一种水凝胶肿瘤疫苗的制备方法以及由其制备的水凝胶肿瘤疫苗和其用途与流程

本发明涉及生物医药及肿瘤治疗领域，具体涉及基于机体肿瘤细胞的个性化肿瘤疫苗的制备方法以及由该制备方法制备的肿瘤疫苗和其用途。

背景技术：

肿瘤复发及转移是肿瘤治疗的最大挑战。传统治疗手段如手术、化疗和放疗对复发及转移性肿瘤疗效有限。近年来癌症免疫疗法对复发或转移肿瘤疗效显著，正受到广泛关注。其中，肿瘤疫苗在预防癌症复发和转移的治疗中发挥重要作用，但传统肿瘤疫苗在不同患者体内的疗效差异巨大。主要是目前多数研究的肿瘤疫苗是针对于肿瘤细胞或组织的某种单一抗原分子，而越来越多的研究显示肿瘤的发生发展并不是由于单一基因的突变，而是由多个靶点的基因或蛋白分子的变异所引起的。随着测序技术的发展，肿瘤新抗原为个性化肿瘤疫苗的设计提供了新的思路，然而，肿瘤新抗原的技术周期长、成本高昂，不利于晚期、高恶性程度癌症病人的长期治疗。因此，本领域亟需构建一种工艺简单的个性化肿瘤疫苗用于高效预防癌症复发和转移。

肿瘤细胞包含大量肿瘤抗原，如果将肿瘤患者实体肿瘤手术切除，收集同源肿瘤细胞、改造并高效调控抗原释放行为，有望作为个性化肿瘤疫苗诱导同一病人产生高强度特异免疫应答，抑制其癌症复发和转移。但是由于机体内存在大量的免疫负调节因子如程序性死亡受体1/程序式死亡-配体1(pd1/pd-l1)，白细胞介素10(il-10)，色氨酸降解酶(ido-1)等，极大地减弱了肿瘤细胞的免疫原性，避免了免疫系统对肿瘤抗原的识别。因此，将癌细胞疫苗与免疫调节剂合用，增强特异性抗原呈递的同时抑制免疫逃避机制，有望为复发及转移性肿瘤个性化治疗提供新思路。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于机体肿瘤细胞的个性化的水凝胶肿瘤疫苗的制备方法以及由其制备的肿瘤疫苗和其用途。由本发明的方法制备的肿瘤疫苗能够有效抑制肿瘤复发与转移。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种水凝胶肿瘤疫苗的制备方法，步骤如下：

(1)肿瘤细胞预处理：向作为载体的肿瘤细胞中加入疏水性药物，得到预处理的肿瘤细胞；

(2)水凝胶载体的制备：将多肽和无机碱溶解于缓冲液中，充分溶解后，30-90℃水浴加热5-50min，即制备得到水凝胶载体，其中，所述多肽为(fmoc)fmoc-kcrgdk，即n端的赖氨酸的两个氨基都被fmoc保护；和

(3)水凝胶肿瘤疫苗的制备：取步骤(2)中制得的水凝胶载体，在涡旋的状态下，缓慢加入步骤(1)中制备的预处理的肿瘤细胞，直至混合均匀，静置得到水凝胶肿瘤疫苗。

本方法步骤(1)中，优选地，所述肿瘤细胞可以为各种来源的实体肿瘤细胞株，优选为4t1乳腺癌肿瘤细胞、emt6乳腺癌肿瘤细胞、mcf-7乳腺癌肿瘤细胞、ct26结肠癌肿瘤细胞、b16-f10黑色素瘤肿瘤细胞，或者，也可以是取自肿瘤患者的手术肿瘤切块，从中分离原代肿瘤细胞，在体外进行培养得到扩增肿瘤细胞。

优选地，本方法步骤(1)具体为：将作为载体的肿瘤细胞置于foxp3固定液中孵育10-60min，即可得到固定、破膜的肿瘤细胞；向肿瘤细胞中加入疏水性药物和有机溶剂，室温搅拌，离心，用pbs洗涤，去除游离的疏水分子，得到预处理的肿瘤细胞。其中，所述pbs洗涤次数优选为2-4次，更优选为3次。其中，优选地，所述预处理的肿瘤细胞中的肿瘤细胞数量与疏水性药物的比例为1×10⁷个:(5-200)μg，所述有机溶剂的体积为1-10ml，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、二甲亚枫、乙腈。其中，优选地，所述搅拌时间为1-10h，离心转速为2000rpm，离心时间为3min。其中，优选地，所述肿瘤细胞与foxp3固定液的数量体积比是1×10⁸个细胞/(1～10)ml。

本方法步骤(1)中，优选地，所述疏水性药物可以是用于肿瘤的治疗的药物。例如，所述疏水性药物可以为荧光分子，如香豆素6，尼罗红；或光敏分子，如二氢卟吩e6，焦脱镁叶绿酸a等；或化疗药物，紫杉醇，阿霉素，喜树碱，铂类药物，卡巴他赛等；或小分子免疫调节剂，如jq1，nlg919等。

