一种A字型结构的肺炎多糖疫苗可溶性微针贴及其制备方法与流程

本发明涉及疫苗的微针给药
技术领域：
，提供了一种a字型结构的肺炎多糖疫苗可溶性微针贴及其制备方法。
背景技术：
：肺炎球菌是导致成人和儿童罹患肺炎疾病住院甚至死亡的重要原因。婴幼儿的抗肺炎球菌荚膜多糖(ps)抗体水平十分低下，而老年人的抗ps抗体缺失或低效，或多型核粒细胞(pmn)功能减退，导致婴幼儿和老年人的肺炎球菌病发病率和死亡率最高。肺炎球菌的91个血清型中有20种血清型与各年龄组超过85％的侵袭性肺炎球菌感染有关。目前13价或23价肺炎球菌多糖疫苗具有很好的安全性，成人和儿童接种后会产生可靠的免疫力，是儿童和成人预防肺炎球菌感染的有效措施。目前临床上应用的13价或23价肺炎多糖疫苗均为注射剂，包括安万特巴斯德公司生产的23价肺炎多糖疫苗(优博23)、默沙东公司生产的23价肺炎球菌多糖疫苗(纽莫法23)、成都生物制品研究所有限责任公司生产的23价肺炎多糖疫苗(惠益康)、辉瑞公司生产的13价肺炎球菌多糖结合疫苗(沛儿13疫苗)。众所周知，注射剂对操作护士的技术熟练要求较高，注射剂会造成组织损伤和出血，一旦操作不当会造成强烈的痛感，甚至大量出血等安全隐患；加上儿童对于注射剂所带来的疼痛和对针头的恐惧往往有较强的排斥心理，所以注射剂型的疫苗不易儿童给药。故，临床上急需一种安全无痛、适合儿童给药的制剂。经皮免疫(transcutaneousimmunization,tci)是一种新型的免疫接种方式。皮肤作为人体最大的免疫器官，存在大量的与免疫反应相关的抗原提呈细胞(antigen-presentingcells，apc)，例如树突状细胞(dendriticcells,dcs)和朗格汉斯细胞(langerhanscells,lcs)。由于皮肤内存在的apc比肌肉内更丰富，使得经皮免疫比肌肉注射更节省剂量。微针技术能通过刺穿皮肤角质层从而大大增强大分子药物的经皮吸收，且由于微针非常细小，在治疗过程中不会使患者感到痛苦，其造成的皮肤孔洞能在较短的时间内自动修复，有望成解决该问题的优良之选。按照微针的结构和释药方式，微针可以分为实心不溶性微针、涂层微针、可溶性微针、空心微针四类。其中可溶性微针具有载药量高、安全卫生、使用方便等优点，具有很好的应用前景。目前，疫苗可溶性微针制剂仍处于研发阶段，并未有上市制剂，涉及疫苗可溶性微针贴片技术的相关专利主要为：公开号为cn104027324a的中国发明专利，公开了一种可溶性微针疫苗贴片，由不含目标药物的可溶性微针基底和含有目标药物的可溶性微针针体所组成，目标药物中提及了肺炎球菌多糖-蛋白偶联疫苗。公开号为cn107158368a的中国发明专利，公开了一种流脑多糖结合疫苗可溶性微针贴片，由可溶性微针基底与可溶性微针针体组成，其中可溶性微针基底由第一水溶性高分子材料的水溶液制备而成，可溶性微针针体由第二水溶性高分子材料的水溶液和a+c群流脑多糖结合疫苗制备而成。公开号为cn107412943a的中国发明专利，公开了一种可溶性微针贴片，由背衬、不含疫苗的基底部分和含有疫苗的针体部分组成，其中针体部分由蛋白聚糖水溶性材料、纤维素类水溶性材料、保护剂和疫苗组成，基底部分为聚乙烯醇，背衬为压敏胶贴片。前述专利的可溶性微针贴，主要存在如下缺点：(1)前述专利的可溶性微针，均属于药物仅载于微针尖端、不存在于底座的分层式结构，由于不同的疫苗理化性质有差异，当选择高浓度的疫苗药物载于微针尖端时，尖端部分的机械性能会受到影响(公开号为cn107158368a的中国发明专利之实施例2中也有类似结论)，从而导致微针难以有效刺入皮肤，或者在储存、使用过程中尖端断裂，无法精确给药。(2)前述专利的微针尖端结构设计，决定了尖端具有非常大的比表面积，导致载于尖端的疫苗药物与空气接触的程度大，易被氧化、失活变质。