的反应为惰性的、足以溶解反应物从而提供可在其中完成所需反应的介质的任何溶剂或溶剂混合物。
在此描述的化合物可具有不对称中心。含有不对称地取代原子的本发明的化合物可以以旋光体或消旋体形式被分离。如何制备旋光体在本领域是熟知的，如通过消旋式的拆分，或通过从旋光的起始材料合成。烯烃的许多几何异构体、c＝n双键等也可以存在于在此描述的化合物中，并且本发明包括所有这样的稳定异构体。本发明的化合物的顺式和反式几何异构体得到描述并且可以作为异构体的混合物或者作为分离的异构形式被分离。除非具体地指出特定的立体化学或异构形式，否则一种结构的所有手性、非对映异构体、消旋以及几何异构体形式都被预期。用于制备本发明的化合物的以及其中制造的中间体的所有工艺被认为是本发明的部分。展示或描述的化合物的所有互变异构体也被认为是本发明的部分。此外，本发明还包括在此描述的化合物的代谢物。
本发明还包括同位素标记的化合物，这些化合物与以本发明的式叙述的那些化合物相同，只是一个或多个原子被所具有的原子质量或质量数不同于自然界中最常见的原子质量或质量数的一个原子代替。可以掺入到本发明的化合物中的同位素实例包括氢、碳、氮、氟的同位素，如3h、11c、14c、2h以及18f。
含有上述同位素和/或其他原子的其他同位素的本发明的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物在本发明的范围内。同位素标记的本发明的化合物，例如掺入放射性同位素如3h和14c的那些，在药物和/或底物组织分布测定中是有用的。氚化的即3h以及碳-14即14c同位素因其容易制备和可检测性而特别优选。11c和18f同位素在pet(正电子发射断层扫描)中是特别有用的。pet可用于脑成像。另外，用较重的同位素如氘即2h取代可以获得源于更大的代谢稳定性(例如增加的体内半衰期和减少的剂量需求)的某些治疗优点，并且因此在一些情况下是优选的。同位素标记的本发明的化合物总体上可以通过本领域已知的技术来制备，如通过实施以下在方案和/或实例中披露的步骤、通过用容易获得的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂。在一个实施例中，本发明的化合物、其盐、水合物、溶剂化物或氨基酸共轭物是非同位素标记的。
当任一变量(例如，rx)在一种化合物的任一构成部分或式中出现不止一次时，其每次出现时的定义与其所有其他次出现时的定义无关。因此，例如，如果一个基团显示被一个或多个rx部分取代，那么每次出现时的rx是独立选自rx的定义。而且，取代基和/或变量的组合是可允许的，只要此类组合产生在指定原子的正常价位内的稳定化合物即可。
如在此所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指在目前患有一种病状的受试者中以任何相当可观的程度减少该病状的症状、标志物和/或任何负面影响。在一些实施例中，可以向仅表现出该病状的早期病征的受试者给予治疗，目的是为了降低发展成该疾病或病状的风险。
如在此所使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指用于部分地或完全地预防或延迟疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发作的任何方法。可以向没有表现出疾病或病状的病征的受试者给予预防。
如在此所使用的，“受试者”意指人或动物(就动物而言，更典型地是哺乳动物)。在一个方面，受试者是人。此受试者可以被认为需要使用fxr激动剂治疗。
如在此所使用的，“未饱和的”是指具有至少一个不饱和度(例如，至少一个双键或三键)的化合物或结构。
如在此所使用的，术语“本发明的化合物”包括一种具有式i、ii、iii或iv中任一个的化合物、或在此明显披露的任何化合物。
如在此所使用的，法尼醇x受体或fxr是指此类受体的所有哺乳动物形式，包括例如选择性剪接亚型和天然存在的亚型(参见，例如胡贝尔(huber)等人,基因,290:35-43(2002))。代表性fxr种类包括但不限于大鼠fxr(基因库登录号nm_021745)、小鼠fxr(基因库登录号nm_009108)、以及人类fxr(基因库登录号nm_005123)。
如在此所使用的，化合物a是
如在此所使用的，化合物b是
如在此所使用的，化合物c是
如在此所使用的，化合物d是
如在此所使用的，化合物e是
如在此所使用的，胆酸是
如在此所使用的，鹅去氧胆酸是
如在此所使用的，熊去氧胆酸是
如在此所使用的，牛磺鹅去氧胆酸是
如在此所使用的，牛熊去氧胆酸是
如在此所使用的，石胆酸是
本发明的方法
本发明的化合物可用于对受试者如哺乳动物(包括人)的治疗。具体地，本发明的化合物可用于一种在受试者中治疗或预防疾病或病状的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，该疾病或病状是fxr介导的(例如，fxr在该疾病或病状的引发或进展中起作用)。在一个方面，该疾病或病状是由降低的fxr活性介导的。在一个方面，该疾病或病状是选自心血管疾病、慢性肝病、脂质失调、胃肠疾病、肾脏疾病、代谢疾病、癌症以及神经疾病。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防心血管疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗心血管疾病的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防心血管疾病的方法。在一个方面，心血管疾病选自动脉粥样硬化、动脉硬化、血脂异常、高胆固醇血症、高血脂症、高脂蛋白血症以及高甘油三酯血症。
术语“高血脂症”是指血液中存在异常升高的脂质水平。高血脂症可以至少三种形式出现：(1)血胆固醇过多，即升高的胆固醇水平；(2)高甘油三酯血症，即升高的甘油三脂水平；以及(3)混合型高脂血症，即血胆固醇过多和高甘油三酯血症的组合。
术语“血脂异常”是指血浆中脂蛋白的不正常水平，包括脂蛋白的抑制水平和/或升高水平(例如，ldl、vldl的升高水平以及hdl的抑制水平)。
