本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种共轭高分子的纳米光敏材料及其制备方法和在癌细胞中双光子成像中的应用及作为肿瘤光动力治疗光敏剂的应用。
背景技术：
癌症是威胁人类健康及生命的最重要疾病之一。据2014年世界卫生组织发布的《世界癌症报告》，全球癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势。中国的癌症发病率几乎占了全球的一半，从而成为我国必须自主攻克的重大疾病之一。光动力疗法是20世纪七十年代末开始形成的一项肿瘤治疗新技术，在一些国家已经进行临床试验。到目前为止，世界各国已应用光动力疗法成功地治疗了3000多例癌症病人，其中包括皮肤癌、食道癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、头颈部癌等多种癌症。光动力疗法由于其在癌症治疗的临床研究及实践中有着空间上高精度性、创伤小、可重复性等优点，被认为是一种有效的癌症治疗方式，该疗法正在快速研究发展中，已成为世界肿瘤防治科学中最活跃的研究领域之一。
光动力疗法主要是利用光照下使富集在癌细胞组织的光敏剂活化产生单线态氧，单线态氧与细胞器蛋白质和核酸起反应从而使癌细胞坏死或凋亡。
传统的光动力疗法所用光敏剂的工作波长主要集中在可见光及红光段,对人体组织的光动力杀伤深度通常只有几毫米，因而在临床上的应用范围有限，只适用于皮肤或官腔内壁表浅肿瘤的治疗，而对于组织深部的肿瘤还难以发挥很好的疗效。
双光子光动力疗法是一种利用双光子激发技术的新一代光动力疗法。这种新兴技术利用波长在近红外区的飞秒激光通过双光子吸收来激活光敏剂。由于近红外光位于生物组织光学窗口内(700-1200nm)，具有更大的生物组织渗透性(最高可达几厘米)。双光子光动力疗法因此能够大幅度提高光动力杀伤深度。
为了同时实现高亮度的双光子荧光成像和高效的光动力疗效，以便更好地应用于生物体系中，双光子光动力治疗技术需要解决以下几个关键问题：(1)为了实现高效的光动力疗效，光敏剂材料需要具有高的双光子吸收截面。然而传统的光敏剂小分子的双光子吸光能力比较低，它们的双光子吸收截面通常只有1-200gm(1gm＝10-50cm4sphoton-1)，需要非常强的飞秒激光才能有效激发。利用高强度飞秒激光可能对生物组织造成潜在的伤害，不能充分发挥双光子光动力疗法的优点。(2)为了实现高亮度的双光子成像，需要材料在红光区域有较高的荧光量子效率。然而光敏剂的主要功能是产生单线态氧，需要有效的从单线激发态到三线态的系间窜越(s1→t1)，不可避免地造成光敏剂具有非常低的荧光量子效率，不能用于同步生物成像。
技术实现要素：
为了克服上述现有光敏剂材料的缺陷，本发明的首要目的在于提供一种能跟癌细胞选择性结合、兼具双光子成像功能和双光子光动力疗效的基于共轭高分子的纳米光敏材料。
本发明的另一目的在于提供上述共轭高分子的纳米光敏材料的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述共轭高分子的纳米光敏材料的应用。所述共轭高分子的纳米光敏材料在双光子成像以及作为光动力疗法光敏剂的应用，特别是在近红外双光子激发的细胞成像以及作为双光子光动力治疗肿瘤光敏剂的应用。本发明通过荧光共振能量转移作用增强纳米材料中小分子光敏剂(能量受体)的单线态氧产生量和红光发光团(能量受体)分子的荧光强度，在近红外双光子激发的细胞成像和光动力疗效中具有较好的效果。所述肿瘤细胞优选为kb细胞。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种兼具双光子成像和光动力疗效的共轭高分子的纳米光敏材料，为水溶性纳米颗粒，水溶性纳米颗粒内部含有共轭高分子、光敏剂以及红光发光化合物，共轭高分子为能量给体材料，光敏剂以及红光发光化合物为能量受体材料；
所述共轭高分子，结构式为：
所述共轭高分子、光敏剂以及红光发光化合物的摩尔比为1:(0～0.1):(0～0.1)，光敏剂和红光发光化合物的用量都不为0，优选为1：(0.01～0.05)：(0.01～0.05)。
所述光敏剂的吸收光谱与共轭高分子的发射光谱有重叠；所述红光发光化合物的吸收光谱与共轭高分子的发射光谱有重叠。
所述光敏剂为四苯基卟啉tpp、四苯基卟啉锌(zntpp)或中-四(4-羧基苯基)卟吩(t790)，优选为四苯基卟啉tpp；
四苯基卟啉tpp结构式如下：
所述红光发光化合物优选为tpd(4,4′-([1,2,5]噻二唑[3,4-c]吡啶-4,7-取代)-bis(n,n-二苯胺))，其结构式为：
所述水溶性纳米颗粒的壳层由表面活性剂形成，以(苯乙烯-co-马来酸酐)或
所述水溶性纳米颗粒的表面经过修饰剂修饰，所述修饰剂优选为含有对肿瘤细胞具有靶向性识别作用的官能团的修饰剂，更优选为叶酸官能团；所述修饰剂dspe-peg(2000)folate和dspe-peg(2000)，优选为dspe-peg(2000)folate。