另，虽有如下文献提供了多种结构的可溶性微针阵列，但对于微针尖端的穿刺性能、微针中疫苗的稳定性，仍存在效果局限性：(1)均匀型：如图1(a)所示，微针结构包括针体和背衬层，药物均匀分布在整个针体与背衬层中，如公开号为cn103181887a的中国发明专利。(2)分层型：如图1(b)所示，微针结构包括针体和背衬层，针体由针尖层和基底层组成，针尖层和基底层可选择不同的基质材料，药物一般分布在针尖层，如公开号为cn104707241a的中国发明专利和授权公告号cn204890943u的中国实用新型专利。(3)包衣型：如图1(c)所示，微针结构包括针体和背衬层，针体由中心层和包衣层组成，中心层和包衣层可选择不同的基质材料，药物一般分布在包衣层，如公开号为cn103301563a和cn104338235a的中国发明专利。(4)包裹微粒型：如图1(d)所示，微针结构包括针体和背衬层，针体由微粒和连续相组成，药物一般分布在微粒中，如公开号为cn104027324a的中国发明专利。综上所述，如何找到一种能同时解决微针尖端机械强度不足导致的尖端断裂、尖端比表面积过大导致的疫苗失活技术瓶颈的可溶性微针结构，方可具有将肺炎多糖疫苗制成可溶性微针贴片的现实可行性，这也是本领域技术人员急需解决的技术难题。技术实现要素：本发明目的在于提供了一种a字型结构的肺炎多糖疫苗可溶性微针贴及其制备方法，解决了现有技术存在的皮肤穿刺效果差、稳定性差等缺陷。本发明所采用的技术方案具体如下：一种a字型结构的肺炎多糖疫苗可溶性微针贴，由截面呈a字型结构的针体和覆盖于针体外周的包衣层组成，针体由上部的尖端层和下部的基底层组成，尖端层含有目标药物，基底层和包衣层不含有目标药物。优选的，目标药物选自减毒活疫苗、亚单位疫苗、多糖-蛋白质偶联疫苗、dna疫苗中的一种。更优选的，目标药物选自肺炎多糖疫苗，更优选为13价和/或23价肺炎多糖疫苗。优选的，尖端层的材料选自海藻糖、果糖、半乳糖、麦芽糖中的一种或几种。优选的，基底层的材料选自硫酸软骨素、聚乙烯醇、透明质酸中的一种或几种。优选的，包衣层的材料选自甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物、聚维酮、硫酸软骨素中的一种或几种，其中甲基乙烯基醚-顺丁烯酸酐共聚物优选为an-139、s-97。优选的，目标药物的固含量占尖端层总质量的1～50％，尖端层长度占针体总长的20～80％。优选的，包衣层固含量占针体总质量的10％-30％，更优选为20％。一种如前所述的a字型结构的肺炎多糖疫苗可溶性微针贴的制备方法，包括如下步骤：(1)第一次注模干燥将目标药物、尖端层材料分别溶解、混合成均一的针尖液，取适量针尖液涂覆于带有下窄上宽的针孔的模具上，离心，使针尖液进入模具的孔洞；取出模具，刮净孔洞外的溶液，干燥固化，得到针孔中含部分固化针尖液的模具；(2)第二次注模干燥将基座层材料溶解成均一的基底液，取适量基底液涂覆于步骤(1)所得的模具上，离心，使基底液充填满模具的孔洞并在模具的表面形成一层连续的背衬层，干燥固化，脱模，得到截面呈a字型结构的针体的微针阵列片；(3)倒置喷雾将步骤(2)所得的微针阵列片倒置，使针体的尖端朝下；并将包衣层材料溶解成均一的包衣液，包衣液通过喷雾装置被均匀喷涂至针体的表面，直至形成包衣层，干燥，即得。优选的，带有下窄上宽的针孔的模具，通过阳模具倒模、固化制得，阳模具的材料选自pdms、石膏、陶瓷、塑料中的一种或几种，更优选pdms。优选的，带有下窄上宽的针孔的模具，制备方法如下：利用liga工艺制备的微针阵列阳模具，材质为硅，微针为四棱锥形，高度600μm、底部为300×300μm的正方形，针阵列之间间距为600μm，20×20共400根针；应用pdms硅橡胶材料，取主剂和固化剂质量比为10:1混匀，浇在阳模具上，90℃加热固化2h后脱模得到pdms阴模具。本发明中，微针的针长范围在150μm到2000μm。针体形状只要满足下窄上宽即可，包括但不限于圆锥形、棱锥型、椭圆锥型等。微针贴的面积范围在0.5～40cm2之间。