在一个方面，本发明涉及一种方法，该方法选自在受试者中降低胆固醇水平或调节胆固醇代谢、分解代谢、膳食胆固醇的吸收、以及胆固醇逆转运，包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防影响胆固醇、甘油三酯、或胆汁酸水平的疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中降低甘油三酯的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防与升高的胆固醇水平相关联的疾病状态的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗与升高的胆固醇水平相关联的疾病状态的方法。在一个方面，本发明涉及一种在受试者中预防与升高的胆固醇水平相关联的疾病状态的方法。在一个方面，该疾病状态选自冠状动脉疾病、心绞痛、颈动脉病、中风、脑动脉硬化、以及黄色瘤。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防脂质失调的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗脂质失调的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防脂质失调的方法。
脂质失调是关于胆固醇以及甘油三酯的异常的术语。脂质异常与患血管病、尤其是心脏病和中风的风险增加相关联。脂质失调的异常是遗传易感性与膳食摄入的性质的组合。许多脂质失调与体重过重相关联。脂质失调还可与其他疾病包括糖尿病、代谢性综合征(有时称作胰岛素抵抗综合征)、甲状腺功能减退相关联，或者是某些药物(如用于经历移植的人的抗排斥方案的那些)造成的后果。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防影响脂质代谢的疾病(即，脂肪代谢障碍)的一种或多种症状的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗影响脂质代谢疾病的一种或多种症状的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防影响脂质代谢疾病的一种或多种症状的方法。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中减少脂质积累的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防慢性肝病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗慢性肝病的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防慢性肝病的方法。在一个方面，慢性肝病选自原发性胆汁性肝硬化(pbc)、脑腱黄瘤病(ctx)、原发性硬化性胆管炎(psc)、药物诱导的胆汁淤积症、妊娠肝内胆汁淤积症、肠胃外营养相关联的胆汁淤积症(pnac)、细菌过度生长或败血症相关联的胆汁淤积症、自身免疫性肝炎、慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、肝移植相关联的移植物抗宿主疾病、活供体移植肝再生、先天性肝纤维化、胆总管结石病、肉芽肿性肝病、肝内或肝外恶性肿瘤、斯耶格伦氏综合征、类肉状瘤病、威尔逊氏病、高雪氏病、血色素沉着症以及α1-抗胰蛋白酶缺乏症。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防胆汁淤积症的一种或多种症状(包括胆汁淤积症的并发症)的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗胆汁淤积症的一种或多种症状的方法。在一个方面，本发明涉及预防胆汁淤积症的一种或多种症状。
胆汁淤积症典型地由在肝脏内(肝内)或在肝脏外(肝外)的因素造成，并且导致胆盐、胆汁色素胆红素、以及脂质在血流中积累，而非被正常地排除。肝内胆汁淤积症的特征为小导管的广泛堵塞、或失调(如肝炎)，这些损害了身体排除胆汁的能力。肝内胆汁淤积症还可由酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、从身体的另一部分蔓延(转移)的癌症、原发性硬化性胆管炎、胆结石、胆绞痛以及急性胆囊炎造成。它也可能作为外科手术、严重损伤、囊性纤维化、感染、或静脉内营养的并发症发生，或者是被药物诱导的。胆汁淤积症也可能作为妊娠的并发症发生，并且常常在妊娠第六个月与第九个月期间出现。
肝外胆汁淤积症最经常由胆总管结石病(胆管结石)、良性胆道狭窄(总胆管的非癌性变窄)、胆管癌(导管癌)以及胰腺癌造成。肝外胆汁淤积症可能以许多药物的副作用的形式发生。
本发明的化合物可用于治疗或预防肝内或肝外胆汁淤积症的一种或多种症状，包括但不限于胆道闭锁、产科胆汁淤积症、新生儿胆汁淤积症、药物诱导的胆汁淤积症、丙型肝炎感染引起的胆汁淤积症、慢性胆汁淤积肝病如原发性胆汁性肝硬化(pbc)、以及原发性硬化性胆管炎(psc)。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中增强肝再生的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，该方法是针对肝移植增强肝再生。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防纤维化的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗纤维化的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防纤维化的方法。