聚(苯乙烯-co-马来酸酐)的结构式如下：
所述纳米光敏材料以水溶液的形式保存和使用。
所述兼具双光子成像和光动力疗效的共轭高分子的纳米光敏材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将共轭高分子、光敏剂、红光发光化合物、表面活性剂与修饰剂采用有机溶剂配成混合溶液；
(2)将混合溶液与水混合，超声处理，去除有机溶剂，获得水溶性纳米颗粒的水溶液，水溶液中纳米颗粒为纳米光敏材料。
所述共轭高分子与表面活性剂的摩尔比为1:(0.1～0.3)，优选为1:(0.1～0.2)。
所述共轭高分子、光敏剂以及红光发光化合物的摩尔比为1:(0～0.1):(0～0.1)，光敏剂和红光发光化合物的用量都不为0，优选为1：(0.01～0.05)：(0.01～0.05)。
所述共轭高分子与修饰剂的摩尔质量比为1μmol：(0.002～0.4)mg。
所述有机溶剂优选为四氢呋喃。
所述共轭高分子在混合溶液中的浓度为(30～50)μmol/l，优选为40μmol/l。
所述水与混合溶液的体积比为(3～40)：1，优选为4:1。
所述超声时间为30～60s。
本发明的光敏材料中纳米颗粒大小主要受基体原料用量影响。相对于能量给体，受体的含量较低，能量传递不充分，不能充分地利用能量给体。为了可以最大限度地利用能量给体，需要足够多的能量受体分子，同时应避免受体分子含量过高从而导致自淬灭。因此，加入的受体分子与能量给体间用量直接影响了能量传递效率。本发明通过单光子、双光子激发荧光光谱分析优化受体小分子(tpp和tpd)的浓度(此浓度是相对于能量给体，占能量给体的百分含量)，达到最优的能量传递效果。
本发明的光敏材料为一种水溶性的纳米颗粒，该纳米颗粒状的光敏材料具有以下优势：(1)水溶性，具有很好地生物相容性。(2)纳米球的尺寸在40～55nm之间，在100nm以内可以很好地进入细胞中。(3)双光子吸收截面大。
本发明的基于共轭高分子的纳米光敏材料，是以高双光子吸收截面的共轭高分子为基体，作为能量给体材料，同时引入光敏剂(如：四苯基卟啉(tpp))和红光发光团(如：tpd)作为能量受体。通过共轭高分子对光敏剂和红光发光团的能量传递作用，增强光敏剂的单线态氧产生量以及红光发光团的荧光强度(能增强红光发光团或光敏剂的双光子激发效率高达几百倍)。聚(苯乙烯-co-马来酸酐)或
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、本发明共轭高分子的纳米光敏材料具有在暗环境下对细胞无毒性，在近红外光照条件下对细胞产生高损伤效果的特点；所述细胞为癌细胞，尤其是kb细胞；
2、本发明共轭高分子的纳米光敏材料为水溶性，生物相溶性好；具有纳米尺寸，易于进入细胞；而且在双光子激发下，通过荧光共振能量转移能够增强光敏剂的单线态氧产生量以及红光发光团的荧光强度(使光敏剂四苯基卟啉的单线态氧产生量增强161倍，使红光发光团tpd的荧光强度增强23倍)，使得本发明的光敏材料具有高效双光子成像功能和双光子光动力疗效；
3、本发明的光敏材料能跟癌细胞选择性结合，可采用同步双光子成像的光动力治疗法治疗肿瘤，治疗效率高，副作用少；
4、本发明共轭高分子的纳米光敏材料具有很强的双光子激发荧光发射性质，具有很好的光稳定性，可利用同步双光子成像的光动力治疗过程，具有较强的应用价值；
5、本发明共轭高分子的纳米光敏材料的原料易得、合成条件温和，制备方法简单。
需强调的是，在现有技术中，未有文献报道过本发明的共轭高分子的纳米光敏材料。本发明通过同时引入两个受体分子，分别应用于单线态氧产生及细胞成像从而使得本发明的材料作为一种高效的兼具双光子成像功能和双光子光动力疗效的纳米光敏材料。
附图说明
图1是本发明制备共轭高分子的纳米光敏材料的原料共轭化高分子ppbf，tpp，tpd在四氢呋喃中的归一化紫外可见吸收光谱图(ppbf-abs，tpp-abs，tpd-abs)和归一化荧光发射光谱图(ppbf-pl，tpp-pl，tpd-pl)；
图2是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料(fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)的粒径分布图；
图3是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料的透射电镜图；