本发明中，微针贴的背衬层，形状不限，包括但不限于圆形，椭圆形，四边形，长方形，月牙形，三角形，星形，面膜形等，根据贴敷部位的不同选择适宜的形状。本发明中，阳模具的形状与本发明制得的a字型微针的形状相匹配，阳模具可通过刻蚀法、铸模法、liga技术、微铣削技术、激光雕刻法、微纳3d打印等方法制得；阳模具的材料可为pdms、石膏、陶瓷、塑料中的一种或几种，材料的选择根据模具采用的制备方法而定。本发明中，第一次注模后的固化方法，包括但不限于自然晾干、烘箱干燥、放入干燥皿内干燥等方法；第二次注模后的固化方法，包括但不限于自然晾干、烘箱干燥、放入干燥皿内干燥、交联剂固化、反复低温冻融交联固化、光催化交联固化等方法。本发明提供的肺炎多糖疫苗可溶性微针贴及其制备方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：①疫苗只载于尖端层，有利于精确控制疫苗接种的剂量，确保儿童给药的剂量安全性与顺应性；②通过选择特定基底层材料和包衣层材料，既确保了机械强度使微针有效刺入皮肤，又能有效隔绝空气，防止内部疫苗的失活变质；③采用先两次注模干燥、后倒置喷雾的制备方式，得到特定a字型结构的微针贴，使用方便；④包衣液采用倒置喷涂的方式，确保包衣液在喷到a字型的针体结构上固化之前不易凝集，有效包衣。附图说明图1为现有文献列举的几种微针贴的结构示意图。图2为本发明制备的a字型结构微针贴的结构示意图。图3为本发明制备的a字型结构微针贴的工艺流程示意图。图4为不同微针刺入人工皮肤的效果对比实验装置示意图。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明中的附图，对本实施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入到了本发明的保护范围。实施例1a字型微针的处方与制备(1)模具的制备利用liga工艺制备的微针阵列阳模具，材质为硅，微针为四棱锥形，高度600μm、底部为300×300μm的正方形，针阵列之间间距为600μm，20×20共400根针。选择pdms硅橡胶材料，取主剂和固化剂质量比为10:1混匀，浇在上述阳模具上，90℃加热固化2h，脱模，得到带有下窄上宽的针孔(即锥形孔)的pdms阴模具。(2)空白组的a字型微针的制备按表1中针尖液、基底液、包衣液的组分与含量进行调配，用去离子水溶解至均一的溶液。表1a字型微针的各部分基质处方组成(wt.)先取适量针尖液，涂覆于方案(1)所得的模具上，放入离心机中，于1000g离心力下离心5min，使得针尖进入模具孔洞。取出模具，刮去表面的溶液，放入37℃烘箱干燥8h后取出，针尖液被蒸干，得到带固化针尖液的模具。再取适量基底液，涂覆于带固化针尖液的模具上，涂覆厚度为3mm，于1000g离心力下离心5min，使基底液充填满模具的孔洞，并在模具的表面形成一层连续的背衬层，放入37℃烘箱干燥8h、固化后，脱模，得到截面呈a字型结构的针体的微针阵列片(如图2)。将前述制得的微针阵列片倒置，使得针体的针尖朝下；并取调配好的适量包衣液，用电压喷雾装置将喷涂液均匀喷涂至针体的表面，直至形成一层包衣层，自然干燥，即得成品。(3)药物组的a字型微针的制备如图3，在方案(2)所得的针尖液中加入13价(或23价)肺炎多糖疫苗，注模、干燥、固化后得到含药尖端，其余制备步骤与方案(2)相同，最终得到特定含药量的a字型微针，且肺炎疫苗重量占针尖部分固含量的40％(wt.)。实施例2不同a字型微针基质处方对皮肤穿刺性能的影响考察实验采用ta-xt-plus质构仪向人工皮肤施加微针，以判断各微针的刺入效果。将微针背衬粘在的圆柱形探头上，采用m膜作为人工皮肤，将人工皮肤裁剪成2×2cm的正方形，平铺在厚度为5mm的聚苯乙烯泡沫板上，并使人工皮肤处于微针的正下方。设置刺入力为10n，刺入速度为0.5m/s，刺入后持续施压时间为30s。