因此，如在此所使用的，术语纤维化是指所有公认的纤维变性病，包括由于病理状况或疾病导致的纤维化、由于物理创伤导致的纤维化(“创伤性纤维化”)、由于放射性损伤导致的纤维化、以及由于接触化疗药物导致的纤维化。如在此所使用的，术语“器官纤维化”包括但不限于肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化、以及肠纤维化。“创伤性纤维化”包括但不限于后继于外科手术(手术瘢痕)、意外物理创伤、烧伤、以及增生性瘢痕的纤维化。
如在此所使用的，“肝纤维化”包括由于任何原因导致的肝纤维化，包括但不限于：病毒诱导的肝纤维化如由于乙型肝炎或丙型肝炎病毒导致的肝纤维化；由于与酒精(酒精性肝病)、某些药用化合物(包括但不限于甲氨蝶呤、一些化学治疗剂、以及大剂量长期摄入的含砷制剂或维生素a)、氧化应激、癌症放射疗法或某些化工原料(包括但不限于四氯化碳和二甲基亚硝胺)接触导致的纤维化；以及由如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、脂肪肝、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎、囊性纤维化、血色素沉着症、自身免疫性肝炎、以及脂肪性肝炎的疾病导致的肝纤维化。目前对肝纤维化的疗法主要涉及除去致病因子，例如除去过量的铁(例如，就血色素沉着症而言)、减少病毒载量(例如，就慢性病毒性肝炎而言)、或者消除或减少对毒素的接触(例如，就酒精性肝病而言)。也已知消炎药如皮质甾类和秋水仙素可用于治疗可引起肝纤维化的炎症。
如本领域所已知的，通常基于活组织检查标本的组织学检查，肝纤维化在临床上可以被划分为五个严重度时期(s0、s1、s2、s3以及s4)。s0指示没有纤维化，而s4指示肝硬化。尽管对于纤维化严重度分期存在不同的标准，但一般而言纤维化的早期是以肝脏的一个门(区)中的不连续、局部的瘢痕区域鉴定的，而纤维化的晚期是以桥接的纤维化(跨越肝脏的多个区的瘢痕)鉴定的。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防器官纤维化的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，纤维化是肝纤维化。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防胃肠疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗胃肠疾病的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防胃肠疾病的方法。在一个方面，胃肠疾病选自炎症性肠病(ibd)、肠道易激综合征(ibs)、细菌过度生长、吸收障碍、放射后结肠炎、以及显微镜下结肠炎(microscopiccolitis)。在一个方面，炎症性肠病选自克罗恩病和溃疡性结肠炎。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防肾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗肾病的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防肾病的方法。在一个方面，肾病选自糖尿病肾病、局灶性节段性肾小球硬化(fsgs)、高血压性肾硬化、慢性肾小球肾炎、慢性移植肾小球病、慢性间质性肾炎、以及多囊肾病。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防代谢疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗代谢疾病的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防代谢疾病的方法。在一个方面，代谢疾病选自胰岛素抗性、高血糖症、糖尿病、肥糖病、以及肥胖症。在一个方面，糖尿病是i型糖尿病。在一个方面，糖尿病是ii型糖尿病。
糖尿病，通常称为多尿症，是指通常特征为在葡萄糖的产生和利用上有代谢缺陷而导致无法保持身体内适当的血糖水平的一种疾病或病状。
就ii型糖尿病而言，该疾病的特征为胰岛素抗性，其中胰岛素丧失其在宽浓度范围内发挥其生物效应的能力。这种对胰岛素反应性的抗性导致肌肉内对葡萄糖摄取、氧化和贮存的胰岛素激活不足，以及对脂肪组织中脂类分解和肝中葡萄糖产生和分泌的胰岛素抑制不足。所导致的病状是血糖升高，这也称作“高血糖症”。不受控制的高血糖症与死亡率增加和过早死亡相关联，这归因于患微血管疾病和大血管疾病的风险增加，这些疾病包括视网膜病变(眼中的血管损伤所导致的视力损害或丧失)；神经病变(神经系统的血管损伤所导致的神经损伤和脚部问题)；以及肾病变(肾脏中的血管损伤所导致的肾脏疾病)；高血压、脑血管病以及冠心病。因此，控制葡萄糖稳态是治疗糖尿病的至关重要的途径。
假设胰岛素抗性使高血压、葡萄糖耐受不良、高胰岛素血症、甘油三酯水平增加和hdl胆固醇降低、以及中心性肥胖症和全身性肥胖症的簇集合为一体。已将胰岛素抗性与葡萄糖耐受不良、血浆甘油三酯的增加和高密度脂蛋白胆固醇浓度的降低、高血压、高尿酸血症、较小较致密的低密度脂蛋白颗粒、以及高循环水平的纤溶酶原激活物抑制剂-1的结合称为“x综合征”。因此，提供了治疗或预防与胰岛素抗性有关的任何病症(包括组成“x综合征”的疾病状态、病状或病症的簇集)的方法。在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防代谢综合征的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗代谢综合征的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防代谢综合征的方法。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防癌症的方法。在一个方面，癌症是结肠直肠癌。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防胆结石的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗胆结石的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防胆结石的方法。
