本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法。
背景技术：
急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是临床上常见的可导致病人猝死的急危重症。冠状动脉介入术恢复冠脉血流是目前临床上挽救AMI病人的常用治疗方法，但随之引起的心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion，I/R)损伤，可促使缺血心肌梗死面积增加20％-50％，目前尚无很好的解决办法。心肌I/R损伤机制主要表现为线粒体功能障碍，及其诱导的心肌细胞凋亡和自噬，恢复线粒体的正常功能对于减轻心肌I/R损伤无疑具有重大科学研究价值。目前临床上治疗心肌I/R损伤的大部分药物缺乏组织特异性，对心肌细胞选择性不强，到达线粒体效应靶点的浓度很低，导致药物的预期疗效不理想。因此，实现药物靶向缺血心肌细胞线粒体具有非常重要的临床意义。
(1)心肌I/R损伤与线粒体mPTP开放密切相关
线粒体功能障碍与心肌I/R损伤的各个环节都密切相关，尤其是心肌细胞凋亡和自噬。生理状态下，线粒体膜上的通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore，mPTP)呈关闭状态，在心肌I/R早期，线粒体偏离生理平衡点，产生大量超氧化物阴离子和活性氧，导致线粒体钙超载和氧化应激增加，线粒体膜、酶、电子传递链发生氧化损伤，产生ATP减少，促使线粒体膜上的mPTP开放，引起线粒体内膜通透性急剧增加，使得细胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)从线粒体内释放入胞浆，触发Caspases的级联效应，导致凋亡相关蛋白Bcl-2(抗凋亡)表达降低、Bax(促凋亡)表达升高，从而诱导心肌细胞凋亡；还可以激活Beclin1介导的自噬，表现为细胞内出现大量自噬体和自噬溶酶体，最终细胞被自身溶酶体降解，引发自噬性细胞死亡。因此，在再灌注早期有效地抑制线粒体mPTP的开放，减少心肌细胞凋亡和自噬，可作为心肌I/R损伤新的治疗策略。
(2)模型药物-葛根素具有抑制线粒体mPTP开放的作用
葛根素是从中药葛根中提取的有效成分，具有扩张冠状动脉、改善冠脉循环、减少心肌I/R损伤和抑制血小板聚集等多种药理作用，临床上常采用葛根素注射液治疗冠心病、心绞痛和心肌梗死等疾病。目前通过对葛根素减少心肌I/R损伤的机制研究发现，葛根素可以抑制线粒体mPTP的开放，调节线粒体的生理功能。Gao Q和Yao H等研究发现葛根素保护I/R损伤心肌的作用与促进mitoKATP通道和mitoKCa通道的开放，进而稳定线粒体膜电位，抑制mPTP开放有关。以上文献报道表明：葛根素通过抑制mPTP的开放，维持线粒体稳态平衡，抑制心肌细胞凋亡和自噬，增加线粒体对缺血的耐受性，从而减少心肌I/R损伤，故推测将药物传递到位于线粒体的效应靶点，实现精准化给药，将有可能很大程度上提高药物治疗效果、减少给药剂量。将葛根素药物传递到线粒体需要克服多层生物学屏障：首先，葛根素药物载体必须富集在缺血心肌部位；其次，药物载体需克服肝脾网状内皮系统(RES)的捕获，确保药物在到达靶器官时能够维持有效浓度；最后，细胞液呈高粘度状态，阻碍线粒体摄取药物，同时细胞内溶酶体还能够降解药物，进一步降低到达效应细胞器的药物浓度。所有这些问题都与构建高效的线粒体靶向递药系统密切相关，值得深入探讨和系统研究。
(3)PEG-PE纳米胶束可以被动渗透富集在缺血心肌部位，还可减少药物被RES捕获