图4是实施例2～5制备的纳米颗粒以及共轭高分子的纳米光敏材料的荧光光谱；其中(a)单光子激发下(400nm)，实施例2中含有不同含量光敏剂tpp的纳米颗粒材料以及实施例4中tpp(2％)nps的荧光光谱；(b)双光子激发下(750nm)，实施例2中含有不同含量光敏剂tpp的纳米颗粒材料以及实施例4中tpp(2％)nps的荧光光谱，tpp(2％)npsx10代表将tpp(2％)nps的光谱信号放大10倍；(c)单光子激发下(400nm)，实施例3中含有不同含量红光发光化合物tpd的纳米光敏材料、实施例2中ppbfnps、ppbf/tpp(2％)nps以及实施例4中tpp(2％)nps和实施例5中tpd(2％)nps的荧光光谱；(d)双光子激发下(750nm)，实施例3中含有不同含量红光发光化合物tpd的纳米光敏材料、实施例2中ppbfnps、ppbf/tpp(2％)nps以及实施例4中tpp(2％)nps和实施例5中tpd(2％)nps的荧光光谱，tpp(2％)npsx10代表将tpp(2％)nps的光谱信号放大10倍；
图5为实施例3中不同tpd含量下，纳米光敏材料的单、双光子激发下荧光增强倍数的曲线图；图a为在纳米光敏材料ppbf/tpp(2％)/tpd(1％、2％、3％、5％)nps中，随着tpd的加入，单、双光子激发下ppbf对tpp的荧光增强倍数；图b为在ppbf/tpp(2％)/tpd(1％、2％、3％、5％)nps中，随着tpd的加入，单、双光子激发下，ppbf对tpd荧光增强倍数；a、b图中400nm对应的纵坐标是单光子增强倍数，750nm对应双光子增强倍数；
图6是实施例3制备的纳米光敏材料(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)、实施例5中tpp(20％)nps以及h2o的单线态氧产量的变化曲线即吸光度值随时间变化的曲线；
图7是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps、实施例3制备的纳米光敏材料(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)以及实施例5制备的fa-tpd(2％)nps对kb细胞在飞秒激光750nm光照下的光动力疗效的细胞存活率的柱状图；
图8是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料(fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)在不同浓度下((0-4μmol/l))对kb细胞的存活率的影响图；
图9是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料(fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)、实施例3制备的ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps以及实施例5制备的fa-tpd(2％)nps在飞秒激光750nm激发条件下，在kb细胞中的成像图；图a为fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps，图b为ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps，图c为fa-tpd(2％)nps；a、b、c中，左边为细胞明场图，中间为细胞中的双光子激发荧光成像图；右边为细胞的明场和双光子激发荧光成像的叠加图；
图10是本发明制备共轭高分子的纳米光敏材料的原料共轭高分子ppbf、tpp、tpd的双光子吸收截面值随波长变化的曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例以及附图，对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中共轭高分子ppbf的合成所参考的文献：liu,p.；li,s.；jin,y.；qian,l.；gao,n.；yao,s.q.；huang,f.；xu,q.-h.；cao,y.,red-emittingdpsb-basedconjugatedpolymernanoparticleswithhightwo-photonbrightnessforcellmembraneimaging.acs.appl.mater.interfaces2015,7(12),6754-6763。
红光发光化合物tpd的合成所参考的文献：jiang,j.；hu,d.；hanif,m.；li,x.；su,s.；xie,z.；liu,l.；zhang,s.；yang,b.；ma,y.,twistangleandrotationfreedomeffectsonluminescentdonor–acceptormaterials:crystalstructures,photophysicalproperties,andoledapplication.adv.opt.mater.2016,4(12),2109-2118.