刺入完成后，取出人工皮肤，采用人工皮肤电阻法判定微针的刺入效果。将微针刺入后的人工皮肤固定在电阻测定装置上(如图4)，人工皮肤夹在两个半池中间，池内注满与生理盐水等渗的k2so4溶液，在距离石蜡膜10mm处各有一根竖直的惰性石墨电极，并与lcr数字交流电桥连接。测量时，将lcr电桥设置为电阻档r，选择并联模式(par)，测试频率为100hz。每张人工皮肤在使用微针前均先用上述测试方法测阻值，阻值大于20mω方能进行实验，以保证测试前人工皮肤的完整性。取实施例1制备的各a字微针进行人工皮肤穿刺性能测试，结果见表3。表2.不同处方a字型微针穿刺后人工皮肤的阻值变化情况(mean±sd,n＝5)处方号a1a2a3a4空白组(ω)376±12395±16386±14854±19含40％(wt.)13价疫苗组(ω)381±14406±15392±161496±29含40％(wt.)23价疫苗组(ω)388±13410±17398±161573±32由表2可知，处方号为a1，a2，a3的微针在载入13价或23价肺炎疫苗前后穿刺人工皮肤的阻值变化率均小于5％，不具有显著差异，说明载入高固含量比的疫苗并不会显著降低这三种处方的a字型微针的穿刺性能；而a4组的空白微针穿刺后人工皮肤阻值均大于a1，a2，a3组的200％，说明a4处方的穿刺性能较差，且载入13价或23价肺炎疫苗前后穿刺人工皮肤的阻值变化率均远远大于5％，说明该处方微针载入高固含量比的疫苗会导致穿刺性能的大幅下降。本实验表明，不同的可溶性材料作为针尖液、基底液或包衣液，都会导致机械强度的差异，从而影响皮肤穿刺效果。实施例3包衣层固含量对皮肤穿刺性能的影响考察实验为考察包衣层固含量与皮肤穿刺性能的相关性影响，选取表1中a1处方，先按实施例1的方法制备针尖液与基底液固含量配比为1:1的针体结构，再按实施例1的方法喷涂包衣液，喷涂时仅改变包衣层的固含量占比，设置为包衣层固含量占比总针体质量的5％、10％、20％，30％、50％，进行单一因素影响实验，实验结果见表2。表3不同包衣层固含量占比对微针穿刺人工皮肤后阻值的影响(mean±sd,n＝5)包衣层占比13价疫苗组23价疫苗组5％1876±321789±3610％623±21626±2420％381±14388±1330％654±19697±2050％1674±391638±37由表3可知，当包衣层固含量占比为10～30％时，13价和23价肺炎疫苗微针由着较好的穿刺效果，其中以20％时的穿刺性能最佳。而当包衣层固含量占比偏小或偏大时，穿刺性能都会逐渐降低，这是由于当占比偏小时，包衣层较薄，所能产生的机械支撑能力弱，容易在穿刺过程中被破坏；而占比偏大时，包衣层较厚，导致针体变粗，也不易刺入皮内。实施例4现有文献列举的几种可溶性微针结构的制备(1)均匀型微针的制备参照公开号为cn103181887a的中国发明专利之实施例2的制备工艺，将实施例2中的药物替换成本发明的13价(23价)肺炎多糖疫苗，实施例2中的基质材料换成本发明的海藻糖，通过调节配比使最终微针中疫苗的固含量为40％(wt.)，其他制备步骤都与实施例2相同。此外，为排除微针高度、粗细和阵列密度的影响，模具统一采用本发明实施例1制得的模具。(2)分层型微针的制备参照公开号为cn204890943u的中国实用新型专利之实施例1的制备工艺，将实施例1中的药物替换成本发明的13价(23价)肺炎多糖疫苗，实施例1中的针尖材料换成替换成本发明的海藻糖，实施例1中的基座材料替换成本发明的pva224，通过调节配比使最终微针的针尖层中疫苗的固含量为40％(wt.)，其他制备步骤都与实施例1相同。同理，为排除微针高度、粗细和阵列密度的影响，模具统一采用本发明实施例1制得的模具。