线粒体靶向给药系统可以很大程度上提高药物的治疗效果，该方面的研究报道主要见于肿瘤药物。如Zhang C课题组构建了一种源头创新的线粒体靶向系统，为线粒体靶点抗肿瘤药物提供了安全、高效的载体平台，构建类似功能的缺血心肌细胞线粒体靶向给药系统，这可能是一个全新的、具有挑战性的研究领域。线粒体在体内组织细胞中均有分布，如何将药物聚集在缺血心肌部位为实现心肌细胞线粒体靶向给药的前提。据文献报道，缺血心肌区域血管内膜通透性异常升高，PEG高分子在缺血心肌部位具有较好的高通透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect,EPR)。正常组织血管壁细胞排列紧密，且结构完整，故PEG高分子载药系统随血液循环过程中几乎不会渗出，但在心肌缺血区域PEG高分子能透过通透性增加的血管内膜，汇集于梗死早期心肌组织。我们的前期研究结果发现：PEG化葛根素在急性心肌缺血模型大鼠心肌组织中的AUC为正常大鼠的1.7倍，具有明显的缺血心肌靶向性；葛根素PEG-PE纳米胶束在急性缺血模型小鼠心脏中的AUC为正常小鼠心脏中的1.9倍，表明葛根素PEG-PE纳米胶束在心肌梗死早期区域具有较好的心脏靶向性，可以将药物蓄积于缺血心肌。Lukyanov AN等也发现聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)纳米胶束主要聚集梗死早期心肌组织，其含量为未梗死区心肌的8倍。前期研究和文献报道支持PEG高分子和PEG-PE纳米胶束在缺血心肌部位具有较好的EPR效应，可以将药物被动蓄积于心脏的病变部位，提高药物的选择性。另外，PEG-PE纳米胶束外围的PEG高分子具有良好的生物相容性，且纳米胶束粒径很小，可以减少肝脾网状内皮系统(RES)的捕获。
(4)TPP阳离子可介导药物载体靶向进入线粒体，并减少药物被溶酶体降解
载药胶束滞留于缺血心肌部位后，如何克服细胞液的阻挡和溶酶体的破坏，为实现药物线粒体靶向的关键问题。目前大量研究证实Triphenyl phosphonium(TPP)阳离子具有线粒体靶向性，由于线粒体内膜带150-180mv负电荷，细胞膜带30-60mv负电荷，而TPP为三苯基膦阳离子带正电荷，正负电荷相互吸引，促使TPP阳离子聚集于线粒体的能力提高100-500倍，能够克服高粘度细胞液的阻碍。文献报道TPP阳离子可介导肿瘤药物、抗氧化药物和G(5)-PAMAM树枝状嵌段共聚物靶向进入线粒体，由此类推，TPP阳离子同样可作为载药纳米胶束递送于心肌细胞线粒体的主动靶向分子；另外，TPP阳离子在溶酶体具有“质子海绵”效应，可以减少细胞内溶酶体和内涵体对纳米胶束的破坏，起到“溶酶体逃逸”效果，进一步提高药物在效应细胞器中的浓度。
经检索国内外文献，查阅到透明质酸修饰的葛根素PEG-PLGA纳米粒，葛根素PEG-PE纳米胶束以及PEG化葛根素等报道，内容主要涉及纳米材料体外缓慢释放药物、降低红细胞溶血、对缺血再灌注心肌的保护作用、抗细胞凋亡以及在急性心肌缺血动物体内的组织分布等，构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体的载药纳米胶束需克服诸多技术瓶颈，本发明鉴于PEG-PE高分子在缺血心肌部位的EPR效应，再加上TPP阳离子的电荷效应，逐步将葛根素等药物递送到缺血心肌细胞线粒体效应部位，抑制线粒体膜上的通透性转换孔开放，从而减少缺血再灌注期心肌细胞大量凋亡和自噬，与以往的葛根素纳米药物相比，精准递送药物至效应细胞器的作用靶点，不仅很大程度上提高药物的作用效果，还可以减少药物的不良反应。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的方法包括如下步骤：