胆结石是通过胆汁组分的堆积而在胆囊内形成的一种结晶架。这些结石在胆囊中形成，但是可向远端进入胆道的其他部分，如胆囊管、总胆管、胰管、或法特氏壶腹。罕见地，在严重炎症的情况下，胆结石可侵蚀穿过胆囊进入黏附的肠中，这可能造成阻塞，称之为胆石性肠梗阻。胆囊中胆结石的存在可能导致急性胆囊炎，这是一种特征为胆囊中胆汁滞留以及常常由肠微生物(主要为大肠杆菌和拟杆菌属种类)引起的继发性感染的炎症性病状。胆道其他部分中胆结石的存在可能致使胆管阻塞，这可导致严重的病状如上行性胆管炎或胰腺炎。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防胆固醇性胆结石病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗胆固醇性胆结石病的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防胆固醇性胆结石病的方法。
在一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗或预防神经疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种治疗神经疾病的方法。在一个方面，本发明涉及一种预防神经疾病的方法。在一个方面，神经疾病是中风。
在一个方面，本发明涉及一种如在此所描述的方法，并且此外，其中该化合物通过选自以下各项的一个途径来给予：口服、肠胃外、肌内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼睛、阴道、直肠以及脑室内。在一个方面，该途径是口服。
在一个方面，在一种或多种在此描述的方法中使用的化合物是一种fxr激动剂。在一个方面，该化合物是一种选择性fxr激动剂。在一个方面，该化合物不激活tgr5。在一个方面，该化合物不激活参与代谢途径的其他核受体(例如，如通过alphascreen测定所测量的)。在一个方面，参与代谢途径的此类其他核受体选自lxrβ、pxr、car、pparα、pparδ、rarα、vdr、tr、pr、rxr、gr以及er。在一个方面，该化合物诱导细胞凋亡。
在一个方面，本发明涉及一种调控胆汁酸体内平衡所涉及的一种或多种基因的表达水平的方法。
在一个方面，本发明涉及一种通过向一个细胞给予本发明的化合物而在该细胞中下调选自cyp7αl和srebp-1c的一种或多种基因的表达水平的方法。在一个方面，本发明涉及一种通过向一个细胞给予本发明的化合物而在该细胞中上调选自ostα、ostβ、bsep、shp、ugt2b4、mrp2、fgf-19、pparγ、pltp、apocii、以及pepck的一种或多种基因的表达水平的方法。
本发明还涉及对一种用于治疗或预防疾病或病状(例如，由fxr介导的一种疾病和病状)的药物的生产，其中该药物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及对一种用于治疗或预防上文所述的任何一种疾病或病状的药物的生产，其中该药物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
本发明还涉及一种在用于治疗或预防疾病或病状(例如，由fxr介导的一种疾病和病状)的方法中使用的组合物，其中该组合物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。在一个方面，本发明涉及一种在用于治疗或预防上文所述的任何一种疾病或病状的方法中使用的组合物，其中该组合物包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物或氨基酸共轭物。
配制品
本发明的方法包括给予有效量的本发明的化合物的步骤。如在此所使用的，术语“有效量”是指足以实现指定效果的本发明的化合物的量。因此，在用于预防或治疗fxr介导的疾病或病状的方法中使用的本发明的化合物的有效量将是足以预防或治疗该fxr介导的疾病或病状的量。
类似地，在用于预防或治疗胆汁淤积肝病或增加胆汁流量的方法中使用的本发明的化合物的有效量将是足以增加胆汁向肠的流量的量。
产生所希望的生物效应所需的本发明的化合物的量将取决于许多因素，如预期的用途、给药方式以及受者，并且最终将由负责的医师或兽医来判断。一般来说，用于治疗一种fxr介导的疾病和病状的典型的每日剂量，例如，可以预期在约0.01mg/kg至约100mg/kg的范围内。这个剂量可以作为单一的单位剂量或作为几个独立的单位剂量或者通过连续输注来给予。类似的剂量将适用于其他疾病、病状的治疗、以及包括预防和治疗胆汁淤积肝病的疗法。
因此，在另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包括作为活性组分的本发明的化合物连同至少一种药用载体或稀释剂，和/或本发明的化合物与至少一种药用载体或稀释剂的混合物。这些药物组合物可以用于预防或治疗前述疾病或病状。
载体必须是药学上可接受的并且必须与该组合物中的其他成分相容，即不会对其他成分造成不利影响。载体可以是一种固体或液体，并且优选被配制为一种单位剂量配制品，例如可能含有按重量计0.05％至95％的活性成分的片剂。如果需要，也可以将其他生理活性成分掺入在本发明的药物组合物中。
可能的配制品包括那些适于口服、舌下、颊面、肠胃外(例如皮下、肌内或静脉内)、直肠、局部给药包括经皮、鼻内和吸入给药的那些配制品。对于特定患者，最适合的给药方式将取决于正治疗疾病或病状的性质和严重度或所用疗法的性质并且取决于活性化合物的性质，但是可能的话，口服给药对于预防和治疗fxr介导的疾病和病状是优选的。适于口服给药的配制品可以作为以下形式提供：离散单位，如片剂、胶囊剂、扁囊剂、锭剂，每一单位含有预定量的活性化合物；粉剂或颗粒剂；呈水性或非水性液体的溶液或悬浮液；或水包油或油包水型乳液。
