本发明涉及一种载药体系，具体涉及一种依托致敏血小板构建的治疗免疫性血小板减少症的载药体系的新方法。
背景技术：
免疫性血小板减少症(immunethrombocytopenia，itp)是一种获得性的自身免疫病，育龄期妇女多见，年发病率约为12/10万人。近年来发病率呈逐年上升，其中难治性itp约占1/10。多项研究表明，itp是由于病毒感染或不明原因的血小板结构变化产生自身抗血小板抗体，被抗体致敏的血小板在肝、脾的巨噬细胞内被破坏从而导致外周血小板减少。参与血小板破坏的单核巨噬细胞主要通过三方面发生作用：(1)内吞致敏血小板，并激活补体系统，导致血小板的持续破坏；(2)作为体内最重要的抗原呈递细胞(apc)，呈递多种抗原给cd4+th，导致该自身反应性t细胞凋亡受抑，刺激b淋巴细胞增殖，不断产生自身抗血小板抗体，形成致敏血小板；(3)刺激b淋巴细胞产生抗体，抗体作用于骨髓内巨核细胞导致其形态受损，从而抑制血小板生成。因此，血小板破坏的主要参与细胞—巨噬细胞是itp治疗的关键靶细胞。
治疗itp主要立足于抑制血小板自身抗体的产生和减少血小板的破坏。糖皮质激素是治疗itp的首选药物，尽管70％～80％的患者达到初始缓解，但长期缓解率不到30％。丙种球蛋白、促血小板生成素等药物均疗效短暂且价格昂贵。并且，itp患者因相关治疗带来的风险甚至大于疾病本身的风险。因此如何在尽量减低治疗毒性的前提下有效治疗itp成为目前治疗研究的热点。
我们设想如能将免疫抑制剂装载于已致敏的血小板中，利用患者体内的巨噬细胞能主动识别致敏血小板并将其吞噬破坏，将药物精准的运载到巨噬细胞内，从而抑制其功能，达到治疗itp的目的。同时药物基本都在巨噬细胞内释放，可能最大程度上避免其对其他组织细胞的毒副作用。如能成功，将实现对itp患者体内破坏血小板的巨噬细胞的精确靶向治疗，这将是itp治疗的崭新途径。
血小板具有良好的生物利用度、安全性、及较长的血循环时间，并且有较高的载药量。因此，血小板可以成为itp患者药物靶向治疗的良好载体，以巨噬细胞表面的fc受体为靶点，靶向载药运输到参与血小板破坏的巨噬细胞。
致敏血小板包载药物作为主动靶向载药体系研究成果既达到了抑制血小板自身抗体的产生和减少血小板的破坏的治疗目的，又有望避免细胞毒药物及脾切除手术的相关副作用，将为治疗itp药物的体内有效传递建立一种通用的靶向载体平台，具有重要的学术意义和应用价值，为临床itp的长期维持治疗提供有力的手段。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种依托致敏血小板构建的治疗免疫性血小板减少症的载药体系的新方法，制成携载抗免疫性血小板减少症药物的致敏血小板靶向巨噬细胞的载药体系，具有生物相容性好、载药率高、主动靶向性强，从而增加药物的疗效，减少药物毒副作用等优点。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种依托致敏血小板构建的治疗免疫性血小板减少症的载药体系的新方法，包括以下步骤：
(1)环境温度为20±5℃，在全血中加入重量百分含量为2-4％柠檬酸钠溶液，离心后得到富血小板血浆；
(2)将步骤(1)得到的血小板丰富血浆再深度离心，并用pbs缓冲液洗涤至不再含有血浆及其他血液成分，得到洗涤血小板；
(3)将步骤(2)得到的洗涤血小板与抗血小板膜糖蛋白gpiib(cd41)抗体在25±0.5℃的环境中震荡孵育15～30分钟，离心洗涤，得到致敏血小板；