(1)合成TPP-PEG-PE嵌段共聚物：将CTPP溶于氯仿，然后加入三乙胺、NHS和EDC，室温(5—30℃)下搅拌后再加入DSPE-PEG-NH2的氯仿溶液，在氮气的保护下，室温(5—30℃)搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤后离心，取下层沉淀物，再将下层沉淀物冷冻干燥，得TPP-PEG-PE嵌段共聚物；所述TPP-PEG-PE嵌段共聚物结构式如式Ⅰ所示：
(2)制备序级靶向载药纳米胶束：将PEG-PE、TPP-PEG-PE与葛根素共溶于甲醇、乙腈或二氯甲烷等有机溶剂中，采用薄膜水化法即可制备载葛根素的序级靶向纳米胶束；所述药物为作用于缺血心肌细胞线粒体治疗心肌缺血再灌注损伤的药物，优选为葛根素或黄芩苷等。
优选地，所述载葛根素的序级靶向纳米胶束的平均粒径为10—100nm，优选约为17nm，且呈良好的正态分布，zeta电势为-20—+20mV。
优选地，步骤(1)中，所述CTPP与氯仿的质量体积比为(90—110mg):(9—11mL)，优选为100mg:10mL，所述CTPP与三乙胺的质量体积比为(90—110mg):(180—220μL)，优选为100mg:200μL，所述CTPP与NHS的质量比为100:(70—80)，优选为100:74，CTPP与EDC的质量比为100:(120—125)，优选为100:124，所述CTPP与DSPE-PEG-NH2的氯仿溶液的质量体积比为(90—110mg):(18—28mL)，优选为100mg:25mL。
优选地，步骤(1)中，所述CTPP的浓度为0.23mM，所述NHS的浓度为0.50—0.70mM，优选为0.64mM，所述DSPE-PEG-NH2的氯仿溶液中DSPE-PEG-NH2的浓度为20—30mg/mL，优选为25mg/mL。
优选地，步骤(2)中，所述PEG-PE与药物的摩尔比为(97—80):(15—25)，优选为90:20，所述TPP-PEG-PE与药物的摩尔比为(3—20):(15—25)，优选为10:20。下面对本发明作进一步说明：
TPP-PEG-PE嵌段共聚物的合成：
精密称取100mg(0.23mM)CTPP溶于10mL氯仿，加入200μL三乙胺，124mg(0.64mM)EDC和74mg(0.64mM)NHS，室温下搅拌2h，然后再加入25mL浓度为25mg/mL DSPE-PEG-NH2(分子量：2800，0.22mM)的氯仿溶液，在氮气的保护下，室温搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤，离心取下层沉淀物，再冷冻干燥，可获得TPP-PEG-PE嵌段共聚物，具体合成路线如下：
载药序级靶向纳米胶束的制备：
由于PEG-PE同时存在亲水和亲油基团，作用于缺血心肌细胞线粒体治疗心肌缺血再灌注损伤的药物如葛根素、黄芩苷等恰好属于疏水性药物，包载于PEG-PE纳米胶束的疏水性内核。将PEG-PE、TPP-PEG-PE分别与药物(PEG-PE与药物的摩尔比为97:20，TPP-PEG-PE与药物的摩尔比为3:20)共溶于甲醇、乙腈或二氯甲烷中，采用薄膜水化法制备序级靶向载药纳米胶束(制备路线见图1)。经检测，发现序级靶向载药纳米胶束平均粒径约17nm，且呈良好的正态分布，zeta电势为-1mV，稳定性良好(结果见图2)。
本发明构建序级靶向缺血心肌细胞线粒体载药纳米胶束的作用过程为：采用PEG-PE、TPP-PEG-PE与药物共溶于甲醇、乙腈或二氯甲烷中，采用薄膜水化法即可制备载序级靶向载药纳米胶束：先以PEG-PE纳米胶束的EPR效应，将载药纳米胶束蓄积于缺血部位的心肌组织，并借助于纳米胶束外周包被的PEG高分子壳层的“隐形”功能，减少肝脾网状内皮系统(RES)的吞噬，将大部分药物转运到作用部位；借助于TPP阳离子的电荷效应，介导药物载体进入缺血心肌细胞内的线粒体，逐步将药物靶向到效应细胞器，提高药物体内作用的特异性。