dspe-peg(2000)folate指的是1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[folate(polyethyleneglycol)-2000](ammoniumsalt)(缩写为dspe-peg(2000)-fa)和dspe-peg(2000)均从avantipolarlipids公司购买。
本发明中所使用的聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(缩写为psma)是从sigmaaldrich公司购买。
实施例1
一种兼具双光子成像和光动力疗效的共轭高分子的纳米光敏材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将共轭高分子(ppbf)、四苯基卟啉(tpp)、红光发光化合物(tpd)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)，dspe-peg(2000)-fa分别溶解在四氢呋喃溶剂中，然后将共轭高分子(ppbf)、四苯基卟啉(tpp)、红光发光化合物(tpd)与聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)的溶液混合，再加入dspe-peg(2000)-fa的四氢呋喃溶液，混匀，得到1ml混合溶液；混合溶液中共轭高分子(ppbf)的浓度为40μmol/l，四苯基卟啉(tpp)的浓度为0.8μmol/l，红光发光团(tpd)的浓度为0.8μmol/l，聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)的浓度为8μmol/l，dspe-peg(2000)-fa的浓度为0.004mg/ml；
(2)将混合溶液快速注入4ml的去离子水中，超声处理30s，旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，得到共轭高分子的纳米光敏材料(记为fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)，纳米光敏材料以水溶液的形式储存，水溶液为澄清的、亮黄色的水溶液。所制备的共轭高分子的纳米光敏材料的浓度按照共轭高分子ppbf的浓度表示，为10μmol/l。本实施例制备的共轭高分子的纳米光敏材料的粒径分布图如图2所示。从图2中可知，本发明所制备的纳米光敏材料的粒径在40～55nm之间，平均直径为45nm左右。
本实施例制备的共轭高分子的纳米光敏材料的透射电镜图如图3所示。
实施例2
几种纳米颗粒材料的制备：
1、纳米颗粒ppbfnps的制备：采用四氢呋喃将共轭高分子(ppbf)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)与dspe-peg(2000)溶解混合，得到1ml混合溶液，该混合溶液中共轭高分子(ppbf)的浓度为40μmol/l，psma的浓度为8μmol/l，dspe-peg(2000)的浓度为0.004mg/ml；将混合溶液快速注射到4ml的去离子水中，超声30s，旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，得到纳米颗粒产物ppbfnps；
2、纳米颗粒ppbf/tpp(1％、2％、3％)nps的制备：采用四氢呋喃将共轭高分子(ppbf)、不同含量的四苯基卟啉(tpp)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)与dspe-peg(2000)溶解混合，分别得到1ml不同tpp含量的混合溶液，混合溶液中共轭高分子ppbf的浓度为40μmol/l，tpp的浓度分别为0.4μmol/l、0.8μmol/l、1.2μmol/l，psma的浓度为8μmol/l，dspe-peg(2000)的浓度为0.004mg/ml；将不同tpp含量的混合溶液分别快速注射到4ml的去离子水中，超声30s，旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，分别得到纳米颗粒产物ppbf/tpp(1％)nps，ppbf/tpp(2％)nps和ppbf/tpp(3％)nps。
实施例3
通过对共轭高分子加入不同比例光敏剂tpp的纳米颗粒材料(实施例2制备的纳米颗粒)的分析，tpp加入量为共轭高分子摩尔含量的2％时最佳，故在此基础上再加入不同比例红光发光团tpd，使ppbf的能量被充分利用。
纳米光敏材料的制备：
纳米颗粒ppbf/tpp(2％)/tpd(1％、2％、3％、5％)nps的制备：