本方法步骤(2)中，所述多肽在溶液中有规律地排列以及与周围水分子的相互作用从而形成水凝胶。加入无机碱是为了中和多肽中的羧基，使其能够在例如ph7.4的pbs中充分溶解。优选地，所述缓冲液选自ph值为7.4的pbs缓冲液、ph值为7.4的hepes缓冲液、ph值为7.4的pb缓冲液等。

本方法步骤(2)中，优选地，所述多肽的浓度为1-50mg/ml，多肽中的羧基与无机碱的摩尔比为2:1-1:5；优选地，所述多肽的浓度为10mg/ml，多肽中的羧基与无机碱的摩尔比为1:1。

本发明步骤(2)中，优选地，所述无机碱选自无水碳酸钠或碳酸氢钠。

本方法步骤(2)中，优选的，水浴加热的温度为40-60℃，水浴加热的时间为15-30min。

本发明制备水凝胶载体的多肽序列(fmoc)fmoc-kcrgdk中由于crgdk肽段能够与肿瘤细胞表面的神经纤毛蛋白-1(nrp-1)受体结合，促进疫苗向肿瘤内部渗透。

本发明还提供了由所述方法制备得到的水凝胶肿瘤疫苗。

本发明还提供了所述水凝胶肿瘤疫苗在制备预防肿瘤复发与转移的药物中的用途。

本发明中，所述肿瘤的类型没有特别限制，例如可以为黑色素瘤、乳腺癌、肺癌和结肠癌等实体肿瘤。

本发明水凝胶肿瘤疫苗具有肿瘤相关的抗原，在体内，能够有效促进肿瘤抗原发呈递，促进树突细胞的熟化，诱导机体产生特异性免疫反应，促进肿瘤组织cd8⁺t细胞的浸润，有效延长免疫记忆效应，以达到抑制肿瘤复发与转移的目的。

本发明技术方案较目前基于肿瘤特异多肽的疫苗具有明显的优势：肿瘤突变多肽的制备与递送技术已经十分成熟，但一个肿瘤往往同时存在多种多靶点的突变，因此针对单一或有限突变的肿瘤多肽疫苗对肿瘤的治疗效果十分有限且个体化差异大。而直接利用肿瘤细胞制备的疫苗则同时拥有所有的肿瘤抗原，且通过将不同疏水药物装载进入肿瘤细胞中，可以联合化疗、光疗或解除免疫抑制，从而进一步增强对肿瘤的治疗效果。

本发明疫苗制备工艺适用于临床用肿瘤疫苗的制备。

取术后病人的肿瘤组织，分离原代肿瘤细胞，在体外进行扩增，收集病人的肿瘤细胞作为原材料，制备病人特异的水凝胶肿瘤疫苗。

肿瘤的治疗包括手术、化疗、放疗和免疫治疗四个方面。本发明疫苗可以在临床上将这四种治疗方法结合在一起。手术摘除肿瘤组织，体外分离富集肿瘤细胞用于制备水凝胶肿瘤疫苗，选择最优化的化疗、放疗方案，减少对机体的毒副作用，再使用本发明水凝胶肿瘤疫苗，激活机体的特异性免疫应答，有效抑制术后肿瘤的复发与转移。

附图说明

图1为本发明实施例一中所制备的多肽在恒温水浴前、中、后的透射电镜图。随着恒温水浴时间的延长，多肽在缓冲液中的微观形态由形态均一的纳米粒子逐渐生长形成纳米纤维，从而形成水凝胶。图中标尺为50纳米。

图2为本发明实施例一中所制备水凝胶的扫描电镜图，该水凝胶具有纤维状网络微观结构。

图3为本发明实施例一中所制备水凝胶的力学性能。流变仪的频率扫描是在多肽形成水凝胶之后(4h)才进行的，应变为1.0％，水凝胶浓度为1.0wt％。水凝胶的弹性模量为帕，且弹性模量和粘性模量随着扫描频率的改变并没有很大的变化，说明凝胶内部形成的是弹性网络。

图4为本发明实施例三中制备水凝胶肿瘤疫苗在各个制备阶段的白光照片和基本的制备步骤。凝胶的浓度为10mg/ml,细胞数目为1×10⁸个。

图5为本发明实施例四中水凝胶肿瘤疫苗对4t1肿瘤复发的抑制作用。当给药27天后，与生理盐水和空白水凝胶组相比，水凝胶肿瘤疫苗能够有效抑制原位肿瘤的复发。图中***代表与生理盐水和水凝胶相比，水凝胶肿瘤疫苗能够显著抑制4t1原位瘤的生长。

图6为本发明实施例四水凝胶肿瘤疫苗对4t1肿瘤远端转移的抑制作用。a.4t1远端转移瘤随时间的生长曲线；b.无转移瘤小鼠的数目随时间的变化。当给药27天后，与生理盐水和空白水凝胶组相比，水凝胶肿瘤疫苗能够有效抑制4t1肿瘤的远端转移。图中***代表与生理盐水和水凝胶相比，水凝胶肿瘤疫苗能够显著抑制远端转移瘤的出现和生长。