总之，本发明采用序级靶向纳米胶束将治疗心肌缺血再灌注损伤的药物靶向递送到缺血心肌细胞线粒体，发挥药理作用。先以PEG-PE纳米胶束的EPR效应，将药物载体靶向蓄积于梗死早期的缺血心肌；然后以TPP阳离子的电荷效应，介导药物载体进入带负电荷的心肌细胞线粒体，将作用于缺血心肌细胞线粒体治疗心肌缺血再灌注损伤的药物逐级靶向到缺血心肌细胞线粒体，实现精准化给药。
附图说明
图1为薄膜水化法制备序级靶向载药纳米胶束的过程图；TPP-PEG-PE为TPP修饰的PEG-PE双亲性高分子材料，PEG-PE为PEG-PE双亲性高分子，Puerarin为葛根素，Self-assembly为自组装形成胶束过程、solution为反应溶剂；最终葛根素药物与上述2种高分子双亲性高分子材料自组装形成纳米胶束溶液，葛根素药物包裹在纳米胶束的亲脂核内层，外围是亲水性的PEG高分子；
图2为载葛根素的序级靶向纳米胶束的粒径分布和zeta电势图；
图3为载葛根素的序级靶向纳米胶束(PUE@TPP-PEG-PE)、载葛根素的PEG-PE纳米胶束(PUE@PEG-PE)和葛根素(PUE)对异丙肾上腺素(ISO)诱导H9c2心肌细胞凋亡的保护作用；其中，图3-1为Hoechst染色，图3-2为.Hoechst阳性细胞百分率(#p<0.05,##p<0.01)，图3-3为Caspase 3活性(#p<0.05,##p<0.01)，图3-4为凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达(#p<0.05,##p<0.01)；
图4为载香豆素(带绿色荧光成分)的序级靶向纳米胶束(C6@TPP-PEG-PE)、载香豆素的PEG-PE纳米胶束(C6@PEG-PE)和香豆素(C6)的细胞摄取试验。
具体实施方式(实施例中未作特别说明的原料和试剂均为市售)
以构建载葛根素的序级靶向纳米胶束的方法为例，包括如下步骤：
(1)TPP-PEG-PE嵌段共聚物的合成：
精密称取100mg(0.23mM)CTPP溶于10mL氯仿，加入200μL三乙胺，124mg(0.64mM)EDC和74mg(0.64mM)NHS，室温下搅拌2h，然后再加入25mL浓度为25mg/mL DSPE-PEG-NH2(分子量：2790，0.22mM)的氯仿溶液，在氮气的保护下，室温搅拌过夜，粗反应物采用冰乙醚多次洗涤，离心取下层沉淀物，再冷冻干燥，可获得TPP-PEG-PE嵌段共聚物，具体合成路线如下：
(2)载葛根素的序级靶向纳米胶束的制备：
由于PEG-PE同时存在亲水和亲油基团，葛根素恰好属于疏水性药物，包载于PEG-PE纳米胶束的疏水性内核。将PEG-PE、TPP-PEG-PE分别与葛根素(PEG-PE与葛根素的摩尔比为97:20，TPP-PEG-PE与葛根素的摩尔比为3:20)共溶于甲醇、乙腈或二氯甲烷中，采用薄膜水化法制备序级靶向载药纳米胶束(制备路线见图1)。经检测，发现载葛根素的序级靶向纳米胶束平均粒径约17nm，且呈良好的正态分布，zeta为-1mV，稳定性良好(结果见图2)。
(3)载葛根素的序级靶向纳米胶束对异丙肾上腺素(ISO)诱导H9c2心肌细胞凋亡的保护作用：