采用四氢呋喃将共轭高分子(ppbf)、四苯基卟啉(tpp)、不同含量的红光发光化合物(tpd)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)与dspe-peg(2000)溶解混合，得到1ml不同tpd含量混合溶液，混合溶液中共轭高分子ppbf的浓度为40μmol/l，tpp的浓度为0.8μmol/l，红光发光化合物tpd的浓度分别为0.4μmol/l、0.8μmol/l、1.2μmol/l、2.0μmol/l，psma的浓度为8μmol/l，dspe-peg(2000)的浓度为0.004mg/ml；将混合溶液快速注射到4ml的去离子水中，超声30s，旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，分别得到纳米光敏材料ppbf/tpp(2％)/tpd(1％)nps、ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps、ppbf/tpp(2％)/tpd(3％)nps、ppbf/tpp(2％)/tpd(5％)nps。
实施例4
tpp(20％)nps和tpp(2％)nps的制备：采用四氢呋喃将不同含量的四苯基卟啉(tpp)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)与dspe-peg(2000)溶解混合，得到1ml不同tpp含量的混合溶液，混合溶液中tpp的浓度分别为0.8μmol/l、8μmol/l，psma的浓度为8μmol/l，dspe-peg(2000)的浓度为0.004mg/ml；将不同tpp含量的混合溶液分别快速注射到4ml的去离子水中，超声30s，旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，分别得到产物tpp(20％)nps和tpp(2％)nps。
实施例5
tpd(2％)nps的制备：采用四氢呋喃将将红光发光化合物(tpd)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)与dspe-peg(2000)溶解混合，得到1ml混合溶液，混合溶液中tpd的浓度为0.8μmol/l，psma的浓度为8μmol/l，dspe-peg(2000)的浓度为0.004mg/ml；将混合溶液快速注射到4ml的去离子水中，超声30s，旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，得到产物tpd(2％)nps。
fa-tpd(2％)nps的制备：采用四氢呋喃将将红光发光化合物(tpd)、聚(苯乙烯-co-马来酸酐)(psma)与dspe-peg(2000)溶解混合，得到1ml混合溶液，混合溶液中tpd的浓度为0.8μmol/l，psma的浓度为8μmol/l，dspe-peg(2000)-fa的浓度为0.004mg/ml；将混合溶液快速注射到4ml的去离子水中，超声30s，旋转蒸发除去溶液中的四氢呋喃，得到产物fa-tpd(2％)nps。
性能测试：
1、本发明制备共轭高分子的纳米光敏材料的原料共轭化高分子(ppbf)，光敏剂(tpp)，红光发光化合物(tpd)在四氢呋喃中的归一化紫外吸收光谱图和归一化荧光发射光谱图如图1所示。从图1中可以看出，ppbf的发射光谱与tpp及tpd的吸收光谱有着很好的重叠，表明该纳米材料中给、受体分子之间可以实现有效的荧光共振能量转移。
本发明所制备的共轭高分子的纳米光敏材料的原料ppbf、tpp、tpd的双光子吸收截面值随波长变化的曲线图如图10所示。
其测试条件为双光子吸收截面以荧光素作为参比，按照下式计算：
2、图4是实施例2～5制备的纳米颗粒以及共轭高分子的纳米光敏材料的荧光光谱；其中(a)单光子激发下(400nm)，实施例2中含有不同含量光敏剂tpp的纳米颗粒材料以及实施例4中tpp(2％)nps的荧光光谱；(b)双光子激发下(750nm)，实施例2中含有不同含量光敏剂tpp的纳米颗粒材料以及实施例4中tpp(2％)nps的荧光光谱，tpp(2％)nps×10代表将tpp(2％)nps的光谱信号放大10倍；(c)单光子激发下(400nm)，实施例3中含有不同含量红光发光化合物tpd的纳米光敏材料、实施例2中ppbfnps、ppbf/tpp(2％)nps以及实施例4中tpp(2％)nps和实施例5中tpd(2％)nps的荧光光谱；(d)双光子激发下(750nm)，实施例3中含有不同含量红光发光化合物tpd的纳米光敏材料、实施例2中ppbfnps、ppbf/tpp(2％)nps以及实施例4中tpp(2％)nps和实施例5中tpd(2％)nps的荧光光谱，tpp(2％)nps×10代表将tpp(2％)nps的光谱信号放大10倍。
测试步骤：对纳米颗粒(ppbf/tppnps)进行光谱测试，分析ppbf/tppnps中ppbf对tpp的能量传递效率，选择ppbf对tpp能量传递约为50％时tpp的浓度，且此浓度下tpp没有发生自淬灭现象。由图4中a,b可知，在共轭高分子纳米颗粒体系中加入2％tpp时，双光子激发ppbf对tpp的能量传递效率约为50％。且此浓度下tpp没有发生自淬灭现象。为充分利用共轭高分子ppbf剩余的能量，在此基础上，进一步加入不同比例的tpd，分析在ppbf/tpp/tpdnps中，ppbf对tpd能量传递效率。综合考虑ppbf对tpp以及tpd的能量传递效率，从而选择一个tpp以及tpd的最优化的浓度。由图4中c,d可知，ppbf/tpp/tpdnps的单光子和双光子荧光光谱趋势与ppbf/tppnps类似。随着受体分子tpd浓度的增高，ppbf的发射峰强度进一步减弱，tpd的发射峰强度逐渐增强；当tpd/ppbf的物质量比为0-2％时，tpd的荧光峰强度与tpd的浓度成比例增长。当tpd/ppbf的物质量比大于2％时，随着tpd的浓度进一步增高(tpd/ppbf物质量浓度比为2％-5％时)，650nm波长处的尖峰减弱，由于受体tpd分子浓度过高，抑制了ppbf对tpp的能量传递。因此为同时获得高双光子诱导荧光、高双光子诱导单线态氧产率，充分考虑tpp、tpd的浓度，最终在以共轭高分子ppbf的浓度为参考基准，优化制备了一个含有2％tpp，2％tpd浓度的纳米材料(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)。