适于舌下或颊面给药的配制品包括：锭剂，其含有活性化合物和典型地调味基体，如糖和阿拉伯胶或黄耆胶；以及软锭剂，其包含在惰性基体中的活性化合物，该惰性基底如明胶和甘油、或蔗糖阿拉伯胶。
适于肠胃外给药的配制品典型地包括含预定浓度的活性化合物的无菌水性溶液，该溶液优选是与预期受者的血液等渗的。
适于肠胃外给药的另外的配制品包括含有生理上适合的共溶剂和/或络合剂如表面活性剂和环糊精的配制品。对于肠胃外配制品，水包油型乳液也是适合的。尽管这些溶液优选通过静脉给予，但是它们也可以通过皮下或肌内注射来给予。
适于直肠给药的配制品优选提供为单位剂量的栓剂，这些栓剂包含在形成栓剂基体的一种或多种固体载体(例如可可脂)中的活性成分。
适于局部或鼻内应用的配制品包括软膏剂、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂以及油剂。适于制剂配制品的载体包括凡士林油、羊毛脂、聚乙二醇、醇类以及它们的组合。
本发明的配制品可以通过任何适合的方法来制备，典型地通过按所需的比例将活性化合物与液体或细分的固体载体或与这二者均一地且紧密地混合，然后，如果需要的话，将所得混合物成型为所希望的形状。
例如，片剂可以通过压制包含活性成分的粉末或颗粒及一种或多种任选的成分如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂或表面活性分散剂的紧密混合物，或通过模制粉状活性成分和惰性液体稀释剂的紧密混合物来制备。
适于吸入给药的配制品包括可由不同类型的定量加压喷雾器、雾化器或吹入器产生的细粒粉尘或薄雾。
对于通过口腔的肺部给药来说，粉末或小滴的粒径典型地在0.5-10μm、优选1-5μm的范围内，以便确保递送到支气管树中。对于鼻内给药来说，优选粒径在10-500μm的范围内，以便确保保留在鼻腔中。
定量吸入器为加压气雾剂分配器，典型地含有活性成分在液化推进剂中的悬浮液或溶液的配制品。在使用时，这些装置将配制品排放通过适于递送定量体积(典型地10-150μl)的一个阀，以产生含有活性成分的微粒喷雾。适合的推进剂包括某些氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷以及它们的混合物。该配制品可以另外地含有一种或多种共溶剂，例如乙醇表面活性剂(如油酸或失水山梨糖醇三油酸酯)、抗氧化剂以及适合的调味剂。
雾化器为可商购获得的装置，其通过使一种压缩气体(典型地空气或氧气)加速通过一个窄的文氏管口或通过超声搅拌而将活性成分的溶液或悬浮液转变成一种治疗性气雾剂薄雾。适用于雾化器的配制品由分散于液体载体中且占配制品的高达40％w/w，优选低于20％w/w的活性成分组成。该载体典型地为水或一种稀释的水性醇溶液，优选通过加入例如氯化钠使之与体液是等渗的。任选的添加剂包括例如羟基苯甲酸甲酯的防腐剂(如果该配制品不是无菌制备的)、抗氧化剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂以及表面活性剂。
适于通过吹入法给药的配制品包括精细粉碎的粉末，这些粉末可以通过一种吹入器递送或以鼻吸药的方式带进鼻腔。在吹入器中，粉末被容纳在典型地由明胶或塑料制成的囊或药筒中，该囊或药筒在原位被刺穿或打开，并且该粉末通过吸入时吸引流过该装置的空气递送或借助于一种手动操作泵递送。吹入器中所采用的粉末或仅由活性成分组成，或由包含活性成分、一种合适的粉末稀释剂如乳糖以及一种任选的表面活性剂的粉末混合物组成。活性成分典型地占配制品的0.1至100％w/w。
除了以上特别提到的成分之外，本发明的配制品可以包括药学领域的技术人员已知的其他试剂，这与所讨论的配制品的类型有关。例如，适于口服给药的配制品可以包括调味剂，而适于鼻内给药的配制品可以包括香料。
以下实例是示意性的并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实例
一般来说，本发明的化合物作为候选药物的可能性可以使用本领域已知的不同测定来测试。例如，对于fxr的体外验证：它的活性和选择性可以使用alphascreen(生物化学检验)来评价；基因表达可以使用rt-pcr(fxr靶基因)来评价；并且细胞毒性(例如，hepg2)可以使用atp含量、ldh释放以及半胱天冬酶-3激活来评价。对于tgr5的体外验证：它的活性和选择性可以使用htr-fret(基于细胞的检验)来评价；基因表达可以使用rt-pcr(tgr5靶基因(即，cfos))来评价；并且细胞毒性(例如，hepg2)可以使用atp含量、ldh释放以及半胱天冬酶-3激活来评价。还可以使用本领域已知的方法研究本发明的化合物的adme(吸收、分布、代谢、以及排泄)/药物代谢动力学特性以及体内验证。
实例1：化合物100和101的合成
根据以下方案合成化合物100和101。
方案1
试剂和条件：a)1)meoh，p-tsa，超声，3h，定量的；2)ac2o，nahco3，thf，回流12h，85％；b)pcc，ch2cl2，6h，62％；c)ac2o，bi(otf)3，ch2cl2，1h，91％；d)br2，苯，30℃过夜，74％；e)nabh4，naoac，pyr，室温2天，80％；f)hi57％，acoh，室温30min；g)cro3，acoh，室温45min；h)zn粉，naoac，回流20min；i)naoh2m，meoh，室温过夜，65％，自化合物5计；l)nabh4，thf/h2o4:1，70％；m)na(s)，sec-buoh，50℃，70％。
该合成是基于使用6α-乙基-胆酸(6-eca，1)作为起始材料，该6α-乙基-胆酸是使用本领域已知的方法制备的。将6-eca(1)在超声辐射下在meoh中用p-tsa处理以获得相应的甲酯，通过在nahco3存在下在thf中用ac2o回流而使该甲酯在c3位置处受到选择性保护，从而得到化合物2。在室温下在ch2cl2中用pcc处理化合物2，然后在室温下在ch2cl2中用ac2o、bi(otf)3处理得到中间体3α,7α-二乙酰氧基-12-氧代-5β-胆烷-24-酸甲酯(化合物3；约48％，自化合物2计)。