(4)将抗免疫性血小板减少症药物用二甲基甲酰胺(dmf)溶解后逐滴加入n-(β-马来酰亚氨基丙酸)酰肼(bmph)，25±0.5℃环境下搅拌反应获得修饰了氨基甲酰马来酰亚胺(maleimide)的药物，将修饰了malemide或未经修饰的药物与步骤(3)得到的致敏血小板，在37±0.5℃的避光环境中震荡反应1～2小时，得到抗免疫性血小板减少症药物与致敏血小板的反应物；
(5)将步骤(4)得到的抗免疫性血小板减少症药物与致敏血小板的反应物通过琼脂糖凝胶2b分离柱分离，并离心洗涤，得到携载抗免疫性血小板减少症药物的致敏血小板载药体系。
所述步骤(1)中，全血与重量百分含量为2-4％柠檬酸钠溶液的体积比为7:1～10:1。
所述步骤(1)中离心为以1200rpm离心5～10min。
所述步骤(2)中深度离心为以3500rpm离心5～10min。
所述步骤(2)得到洗涤血小板计数控制在(5～10)×106/ul。
所述步骤(3)中洗涤血小板与cd41抗体体积比为200：1。
所述步骤(3)中离心洗涤是用pbs缓冲液以3500rpm离心洗涤2～3次，每次5～10分钟。
所述步骤(4)中药物为免疫抑制剂或细胞毒药物的一种，药物浓度为80～320ug/ml。
所述步骤(4)中制备的修饰maleimide药物的反应时间为2～3小时，药物与致敏血小板的体积比为2:1。
所述步骤(5)中离心洗涤是用pbs缓冲液以3500rpm离心洗涤2～3次，每次5～10min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明将致敏血小板作为靶向生物载药系统，包载某些常见的免疫抑制剂应用于itp治疗中。血小板作为机体成分之一，具有良好的生物相容性，包载药物后不会引起免疫排斥反应，并可使携载的药物血循环时间延长；同时血小板的含量丰富，其装载药物的量远远高于纳米载体。
(2)通过将药物包载于连接cd41单抗的致敏血小板中，利用患者体内的巨噬细胞能主动识别致敏血小板并将其吞噬破坏，将药物精准地运载到巨噬细胞内，从而抑制其功能，达到治疗的目的。同时药物基本都在巨噬细胞内释放，能最大程度上避免其对其他正常组织的毒副作用，如神经损伤等。这些都对提高患者生活质量和医疗质量具有重要意义，并且具有一定的社会和经济效益，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的携载长春新碱的致敏血小板靶向载药体系的荧光显微镜图像。
图2为本发明制备致敏血小板与不同浓度的长春新碱作用下的包封率。
图3为单独血小板和携载长春新碱的致敏血小板的扫描电镜图像；其中上图为单纯的血小板、下图为携载长春新碱的致敏血小板。
图4为致敏血小板携载长春新碱的药物体外释放曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种依托致敏血小板携载长春新碱构建的治疗免疫性血小板减少症的载药体系的新方法，该方法包括如下步骤：
第一步：在环境温度为20±5℃的室温条件下，在取得的全血中加入重量百分比为3.2％柠檬酸钠溶液抗凝，全血与柠檬酸钠溶液的体积比为9:1，1200rpm离心5min后得到血小板丰富血浆；
第二步：富血小板血浆以3500rpm离心10min，并用pbs缓冲液洗涤三次，使其不再含有血浆及其他血液成分，弃去上清，得到洗涤血小板，控制血小板计数为(5～10)×106/ul。
第三步：将洗涤血小板500μl的重悬液与2.5μlcd41抗体在在25±0.5℃的环境中震荡孵育15分钟，3500rpm离心洗涤2次，每次5分钟，得到致敏血小板。
第四步：将致敏血小板与160μg/ml长春新碱混合，体积比为2:1，在37±0.5℃的避光环境中以100rpm震荡反应1小时。
第五步：将致敏血小板与长春新碱混合反应物通过琼脂糖凝胶2b分离柱分离，再用pbs缓冲液以3500rmp离心洗涤2次，每次5分钟，即得到携载长春新碱的致敏血小板载药体系。