3、图5为实施例3中不同tpd含量下，纳米光敏材料的单、双光子激发下荧光增强倍数的曲线图；图a为在纳米光敏材料ppbf/tpp(2％)/tpd(1％、2％、3％、5％)nps中，随着tpd的加入，单、双光子激发下ppbf对tpp的荧光增强倍数；图b为在ppbf/tpp(2％)/tpd(1％、2％、3％、5％)nps中，随着tpd的加入，单、双光子激发下，ppbf对tpd荧光增强倍数；a、b图中400nm对应的纵坐标是单光子增强倍数，750nm对应双光子增强倍数。
通过对增强倍数的计算可知，样品ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps在双光子激发下，通过荧光共振能量转移可使光敏剂tpp的单线态氧产生量增强161倍，使红光发光团tpd的荧光强度增强23倍。
4、图6是实施例3制备的纳米光敏材料(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)，实施例4中tpp(20％)nps和h2o的单线态氧产量的变化曲线即吸收值随时间变化的曲线。
图6体现的是利用光谱的方法检测本发明所制备的纳米光敏材料的单线态氧的产生量。在光动力学治疗中，单线态氧作为一种主要的活性氧物质可杀死癌细胞。一旦有单线态氧的存在，9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(缩写为abda)被氧化降解而使其吸收值降低，故abda可作为化学探针间接地确定纳米光敏材料所产生单线态氧的量。通过检测abda吸收的变化来确定纳米光敏材料所产生单线态氧的量。在单线态氧的检测中，取0.5ml10μmol/l的纳米光敏材料(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)的水溶液(或tpp(20％)nps的水溶液，或h2o)中加入abda，使abda的浓度为0.01mol/l。将该纳米光敏材料与abda混合物的水溶液置于光功率密度为0.91wcm-2的750nm的飞秒激光下，检测abda位于260nm处的最大吸收值随着照射时间的变化。以2min为间隔连续检测abda在22min内吸收光谱的变化。从图6对样品ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps，tpp(20％)nps和h2o的双光子激发诱导abda的氧化效果可以知道：
在双光子激发(750nm)下该复合的纳米材料产生单线态氧的效率相比单纯的tpp纳米材料增强149倍。这表明在纳米颗粒ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps中，通过共轭高分子对小分子光敏剂的荧光共振能量传递过程，明显增强了单线态氧的产生量。
5、图7是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps、实施例3制备的纳米光敏材料(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)以及实施例5制备的fa-tpd(2％)nps对kb细胞在飞秒激光750nm光照下的光动力疗效的细胞存活率的柱状图。在750nm飞秒激光光照15min下，检测fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps、ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps以及fa-tpd(2％)nps处理后的细胞存活情况，加入样品fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps的细胞内可以观察到明显的双光子红光信号，而表面无靶向物的样品(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)以及只含有小分子红光发光团样品(fa-tpd(2％))的细胞中没有观察到明显的双光子荧光信号，表明修饰有靶向性fa的样品(fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)可以很好地进入到kb细胞中且在有共轭高分子ppbf的纳米颗粒中由于作为能量供体的ppbf对小分子tpd的能量传递作用，从而使得tpd的荧光显著增强。验证了双光子激发下fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps可以选择性作用于癌细胞，具有更强的双光子光动力疗效。