在苯中用br2处理化合物3，持续例如12h，产生合物4。在新蒸馏的吡啶中使化合物4与nabh4和naoac反应，获得相应的11β-12β环氧化物(化合物5)，在硅胶纯化后收率为约59％。在室温下在acoh中使化合物5与hi反应，得到卤代醇中间体，然后在acoh中用cro3对该卤代醇中间体的c11位置进行氧化，产生化合物6。在沸腾的acoh中使化合物6与zn粉反应并且进行碱性水解(naoh/meoh)，得到3α,7α-羟基-12-酮基-513-胆烷-24-羧酸(化合物7；约65％收率，自化合物5计)。
在混合物thf/h2o＝(4:1，v/v)中使用nabh4对化合物7的c11-羰基进行立体选择性还原，获得3α,7α,11β-三羟基-6α-乙基-5β-胆烷-24-羧酸(化合物100；约27％，自化合物3计)，色谱纯化后得到化合物100。可替代地，在50℃下在sec-buoh中用钠还原化合物7，纯化后获得化合物101(约70％收率)。
实例2：化合物100是一种有效的、特异性fxr激动剂
在细胞核中，配体结合的核受体(nr)通过直接与基本转录机器相互作用或通过接触称作共激活子的桥接因子来调控转录的启使(奥纳特sa(onatesa)等人,科学(science)1995；270:1354-1357；wangjc等人,生物化学杂志(jbiolchem)1998；273:30847-30850；朱应(zhuy)等人,基因表达(geneexpr)1996；6:185-195)。nr与它们的共激活子的配体依赖性相互作用发生在位于受体配体结合结构域(lbd)中的激活功能2(af-2)与位于共激活子上的核受体盒(nr盒)之间(诺尔特rt(noltert)等人,自然(nature)1998；395:137-143)。若干条证据证实了nr盒中存在的lxxll肽序列表示促进不同蛋白质与af-2区相互作用的一种特征基序(希瑞dm(heerydm)等人,自然1997；387:733-736；托尔基亚j(torchiaj)等人,自然1997；387:677-684)。
使用alphascreen是为了通过利用主要在fxr与类固醇受体共激活子1(src-1)的nr盒中存在的lxxll基序之间的双分子交互作用来鉴定新型调节剂。
在生物素化的lxxllsrc-1肽存在下，用递增浓度的指定配体孵育人fxr-lbd-gst。当形成复合物受体-共激活子时，alphascreen信号增加。对于鹅去氧胆酸(cdca；其为阳性对照)，ec50值是8.9μμ；对于化合物a，ec50值是0.16μμ；并且对于化合物100，ec50值是0.16μμ。这些结果是来自所进行的三个实验中的一个代表性实验的一式三份样品的平均值±s.d.。如0.84的z'因子所显示的，alphascreen测定是一种非常稳健并可再现的测定(张(zhangjh)等人,生物分子筛选杂志(jbiomolscreen),1999；4:67-73)。因此，化合物100是一种高度有效的fxr激动剂。
此外，下表中的数据显示化合物100对人fxr有选择性并且对人tgr5无活性。
表1
另外地，使用alphascreen测定，证实了化合物100特异性地激活fxr，并且不激活代谢途径所涉及的13个其他的核受体。
表2
*：反向激动剂。
针对获自里佐g(rizzog)等人,分子制药(mol.pharm.),2010；78:617-630的化合物b的值
还在基于细胞的反式激活测定中使用利用gal4-fxr-lbd嵌合体瞬时转染的hek293t细胞系和(uas)5-luc系统测试化合物100诱导的fxr激活作用(图1)。在基于细胞的测定中，化合物100诱导的fxr激活作用与化合物a诱导的fxr激活作用是相当的，这表明这些化合物是有效的fxr激动剂。图1是示出了在hek293t细胞中的反式激活测定中化合物100相比于化合物a的活性的图。nt是未暴露于化合物a或化合物100的fxr载体转染的细胞。值以μμ为单位来表示。
胆汁酸(ba)不但调节若干核激素受体，而且还是g蛋白偶联受体(gpcr)tgr5的激动剂(牧岛m(makishimam)等人,科学1999；284:1362-1365；帕克斯dj(parksdj)等人,科学1999；284:1365-1368；马路雅玛t(maruyamat)等人,生物化学与生物物理研究通讯(biochembiophysrescommun)2002；298:714-719；科瓦马特y(kawamatay)等人,生物化学杂志,2003；278:9435-9440)。经由fxr和tgr5的信号传导调节若干个代谢途径，不但调控ba合成和肠肝再循环，而且还调节甘油三脂、胆固醇、葡萄糖、以及能量体内平衡。为了评价本发明的化合物激活tgr5的能力，针对作为tgr5激活的读出的细胞内camp增加，对化合物100和其他比较化合物进行筛选。将组成性表达tgr5的人肠内分泌nci-h716细胞暴露于递增浓度的化合物100，并且通过tr-fret测量细胞内的camp水平。使用石胆酸(lca)作为阳性对照。
如图2a中所示，化合物100在生理上表达tgr5受体的细胞中不诱导tgr5活性，因为未观察到细胞内camp的水平变化。为了进一步评估化合物100能否结合tgr5，将一种过表达tgr5的克隆细胞系暴露于不同浓度的化合物100。图2b中示出的结果显示，即使在过表达tgr5的受体的情况下，化合物100也没有产生相关的效应。图2a是示出了在以生理水平表达tgr5的人肠内分泌细胞中化合物100诱导的tgr5活性(没有活性)和lca诱导的tgr5活性的图。结果显示为所进行的三个实验中的一个代表性实验的一式三份样品的平均值±s.d.。图2b是示出了在过表达tgr5的人中国仓鼠卵巢(cho)中化合物100诱导的tgr5活性(没有活性)和lca诱导的tgr5活性的图。
实例3：由化合物100调节的fxr靶基因