具体实施方式

以下结合附图通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明不受这些具体实施例限定。

实施例中所用的短肽序列由上海吉尔生化有限公司合成。光敏分子吲哚菁绿icg购自北京百灵威科技有限公司。免疫调节剂三苯甲烷三异氰酸酯(jq1)购自selleck化学科技有限公司。foxp3固定液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。4t1乳腺癌细胞购自美国atcc细胞库，细胞培养用rpim1640培养基和胎牛血清均购自gibco公司。在本申请中，如无特殊说明，其余所用试剂和溶剂均购自国药集团(上海)化学试剂有限公司。

如无特殊说明，所用设备及测试方法均为本领域常规的设备和方法。透射电镜照片由tecnai型透射电子显微镜获得，扫描电镜照片由novanano450扫描电子显微镜获得。疫苗的流变学性质由kinexus旋转流变仪测得。

4-5周龄的balb/c白鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，并通过于小鼠脂肪垫接种体外培养的4t1乳腺癌细胞构建荷4t1肿瘤的荷瘤小鼠模型。整个动物实验的操作过程均严格遵循上海药物研究所动物护理与使用委员会的相关规定。

实施例一本发明水凝胶载体的制备

以(fmoc)fmoc-krgdk多肽序列为实例：利用恒温水浴法制备渗透性水凝胶载体，作为肿瘤细胞的载体，赋予疫苗稳定性和可注射型。

具体操作过程：

取(fmoc)fmoc-krgdk多肽5mg与0.92mg无水碳酸钠，共同溶解于0.5mlpbs缓冲液(ph7.4)中，将所得溶液70℃恒温水浴，直至水凝胶的形成。在水浴前(0min)、中(水浴开始后5min)、后(水浴开始后50min)，分别取适量的水凝胶用透射电子显微镜观察水凝胶的形成过程以及微观形态，如图1所示。水凝胶形成后用扫描电子显微镜观察其具体的微观空间形态，结果如图2所示。取适量制备好的水凝胶，用流变仪检测水凝胶的流变学性质，结果如图3所示。

实施例二本发明预处理的肿瘤细胞的制备

以小鼠乳腺癌4t1细胞系为模型为实例：用小鼠乳腺癌4t1细胞为细胞模型，制备细胞载体；以光敏分子吲哚菁绿(icg)和免疫调节剂jq1为模型药物，装载进4t1细胞。

具体操作过程：

收集4t1肿瘤细胞(1×10⁷个)，置于1mlfoxp3固定液中孵育30min后，用pbs洗涤3次，再加入5ml含吲哚菁绿和jq1的甲醇溶液混合均匀，搅拌4h，其中吲哚菁绿和jq1的浓度均为10μg/ml。2h后，2000rpm离心3min去除游离的药物，并用pbs洗涤3次，即可得到装载吲哚菁绿和jq1的4t1细胞。

实施例三本发明水凝胶肿瘤疫苗的制备

将实施例二中得到的装载吲哚菁绿和jq1的4t1细胞与实施例一中所得的水凝胶载体混合制备水凝胶肿瘤疫苗，所述水凝胶肿瘤疫苗接种荷4t1肿瘤的balb/c小鼠后，再给小鼠接种4t1肿瘤细胞，观察所述疫苗对小鼠的保护作用。

具体操作过程：

取1ml实施例一中所得水凝胶载体，涡旋时缓慢加入1×10⁷个实施例二中得到的装载吲哚菁绿和jq1的4t1细胞，充分涡旋混合后静置，即可得到水凝胶肿瘤疫苗，具体过程如图4所示。

实施例四使用本发明水凝胶肿瘤疫苗抗肿瘤复发与转移

取18只8周龄雌性balb/c小鼠，分别在左侧腋下脂肪垫上接种对数生长4t1乳腺癌细胞，待肿瘤生长至500mm³后，手术切除大部分肿瘤组织，随机分成三组，第一组接种生理盐水，第二组接种实施例一中制备的水凝胶载体，第三组接种实施例三中得到的水凝胶肿瘤疫苗进行免疫。免疫后，再取1×10⁵个4t1肿瘤细胞接种于上述三组小鼠的右侧下腹部。每隔6天，按上述分组分别免疫一次，一共免疫3次。每两天检测小鼠左侧原位肿瘤的复发和右侧远端转移瘤的生长情况。

实验结果：

抗肿瘤复发与转移实验发现实施例三中所得水凝胶肿瘤疫苗能够有效抑制手术后4t1原位瘤的复发。手术40天后，生理盐水和水凝胶载体免疫后的两组小鼠原位瘤全部复发并生长至3000cm³左右。而使用水凝胶肿瘤疫苗免疫后的小鼠，其原位瘤基本没有复发，如图5所示。同时，对右侧远端转移瘤的检测结果也发现，生理盐水、水凝胶载体免疫不能抑制远端转移瘤的发生、发展。而水凝胶肿瘤疫苗免疫能够有效抑制远端转移瘤的产生，结果如图6所示。

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<110>中国科学院上海药物研究所

<120>一种水凝胶肿瘤疫苗的制备方法以及由其制备的水凝胶肿瘤疫苗和其用途

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