采用上述方法制备出的携载长春新碱的致敏血小板载药体系，通过扫描电镜、荧光显微镜和高效液相色谱法进行表征，结果表明抗cd41单抗成功连接于血小板上、长春新碱可被包载于致敏血小板内且未影响血小板的形态，如图1、图2、图3所示。采用高效液相色谱法计算得到其包封率和载药率分别为60.73％和41.16％，表明致敏血小板能够有效地携载长春新碱。通过观察不同ph环境下载药体系的药物释放率，证明长春新碱的释放率在酸性环境中明显增加，而在生理环境(ph＝7)中维持相对稳定，如图4所示，表明致敏血小板载药体系可在巨噬细胞内溶酶体中大量释放携载药物，而减少药物在正常组织的释放，从而降低药物的毒副作用。
下面通过试验对本实施例的有益效果作进一步的详细说明。
1、将cd41单抗连接绿色荧光二抗，通过荧光显微镜观察致敏血小板载药体系，可见绿色荧光，证明cd41单抗成功连接于血小板上，形成致敏血小板，如图1所示。通过高效液相色谱法定量计算致敏血小板携载长春新碱的载药率和包封率，分别为41.16％和60.73％，表明致敏血小板对长春碱类药物具有较高的包载率。通过扫描电镜，发现载药后的血小板形态与单纯的血小板形态相比，无明显改变，如图3所示，说明抗体和药物不会对血小板造成明显影响，提示血小板可作为高效的药物载体。
2、本发明制备的携载长春新碱的致敏血小板载药体系，药物释放曲线结果显示由致敏血小板包载的药物在酸性环境中释放率较高，而在中性环境中的释放明显减少，如图4所示，因此降低了药物对机体正常组织的毒副作用。
3、cck-8实验结果显示，与游离药物相比，携载长春新碱的致敏血小板载药体系作用于thp-1诱导的巨噬细胞后，对细胞的生长抑制作用更加明显；通过流式细胞术，发现与游离药物相比，携载长春新碱的致敏血小板载药体系可显著促进thp-1诱导的巨噬细胞凋亡。用高效液相色谱法检测到致敏血小板载药体系显著增加了巨噬细胞内的药物浓度，从某种程度上解释了携载长春新碱的致敏血小板载药体系作用增强的原因。
实施例2
一种依托致敏血小板携载修饰后长春地辛构建的治疗免疫性血小板减少症的载药体系的新方法，该方法包括如下步骤：
第一步：在环境温度为20±5℃的室温条件下，在取得的全血中加入重量百分比为4％柠檬酸钠溶液抗凝，全血与柠檬酸钠溶液的体积比为10:1，1200rpm离心5min后得到血小板丰富血浆；
第二步：富血小板血浆以3500rpm离心5min，并用pbs缓冲液洗涤三次，使其不再含有血浆及其他血液成分，弃去上清，得到洗涤血小板，控制血小板计数为(5～10)×106/ul。
第三步：将洗涤血小板400μl的重悬液与2μlcd41抗体在在25±0.5℃的环境中震荡孵育30分钟，3500rpm离心洗涤3次，每次10分钟，得到致敏血小板。
第四步：将长春地辛用二甲基甲酰胺(dmf)溶解后逐滴加入n-(β-马来酰亚氨基丙酸)酰肼(bmph)，25±0.5℃环境下搅拌反应2h，获得修饰了氨基甲酰马来酰亚胺(maleimide)的长春地辛，将修饰了malemide的80ug/ml长春地辛与步骤(3)得到的致敏血小板混合，体积比为2:1，在37±0.5℃的避光环境中以100rpm震荡反应2小时。
第五步：将致敏血小板与长春地辛混合反应物通过琼脂糖凝胶2b分离柱分离，再用pbs缓冲液以3500rmp离心洗涤3次，每次10分钟，即得到携载长春地辛的致敏血小板载药体系。
通过高效液相色谱法定量计算其包封率和载药率，分别为58.91％和39.64％，表明致敏血小板载药体系对细胞毒药物有较高的包载率。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。