为了评价化合物100调节fxr靶基因的能力，进行定量rt-pcr测定。选择hepg2细胞系作为一种相关的细胞系来测定本发明的化合物是否可以调控内源性fxr遗传网络。通过从用1μμ化合物a、b和100过夜处理的细胞分离出总rna来评估本发明的化合物诱导fxr靶基因的能力。将化合物a确立为一种有效的fxr选择性激动剂，并且将化合物b确立为一种双重有效的fxr/tgr5激动剂。将hepg2细胞中的化合物100的基因激活曲线与化合物a和b的曲线进行比较(佩里恰里r(pellicciari,r)等人,药物化学杂志(jmedchem.)2002；8月15日；45:3569-72；里佐g等人,分子制药,2010；78:617-630)。
fxr调控ba体内平衡所涉及的若干种靶基因的表达。简而言之，fxr在若干代谢途径中起着中心作用，包括即脂质代谢、胆汁酸代谢、以及碳水化合物代谢。关于基因表达谱，编码参与脂质代谢的蛋白质的基因包括例如apocii、apoe、apoai、srebp-1c、vldl-r、pltp以及lpl；编码参与胆汁酸代谢的蛋白质的基因包括例如osta/β、bsep、mrp2、shp、cyp7a1、fgf19、sult2a1以及ugt2b4；并且编码参与碳水化合物代谢的蛋白质的基因包括例如pgcla、pepck以及glut2。
如图3a-3h中所示，化合物100激活fxr，通过增加肝脏和肠中核受体shp的水平并且增加fgf19的水平而直接抑制ba生物合成酶cyp7a1的表达(古德温b(goodwin,b)等人,分子细胞(mol.cell),2000；6:517-526)。化合物100激活的fxr还正调控了编码参与ba转运的蛋白质的基因(包括bsep和ostα以及ostβ)的表达。重新合成的ba与牛磺酸或甘氨酸共轭，然后在胆囊中活跃地分泌，fxr对这些关键过程都进行调控。然后，单阴离子共轭的ba和二价阴离子共轭的ba分别通过bsep和多药相关蛋白2(mrp2)在胆囊中活跃地分泌。这些转运体属于abc转运体家族并且均在转录水平下被fxr诱导。为了避免ba在肝脏中积累以及随之发生的肝损伤，这些abc转运体的调控是非常重要的(申克尔ah(schinkelah)等人,哺乳动物的药物外排转运蛋白atp结合盒(abc)家族：概述(mammaliandrugeffluxtransportersoftheatpbindingcassette(abc)family:anoverview),先进药物递送综述(advdrugdelivrev.),2012；9月13日)。
图3是示出了化合物100和其他比较化合物在调控ostα(a)、ostβ(b)、bsep(c)、mrp2(d)、cyp7a1(e)、shp(f)、fgf-19(g)以及ugt2b4(h)的表达中的活性的一系列图。注意在图3a-3h中，y轴显示的是相对于未经处理的细胞的表达倍数变化。将数据相对于b2m归一化。误差条显示三次重复实验的标准误差。
fxr激活有助于胆固醇逆转运，即一种使得胆固醇从外周组织递送到肝脏以用于胆汁处理以及后续粪便排除的过程(兰伯特g(lambert,g)等人,生物化学杂志2003；278,2563-70)。在这个代谢情况中，fxr调控磷脂转移蛋白(pltp)的表达，磷脂转移蛋白负责将磷脂和胆固醇从ldl转移到hdl即肝脏脂蛋白如apoe、apoc-i、apoc-iv以及清道夫受体bl(srbl)，清道夫受体bl参与肝脏的hdl摄取。
fxr通过调控肝再次脂肪生成和甘油三脂清除来控制甘油三脂(tg)代谢。在被化合物100激活后，fxr下调srebp-1c的表达，srebp-1c是在刺激脂肪酸合成和脂肪生成中起着关键性作用的一种转录因子(图4a-4d)(兰德里尔jf(landrier,jf)等人,临床研究杂志(jclininvest),2004；113,1408-18)。除了减少再次脂肪生成之外，fxr激活还调节tg清除。fxr的这种额外的降低tg的作用在分子水平上通过关键基因(如apo-c-illp和vdl受体)的诱导得以解释(卡斯特hr(kast,hr)等人,分子内分泌学2001；15,1720-8)。
图4是示出了化合物100和其他比较化合物在调控参与脂质代谢(a)、srebp-1c(b)、apocii(c)、以及pparγ(d)的pltp中的活性的一系列图。注意在图4a-4d中，y轴显示的是相对于未经处理的细胞的表达倍数变化。将数据相对于b2m归一化。误差条显示三次重复实验的标准误差。
fxr还可能对碳水化合物代谢起作用。(马k(mak)等人,临床研究杂志2006；116:1102-9)。使用化合物100研究pepck基因调控(图5)。图5是示出了化合物100和其他比较化合物对pepck基因的调控的图。y轴显示的是相对于未经处理的细胞的表达倍数变化。将数据相对于b2m归一化。误差条显示三次重复实验的标准误差。
共同地，基因表达研究显示化合物100对fxr靶基因的调节与化合物a或b相同(也参见表3)。
表3
实例4：化合物100未在hepg2细胞中产生细胞毒性效应。
为了评价化合物100的体外细胞毒性，采用两种不同的测定方法。这些测定通过测量atp水平来评价细胞活力，并且通过测量ldh释放来评价细胞毒性。三磷酸腺苷(atp)核苷酸表示基础分子水平上的能量来源，因为它是在每个细胞中用作辅酶的一种多功能分子，并且是线粒体dna的一个组成部分(坎加斯l(kangasl)等人,医用生物学(medicalbiology),1984；62,338-343；克劳奇spm(crouchspm)等人,免疫学方法杂志(j.immunol.methods),1993；160,81-88；佩蒂rd(pettyrd)等人,生物发光和化学发光杂志(j.biolumin.chemilumin.)1995；10,29-34)。当涉及到细胞内能量转移时，它被称为“分子通货(molecularunitofcurrency)”。这是为了确保atp在代谢中的重要作用，并且atp含量的降低是揭示细胞损害的第一步(斯托勒rd(storerrd)等人,突变研究(mutationresearch),1996；368,59-101；克里ia(creeia)、安德烈奥蒂pe.(andreottipe.),体外毒理学(toxicologyinvitro),1997；11,553-556)。
细胞活力被确定为与测试化合物的暴露时间和浓度相关的细胞内atp的量度(苏斯曼nl.(sussman,nl.)；生命科学细胞分析(promegacellnotes),第3期,2002)。