(3)包衣型微针的制备参照公开号为cn103301563a的中国发明专利之实施例2的制备工艺，将实施例2中的药物替换成本发明的13价(23价)肺炎多糖疫苗，且只载于外层包衣层，实施例2中的外层包衣材料替换成本发明的an-139，实施例2中的中心层材料替换成本发明的海藻糖，通过调节配比使最终微针的针尖层中疫苗的固含量为40％(wt.)，其他制备步骤都与实施例2相同。同理，为排除微针高度、粗细和阵列密度的影响，模具统一采用本发明实施例1制得的模具。(4)包裹微粒型微针的制备参照公开号为cn104027324a的中国发明专利实施例2的制备工艺，将实施例2中的药物替换成本发明的13价(23价)肺炎多糖疫苗，且只载于脂质纳米粒中，实施例2中的针体制作液材料(连续相材料)替换成本发明的海藻糖，通过调节配比使最终微针的脂质纳米粒中疫苗的固含量为40％(wt.)，其他制备步骤都与实施例2相同。同理，为排除微针高度、粗细和阵列密度的影响，模具统一采用本发明实施例1制得的模具。实施例5不同结构的微针对皮肤穿刺效果的比较实验取本发明实施例1制备的处方号为a1的a字型微针、实施例4制备的其他几种可溶性微针，按照本发明实施例2的方法进行人工皮肤穿刺效果比较，结果见表4。表4各微针穿刺后人工皮肤的阻值变化情况(mean±sd,n＝5)微针结构空白组含40％(wt.)13价疫苗组含40％(wt.)23价疫苗组a字型376±12381±14388±13均匀型379±111283±351332±38分层型428±171165±321207±38包衣型354±10952±301089±28包裹颗粒型574±191573±361612±41由表4可知，其他的几种可溶性微针在载入高达40％固含量的肺炎疫苗后，对于人工皮肤的刺入效果下降显著，电阻值均大于原先的200％，而a字型微针由于基底层和包衣层的存在，穿刺效果并未显著下降，电阻值变化率小于5％，依然保留着较强的机械强度。实施例6不同结构的微针对疫苗稳定性的比较实验将本发明实施例1和实施例4中制得的几种肺炎疫苗微针，置于10ml37℃蒸馏水中溶解，用elisa法检测溶液中的疫苗活性，记为初始(0月)疫苗活性为(100％)，另将前述同一批次制得的各种微针，放置在温度20℃、相对湿度30％的空气环境中保存6个月后，再用相同的elisa法检测各微针疫苗相对于初始时的活性百分比，结果见表5。表5各微针放置6月后疫苗活性结果(mean％±sd％,n＝5)微针结构含40％(wt.)13价疫苗组含40％(wt.)23价疫苗组a字型-a198.68±0.5998.96±0.43a字型-a297.73±0.6597.01±0.55a字型-a396.58±0.8996.19±1.02a字型-a486.85±2.6487.46±2.49均匀型56.09±5.8353.57±5.59分层型64.73±4.8261.65±4.49包衣型49.39±6.9345.97±6.96包裹颗粒型75.86±2.5973.08±3.93由表5可知：(1)a1，a2，a3处方的13价或23价肺炎疫苗微针，在空气中放置6个月后活性下降率均小于5％，这是由于a字型微针包衣层的存在，使得疫苗与外界有效隔绝，同时疫苗与具有保护作用的糖类基质均匀混合在一起，因此很好地保持了其活性，故6个月后疫苗的活性相比于其他各种微针高出很多。(2)而a4组由于所采用的包衣材料的隔绝空气性能相对较弱，保存6个月后疫苗活性相较于a1，a2，a3组相比略弱，这样表明了不同包衣材料对疫苗的稳定性也有着显著地差异影响。此外，由于包衣层的存在，a4组相比于实施例2制备的其他几种结构(即均匀型、分层型、包衣型、包裹颗粒型)的微针组，疫苗活性都要高。(3)在四种非a字型结构微针中，包裹颗粒型微针，由于包裹的颗粒多采用纳米粒，具有一定保护疫苗的作用，故6个月后其疫苗活性较其余三种非a字型结构微针略高；但与各a字结构微针相比，保护疫苗活性显著较弱，比效果最差的a4组也要弱于10％以上。包衣型微针由于疫苗负载在包衣层，与外界空气接触面积大，更易失活，因此保存6个月后其疫苗活性最低。当前第1页12