Con：空白对照组；ISO：模型组，采用10μM异丙肾上腺素(ISO)诱导H9c2心肌细胞凋亡造模；ISO+PUE：H9c2心肌细胞先与20μM葛根素(PUE)药物共同孵育0.5h，再加入10μM异丙肾上腺素(ISO)诱导心肌细胞凋亡，继续共同孵育24h；ISO+PUE@PEG-PE：H9c2心肌细胞先与20μM载葛根素的PEG-PE纳米胶束(PUE@PEG-PE，含等剂量PUE)共同孵育0.5h，再加入10μM异丙肾上腺素(ISO)诱导心肌细胞凋亡，继续共同孵育24h；ISO+PUE@TPP-PEG-PE：H9c2心肌细胞先与20μM载葛根素的序级靶向纳米胶束(PUE@TPP-PEG-PE，含等剂量PUE)共同孵育0.5h，再加入10μM异丙肾上腺素(ISO)诱导心肌细胞凋亡，继续共同孵育24h，最后各组进行如下检测。
①Hoechst阳性细胞百分率 各组细胞采用Hoechst 33258染色，在荧光显微镜下观察各组细胞的凋亡情况，结果显示ISO诱导H9c2心肌细胞凋亡组的细胞形态出现了明显的萎缩和细胞碎片(箭头指示)，表明模型组药物ISO诱导H9c2心肌细胞凋亡试验成功，而PUE、PUE@PEG-PE、PUE@TPP-PEG-PE预处理组可以明显减少心肌细胞数量，其中PUE@TPP-PEG-PE预处理组的抗凋亡效果均显著优于PUE和PUE@PEG-PE组，存在显著性差异(见图3-1、3-2)。
②Caspase 3活性 各组细胞检测凋亡相关的Caspase 3活性，结果显示ISO诱导H9c2心肌细胞凋亡组Caspase 3活性最高，表明模型组诱导H9c2心肌细胞凋亡试验成功，而PUE、PUE@PEG-PE、PUE@TPP-PEG-PE预处理组可以明显减少Caspase 3活性，其中PUE@TPP-PEG-PE预处理组降低Caspase 3活性明显优于PUE和PUE@PEG-PE组，存在显著性差异(见图3-3)。
③凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达 各组细胞检测凋亡相关蛋白Bcl-2(抗凋亡)、Bax(促凋亡)的表达，结果显示ISO诱导H9c2心肌细胞凋亡组蛋白Bcl-2表达最低，Bax最高，表明模型组诱导H9c2心肌细胞凋亡试验成功，而PUE、PUE@PEG-PE、PUE@TPP-PEG-PE预处理组可以明显升高Bcl-2表达、降低Bax表达，其中PUE@TPP-PEG-PE预处理组升高Bcl-2表达和降低Bax表达程度均明显优于PUE和PUE@PEG-PE组，存在显著性差异(见图3-4)。
以上这些结果表明TPP-PEG-PE纳米胶束可以显著增强葛根素的抗凋亡作用，而这些Caspase 3活性、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达均与葛根素抑制线粒体mPTP开放密切相关，由此间接表明TPP-PEG-PE纳米胶束可以将药物序级靶向至缺血心肌细胞线粒体，在线粒体靶向部位发挥药理作用。
(4)载香豆素的序级靶向纳米胶束的细胞摄取试验
采用薄膜水化法，将香豆素-6(Coumarin-6，C6)荧光物质(绿色)载入PEG-PE和TPP-PEG-PE纳米胶束中，制备载香豆素的PEG-PE纳米胶束(C6@PEG-PE)和载香豆素的序级靶向纳米胶束(C6@TPP-PEG-PE)。然后再将香豆素-6(C6)、载香豆素的PEG-PE纳米胶束(C6@PEG-PE)和载香豆素的序级靶向纳米胶束(C6@TPP-PEG-PE)与H9c2心肌细胞共同孵育，在2h和4h时采用荧光显微镜观察香豆素-6荧光物质在细胞内摄取情况。结果发现香豆素-6组在细胞内摄取情况很少，而C6@PEG-PE和C6@TPP-PEG-PE被细胞摄取呈明显的时间依耐性，且基本聚集在细胞核周围(DAPI染色：显蓝色荧光)，C6@TPP-PEG-PE表现尤为明显，由此可知，TPP阳离子可以加速PEG-PE纳米胶束的跨膜转运，故细胞摄取药物量也将相应增加，推测该载药系统可以增强药物的药理作用。