图6是示出了用指定浓度的化合物处理4h的hepg2细胞中atp的测量结果的图。结果说明，存在于不同浓度的化合物100中的所有细胞与用单独的媒介物处理的细胞活力相当，即用化合物100处理的所有细胞仍保留活力(100％)。对于这些测定，将lca，即一种熟知的细胞毒性胆汁酸用作比较物，并且将它莫西芬用作阳性对照。
用于确定细胞活力的另一种方法是检测限定细胞区室化的膜的完整性。在受损的细胞膜中测量到来自细胞质的组分的漏出，这指示细胞膜完整性的缺失，并且ldh释放是用于确定细胞中的常见毒性的方法。用化合物100处理hepg2细胞，进行连续稀释，将lca稀释液加入到铺展的细胞中，与没有细胞的和未经处理的细胞一起作为测定对照。对于每个测试化合物浓度，一式三份进行测定。
结果表明化合物100未对hepg2细胞诱导任何细胞毒性效应。石胆酸在70μμ下使ldh释放增加，而对照它莫西芬在大约25μμ下产生细胞毒性效应(参见表4)。
表4
*里佐等人,分子制药2010
实例5：化合物100不抑制细胞色素p450酶。
为了评价化合物100对于药物-药物相互作用的潜能，调研六种主要的cyp450亚型(cyp1a2、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、cyp2e1、cyp3a4)。(欧拜克rs(obach,rs)等人,药理学与实验治疗学杂志(jpharmcolexpther),2006；316(1):第336-48页)。
为了测定化合物100与细胞色素p450酶之间的相互作用，使用重组cyp450蛋白(baculosomes；英杰公司(invitrogen))、底物以及抑制剂，通过化合物100抑制(或不抑制)一种荧光信号的产生的能力来分析化合物100(皮德斯特鲁普tb(bidstrup,tb)等人,英国临床药理学杂志(brjclinpharmacol),2003；56(3):第305-14页)。作为阳性对照，在相同的板中测试用于每个cyp450亚型的一种选择性抑制剂(表5)。
表5
ic50>10μμ意指该化合物不抑制cyp450。所获得的结果说明，如同化合物a和b，化合物100不抑制所测试的细胞色素p450酶，这表明化合物100不大可能受药物-药物互作效应的影响。(里佐g等人,分子制药,2010；78:617-630)。
实例6：化合物100不抑制人erg钾通道
为了确定离子通道功能，采用predictortmherg荧光偏振测定，因为它提供了一种用于初始测定测试化合物阻断herg通道的倾向的有效方法(多恩a(dorn,a)等人,生物分子筛选杂志,2005；10(4):339-47)。该测定是基于以下假设：herg钾通道活性有助于永久转染细胞中的静息膜电位，因此阻断herg通道会引起细胞膜的去极化。该测定被设计来通过产生与膜片钳电生理学研究准确相关的数据来鉴定潜在的herg通道阻断剂。来自predictor测定的结果证实了与获自膜片钳技术的那些结果的高度相关性(表6)(多恩a等人,生物分子筛选杂志,2005；10(4):339-47)。
表6
表6示出了使用predictortmherg荧光偏振测定产生的ic50值与膜片钳和放射性配体置换测定所报告的ic50值的比较。
使用该predictor荧光偏振测定将来自用herg钾通道稳定转染的中国仓鼠卵细胞的膜制品用来评价化合物100对这个通道的潜在抑制作用。抑制herg钾通道导致的膜极化减少直接与荧光偏振(fp)的减少相关。结果表明如同化合物a和b，化合物100不阻断或抑制herg钾通道。
通过使用测试化合物以及阳性对照e-4031和它莫西芬的16点剂量-响应来一式三份地进行该测定。获得的e-4031的ic50为15nm(δmp＝163)，它莫西芬的ic50为1.4μμ(δmp＝183)。认为超过100mp(毫偏振)的测定窗是良好的。z'值为0.78，表示一种优异的测定。通过graphpadprism(graphpad软件公司)分析获得非线性回归曲线，用来计算ic50值。
简而言之，通过fxr的信号传导调节多种代谢途径，所以选择性fxr调节剂是用于治疗一系列影响肝脏、肾脏的慢性病、以及代谢疾病的有吸引力的候选者。在此所描述的实例中的结果将化合物100表征为一种有效的且具特异性的fxr激动剂。
显然，尽管化合物100有效地激活fxr，但是它对其他核受体没有表现出活性，并且不激活胆汁酸gpcrtgr5。除了高核受体选择性之外，化合物100具有适合于候选药物的药理学曲线。化合物100对人hepg2肝细胞没有表现出细胞毒性效应，这表明没有肝脏毒性；并且不抑制所测试的任一种cyp450酶，这表明化合物100不具有明显的药物-药物相互作用的危险。此外，化合物100不抑制人erg钾通道。
化合物100的组合选择性和效力连同其有利的似药特性(具体地优异的安全性曲线)，使得化合物100成为用于治疗和预防疾病的一种有吸引力的候选者。
实例7：化合物100的生化特性
使用本领域已知的方法测定化合物100的生化特性，如水溶性、临界胶束浓度、表面张力以及logpa。将化合物100的这些性质与天然的和合成的类似物作比较(表7)。
表7
aws：水溶性涉及作为质子化了的物质的ba，因此没有针对高度可溶(hs)的化合物b、tcdca以及tudca进行评价；
bcmc：在0.15mnacl水溶液中测定的临界胶束浓度；
cstcmc：在0.15mnacl水溶液中在cmc下的表面张力；
dlogpa-：作为已电离的物质的所研究的胆汁酸的1-辛醇-水分配系数；
实例8：在id和iv给药之后，胆瘘大鼠中的药物代谢动力学和新陈代谢：体内
在体内模型中，以1小时1μmol/min/kg的单次剂量向大鼠给予化合物100(参见图7a、7b以及7c)。图7a是示出了针对id和iv给药化合物100的利胆作用的图。图7b是示出了针对id和iv给药化合物100随时间变化的分泌的图。图7c是示出了化合物100随时间变化的血浆浓度的图。
等效物
本领域的普通技术人员顶多使用常规实验即可识别出或能够确定在此所述的特定实施例和方法的许多等效物。此类等效物打算由本发明的范围涵盖。
在此引用的所有专利、专利申请以及文献参考都特此明确通过引用而结合。