6、细胞毒性测试：fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps的细胞毒性测试。kb细胞接种于96孔玻璃底共聚焦专用培养皿中，并在37℃，5％的co2的培养箱内培养24个小时直至细胞达到20-30％的饱和度。在细胞中加入不同浓度(0-4μmol/l)的共轭高分子的纳米光敏材料后继续在培养箱内培养24个小时，根据mtt法检测各个处理条件下的细胞存活率。测试结果如图8所示。
图8是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料(fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)在不同浓度下((0-4μmol/l))对kb细胞的存活率的影响图。kb细胞在高达4μmol/l的fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps中，细胞活性仍然达到85％，表明该纳米光敏材料fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps具有很好的无毒性，可以更好地应用于生物体内。
7、光动力治疗效果测试：kb细胞接种于共聚焦专用培养皿中，并在37℃，5％的co2的培养箱内培养24个小时直至细胞达到70-80％的饱和度。在细胞中加入1μmol/l浓度的fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps、ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps以及等量的fa-tpd(2％)nps，并继续在培养箱内培养12个小时后，细胞用一台双光子共聚焦扫描显微镜(olympusix73)观察，光谱接收范围为610-700nm，细胞成像中所使用的物镜为100倍的油镜。
图9是实施例1制备的共轭高分子的纳米光敏材料(fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)、实施例3制备的ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps以及实施例5制备的fa-tpd(2％)nps在飞秒激光750nm激发条件下，在kb细胞中的成像图；图a为fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps，图b为ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps，图c为fa-tpd(2％)nps；a、b、c中，左边为细胞明场图，中间为细胞中的双光子激发荧光成像图；右边为细胞的明场和双光子激发荧光成像的叠加图。根据750nm双光子激发下的细胞荧光成像图(如图9所示)，加入样品fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps的细胞内可以观察到明显的双光子红光信号，而表面无靶向物的样品(ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)以及只含有小分子红光发光团样品(fa-tpd(2％)nps)的细胞中没有观察到明显的双光子荧光信号，表明修饰有靶向性fa的样品(fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps)可以很好地进入到kb细胞中且在有共轭高分子ppbf的纳米颗粒中，由于作为能量供体的ppbf对小分子tpd的能量传递作用，从而使得tpd的荧光显著增强。这也与荧光光谱(图4)的数据相符合。验证了双光子激发下，fa-ppbf/tpp(2％)/tpd(2％)nps可以选择性作用于癌细胞，相较于单纯的红光发光团tpd纳米材料具有更强的细胞荧光成像效果。
对于图4～6中光敏材料的结论仍适用于dspe-peg(2000)-fa代替dspe-peg(2000)所制备的光敏材料。
综上所述，与现有的光敏剂对比，本发明提供的含共轭高分子、红光发光团及光敏剂的纳米光敏材料在保证生物相容性的同时能够充分发挥给体共轭高分子ppbf以及两个受体分子tpp与tpd各自优点。fa-ppbf/tpp/tpdnps在近红外双光子激发下，可通过荧光共振能量作用增强光敏剂单线态氧的产生以及红光发光团的荧光强度，实现高效地同步双光子荧光成像和光动力疗效。双光子激发具有显著优势：(1)长波处的近红外光比短波长光受散射影响较小，可以获得更大的生物组织渗透性，可以进行更深层组织的光动力治疗；(2)具有更好的聚焦点，提高信噪比；(3)长波处的近红外光比短波长的光对细胞毒性小。
本发明的纳米光敏材料具有很高的双光子吸收截面，通过荧光共振能量传递过程可以大大地增强了双光子成像和光动力疗效的效果，克服了传统的光敏剂双光子截面小，不能同步进行细胞成像的缺陷，同时本发明的纳米光敏材料在暗环境中对癌细胞具有无毒性。而且利用双光子激发具有显著优势：(1)长波长的近红外光比短波长光受散射影响较小，可以获得更大的生物组织渗透性，可以进行更深层组织的光动力治疗；(2)具有更好的聚焦点，提高信噪比；(3)长波处的近红外光比短波长的光对细胞毒性小。
以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。